Computational mass spectrometry

Computational Mass Spectrometry
Jiří Novák
SiRet Research Group
Department of Software Engineering
Faculty of Mathematics and Physics
Charles University in Prague
Czech Republic
http://www.siret.cz
Obsah
• Fyzikální princip spektrometru
– MALDI, ESI, hmotnostní analyzátory
• Základy MS a MS/MS
– rozdíl, vlastnosti MS/MS spekter
– využití MS/MS pro identifikaci a kvantifikaci proteinů/peptidů
• Identifikace peptidových sekvencí
– podobnostní vyhledávání v DB (SPC, kosinová podobnost,
param. Haus. vzd., X!Tandem, OMSSA, SEQUEST, MASCOT)
– De Novo, Sequence-Tag
– statistické hodnocení výsledků
• OpenMS, TOPP
Princip spektrometru
• iontový zdroj  hmotnostní analyzátor  detektor
• iontový zdroj
– MALDI, ESI, ...
– převádí neutrální molekuly na ionty (ionizace)
• hmotnostní analyzátor
– rozděluje ionty podle poměru m/z (hmotnost/náboj)
• detektor
– zaznamenává jednotlivé ionty a jejich intenzity
MALDI
• Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
• vzorek rozpuštěn, smíchán s matricí, vykrystalizován na MALDI
destičce
• krátké laserové pulsy ionizují molekuly matrice
• molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice
• nejčastěji vznikají ionty s nábojem 1+
ESI (Electrospray Ionization)
•
•
•
•
•
vznikají vícenásobně nabité ionty 2+, 3+, ...
rozpuštěný analyt se přivádí vstupní kovovou kapilárou do iontového zdroje
za pomoci proudu dusíku vznikají malé kapičky (aerosol), které nesou
vzhledem k vysokému napětí v kapiláře množství nábojů
odpařováním rozpouštědla se kapičky zmenšují a hustota elstat. náboje
roste, jakmile dosáhne kritické hodnoty dojde k Coulombické explozi –
rozpadu kapiček na menší
Coulombické exploze se opakují tak dlouho, dokud není dostatečně malá a
nedojde k uvolnění iontu z jejího povrchu
Hmotnostní analyzátory
• TOF (Time-Of-Flight)
– analyzátor doby letu
– ionty o stejné kinetické energii se pohybují různou rychlostí v
závislosti na poměru m/z
– „menší ionty jsou rychlejší než větší“
– měří se čas, za který dolétnou k detektoru, čímž se určí jejich
m/z
• kvadrupólový
– v daný okamžik jím mohou projít pouze ionty s daným m/z,
ostatní zůstanou zachyceny
– změnou napětí, pak postupně projdou všechny ionty na detektor
Hmotnostní analyzátory
• iontová past
– podobné jako kvadrupólový
– ionty jsou „uvězněny“ a pak postupně uvolňovány na detektor
• magnetický analyzátor
– využívá zakřivení dráhy iontů v magnetickém poli,
které závisí na m/z
– ionty s nižší m/z mají větší zakřivení dráhy a naopak
– hodnota m/z je úměrná druhé mocnině poloměru dráhy iontu
MS - identifikace proteinů
• Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
–
–
–
–
starší metoda
protein enzymaticky rozdělen na peptidy
1 spektrum pro celý protein (směs proteinů)
peak odpovídá peptidu - nelze stanovit pořadí aminokyselin,
protože jejich libovolná permutace dá stejnou hmotnost
– identifikace založena výhradně na vyhledávání v databázi
známých proteinových sekvencí nebo porovnání s již
naměřenými knihovnami spekter
MS/MS hmotnostní spektrometrie
MS vs. MS/MS
MS
MS/MS
spektrum ~ protein/y
sada spekter ~ protein/y
peak ~ peptid
spektrum ~ peptid
peak ~ fragmentový ion
MS/MS hmotnostní spektrum
Nedokonalosti spekter
• iontové série zpravidla nejsou kompletní
– zejména y-ionty a b-ionty jsou pro identifikaci peptidů
nejdůležitější
• šum
– může tvořit i 80% peaků ve spektru
• sada spekter
– u starších spektrometrů nelze identifikovat až 90% spekter
– s novějšími metodami se snižuje až na 50%
• modifikace aminokyselin
Modifikace aminokyselin
• záměrně přidané
– zabraňují „sbalení“ proteinů/peptidů při analýze
– např. Carbamidomehyl C (+57 Da)
– fixní – každé C je modifikováno
• náhodně vznikající při přípravě vzorku nebo
ve spektrometru
– např. Oxidation M (+16 Da)
– variabilní – ne každé M je modifikováno
• posttranslační
– vznikají kdykoliv za doby existence proteinu
– dávají proteinům nové vlastnosti, stabilizují jejich konformace,
pomáhají regulovat jejich funkce, apod.
• databáze proteinových modifikací – www.unimod.org
– obsahuje více než 950 typů
MS/MS - identifikace proteinů
• metoda bottom-up
–
–
–
–
častější, jednodušší
proteiny jsou enzymaticky rozděleny na peptidy
sekvence se „skládá“ z peptidů
identifikace purifikovaných směsí proteinů (< 5 proteinů)
• identifikace “kompletních” proteinových sekvencí
– shot-gun proteomics (HPLC-MS/MS)
• identifikace všech proteinů ve vzorku (několika tisíc)
• stanovení kompletních proteinových sekvencí je obtížné
• vhodné pro kvantifikaci proteinů/peptidů ve vzorku
• metoda top-down
–
–
–
–
méně časté, obtížnější (dekonvoluce spekter)
proteiny nejsou děleny na peptidy, analyzují se jako celek
y-ionty, b-ionty existují pro celé proteiny
vhodné např. pro studium posttranslačních modifikací
HPLC-MS/MS
E.coli – 2D
E.coli – 3D
MS/MS - kvantifikace
• label-free kvantifikace
– pro každý vzorek zvlášť se
identifikují peptidy
– spectral counting – pro každý
peptid se vypočte kolika spektrům
byl přiřazen
– množství peptidů/proteinů odpovídá
počtu spekter
MS/MS - kvantifikace
• SILAC
– stable isotope labelling by amino acids in cell culture
– 2 vzorky analyzovány současně
– buňečná kultura v 1. vzorku se „krmí normálními”
aminokyselinami
– kultura ve 2. vzorku aminokyselinami s težkými izotopy uhlíku
13C místo 12C
– Arg0  Arg6, Lys0  Lys8
Identifikace peptidových sekvencí
• Podobnostní vyhledávání
• De novo
• Sequence-Tag
Podobnostní vyhledávání
• databáze
– známých proteinových sekvencí
– predikovaných proteinových sekvencí
(6 rámcový překlad DNA sekvencí)
– naměřených spekter
• podobnostní míra
Databáze
• proteinové sekvence v databázi jsou
rozděleny na peptidové sekvence
• parametr „missed cleavage sites“
Databáze
• z peptidových sekvencí jsou
vygenerována teoretická hmotnostní
spektra
Podobnostní míra
• podobnostní míra s(*,*) vrací podobnost
mezi naměřeným a teoretickým spektrem
–
–
–
–
–
–
–
–
počet sdílených peaků (SPC – shared peak count)
kosinová podobnost (cosine similarity)
parametrizovaná Hausdorffova vzdálenost
X!Tandem
OMSSA
SEQUEST
MASCOT
atd.
SPC
• dot product
• počet peaků y,b,a,y2+,... které se napárují
mezi experimentálním a teoretickým
spektrem
Kosinová podobnost
• normalizovaný SPC
Parametrizovaná Hausdorffova vzdál.
• x,y – spektra (vektory poměrů m/z)
• dim(x) – počet peaků ve spektru x
• ξ – m/z chyba přístroje
X!Tandem - hyperscore
počet b-iontů
 n

HyperScore    Ii * Pi  * Nb !* Ny !
 i 0

počet y-iontů
intenzita
peak nalezen v teoretickém
spektru (1) nebo ne (0)
http://www.thegpm.org/tandem/
OMSSA
• Open Mass Spectrometry Search Algorithm
• skóre založeno na výpočtu pravděpodobnosti
náhodného spárování peaků
• počet spárovaných y-iontů a b-iontů odpovídá
Poissonovu rozdělení
1 spektrum vs.
všechny peptidy
v NCBI (nr)
OMSSA
• pro fragmentové ionty s nábojem 1+
• (r-o)/2t – maximální počet zásahů peaků mezi exp. a
teor. spektrem
– r – maximální naměřené m/z
– o – minimální naměřené m/z
– t – chyba přístroje
• h(r-o)/m – tolik peaků se snažíme
napárovat do v experimentálních
– h – počet vygenerovaných peaků
– m – neurální hmotnost prekurzoru
OMSSA
• pro fragmentové ionty s nábojem
1+ a 2+
• dále heuristické zrychlení a zpřesnění s předpokladem,
že aspoň 1 teoretický peak se spáruje s jedním z n=3
nejvyšších peaků v experimentálním spektru – to ale
změní pravděpodobnostní rozdělení
• q = n/v – pravděpodobnost spárování naměřeného
peaku s experimentálním
OMSSA
• E-value – výsledné skóre pro PSM (peptide-spectrum
match)
• očekávaný počet náhodných PSM takových, že náhodné
PSM mají skóre lepší nebo rovné než PSM s danou Evalue
• př. E-value = 1, říká že existuje jeden PSM se stejnou
nebo lepší E-value, který ale bude náhodný
OMSSA
• pravděpodobnost, že PSM na základě 1 porovnání je
náhodné; y – počet spárovaných peaků, z = 1 nebo 2
• pravděpodobnost, že PSM na základě porovnání
jednoho spektra s N teoretickými spektry je náhodné
• E-value
OMSSA
• http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/
• Open mass spectrometry search algorithm
SEQUEST
•
•
•
•
•
hrubší skóre Sp
im – intenzita spárovaného peaku
ni – počet spárovaných peaků
nt – počet všech peaků v exp. spektru
iniciální hodnota β = 0 je inkrementována o malý
přírůstek pokaždé když dojde ke spárování y-iontu nebo
b-iontu
• ρ – podobně pro immoniové ionty
• vyšší hodnota lepší, nt zabraňuje nárůstu skóre pro
dlouhé peptidové sekvence
SEQUEST
SEQUEST
• jemnější skóre Xcorr
• křížová korelace (cross correlation)
• spektrum normalizováno, odstraněny peaky s nízkou
intenzitou, hodnoty m/z zaokrouhleny na nejbližší vyšší
celé číslo  spektrum X
• Y – teoretické spektrum vygener. z databáze sekvencí
• korelační funkce Corr(t) – součin vektorů X a Y, přičemž
Y je posunut o t hmotnostních jednotek
• avg – průměruje hodnoty v intervalu; t ϵ <-75;75>
SEQUEST
• Xcorr je výpočetně náročnější než Sp
• Xcorr je závislá na délce peptidu
• na výstupu jsou preferovány ty PSM pro něž jsou obě
skóre nejvyšší
• doplňkové skóre pro nejlepší PSM – rozdíl Xcorr mezi 1.
a 2. nejbližším teoretickým spektrem
• jeden z nejstarších programů (1993), není volně
dostupný
• http://fields.scripps.edu/sequest/
MASCOT
• komerční, ale známý a často používaný produkt
• detaily algoritmu nebyly publikovány
• http://www.matrixscience.com/search_form_select.html
MASCOT
• principiálně vychází z algoritmu MOWSE (MOlecular
Weight SEarch)
• MOWSE původně definován pro data ze starších
spektrometrů, kdy nemáme sadu spekter, ale pouze 1
spektrum, kde jsou m/z precursorů a intenzity jejich
výskytu (peptide mass fingerprinting - PMF)
MOWSE
•
•
•
•
základem je matice frekvenčních koeficientů F
řádek interval 100 Da peptidové hmotnosti
sloupec 10 kDa proteinové hmotnosti
důvod – peptidy s nižší hmotností vznikají častěji,
přičemž tato závislost je ještě ovlivněna délkou pův.
proteinové sekvence
• v praxi různé matice pro různé enzymy a databáze
MOWSE
• procházíme DB sekvencí, inkrementujeme příslušné
elementy fi,j
• na konci jsou všechny prvky v daném sloupci přeočteny
na pravděpodobnost jejich výskytu podle vztahu
• následně ještě normalizujeme podle maximální hodnoty
v daném sloupci, získáme tak prvky nové matice M
(MOWSE factor matrix)
MOWSE
• výsledné skóre proteinu
• Mprot – relativní molekulová hmotnost proteinu
• n – počet nalezených peptidů
• 50 kDa – normalizační konstanta pro redukci náhodného
růstu skóre pro velmi dlouhé sekvence
• v praxi je používán o něco složitější pravděpodobnostní
model, který nebyl publikován
De Novo
• identifikace peptidových sekvencí ze spekter s využitím
grafových algoritmů (bez databáze známých sekvencí)
• hmotnosti amynokyselin jsou definovány, vypočteme si
si hmotnosti všech dvojic (20*20) případně trojic
(20*20*20) aminokyselin
• problémy
– spektra typicky neobsahují kompletní série y-iontů, b-iontů
– spektra obsahují šum (peaky odpovídající nepredikovatelným
fragmentovým iontům – až 80% peaků)
– I a L mají stejnou hmotnost
– některé dvojice, trojice aminokyselin mají stejnou hmotnost
(stejné složení atomů)
– ve dvojici, trojici aminokyselin nelze stanovit správné pořadí
– posttranslační modifikace
De Novo
• cílem je najít cestu s největším počtem hran
De Novo
Sequence-Tag
• kombinace De Novo
s vyhledáváním v DB
• určí se krátká sekvence
„tag“, pak se prohledá DB
Sequence-Tag
Statistické hodnocení výsledků
• target-decoy přístup – proteinové sekvence v databázi přepíší
pozpátku a připojí se k původní databázi
– původní sekvence se označí „target“
– otočené sekvence „decoy“
• distribuce skóre pro PSMs v decoy databázi umožňuje rozlišit, zda
PSM s daným skóre je náhodný nebo ne
• FDR (false discovery rate)
– podíl počtu náhodných PSM ku všem
• q-value – minimální FDR, při kterém je PSM akceptován
• FDR – vlastnost množiny PSMs; q-value vlastnost jednoho PSM
• př.
– pro skóre 4.14, 4 decoy PSMs a 919 target PSMs, FDR = 0.35%
– pro skóre 3.98, 4 decoy PSMs a 1294 target PSMs, FDR = 0.27%
– q-value 0.27% má tedy 1294 PSMs, tj. pravděpodobnost, že daný PSM
je náhodný je 0.27%
OpenMS, TOPP & TOPPAS
• OpenMS je open source knihovna pro práci s MS/MS
spektry (C++)
• TOPP (balík *.exe souborů)
• TOPPAS
– z jednotlivých nástrojů lze skládat komplexní pipeline
• podpora ConsensusID
– identifikace peptidů se současným
využitím více nástrojů
• vyvíjeno v Applied Bioinformatics
Group, Eberhard-Karls Universität
in Tübingen, Německo
• www.open-ms.de
Jednoduchá identifikace
ConsensusID
That’s all folks !