Sborník - orion - Masarykova univerzita

Masarykova univerzita v Brně – Přírodovědecká fakulta
a
Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii
pod záštitou
rektora Masarykovy univerzity prof. RNDr. Jiřího Zlatušky, CSc.
děkana Přírodovědecké fakulty MU doc. RNDr. Milana Gelnara, CSc.
VIII. Pracovní setkání biochemiků
a molekulárních biologů
Sborník příspěvků
3. – 4. února 2004
Konferenční centrum USKM Vinařská v Brně
PŘEDEŠLÁ PRACOVNÍ SETKÁNÍ BIOCHEMIKŮ A MOLEKULÁRNÍCH
BIOLOGŮ
14. červenec 1997 ; 21. leden 1998; 3. únor 1999; 9. únor 2000; 14. únor 2001; 7. únor 2002; 29. leden 2003
http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm
Vážení přátelé,
dovolujeme si Vás přivítat na osmém Pracovním setkání biochemiků a molekulárních biologů
v Brně.
Těší nás Váš vzrůstající zájem o naše pravidelná setkání, na jehož základě jsme jej rozšířili na
již dvoudenní a přesunuli jeho pořádání do větších prostor.
Doufáme, že se nám společně podařilo vytvořit program, ve kterém si každý z nás najde
spoustu nových a zajímavých informací z ostatních zúčastněných pracovišť.
Zároveň přejeme hodně úspěšných prezentací I našim doktorandům, stejně jako v minulém
roce Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii a organizuící Katedra biochemie
PřF Masarykovy university se rozhodly finančně ocenit nejlepší prezentace v anglickém
jazyce v Sekci mladých.
Současně vyhlašujeme veřejnou hlasovací soutěž o nejhezčí/nejlépe prezentované postery na
Setkání, jejichž autory oceníme malým dárkem..
Přejeme Vám, abyste z Brna odjížděli spokojeni a my Vás opět mohli přivítat při
následujících příležitostech.
V neposlední řadě bychom chtěli poděkovat také firmám, bez jejichž účasti bychom nemohli
takové setkání uskutečnit a které do značné míry umožňují námi prezentované výsledky
realizovat.
Vaši organizátoři
Michaela Wimmerová, Libuše Trnková, Petr Beneš a Petr Zbořil
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta
Kotlářská 2, 611 37 Brno
Tel: 541129406, Fax: 541129623
E-mail: [email protected];
http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm
Obsah sborníku
Přednášky
Sekce mladých
Postery
Autorský rejstřík
Prezentace firem
2
3 – 21
22 – 37
39 – 79
80 – 81
82 – 95
PŘEDNÁŠKY
ZVÝŠENÁ EXPRESE VIMENTINU JAKO MARKER DIFERENCIACE
MONOBLASTŮ BM2
INCREASE IN VIMENTIN EXPRESSION AS A MARKER OF BM2 MONOBLAST
DIFFERENTIATION
Petr Beneš1, Eva Zahradníčková1, Hana Konečná2, Zbyněk Zdráhal2, Jan Šmarda1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a
proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno
1
Diferenciace krevních buněk je doprovázena významnými změnami jejich
morfologických a fyziologických vlastností. Buněčná linie BM2 je linie kuřecích monoblastů
transformovaná onkogenem v-myb viru ptačí myeloblastózy. Exprese tohoto onkogenu
zabraňuje dokončení monocytické/makrofágové diferenciační dráhy a buňky BM2 proto
setrvávají ve stádiu monoblastů. Tuto blokádu lze překonat např. působením forbolového
esteru TPA, inhibitorem histonových deacetyláz trichostatinem A (TSA). V případě buněk
BM2 se zvýšenou expresí exogenních jaderných receptorů pro kyselinu retinovou (RAR,
RXR), respektive proteinů Jun, které podporují aktivitu endogenních RAR, lze tuto blokádu
překonat také působením kyseliny retinové (RA).
Při studiu změn proteomu buněk BM2 navozené TPA jsme zjistili, že dochází
k indukci exprese proteinu o molekulové hmotnosti 55 kDa. Hmotnostní spektrometrií
MALDI-TOF byl tento protein identifikován jako cytoskeletární protein vimentin. Následným
westernovým přenosem jsme prokázali, že intracelulární hladina vimentinu stoupá u buněk
BM2 během inkubace s TPA i TSA. Nárůst hladiny vimentinu je patrný také po působení RA
na buňky BM2 se zvýšenou produkcí jaderných receptorů RAR, RXR, respektive proteinů
Jun. Tyto výsledky jsme potvrdili u všech uvedených linií rovněž nepřímou
imunoflourescencí. Zatímco u kontrolních nestimulovaných buněk BM2 jsme pozorovali
velmi řídkou síť vimentinových vláken poblíž jádra, u všech buněčných linií, které byly
indukovány k makrofágové diferenciaci, dochází k výraznému zvýšení hustoty sítě
vimentinových filament nejen v blízkosti jádra, ale především v cytoplazmě.
Tyto výsledky ukazují, že během diferenciace monoblastů transformovaných
onkogenem v-myb (BM2) dochází k výraznému nárůstu intracelulární hladiny vimentinu,
která souvisí s vytvořením husté sítě vimentinových filament v buněčné cytoplazmě. Zvýšení
úrovně exprese vimentinu je tedy spolehlivým diferenciačním markerem buněk BM2.
Tato práce byla sponzorována grantem MSM 143100008 Ministerstva školství mládeže a
tělovýchovy a granty č. 301/03/D022 a 301/03/1055 Grantové agentury České republiky.
3
LYMPHOCYTE ACTIVATION RECEPTORS: NEW STRUCTURAL PARADIGMS
IN THE GROUP V OF C-TYPE LECTINS
Karel Bezouška
Center for Molecular Interactions and Biotransformation of Drugs, Faculty of Science,
Charles University Prague and Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Czech
Republic, Prague, Czech Republic. E-mail: [email protected]
C-type (calcium-dependent) animal lectins are widely distributed carbohydratebinding receptors important in many immune recognition processes. These molecules are
defined by a small globular protein domain, the carbohydrate-recognition domain, of about
100 amino acids that can be variously positioned into the context of other protein domains in
either soluble, type I membrane, or type II membrane proteins. Depending on the details of
protein architecture, a total of 7 groups of C-type lectins have been defined: the
proteoglycans, the hepatic lectins, the collectins, the selectins, natural lymphocyte receptors,
mannose macrophage receptors, and lectins with isolated carbohydrate-recognition domains.
From the point of view of structural biology, our understanding of the structure –
function relationships in the C-type lectin family remains fragmentary. By far the best
characterized molecule of the whole family is the soluble mannose binding protein studied
protein crystallography. This protein binds to calcium ions in the ligand-binding domain, and
the binding of calcium is intimately linked to the recognition of carbohydrates [1,2].
Receptors of natural killer lymphocytes have been also structurally characterized.
Since this group is evolutionarily most divergent, interesting structural paradigms have been
observed with regard to binding of calcium, carbohydrates, and other ligands. In NKR-P1,
calcxium may not be easily removed by chelating agents because of its unique chemical
nature [3]. In CD69, binding of calcium causes a structural shift in amino acids important for
binding of carbohydrates [4]. Structural studies have also allowed to understand an interesting
preference of these receptors for either linear (NKR-P1, Fig.1) or branched (CD69, Fig.2)
sugars. Remodeling of the binding surface in CD94 or Ly-49 opens the way for specific
recognition of protein and peptide ligands, which seems to be characteristic for entire group.
1. Drickamer K. (1992) Nature 360, 183. 2. Weis W.I. (1996) Annu. Rev. Biochem. 65, 441.
3. Bezouška K. (1994) JBC 269, 16952. 4. Pavlíček J. (2003) Biochemistry 42, 9295.
Supported by Ministry of Education of Czech Republic (MSM113100001), by Institutional
Research Concept AVOZ5020903, and by Volkswagen Foundation (project I/74 679).
Fig.1
Fig.2
Binding of carbohydrates by two activation receptors of lymphocytes, NKR-P1
(Fig.1) and CD69 (Fig.2). NKR-P1 binds chitotetraose, CD69 binds GlcNAc 1,2 and 3
4
PROTEOMOVÁ ANALÝZA BAKTERIE PARACOCCUS DENITRIFICANS A
KONSTRUKCE 2-DE DATABÁZE BÍLKOVIN
PROTEOME STUDY ON BACTERIUM PARACOCCUS DENITRIFICANS AND
CONSTRUCTION OF 2-DE PROTEIN DATABASE
Pavel Bouchal, Petra Přecechtělová*, Zbyněk Zdráhal** and Igor Kučera*
*Department of Biochemistry, **Laboratory of Mass Spectrometry of Biomolecules,
Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic
Paracoccus denitrificans is a non-fermentative, facultatively autotrophic soil
bacterium often studied in the field of bioenergetics, particularly due to resemblance of its
aerobic respiratory chain to that of mitochondria. Also an aspect of a great nutritional
adaptability was discovered, related to the ability of exploiting various electron donors and
electron acceptors for maintenance and growth. To discuss mechanisms underlying regulation
of gene expression by growth conditions, a high-throughput proteome mapping is one of the
most effective tools to-date.
For 2-DE gel analysis of whole-cell extract and its membrane fraction, newly
optimized methods using isoelectric focusation with immobilized pH gradient in the first
dimension and denaturing SDS-PAGE in the second dimension were used. Using this
approach, more than 800 protein spots of total cell extract and membrane fraction were
detected in the range pI 3-10 and Mr 15-100 kDa.
In order to follow the dynamics of protein expression under different growth
conditions, we compared complex protein composition of whole cells of P. denitrificans
cultivated (i) aerobically, (ii) anaerobically with nitrate (as electron acceptor), (iii)
anaerobically with nitrite, (iv) anaerobically with nitrous oxide. We also observed effect of
azide on protein expression, which is known to induce some denitrification enzymes under
aerobic conditions. For this reason, we compared protein composition of whole cells as well
as its membrane fraction grown (i) aerobically, (ii) aerobically with addition of 0.4 mM
sodium azide, (iii) anaerobically with nitrate, (iv) anaerobically with nitrite (whole cells only),
(v) anaerobically with nitrite and addition of 0.4 mM sodium azide (whole cells only). By
combined statistical and quantitative evaluation of set 30 large format 2-DE gels, we followed
alterations in the quantity of protein spots. We detected significant differences related to the
growth on various terminal electron acceptors and sodium azide; the results will be presented
and discussed.
49 protein spots have been submitted for analysis by peptide mass fingerprinting using
MALDI-TOF MS. However, the genome of P denitrificans have not been completely
sequenced yet and, currently, information about only 98+126 proteins is available from
Swiss-Prot/TrEMBL database. Due to this fact, we were able to identify only 8 proteins up todate. Among them, nitrite reductase and succinate dehydrogenase are key enzymes in P.
denitrificans metabolism.
We also compared expression data of nitrite reductase obtained by proteome analysis
with measurement of nitrite reductase enzyme activity. These data were in a good agreement.
The quantitative data and protein maps are kept in a database in PDQUEST format.
This database is going to become web-accessible.
This work was supported by grants No. 203/01/1589 from the Grant Agency of Czech
Republic and No. 740/2002 from Czech Ministry of Education.
5
MOŽNOSTI ANALÝZY EXPANZE TRINUKLEOTIDOVÝCH OPAKOVÁNÍ
POMOCÍ ELEKTROCHEMICKÝCH SENZORŮ
POSSIBILITIES OF ANALYSIS OF TRINUCLEOTIDE REPEAT EXPANSION BY
MEANS OF ELECTROCHEMICAL SENSORS
Miroslav Fojta, Luděk Havran, Marie Vojtíšková, Emil Paleček
Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, 612 65 Brno; [email protected]
Trinukleotidová opakování (trinucleotide repeat sequences, TRS) se běžně vyskytují
v lidském genomu (tzv. „mikrosatelity“). Tyto sekvence jsou přirozeně náchylné k expanzi
(prodlužování jejich délky). S expanzí určitých TRS souvisí řada dědičných
neurodegenerativních onemocnění, včetně myotonické dystrofie (expanze tripletů CTG),
Huntingtonovy chorey (CAG), syndromu fragilního chromozomu X (CGG) nebo
Friedrichovy ataxie (GAA)1, 2. Analýza délky příslušných TRS je tudíž důležitých kritériem
při diagnostice těchto chorob, včetně diagnostiky na prenatální či prekoncepční úrovni.
Obvykle využívané metody jsou založené na Southernově přenosu DNA a hybridizaci se
sondou komplementární k jednomu řetězci TRS, nebo na PCR amplifikaci genomového
lokusu obsahujícího TRS a stanovní délky amplikonu pomocí agarózové elektroforézy2.
V oblasti vývoje metod, které by se mohly v blízké budoucnosti uplatnit v DNA
diagnostice, je značná pozornost věnována elektrochemickým biosenzorům3. Tato zařízení
jsou obecně méně nákladná než např. optické analyzátory, jsou vysoce citlivá, poskytují
rychlou odpověď a v principu umožňují vysoce paralelní analýzu. V nedávné době byly
elektrochemické metody využity i při detekci expanze TRS. Thorp a kol. navrhli metodu
založenou na měření elektrokatalytického signálu guaninových zbytků v sekvenci CTG.CAG
imobilizované na povrchu elektrody4. Délka TRS byla vypočtena z velikosti měřeného
signálu vztaženého na počet imobilizovaných molekul, které byly koncově radioaktivně
značeny.
V naší laboratoři jsme navrhli tzv. dvoupovrchovou metodu elektrochemické analýzy
hybridizace DNA, založenou na hybridizaci DNA na povrchu magnetických mikročástic a
následné elektrochemické detekci. Tento postup jsme nedávno využili pro stanovení délky
TRS GAA.TTC, spojené s Friedrichovou ataxií5. Naše metoda, která dobře pracuje i při
analýze „skutečných“ klinických vzorků, zahrnuje PCR amplifikaci příslušného genomového
lokusu, modifikaci denaturovaného amplikonu komplexem OsO4, 2,2’-bipyridin (Os,bipy,
kovalentně modifikující pyrimidinové, ale nikoli purinové baze), zachycení cílového řetězce
obsahujícího (GAA)n sekvenci na magnetických kuličkách, a jeho hybridizaci se sondou
(TTC)12 značenou biotinem. Na tuto sondu se poté naváže streptavidin značený alkalickou
fosfatázou, katalyzující přeměnu 1-naftylfosfátu na 1-naftol, který je stanoven
elektrochemicky. Čím je délka TRS větší, tím větší počet molekul sondy hybridizuje s jednou
molekulou cílové DNA a tím větší je měřený signál, který je normalizován na počet
zachycených molekul cílové DNA. Ten je zjištěn měřením signálu Os,bipy, navázaného na
cílový řetězec v sekvencích lemujících TRS. V poslední době jsme ukázali, že tato metoda
pracuje dobře i v „jednopovrchovém“ uspořádání, kdy jak hybridizace DNA, tak měření
signálu probíhá na povrchu grafitové elektrody.
Práce byla financována grantem GAAV č. A4004402.
Literatura:
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
6
Sutherland, G. R.; Richards, R. I. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92, 3636-3641.
Campuzano, V.; et al. Science 1996, 271, 1423-1427.
Palecek, E.; Fojta, M. Anal. Chem. 2001, 73, 74A-83A.
Yang, I. V.; Thorp, H. H. Anal Chem 2001, 73, 5316-5322.
Fojta, M.; Havran, L.; Vojtíšková, M.; Palecek, E. submitted 2004
INTERAKCE UMLČENÉHO TRANSGENNÍHO LOKUSU S HOMOLOGNÍM
LOKUSEM IN TRANS
IN TRANS INTERACTION OF SILENCED TRANSGENIC LOCUS WITH A
HOMOLOGOUS LOCUS
Miloslava Fojtová, Aleš Kovařík
Laboratoř molekulární epigenetiky, Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65
Brno
Transgenní organismy jsou významným nástrojem studia regulace základních
molekulárně-biologických dějů. Mechanismus regulace exprese genů pomocí malých molekul
RNA, který se ukázal být obecným a zásadním fenoménem, byl odhalen právě pomocí
experimentů prováděných na modelovém transgenním organismu (červ Caenorhabditis
elegans s vneseným genem pro syntézu GFP, „green fluorescein protein“ 1). Je prokázáno, že
analogické principy, kterými je regulována exprese vnesených genů a genových rodin, platí i
pro geny endogenní.
Transgenní rostliny Nicotiana tabacum nesou kazetu obsahující reportérový gen pro
bakteriální neomycinfosfotransferázu II (nptII) pod kontrolou silného virového promotoru
35S. V rostlině HeLo2, která intenzívně exprimuje gen nptII, je tato kazeta přítomna jako
jednokopiová inzerce (lokus 2). V rostlině HeLo1 je transgen uspořádán jako obrácená
repetice (lokus 1) a je umlčen na posttranskripční úrovni. DNA genu nptII je u této linie
metylována na 3´ konci přepisované části. Dlouhodobou kultivací HeLo1 v tkáňové kultuře
došlo ke změně epigenetického stavu transgenního lokusu: výrazné de novo metylaci
promotoru a zároveň k poklesu metylace v nesymetrickém sekvenčním motivu v přepisované
oblasti genu nptII. S těmito změnami byla spojena i změna mechanismu umlčení transgenu z
posttranskripčního na transkripční 2. Epimutovaný lokus 1 byl označen 1E.
Z předchozích experimentů je známo, že posttranskripčně umlčený lokus 1 je schopen
interakce s homologním lokusem ve smyslu navození jeho metylace a umlčení 3. Zajímalo
nás, jestli bude mít tuto schopnost i transkripčně umlčený lokus 1E. Analýza hybridních
rostlin obsahujících lokus 2 a lokus 1E ukázala, že epimutovaný lokus 1 není schopen
komunikace s homologním lokusem 2: nebyla detekována metylace lokusu 2 ani v genu nptII
ani v oblasti promotoru 35S. Expresní analýza genu nptII na úrovni RNA (Northern blot) a
proteinu (NPTII ELISA) prokázala hladinu transkriptu nptII, respektive proteinu NPTII, na
úrovni řádově srovnatelné s neumlčenou rostlinou HeLo2. Na základě těchto výsledků je
možno usuzovat, že v tomto transgenním systému je umlčovací potence transgenního lokusu
spojená s jeho aktivní transkripcí.
Práce je financována grantem GAČR 521/04/0775.
Literatura:
1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., Mello, C.C. Nature 1998,
391, 806-811.
2. Fojtová, M., Van Houdt, H., Depicker, A., Kovařík, A. Plant Physiol. 2003, 133, 1-11.
3. Van Houdt, H., Kovařík, A., Van Montagu, M., Depicker, A. FEBS Lett. 2000, 467, 4146.
7
ELEKTROAKTIVITA AVIDINU A STREPTAVIDINU
ELECTROACTIVITY OF AVIDIN AND STREPTAVIDIN
Luděk Havran, Sabina Billová, Emil Paleček
Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, Brno
[email protected]
Avidin a streptavidin jsou proteiny, které se vyznačují velmi silnou afinitou k
nízkomolekulárnímu vitamínu biotinu [1]. Oba proteiny jsou strukturně velmi podobné.
Streptavidin, ale na rozdíl od avidinu, nemá ve svém řetězci aminokyseliny obsahující síru.
Tento fakt významným způsobem ovlivňuje jeho elektrochemické chování. Velmi silné
interakce (strept)avidin – biotin se často využívá v biotechnologiích. Biotin, který je
kovalentně zachycen na zkoumanou molekulu, se váže na (strept)avidin nesoucí reaktivní
značku. V závislosti na typu značky je pak zvolena metoda detekce.
V minulosti byla za použití elektrochemických metod studována interakce avidinu s biotinem
předavším na uhlíkových elektrodách [2-4]. V těchto pracích je interakce detekována za
použití biotinu modifikovaného redox-aktivními značkami. Podle literatury [3, 4] je avidin
pokládán za elektroinaktivní. Existuje pouze jedna práce popisující elektrochemické chování
avidinu a streptavidinu na rtuťových elektrodách [5]. V této práci je signál avidinu přisuzován
redukci S-S vazby.
Zkoumali jsme elektroaktivitu avidinu a streptavidinu na rtuťových a uhlíkových elektrodách.
Zjistili jsme, že oba proteiny poskytují na uhlíkových elektrodách signály odpovídající
oxidaci zbytků tyrosinu a tryptofanu. Na rtuťových elektrodách avidin dává pík redukce
sloučeniny síra-rtuť a dále pak signály katalytického vylučování vodíku tzv. Brdičkovu reakci
a pík H [6]. Streptavidin v důsledku nepřítomnosti síru obsahujících aminokyselin poskytuje
pouze pík H. Dále jsme zjistili, že u avidinu dochází v důsledku jeho vazby k biotinu ke
změnám všech pozorovaných signálů. Byly také zkoumány adsorpčně/desorpční vlastnosti
avidinu a jeho komplexu s biotinem. V důsledku vazby biotinu je míra adsorpce komplexu
avidin-biotin k povrchu elektrody menší než v případě samotného avidinu. Ze získaných
výsledků vyplývá, že elektrochemické metody lze úspěšně použít pro monitorování vazby
biotinu - avidin.
Práce vznikla za podpory grantu KJB4004302 Grantové agentury AVČR.
[1] N.M. Green, in Methods in Enzymology, (Eds.: M. W. E. E. A. Bayer), Academic Press,
London, 1990, 51.
[2] D. Athey, M. Ball, C.J. McNeil, Ann. Clin. Biochem. 1993, 30, 570.
[3] K. Sugawara, S. Tanaka, H. Nakamura, Bioelectrochem. Bioenerg. 1994, 33, 205.
[4] K. Sugawara, Y. Yamauchi, S. Hoshi, K. Akatsuka, F. Yamamoto, S. Tanaka, H.
Nakamura, Bioelectrochem. Bioenerg. 1996, 41, 167.
[5] E. Buckley, J.M.F. Alvarez, M.R. Smyth, R. O'Kennedy, Electroanalysis 1991, 3, 43.
[6] M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta, E. Palecek, Electroanalysis 1998, 10, 403.
8
AROMATÁZA – KLÍČOVÝ ENZYM STEROIDOGENESE
AROMATASE – KEY ENZYME OF STEROIDOGENESIS
1
1
Petr Hodek, 1Tomáš Koblas, 2Pavel Trefil
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40
Prague 2, The Czech Republic, [email protected]
2
BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs, a. s., Pohoří
Chotouň, CZ-254 49 Jílové, The Czech Republic, [email protected]
Cytochrome P450 19, aromatase (CYP19), is an unique enzyme which builds a phenolic ring
A of all estrogens, female sex hormones. This enzyme is present in ovary, placenta, testis,
prostata tissues and in much lower levels in adipose and brain tissue. Since estrogens are
known cell proliferators, they are frequently expressed in tumors of e.g. breast. Moreover,
some metabolites of estrogens (catecholes) are also carcinogens. Inhibition of aromatase is of
a particular interest in prophylaxis and/or treatment of various cancer diseases. The
modulation of CYP19 activity might significantly change the estrone/testosterone ratio and
consequently change the experimental animal sex phenotype. In case of e.g. chicken, female
masculinization, resulting in lowered body fat and increased volume of muscles, might be
important in the respect of the chicken meat production.
Natural plant compounds, flavonoids, are potential CYP19 inhibitors. Hence, synthetic
flavonoids, 7,8-benzoflavone (ANF) and its thio-analogue (SANF), were tested in vivo as
food additive for hatched animals. Resulting changes of CYP expression, steroid hormone
levels, body composition, and chicken behavior were monitored. Application of ANF within
the fattening period of broiler chickens resulted in statistically significant difference (P<0.01)
in the weight of the testis (4.7g) in comparison to controls (1.2g). Moreover, spermatogenesis
started very early (the 10th week) - 4 weeks earlier than in the control group. Ovary of treated
hens was heavier (P<0.05) in comparison to control groups and the beginning of their laying
period was at least one week earlier comparing to the control group.
However, much less is known about their metabolism. In the model microsomal
systém, 5,6-dihydrodiol, 7,8-dihydrodiol and 5,6-epoxid of ANF were determined as the
major ANF metabolites. SANF is not metabolized into any hydroxy-derivatives in the
microsomal system used. This compound is converted to ANF first and then it undergoes its
regular metabolism.
In addition, an administration of ANF or SANF results also in induction of different
CYPs in various organs (liver, column, testis). It is clear that flavonoids might enhance CYPmediated activation of carcinogens and/or metabolism of drugs. Thus, intake of food additives
and herb extracts containing flavonoids has to be considered with caution.
The work was supported by the grant MSM-113100001 from The Czech Ministry of
Education.
9
SECRETED ASPARTIC PROTEINASES OF CANDIDA PARAPSILOSIS:
ACTIVATION AND SPECIFICITY OF TWO ISOENZYMES
SEKRETOVANÉ ASPARTÁTOVÉ PROTEÁZY KVASINKY CANDIDA
PARAPSILOSIS: AKTIVACE A SPECIFITA DVOU ISOENZYMŮ
Jiří Dostál, Michaela Merkerová, Iva Pichová and Olga Hrušková-Heidingsfeldová
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Flemingovo nám.2, Praha 6, 166 10
Candida parapsilosis is an opportunistic pathogen that causes infections in
immunocompromised individuals. The pathogenic Candida species produce secreted aspartic
proteinases (Saps), which play an important role in Candida infectivity. Three genes coding
for Saps have been found in C. parapsilosis so far. Two of them have been studied before (1),
but only the gene product of SAPP1 has been characterized on the enzymological level: the
Sapp1p isoenzyme was isolated from C. parapsilosis culture supernatants and its substrate
specificity was studied (2). However, the mechanism of Sapp1p activation remained unclear.
Controversial results have been published with respect to SAPP2 gene product. SAPP2 was
believed to code for a proteinase that was expressed on a very low level or under not
identified conditions. According to an alternative hypothesis, SAPP2 was considered to be a
pseudogene (1,3,4).
To address these problems, the Sapp1p and Sapp2p precursors were expressed in E. coli,
purified to homogeneity and stored at pH 7.5. The Sapp1p precursor was autocatalytically
processed within 30 minutes following the transfer to acidic pH, yielding an active enzyme.
However, the cleavage occurred one residue downstream from the N-terminus that has been
identified using an authentic Sapp1p (= the proteinase isolated from C. parapsilosis culture
supernatant): D↓SISL... A synthetic peptide derived from the processing site was cleaved by
Sapp1p at both sites: ...KR↓D↓SISL. These data suggest that Sapp1p can be autocatalytically
processed in a pepsinogen-like manner but there may be also another strategy involving a
processing proteinase that recognizes the Arg-Lys sequence.
Autocatalytical processing of Sapp2p precursor in acidic pH proceeded very slowly, up to
three days. The cleavage occurred eight residues upstream from the expected site. Therefore,
precursor cleavage was tested using trypsin that was chosen as a substitute for a serine type
processing proteinase. Trypsin cleaved the Sapp2p precursor at the expected site:
KR↓SSPSS...Proteolytic activity of the protein processed by trypsin was higher than that of
the autocatalytically processed one. The resulting Sapp2p differed substantially from Sapp1p
in the substrate specificity, showing no preference for aromatic residues adjacent to scissile
bonds. Peptide substrates designed for pepsin and were cleaved by Sapp2p at different sites
and on lower rate. Despite of the sequence similarity, the Sapp1p and Sapp2p isoenzymes
differ in the mode of activation and in the substrate specificity.
1.
2.
3.
4.
De Viragh, P.A., et al. (1993) J.Gen.Microbiol. 139, 335-342.
Pichová, I., et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268, 2669-2677.
Fusek, M., et al. (1993) FEBS Lett. 327, 108-112.
Hrušková-Heidingsfeldová, O., et al. (2001) Collect. Czech. Chem. Commun. 66, 17071719.
Supported by IGA MZ NI/6485-3
10
REPARACE PLASMIDOVÉ DNA pUC19 V BUŇKÁCH E. COLI PO PUSOBENÍ
CIS-PLATINY
1
M. Hyršová1, E. Janovská2, V. Brabec2, M. Vojtíšková 2
Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta MU v Brně
2
Biofyzikální ústav AV ČR, 61265 Brno
Úspěšné využití ciplatiny v chemoterapii nádorových onemocnění může být omezeno
vyvolanou nebo vnitřní resistencí buňky. Cytotoxicita cisplatiny se odvíjí od její schopnosti
vytvářet kovalentní DNA adukty , přitom tyto adukty mohou být z DNA odstraněny
především nukleotidovou excisní reparací (NER). NER je tudíž považován za centrálního
hráče v „úspěchu“ cisplatinové cytotoxicity jak v eukaryontních, tak i v prokaryotních
buňkách, kde se zejména reparace účastní komplex uvrABC proteinů. Pro studium
reparačních mechanismů v buňce po působení cisplatiny bylo využito plasmidové DNA
pUC19 transformované do baterie isogenetických kmenů E.coli s normální nebo DNA
defektní reparační kapacitou, jednoduchých uvr A a dvojitých mutant uvrA, recA kmene
WP2 . Transformované kmeny WP2 (wt) a WP2 (uvrA) nesoucí plasmid pUC19 vykazovaly
podstatně výšší
citlivost vůči působení 10um cisplatiny (20 hod, 37o C) ve srovnání
s původními kmeny. U vzorků plasmidové DNA pUC19 izolovaných z isogenetických
kmenů E. coli po modifikaci cisplatinou za podmínek in situ a in vivo nebyla prokázána
inhibice štěpení BamHI, svědčící o přítomnosti intrařetězového GG aduktu platiny v této
sekvenci, na rozdíl od modifikované DNA pUC19 in vitro. Další typ cisplatinového aduktu,
vytvoření meziřetězové příčné vazby (ICL) na DNA , byl prokázán denaturační alkalickou
agarózovou elektoroforézou a to na modifikovaných vzorcích DNA pUC19 za rozdílných
podmínek, což s velkou pravděpodobností svědčí o obtížnosti odstranění ICL lézí pro
buněčné reparační systémy.
HYBRIDNÍ MOLEKULY KOLICINŮ U/Y A JEJICH INTERAKCE S IMUNITNÍM
PROTEINEM
HYBRID COLICINS U/Y AND THEIR INTERACTION WITH COGNATE
IMMUNITY PROTEINS
Magda Janalíková, David Šmajs
Biologický ústav LF MU, Joštova 10, 662 43 Brno
Přes sekvenční podobnost kolicinů U a Y nejsou producenti kolicinů U a Y zkříženě imunní.
Pro studium protein-proteinových interakcí mezi kolicinem a jeho imunitním proteinem jsme
zkonstruovali sedm hybridních genů pro kolicin U/Y. Plazmidy nesoucí tyto geny byly
transformovány do E. coli a z těchto buněk byly následně izolovány hybridní koliciny.
Zkoumali jsme jejich letální účinek na buňky transformované plazmidem nesoucí gen pro
imunitní protein kolicinu U a kolicinu Y. Buňky bez imunitního proteinu sloužily jako
kontrola. Zjistili jsme, že aminokyselinové zbytky kolicinů U a Y, důležité pro interakci s
jejich imunitními proteiny, jsou rozdílné. Pro interakci kolicinu U s jeho imunitním proteinem
je klíčový aminokyselinový zbytek G580. Navíc v rekognici imunitního proteinu kolicinem U
hraje významnou roli aminokyselinový zbytek F576. Třetí interakční místo je distálně od SpeI
místa kolicinového genu (v 34 aminokyselinách na C-konci - z nichž je u kolicinu U a Y 12
rozdílných). Oproti tomu u kolicinu Y jsou pro tutéž interakci významné aminokyselinové
zbytky V590 a Y586. Menší význam pro interakci kolicinu Y s imunitním proteinem má také
11
aminokyselinový zbytek A594 a/nebo A595. I zde se předpokládá vliv interakčního místa v
C-terminálních 34 aminokyselinách.
CENTRÁLNÍ LABORATOŘ SPECIÁLNÍCH TECHNIK
NA MASARYKOVĚ UNIVERZITĚ
CORE FACILITY AT MASARYK UNIVERSITY
Hana Konečná, Eliška Nejedlá, Eva Paděrová, Zbyněk Zdráhal, Břetislav Brzobohatý
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta,
Laboratoř funkční genomiky a proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Laboratoř funkční genomiky a proteomiky (FGP) je jednou ze čtyř základních složek celku
ILBIT (Integrované laboratoře biomedicínských technologií), v němž má být současně
s vlastním výzkumným programem soustředěna špičková instrumentace a kvalifikovaný
servis zajišťující práce na dalších vědeckých projektech MU a spolupracujících institucích
v rámci budovaného univerzitního kampusu v Brně-Bohunicích. Univerzita tak vytváří
intelektuální a technickou infrastrukturu nezbytnou k řešení komplexních výzkumných
projektů.
Myšlenka vytvoření pracoviště typu core facility, které zprostředkovává akademické
komunitě přístup k pokročilým technologiím prostřednictvím sdílení finančně náročné
instrumentace a její kvalifikované obsluhy, je na MU systematicky rozvíjena od roku 1996,
kdy v rámci Laboratoře molekulární fyziologie rostlin vznikla Centrální laboratoř speciálních
technik molekulární biologie (CL).
V současné době poskytuje CL na objednávku syntézu a purifikaci oligonukleotidů a rovněž
kompletní konzultační činnost spojenou s navrhováním, purifikací a použitím
oligonukleotidů. Na genetických analyzátorech provádí sekvenování DNA, analýzu
fragmentů DNA a zajišťuje interpretaci sekvencí. Disponuje separačními technikami, jako je
vysokotlaká, nízkotlaká a perfúzní chromatografie a jednorozměrná a dvourozměrná gelová
elektroforéza. FGP personálně zajišťuje chod Laboratoře hmotnostní spektrometrie
biomolekul (LMSB), která je součástí Laboratoře pro analýzu proteomu, a je vybavena LCMS a MALDI-TOF MS instrumentací. Hlavním předmětem činnosti LMSB je analýza a
identifikace proteinů.
Jedním z hlavních poslání CL je poskytovat pomoc při zavádění nových experimentálních
přístupů (semináře, exkurze, praktická cvičení, konzultace). CL umožňuje diplomantům a
studentům doktorského studia proniknout do hloubky studované problematiky s využitím
pokročilé instrumentace a pod vedením zkušených specialistů. V rámci výuky předmětů Kurs
základů genomiky a Kurs základů proteomiky, které jsou nabízeny studentům magisterského
a doktorského studia Laboratoří funkční genomiky a proteomiky, CL zpřístupňuje studentům
špičkovou instrumentaci v oblasti genomiky a proteomiky. Všechny detailní informace obdrží
zájemci na http://www.sci.muni.cz/LMFR/.
Centrální laboratoř je řádným členem Association of Biomolecular Resource Facilities
(ABRF), mezinárodní organizace sdružující obdobná univerzitní pracoviště.
CL byla vybavena z prostředků MŠMT Posílení výzkumu na vysokých školách (projekt
VS96096). LMSB byla vybavena z prostředků Přírodovědecké fakulty MU (FRIM) a
prostředky na další dovybavení byly získány z FRVŠ 796/2003 a MSM 143100005. Obě
laboratoře jsou podporovány z grantového projektu MSM 143100008.
12
ROZDÍLY GENOMŮ BLÍZCE PŘÍBUZNÝCH TREPONEM A JEJICH SPECIFICKÁ
DETEKCE
GENOME DIFFERENCES OF CLOSELY RELATED TREPONEMES AND THEIR
SPECIFIC DETECTION
Petra Matějková1, David Šmajs1, Steven J. Norris2 a George M. Weinstock3
Biologický ústav LF MU v Brně, Joštova 10, Brno 662 43, Česká republika
2
Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas, Houston Medical
School, 6431 Fannin Street, Houston TX 77030, USA
3
Human Genome Sequencing Centre, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Alkek
N1519, Houston, TX 77030, USA
1
Druh Treponema pallidum zahrnuje 3 pro člověka patogenní poddruhy. Tyto poddruhy –
pallidum, pertenue a endemicum - způsobují přes velice blízkou sekvenční příbuznost
onemocnění s odlišnou klinickou manifestací. Jedná se o syfilis, yaws a endemickou syfilis.
V současnosti používaná serologická diagnostika nedokáže zachytit časná stadia treponemální
infekce ani odlišit jednotlivá treponemální onemocnění navzájem. Předpokládaná vysoká
sekvenční příbuznost genomů patogenních poddruhů T. pallidum je přitom předurčuje
ke komparativním genomickým studiím k indentifikaci kontrétních sekvenčních rozdílů. Těch
lze využít pro specifickou diagnostiku jednotlivých treponemálních patogenů a zvýšení
diagnostické citlivosti.
Technikou DNA microarray hybridizací nebyly identifikovány výrazné rozdíly v genomové
struktuře poddruhů pallidum a pertenue (kmenů Gauthier, Samoan D a CDC-2).
Verifikačními sekvenacemi byly odhaleny výhradně jednonukleotidové záměny. Nalezli jsme
celkem 19 jednonukleotidových polymorfismů (SNP), z nichž 12 znamená záměnu
aminokyseliny v polypeptidovém řetězci treponemálních proteinů. Charakteristické rozložení
jednonukleotidových záměn mezi kmeny poddruhu pertenue umožnilo navržení specifické
diagnostiky. Tato diagnostika je založena na PCR amplifikaci, jejíž diferenciační podmínkou
je přítomnost komplementárního nukleotidu na 3´-konci amplifikačního primeru. V současné
době je k dispozici protokol k detekci SNP319-241 (záměna adeninu za cytosin v pozici 241
genu kódujícího domnělý membránový lipoprotein TmpC, TP0319) odlišující kmen
T. pallidum subsp. pallidum Nichols od kmenů poddruhu pertenue. Mezi kmeny poddruhu
pertenue lze odlišit kmen CDC-2 detekcí SNP806-578 specifickou pro tento kmen; kmen
Gauthier lze od ostatních odlišit detekcí SNP319-396. Tyto diagnostické postupy budou
testovány na souboru seropozitivních syfilitických ser a bude stanovena jejich reálná
diagnostická účinnost.
Podporováno grantem IGA MZ ČR č. NF NI/7351-3.
VYUŽITÍ MACROARRAY PRO STUDIUM MUTOVANÉHO PROTEINU P53
Petr Müller1, Roman Hrstka1, Miroslav Strnad2, Bořivoj Vojtěšek 1
1
Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, Brno 65653
2
Laboratoř růstových regulátoru, PřF UP, Šlechtitelů 11, Olomouc 783 71
Protein p53 je nádorový supresor fungující jako transkripční faktor. Při genotoxickým
stresu dochází v buňce k jeho aktivaci, váže se na DNA a spouští transkripci genů
13
zodpovědných za zástavu buněčného cyklu i apoptozu. Inaktivace p53 bodovou mutací se tak
stává zásadním krokem při maligní transformaci buňky. Velké procento bodových mutací v
DNA vazebné doméně p53 vede k nestabilitě konformace proteinu. Tyto mutace jsou často
teplotně senzitivní a stávají se tak vhodným cílem pro terapii založené na jejich reaktivaci.
V předchozích pracích jsme prokázali teplotně senzitivní charakter mutovaného proteinu
p53 285Lys v buňkách nádorové linie karcinomu prsu BT474. Prokázali jsme změnu
konformace mutanta při přechodu do 32°C a obnovení jeho DNA vazebné schopnosti.
Rovněž jsme potvrdili obnovení exprese p53-regulovaných proteinů p21 a MDM2, která byla
dále zvýšena při použití Cdk inhibitoru Roscovitinu. Cílem této práce bylo zjistit, zda
reaktivace mutovaného p53 285Lys vede k obnovení transaktivace na všech promotorech
genů regulovaných pomocí p53. Pro tento experiment byla vybrána macroarray analyzující
hladinu mRNA genů, které buď regulují aktivitu p53 (upstream) a nebo jsou pomocí p53
exprimovány (dowstream).
Nádorová linie BT474 byla vystavena jednak teplotě 37°C (kontrola) , nebo 24 hodin
teplotě 32°C. Současně byly buňky ovlivněny 20uM Roscovitinem silně stabilizujícím
hladinu p53 v buňce. Z výsledků vyplývá, že mutovaný protein p53 reaktivovaný při teplotě
32°C a stabilizovaný pomocí Cdk inhibitoru Roscovitinu je schopný mnohonásobně zvýšit
expresi proteinů vedoucích k zástavě buněčného cyklu či k reparaci DNA. Reaktivace však
nevedla k dostatečnému zvýšení genů regulujících apoptózu.
Pomocí této metody byla rovněž detekována nepřiměřeně vysoká exprese silně
proapoptotického genu PUMA. Exprese tohoto genu v našem experimentu nevykazovala
závislost na reaktivaci mutovaného p53 a proto může tento výsledek vést k podezření na
defekt v tomto genu ve smyslu delece, translokace mutace apod.
Tato práce byla podporována granty: GA-ČR 301/02/0831, MŠM 153100008 a
VZMZ 00020980501
METABOLISM OF IODINE IN THE RAT IS MARKEDLY AFFECTED
BY HIGH BROMIDE INTAKE
Stanislav Pavelka
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 611 37 Brno and
Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, 142 20 Prague 4
Goitrogenic effects of excessive bromide in adult male and female rats are
summarized. In addition to the effects on the rat thyroid, we also survey interferences of
exogenous bromide with the whole-body metabolism of iodine, as documented in a series of
our recent papers [1-9]. We suggest that high levels of bromide in the organism of
experimental animals can influence their iodine metabolism in two parallel ways: by a
decrease in iodide accumulation in the thyroid, and by a rise in iodide excretion by kidneys.
By accelerating the renal excretion of iodide, excessive bromide can also influence the pool of
exchangeable iodide in the thyroid.
Moreover, our recent results concerning the influence of high bromide intake in the
lactating rat dam on iodine and bromide transfer to the sucklings, and the impact of seriously
decreased iodine content and increased bromide concentration in mother’s milk on the young,
are discussed. We must state, however, that the virtue of the toxic effects of excessive
bromide on the thyroid gland and its interference with the biosynthesis of thyroid hormones,
as well as the exact mechanism of bromide interference with postnatal developmental
processes have not been so far elucidated.
14
References
[1] Pavelka S. (2004) In: Elements and Their Compounds in the Environment. Occurence, Analysis
and Biological Relevance, 2nd ed. (Merian E. et al., eds.). Wiley-VCH Verlag, Weinheim, Vol. 3,
Part IV, pp.
[2] Pavelka S. (2004) Physiol. Res., submitted.
[3] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J., Švandová E. (2000a) Biol. Trace Elem. Res. 76,
57-66.
[4] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2000b) Biol. Trace Elem. Res. 76, 67-74.
[5] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2001a) Biol. Trace Elem. Res. 82, 125-132.
[6] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2001b) Biol. Trace Elem. Res. 82, 133-142.
[7] Pavelka S., Babický A., Lener J., Vobecký M. (2002) Food Chem. Toxicol. 40, 1041-1045.
[8] Vobecký M., Babický A., Pavelka S., Lener J. (2000) J. Trace Microprobe Tech. 18, 467-473.
[9] Vobecký M., Babický A., Pavelka S. (2003) Food Chem. Toxicol., submitted.
VYUŽITÍ siRNA A MICROARRAYS V ONKOLOGII
APPLICATION OF siRNA AND MICROARRAY TECHNOLOGIES
IN CANCER RESEARCH
Šárka Pospíšilová, Boris Tichý, Soňa Štruncová, Romana Borská a Jiří Mayer
Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika, FN Brno,
Černopolní 9, 625 00 Brno
Nové možnosti onkologické diagnostiky a protinádorové terapie jsou stále více
spojovány s rozvojem molekulárně biologických technologií. V poslední době se v řadě
oblastí onkologického výzkumu začínají uplatňovat DNA čipy (microarrays), které umožní
detailní charakterizaci nádorové tkáně z hlediska míry genové exprese a porovnání
nádorového expresního profilu s tkání zdravou. Významným pomocníkem při studiu funkce
jednotlivých genů hrajících významnou úlohu při maligní transformaci buňky a jejich vlivu na
regulaci buněčného cyklu je využití jevu RNA interference. RNAi zprostředkovaná
dvouřetězcovými molekulami RNA byla popsána jako mechanismus ochrany buňky před
buněčnými parazity a jako mechanismus post-transkripčního utlumování genové exprese
(gene silencing). siRNA (small interfering RNA), vznikající z dlouhých dsRNA molekul
působením enzymu DICER, se stávají součástí komplexu RISC (RNA-induced silencing
complex), který s vysokou specificitou váže cílové komplementární mRNA. Striktního
požadavku na komplementaritu lze úspěšně využívat k rozpoznání a odlišení mutantních nebo
chimerních mRNA molekul a specificky je inaktivovat. siRNA molekuly tak mohou být
cíleny proti nejčastějším genetickým změnám navozujícím maligní transformaci buněk jako
jsou genové přestavby v důsledku chromozomálních translokací (především u leukémií,
lymfomů a sarkomů – např. EWS-FLI1 u Ewingova sarcomu), ale také mohou utlumit
nežádoucí expresi genů podporujících progresi buněčného cyklu - např. anti-apoptotických
faktorů nebo mutatních forem antionkogenu p53. Protein p53, který je mutován ve více než
50% lidských nádorových buněk, ztrácí mutacemi nebo nesprávnými post-translačními
modifikacemi schopnost podílet se na regulaci buněčného cyklu a aktivovat apoptotické
dráhy, a proto se utlumení exprese nefunkčního proteinu p53 a jeho substituce wt-p53 jeví
jako progresívní protinádorová terapie.
Práce byla podporována grantem MŠMT 1K04017C a výzkumným záměrem MZ 00065 26 97
05.
15
POUŽITÍ RAPD TYPIZACE PRO IDENTIFIKACI LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP.
LACTIS A SUBSP. CREMORIS
USING OF RAPD FINGERPRINTING FOR IDENTIFICATION OF LACTOCOCCUS
LACTIS SUBSP. LACTIS AND SUBSP. CREMORIS
Jana Prodělalová, Bohuslav Rittich
Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Tvrdého 14, 602 00,
Brno, Česká republika
Bakterie rodu Lactococcus patří mezi nejvýznamnější zástupce skupiny bakterií mléčného
kvašení. Při výrobě fermentovaných mléčných výrobků se jako startovací kultury používají
dva poddruhy Lactococcus lactis, lactis a cremoris. Vzhledem k jejich odlišným
technologickým vlastnostem je nezbytné od sebe oba poddruhy odlišit. Tradičně jsou pro
odlišení L. lactis subsp. lactis a subsp. cremoris používány růstové a biochemické
charakteristiky, jako je růst při odlišných teplotách, tolerance ke zvýšeným koncentracím
chloridu sodného a schopnost hydrolyzovat arginin. Tento způsob identifikace je časově
náročný a nemusí být zcela spolehlivý. Proto se používají různé rychlejší a vhodnější
molekulární metody. Cílem práce bylo použít metodu RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) pro typizaci souboru kmenů L. lactis. Pro typizaci byla použita sada
sedmi RAPD primerů. Kmeny byly analyzovány také pomocí PCR s druhově a poddruhově
specifickými primery. Na základě hodnocení vzniklých RAPD profilů byly kmeny rozděleny
do dvou skupin. První skupina byla vytvořena kmeny zařazenými na základě amplifikace
s druhově a poddruhově specifickými primery zařazeny do poddruhu L. lactis subsp. lactis.
Druhá skupina byla vytvořena kmeny zařazenými na základě PCR s druhově a poddruhově
specifickými primery do poddruhu L. lactis subsp. cremoris.
Práce byla podporována grantem FRVŠ 552/2003
BAKTERIOFÁGY DRUHU CITROBACTER YOUNGAE
BACTERIOPHAGES OF CITROBACTER YOUNGAE
Slováčková Hana
Biologický ústav LF MU, Joštova 10, Brno 602 00
Metodou křížového vpichového pokusu bylo v souboru 55 testovaných kmenů Citrobacter
youngae nalezeno 10 lyzogenních kmenů tohoto druhu. Současně bylo vybráno 5 kmenů
citlivých k produkovaným mírným bakteriofágům. Příslušné fágy byly po izolaci
z produkčních kmenů pomnožovány metodami odpichu z izolovaných plaků a vymýváním
z plaků. Jako kontrola byl přiřazen dobře prostudovaný fág λ druhu Escherichia coli (citlivý
kmen K12).
Cílem práce je charakterizace izolovaných mírných bakteriofágů druhu Citrobacter youngae,
a to na základě morfologie jejich plaků, spektra aktivity, schopnosti indukce (chemické i
fyzikální) a morfologie fágových částic.
Spektrum aktivity fágů bylo testováno na souboru 25 vybraných indikátorových kmenů
gramnegativních druhů Citrobacter youngae (10), Kluyvera ascorbata (1),
Leclercia adecarboxylata (2), Escherichia coli (5), Escherichia fergusonii (1), Escherichia
hermanii (1), Providencia rettgeri (1), Shigella sonnei (3) a Shigella flexneri (1). Izolované
bakteriofágy jsou aktivní vždy jen v rámci svého druhu. Morfologie plaků je většinou
16
charakterizována velmi drobnými rozměry (0,2–1,9 mm). Všechny izolované fágy tvoří
matné plaky, některé jsou až nevýrazné, jiné pak nápadně drobné (tečkovité). Nevyskytuje se
kolem nich lytické halo. Určité citrobakterové fágy, lyzující stejné citlivé kmeny, vytvářejí
plaky podobné až shodné. Ostatní fágy vykazují významnou rozdílnost v morfologii plaků.
Zda jsou bakteriofágy s podobnou morfologií plaků totožné, bylo zjišťováno testováním
všech bakteriofágů na necitlivých (specificky imunních) indikátorových kmenech a následně
porovnáváno s hostitelským spektrem příslušných fágů. Tímto postupem byla nalezena
shodnost bakteriofágů ve dvou dvojicích 6/12 a 11/12 a také 18/26 a 19/26. Chemická
indukce mitomycinem C a fyzikální indukce UV zářením vedla ke zvýšení produkce fágů o
jeden až dva řády (oproti neindukované kontrole) u šesti z celého souboru. Další
charakterizace izolovaných fágů byla provedena pomocí elektronové mikroskopie, která
ukázala lambdoidní charakter citrobakterových fágů. Všechny bakteriofágy tedy mají
ikozaedrické hlavičky a dlouhé kontraktilní bičíky podobné fágu λ. Navíc ve vzorcích
určitých fágů (18/26,19/26) se často vyskytovaly struktury podobné fágovým bičíkům a ve
třech dalších vzorcích (12/29,31/47,54/39) se nalézaly polymery bakteriocinů. V další práci
bude zkoumána ještě imunologická podobnost těchto fágů s fágem λ.
INTERAKCE KOLICINŮ U A Y S REKOMBINANTNÍMI IMUNITNÍMI PROTEINY
INTERACTION OF COLICINS U AND Y WITH RECOMBINANT IMMUNITY
PROTEINS
D. Šmajs, P. Matějková
Biologický ústav LF MU, Joštova 10, 662 43 Brno
Pro identifikaci aminokyselinových zbytků imunitního proteinu kolicinu U a Y interagujících
s kolicinem U a Y byly použity dvě základní techniky. První z nich spočívala v konstrukci
hybridních proteinů mezi imunitními proteiny kolicinů U a Y a druhý přístup spočíval
v cílené mutagenezi genu pro imunitní protein kolicinu U tak, aby změny v aminokyselinové
sekvenci odpovídaly sekvenci imunitního proteinu kolicinu Y. Bylo připraveno 16 odlišných
hybridních genů pro imunitní protein a 29 konstruktů zahrnujících záměnu 44 odlišných
aminokyselinových zbytků (z celkového počtu 54 odlišných). U těchto konstruktů byla
testována imunita ke kolicinům U, Y, A, B a N. Imunitní protein kolicinu U je zcela
specifický pro kolicin U a nepřináší imunitu proti žádnému jinému testovanému kolicinu.
Oproti tomu imunitní protein kolicinu Y přináší jak specifickou imunitu proti kolicinu Y
(i když ne tak výraznou jako imunitní protein kolicinu U ke kolicinu U), tak částečnou
imunitu ke kolicinu U a A (nikoliv však k sekvenčně příbuzným kolicinům B a N).
Aminokyseliny významné pro imunitu ke kolicinu U jsou lokalizovány mezi zbytky 13 - 19
imunitního proteinu. Tyto aminokyseliny jsou lokalizovány v 1. transmembránovém úseku
imunitního proteinu. Další interakční místo se předpokládá ve druhém a čtvrtém
transmembránovém úseku. U imunitního proteinu kolicinu Y je pravděpodobné, že interakční
místo s kolicinem Y tvoří aminokyselinové zbytky druhého a čtvrtého transmembránového
úseku, které navzájem spolupracují a kódují imunitu ke kolicinu Y jen tehdy, jsou-li přítomny
současně.
17
STUDY ON MECHANISM OF ACTION OF A CHEMOTHEPEUTIC ELLIPTICINE
AS A MEAN TO DEVELOPE ANTICANCER DRUGS OF NEW GENERATIONS
Marie Stiborová1, Eva Frei2
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2
2
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
1
Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic and anti-HIV activities. This
agent and some its derivatives are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have
multiple cellular targets. Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation
into DNA, was hitherto considered the most important property for its cytotoxicity. Recently,
we found that ellipticine also acts as alkylation (arylation) agents, covalently binding to DNA
in vitro and in vivo. The formation of the major DNA adduct is dependent on the activation of
ellipticine by cytochrome P450 (CYP) and peroxidases [1-3]. The most potent activating
human enzyme is CYP3A4, followed by CYP1A1 and CYP1A2 [1-3].
Here we show that ellipticine-DNA adducts are also formed in target tumor tissue, namely,
in breast tumors of rats treated with ellipticine. The levels of DNA adducts are higher in
tumor tissue than in healthy breast cells. In addition, we found that these adducts are
generated in human cancer cells in culture. Ellipticine cytotoxicity against human breast
adenocarcinoma MCF-7 cells, human leukemia HL-60 and CCRF-CEM cells is correlated
with formation of ellipticine-derived DNA adducts.
In order to elucidate the mechanisms of ellipticine-DNA adduct formation, we focused on
identification of the target deoxynucleotides in DNA for ellipticine binding and on the
cytochrome P450- and peroxidase-mediated metabolism of this drug. We identified
deoxyguanosine as the target for ellipticine binding to DNA after its activation of CYPs and
peroxidases. Peroxidases (lactoperoxidase and myeloperoxidase expressed in target tumor
tissues) oxidize ellipticine to dimer and N(2)-oxide of ellipticine as major and minor
metabolites, respectively. Five ellipticine metabolites containing an oxygen atom in their
molecules (M1-M5) are generated by CYPs; two of them were identified to be 9-hydroxyand 7-hydroxyellipticines. The metabolites M3 and M5 were identified to be 5hydroxyellipticine and N(2)-oxide of ellipticine, respectively, while the structure of
metabolite M2 has not yet been exactly characterized. 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of
ellipticine are metabolites responsible for formation of two major ellipticine-derived adducts
generated on deoxyguanosine in DNA. The reaction mechanism of their formation is
proposed.
Activation of ellipticine to a DNA binding species by CYPs and peroxidases is an
interesting finding in view of the compound’s activity against breast cancer and leukemia.
The results obtained in this study might, moreover, be employed for development of new
drugs suitable for gene therapy and tumor targeting.
References
1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675 (2001).
2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.: Chem.
Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003).
3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: Int. J.
Cancer, 107, 885-890 (2003).
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of
Education of the Czech Republic (grant MSM 113 00001).
18
PROTEIN C-JUN INDUKUJE EXPRESI CYKLINU A V MONOBLASTECH BM2
C-JUN PROTEIN INDUCES EXPRESSION OF CYCLIN A IN BM2 MONOBLASTS
Petr Vaňhara1,2, Vítězslav Bryja2, Sabina Ševčíková1, Jan Šmarda1
1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno, 2 Centrum buněčné terapie, Karlova univerzita, Praha a
Oddělení molekulární embryologie, ÚEM AV ČR, 613 00 Brno
Aktivační protein 1 (AP-1) je transkripční faktor, který jako součást buněčných signálních
drah, zprostředkovává odpověď buňky na mimobuněčné podněty ovlivněním exprese
cílových genů. AP-1 i jeho jednotlivé složky jsou účinnými regulátory proliferace různých
buněčných typů, ale přesný vztah mezi AP-1 a vlastními regulátory buněčného cyklu není
dosud plně objasněn. Jedním z proteinů, který se podílí na sestavení AP-1 je transkripční
faktor Jun, jehož přirozená buněčná forma c-Jun i zkrácená virová forma v-Jun zpomaluje
proliferaci monoblastů transformovaných onkogenem v-myb viru ptačí myeloblastózy (BM2).
Pro objasnění protirůstového účinku proteinů Jun jsme sledovali změny exprese a/nebo
aktivity některých klíčových regulátorů cyklu (cyklin-dependentních kináz CDK2, CDK4,
CDK6 a cyklinů D1, D2, A, E) v buňkách BM2 inducibilně exprimujících geny v-jun a c-jun
a to jak v podmínkách sérové deprivace (LS), tak v podmínkách plné saturace růstovými
faktory (NS). Prokázali jsme, že s výjimkou genu CDK2, který se exprimuje v nezměněné
míře v podmínkách LS i NS, je exprese ostatních regulátorů zřetelně snížena v podmínkách
LS. Srovnávací analýzou parentální linie BM2 s jejími deriváty BM2cJUN a BM2vJUN, které
proteiny Jun syntetizují v závislosti na přítomnosti induktoru (ZnCl2) bylo zjištěno, že
indukce exprese c-jun a v menší míře také v-jun v buňkách BM2cJUN, resp. BM2vJUN
stimuluje expresi cyklinu A. Uvedený jev byl patrný v podmínkách NS i LS. Exprese cyklinů
D1, D2, E, stejně jako kináz CDK2, CDK4 a CDK6, vyšší buněčnou hladinou proteinů Jun
ovlivněna nebyla. Abychom otestovali, zda se vyšší hladina cyklinu A v buňkách BM2vJUN
a BM2cJUN projeví také změnou aktivity příslušné CDK, srovnali jsme aktivitu CDK2
v buňkách BM2vJUN, resp. BM2cJUN, s aktivitou CDK2 nalezenou v kontrolní linii BM2.
Ve srovnání s podmínkami NS, došlo v podmínkách sérové deprivace k snížení aktivity
CDK2 v liniích BM2 a BM2vJUN. V linii BM2cJUN kultivovaných v podmínkách LS a NS
nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v aktivitách CDK2. Také při srovnání aktivity
CDK2 v buňkách BM2, BM2vJUN a BM2cJUN v podmínkách NS nebyly zaznamenány
statisticky významné rozdíly. Naopak v podmínkách sérové deprivace je patrný trend zvýšené
aktivity CDK2 v linii exprimující c-jun, který není patrný u linií BM2 a BM2vJUN. Z těchto
výsledků vyplývá, že mechanismus, kterým protein c-Jun inhibuje růstu monoblastů BM2,
patrně spočívá v posílení exprese cyklinu A a nadměrné aktivaci CDK2.
Tato práce byla podporována výzkumným záměrem MSM143100008 Ministerstva školství
mládeže a tělovýchovy ČR.
19
STRUKTURNÍ A TERMODYNAMICKÁ CHARAKTERIZACE INTERAKCÍ MEZI
PA-IIL LEKTINEM BAKTERIE PSEUDOMONAS AERUGINOSA A
POVRCHOVÝMI OLIGOSACHARIDY NA POVRCHU BUNĚK
Michaela Wimmerová1, Charles Sabin2, Edvard P. Mitchell3, Martina Budová1, Catherine
Gautier2 and Anne Imberty2
1
Department of Biochemistry and National Centre for Biomolecular Research, Masaryk
University, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Czech Republic, 2CERMAV-CNRS, BP 53, 38041
Grenoble, France 3ESRF- Experiments Division, BP 200, F-38043 Grenoble, France
Chronická kolonizace plic oportunistickým patogenem Pseudomonas aeruginosa je hlavní
příčinou vysoké mortality a morbidity pacientů s cystickou fibrosou. Mutace v genu
kodujícímu CTFR protein (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) je příčinou
pozměněného transportu iontů, jež ovlivňuje mnohé tělesné orgány především však plíce,
střeva, játra a pankreas. Toto vrozené onemocnění vede mimo jiné k pozměněné glykosylaci
glykokonjugátů povrchových epitelií a slinných a plicních mucinů. U pacientů s cystickou
fibrosou bylo prokázáno zvýšené množství fukosylovaných oligosacharidů Lewis typu, často
doprovázané zvýšenou sialylací a/nebo sulfatací.
P. aeruginosa produkuje dva lektiny úzce spojené s jeho virulencí: PA-IL, jež specificky
rozpoznává D-galaktosu, a PA-IIL, vážícího L-fukosu.
PA-IIL lektin je charakterizován vysokou afinitou k fukose s asociační konstantou Ka =
0.3 x 106 M-1, jež je neobvyklá pro interakce lektinů s monosacharidy. Tato afinita je dána
zapojením dvou vápenatých iontů do interakce se sacharidem, jež je unikátní mezi známými
lektiny [1]. Detailní pohled do vazebného místa PA-IIL umožnil vymezit tři hydroxylové
skupiny sacharidu podílejících se na přímé interakci s vápenatými ionty. Na tomto základě
byla provedena strukturní a termodynamická charakterizace interakce PA-IIL s dalšími
stereochemicky příbuznými monosacharidy.
Další kroky jsou zaměřeny na stadium biologicky zajímavých oligosacharidů, především
antigenních determinant serie Lewis. Molekulární dokování Lewis a a Lexis X trisacharidů do
vazebného místa PA-IIL objasnilo preferenci lektinu k oligosacharidům Lewis X typu. Lepší
porozumění těchto interakcí může být základem navrhování specifických ligandů jako
základu protibakteriálních antiadhezivních terapeutik.
[1] E. Mitchell, C. Houles, D. Sudakevitz, M. Wimmerová, C. Gautier, S. Pérez, A.M. Wu, N.
Gilboa-Garber & A. Imberty (2002) Structural basis for oligosaccharide-mediated adhesion
of Pseudomonas aeruginosa in the lungs of cystic fibrosis patients. Nature Struct. Biol. 9,
918-921.
Práce byla podporována grantovým projektem MŠM 14310005.
20
LC-MS A CE V PRAKTICKÉ VÝUCE ANALÝZY PROTEOMU NA MU.
Zbyněk Zdráhal1, Jan Preisler2, Hana Konečná1, Eva Táborská3, Michaela Wimmerová4,
Zdenek Glatz4, Josef Havel2 a Břetislav Brzobohatý1
1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a
proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie,
Kotlářská 2, 611 37 Brno
3
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Kotlářská 2, 611
37 Brno
4
Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta, Biochemický ústav, Kotlářská 2,
611 37 Brno
Analýza proteomu je dalším postupným krokem k dokonalému pochopení procesů v
buňce. Identifikace proteinů a sledování jejich expresních profilů za daných podmínek
umožňuje určit jejich roli v jednotlivých buněčných procesech. Porozumění dynamiky
proteomu představuje jeden z důležitých předpokladů pro řešení problémů základního
výzkumu, tak pro rozvoj medicínských a biotechnologických aplikací. Z tohoto důvodu se
stává proteomika, disciplína zabývající se analýzou proteomu, nedílnou součástí výuky na
vysokých školách zaměřených na biologické,chemické, biotechnologické a biomedicínské
obory.
V loňském roce byla stávající proteomická instrumentace (1) doplněna díky grantové
podpoře MŠMT. Byl dovybaven LC/MS systém a pořízena instrumentace pro kapilární
zónovou elektroforézu. Zatímco kapalinová chromatografie na reversní fázi ve spojení on-line
s hmotnostní spektrometrií LC-MS, resp. LC-MSMS je jedním ze základních nástrojů pro
analýzu peptidů, identifikaci proteinů a studium jejich post-translačních modifikací, CZE je
díky svému odlišnému separačnímu principu perspektivní alternativní separační technikou pro
peptidy resp. proteiny vhodnou také pro on-line spojení s MS.
V současné době je tato instrumentace společně se stávající instrumentací zařazena do
praktické výuky studentů PřF a LF v těchto předmětech: PřF - Kurz základů proteomiky
(Bi8202), Metody separace proteinů (C6270), Klinická biochemie-cvičení (C6230), Speciální
metody–laboratorní cvičení (C8102) a LF - Klinická biochemie-cvičení (VLKB091).
(1) www.sci.muni.cz/proteom
Instrumentace byla pořízena z dotace MŠMT a z projektu FRVŠ 796/2003.
Práce byla podporována grantovým projektem MŠM 143100008.
21
SEKCE MLADÝCH
STRUCTURAL STUDIES OF THE 12 kDa FORM OF PROTEASE FROM MASONPFIZER MONKEY VIRUS
Bauerová H.1, Veverka V.2, Zábranský A.1, Lang J.2, Ruml T.2, Hrabal R.2, and Pichová I.1
1
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech
Republic, Prague
2
NMR Laboratory, Institute of Chemical Technology in Prague
In Mason-Pfizer monkey virus the assembly of immature capsids and the cleavage of
polyprotein precursors are temporary and spatially separated processes making the virus an
attractive model for investigation of protease activation. Here we present high resolution
NMR structure of fully folded monomer of 12 kDa M-PMV protease (PR). The overall
structures of both wt PR and the Cys mutant follow the conservative structural motif of other
retroviral proteases. The most prominent difference from the canonical fold of retroviral
proteases is a lack of interfacial β-sheet, which leads to the loss of the principal force
stabilizing the dimer of M-PMV PR. The equilibrium monomer-dimer can be shifted back in
favor of the dimer by adding a substrate or an inhibitor partially compensating for the missing
role of the β-sheet. We also show that cysteines C7 and C106 play a crucial role in stabilizing
dimers and consequently in dramatic increasing of proteolytic activity of M-PMV PR
suggesting that reversible oxidative modification of cysteines within Gag polyproteins tightly
regulates maturation of M-PMV assembled immature capsids.
DEVELOPMENT OF LATERAL FLOW IMMUNOASSAYS FOR GENERAL AND
SPECIFIC DETECTION OF LISTERIA SPP. AND LISTERIA MONOCYTOGENES
VÝVOJ LATERAL FLOW IMMUNOASSAYS PRO DETEKCI RODU LISTERIA A
SPECIFICKOU DETEKCI LISTERIA MONOCYTOGENES
1
Martina Blažková 1 , Pavel Rauch 1 , Jan H. Wichers 2 and Aart van Amerongen 2
:Department of Biochemistry and Microbiology, Institute of Chemical Technology,
Technická 5, 16628 Praha, Czech Republic
2
:Agrotechnology and Food Innovations (A&F), Wageningen University and
Research Centre, P.O. Box 59, 6700 AA, Wageningen, The Netherlands
The genus Listeria currently includes six species: L. monocytogenes, L. ivanovii,
L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri, and L. grayi. The infectious disease caused
by these gram-positive bacteria is known as listeriosis. Only L. monocytogenes has
been recognized as an important food borne pathogen that may cause a variety of
disease symptoms or even death in both man and animal. L. ivanovii infections are
rare, the vast majority of reported isolations of this species being from abortions,
stillbirths and neonatal septicemias in sheep and cattle. The other Listeria spp. are
considered to be avirulent, although L. innocua may occasionally cause disease in
ruminants and L. seeligeri has been implicated in at least one case of human
listeriosis. The most frequently contaminated foods are raw milk, soft cheeses
(particularly those made from unpasteurized milk), ice cream, raw vegetables,
fermented raw-meat sausages, raw and cooked poultry and raw and smoked fish.
22
Food producers and distributors as well as public health authorities have great
interest in timely detection of Listeria contamination.
We present here the development of Lateral Flow ImmunoAssay (LFIAs) for general
detection of genus Listeria and specific determination of Listeria monocytogenes.
Two polyclonal antisera had previously been developed. With these antisera ELISA's
had been set up, one specific for Listeria spp., and the other specific for L.
monocytogenes. In the present study these antibodies are used to develop LFIA's that
only require the addition of sample into the sampling window. These simple and
rapid strip tests are based on the principle of immunochromatography. Detector
antibody is conjugated on colloidal carbon particles, used as a mobile phase
immunosensor. Capture antibody is immobilized in line onto nitrocellulose
membrane. The antibody-antigen-antibody complex (sandwich assay) is visualized as
a black line.
Acknowledgement: This work was supported by the Grant Agency of the Czech
Republic, No. 525/03/0350.
VLIV ROSTLINNÝCH HORMONŮ CYTOKININŮ NA PROTEOM ARABIDOPSIS
THALIANA
ARABIDOPSIS THALIANA PROTEOME INFLUENCED BY PLANT HORMONES
CYTOKININS
Gabriela Böhmová, Pavlína Váňová, Hana Konečná, Zbyněk Zdráhal, Břetislav Brzobohatý
Department of Functional Genomics and Proteomics, Faculty of Science, Masaryk
University,
Kotlářská 2, CZ-61137 Brno, Czech Republic
Cytokinins are essential plant hormones that control several processes such as cell
division, shoot meristem initiation, leaf and root differentiation, chloroplast biogenesis, stress
tolerance, and senescence. An experimental set-up to analyse dynamics of changes in the
proteome in response to regulated changes in endogenous levels of cytokinins is being
established. In the long-term, the proteome-based approach is expected to deepen our
knowledge of the biological functions of cytokinins.
The classical proteome analysis with the aim of finding a set(s) of proteins whose
expression level is influenced by cytokinins was performed. Total proteins extracted from
Arabidopsis thaliana wild-type (Col0) and mutant lines with increased level of endogenous
cytokinins (amp1), were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Computer analysis
of two-dimensional gels revealed the association of a set of proteins showing a differential
expression with the mutant lines when grown under the same conditions as a wild type.
Altogether 14 qualitatively different spots in gels with pH range 3-10 and 23 spots in gels
with pH range 4-7 were found. Two significant proteins from each group were digested in gel
and identified by mass spectrometry.
This work was supported by grants MSM143100008 and FRVŠ 796/2003 from the Ministry of
Education of the Czech Republic.
23
FRAGILE X SYNDROME: THE ROLE OF FRAGILE X MENTAL RETARDATION
PROTEIN (FMRP) IN THE SYNAPTIC PLASTICITY
Romana Borská, Martin Trbušek
Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika, Centrum molekulární biologie
a genové terapie, Černopolní 9, 625 00 Brno
Fragile X syndrome, the most common form of inherited mental retardation, is caused by
the loss of the FMRP protein in FraX patients. FMRP is predominantly found in neurones of
hipoccampus and cerebellum and is synthetized in response to mGluR activation. FMRP is
suspected to participate in the synaptic plasticity of neurons by acting on posttranslational
control of gene expression. It is an RNA-binding protein that associates with mRNAs together
with other proteins to form large ribonucleoprotein complexes that associate with translating
polyribosomes near the synapses. Therefore, one of the important steps to understand the
molecular pathogenesis of FraX syndrome is identification of the mRNAs and proteins that
are bound by FMRP.
We compared the gene expression in B lymphoblastoid cell lines derived from FraX
patients and healthy men using differential display. We identified a gene coding for the heat
shock protein Hsp90β, which significantly exhibited decreased mRNA expression in all FraX
cell lines.
Hsp90β is specifically involved in the folding or conformational regulation of central
signal transduction molecules, particularly of steroid hormone receptors. From this point of
view it is interesting that Hsp90 protein regulates the growth and differentiation of axons and
dendrites in developing brain through the regulation of steroid hormone estrogen. FraX
patients as well as FMRP knockout mice show higher density of abnormally thin and long
dendritic spines. Also another prominent feature of fragile X syndrome, abnormalities in
hypothalamic-pituitary system, which is regulated by circulating glucocorticoids, might have
direct cause in Hsp90 deregulation. The fragile X patients exhibit increased levels of cortisol,
a hormone of the hypotalamic-pituitary-adrenal axis associated with stress, which, in addition,
was shown to regulate Hsp90 mRNA (1, 2).
References:
1) Hessl D., Glaser B., Dyer- Friedman J., Blasey C., Hastie T., Gunnar M., Reiss A.L. 2002.
Cortisol and behavior in fragile X syndrome. PNEC 27(7), 855-72
2) Sathiyaa R., Campbell T., Vijayan M.M. 2001. Cortisol modulates HSP90 mRNA
expression in primary cultures of trout hepatocytes. CBP 129, 679-685
This work was supported by the Scientific programme CEZ/MZ 98/0001/00209627
RECOMBINANT ANTIBODIES IN ENVIRONMENTAL ANALYSIS
Jiří Brichta
Test Line Clinical Diagnostics s. r.o., Křižíkova 68, 612 00 Brno
Antibody engineering by molecular aproaches gathered steam for the technology of antibody
production, particularly in the area of immunotherapy and diagnostics. The development
fueled by novel technologies for the in vitro isolation of antibodies from combinatorial
libraries and their functional expression in bacteria. This lesson presents an overview of the
methods available for the de novo generation of recombinant antibodies, for engineering
24
antibodies with increased antigen affinity, and for the production of antibody fragments.
Applications of recombinant antibodies in the field of environmental analysis are also
presented, and complemented by results obtained with antibody clone selection using
Griffin1. phage display library.
DETEKCE ESCHERICHIA COLI POMOCÍ MULTIPLEX PCR
DETECTION OF ESCHERICHIA COLI BY MULTIPLEX PCR
Mgr. Kateřina Horáková)1, RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D.)2, RNDr. Petr Mlejnek, Ph.D.
)1
Katedra mikrobiologie PřF MU, Tvrdého 14, 60300 Brno
)2
Výzkumný ústav vodohospodářský TGM, Dřevařská 12, 65757 Brno
)3
Ústav biologie LF UP, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc
Lactose fermentation and glucuronide hydrolysis are the biochemical hallmarks used for
conventional identification of E. coli according to the Czech standards ČSN EN ISO 9308-1,
TNV 75 7835 and TNV 75 7837. Nevertheless it is well known that these routinely applied
methods have many drawbacks. Polymerase chain reaction was used for precise and more
sensitive detection of the genes coding for lacZ (β-D-galactosidase / lactose fermentation),
uid (β-D-glucuronidase) and gene cyd (cytochrome-d-oxidase / respiratory chain protein). Our
results indicated that simultaneous detection of above-mentioned three genes provided very
reliable evidence for presence of Escherichia coli in water samples. Primers for amplification
of gene specific DNA fragments derived from lacZ, uid, and cyd were carefully designed so
that we were able to amplify all three DNA fragments in one tube - multiplex PCR. Therefore
our approach for identification of Escherichia coli using multiplex PCR is also relatively
inexpensive.
TISSUE SPECIFIC ALTERNATIVE SPLICING IN THE GENE FOR AHP5, A
HISTIDINE-CONTAINING PHOSPHOTRANSFER PROTEIN FROM ARABIDOPSIS
THALIANA.
TKÁŇOVĚ SPECIFICKÝ ALTERNATIVNÍ SESTŘIH GENU AHP5, PŘENAŠEČE
SIGNÁLU V DVOU-KOMPONENTNÍM SYSTÉMU U ROSTLINY ARABIDOPSIS
THALIANA.
Hradilova J1, Brzobohatý B2*
1
Laboratory of Plant Molecular Physiology, Masaryk University Brno, Faculty of Science,
Kotlářská 2, 611 37, Brno, Czech Republic
2
Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Kralovopolská 135,
61265 Brno, Czech Republic.
A multistep two-component system is involved in signal transduction in Arabidopsis and
consists of a sensory histidine kinase, a phosphotransfer factor and a response regulator.
Factors with histidine-containing phosphotransfer domains (AHPs) transfer the phosphoryl
group from membrane localised receptor (histidine kinases) to effectors (response regulators)
localised in the nucleus. Five AHPs have been identified in Arabidopsis. AHPs are small
proteins (14,5 – 18 kDa), with a predicted acidic isoeletric point (5.5–3.9) and a typical
phosphotransfer domain, including the conserved sequence XHQXKGSSXS. AHP5
comprises six exons and five introns. RNA was prepared using Trizol reagent from different
25
plant tissues: leaves, roots, shoot, flowers, siliques and seedlings. Using RT-PCR we detected
two products (AHP5s and AHP5l). Following sequencing, the second intron was found intact
at position 211 bp in the longer product (AHP5l). Real time RT-PCR showed that the ratio
between spliced and nonspliced products is in tested tissues significant different. Other AHPs
(AHP1, AHP2, AHP3 and AHP4) were established to be normally spliced. AHP5l comprises
two open reading frames, and in the longer of them the phosphotransfer domain is preserved
intact as the original reading frame is not altered. This protein has a predicted molecular mass
of 11.7kDa and the putative isoeletric point is 7.72.
NEW ELISA TECHNIQUE FOR ANALYSIS OF P53 PROTEIN/DNA BINDING
PROPERTIES
DETEKCE VAZBY PROTEINU P53 NA DNA POMOCÍ NOVÉ ELISA TECHNIKY
a
Eva Jagelskáa ,Václav Brázdaa, Petr Pečinkaa, Šárka Pospíšilováb and Emil Palečeka
Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135,
Brno, Czech Republic
b
Masaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, Brno, Czech Republic
The p53 tumour suppressor protein is one of the most important topics in cancer research. Its
function is associated with the ability to bind DNA in a sequence-specific manner and to
operate as a transcription factor. In the present study, we have developed a rapid and reliable
method for analysing sequence-specific binding of p53 protein to DNA using a modified
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this p53/DNA-ELISA, we used
streptavidin-coated microplates to capture biotynylated oligonucleotides containing p53
consensus sequences (p53CON). This newly developed nonradioactive assay allows the
detection of p53/DNA complexes using different monoclonal antibodies recognising p53 and
has comparable or higher sensitivity to more complicated radioactive methods. Using this
method, we can detect binding of endogenous p53 to p53CON and activation of p53 protein
for sequence-specific DNA binding. Variations of the basic protocol have also been
developed to perform competition experiments and to study p53 binding to natural binding
sequences. This modified DNA-ELISA is applicable for screening p53 properties from
various sources in a short time.
PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍHO ZNAČENÉHO PROTEINU CD69 PRO MĚŘENÍ
NMR SPEKTER
PREPARATION OF RECOMBINANT LABELED CD69 FOR NMR SPECTRA
EVALUATION
1
Daniel Kavan1, Karel Bezouška 1,2
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 8, 128 40
Praha
2
Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha
Molecule CD69 belongs to the C-type family lectins, that is lectins binding Ca2+ ion.
The structure of human CD69 is quite well known, however knowledge of its rat analogue are
much less compact and possible NMR spectra will be surely very valuable acquisition to its
structure description. Evaluation of NMR spectra however require isotope labeled protein so
not only the rich media production but also the minimal ones must be optimised.
26
DNA coding CD69 molecule was acquired from total RNA of RNK-16 cell line and
inserted into pET-30(a)+ vector (Novagen). Recombinant protein was produced in BL-21
DE3 Gold cells (Stratagene) into inclusion bodies. After its isolation and purification came
refolding of CD69 in vitro by its quick dilution. Here came the first problem: according to
reducing to oxidizing agent ratio there were two forms of protein with different mobility on
non-reducing SDS gels caused probably by different cysteine-cyssteine bonds. The right
disulfide bonds form was revealed by means of mass spectrometry.
The protein purification was pursued on the S-Sepharose FF column in buffer pH 5.8
and by linear gradient elution into 1M NaCl, followed by gel filtration on Superdex 200 HR
column. Even after these steps there were found some lower amount of contaminants.
From 2 l of M9 media we have obtained about 7-10 mg well-folded protein moreover
well-soluble (up to 15 mg/ml).
Next task is a perfect purification of protein and reproducing the whole process with
production on 15NH4Cl labeled M9 medium. NMR spectra evaluation will be done in
specialized laboratory.
STRUKTURNÍ POHLED DO SPECIFITY RALSTONIA SOLANACEARUM
LECTIN RS-IIL
STRUCTURAL INSIGHT INTO SPECIFICITY OF RALSTONIA SOLANACEARUM
LECTIN RS-IIL
Nikola Kostlánová1, Edward P. Mitchell2,
Nechama Gilboa-Garber3, Michaela Wimmerová1 and Anne Imberty4
1
National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Masaryk
University, Kotlářska 2, 61137 Brno, Czech Republic, 2E.S.R.F. Experiments Division, BP
220, F-38043, Grenoble Cedex, France, 3Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University,
Ramat-Gan 52900, Israel, 4CERMAV-CNRS, BP 53, F-38041, Grenoble, Cedex 09, France
Carbohydrates are essential components of life and play significant roles in each organism
including host – pathogen interactions. Lectins that specially recognize sugar components can
be involved in primary recognition of host organism and thus they are candidates responsible
for pathogenicity of bacterium[1].
Ralstonia solanacearum is a devasting soil-borne plant pathogen with a global distribution
and wide host range [1]. It is phylogenetically related to an animal pathogen Pseudomonas
aeruginosa that express two soluble lectins, PA-IL and PA-IIL respectivelly. Both lectins are
closely associated with the virulence of the bacterium [2].
The contribution is focused on structural characterization of R. solanacearum lectin RSIIL that shows high sequence similarity with the PA-IIL lectin.
RS-IIL was crystallized by hanging drop vapor diffusion method and the diffraction data
at 1.70Å resolution were collected under cryogenic conditions (100K) on the beamline
ID14-2, at ESRF, Grenoble, France. The protein crystallizes in I222 space group with unit cell
a = 59.1, b = 61.7, c = 74.8 Å. Phasing of native RS-IIL was perfomed by the molecular
replacement of the crystal structure of the PA-IIL/fucose complex (PDB 1L7L). To obtain
RS-IIL/sugar complexes protein was directly co-crystallized with α-methyl-D- mannoside.
The RS-IIL crystal contains one monomer of 113 amino acids per asymmetric unit, together
with two Ca2+ ions and one α-Me-mannoside residue. The quaternary structure is created by
four monomers and both monomeric and tetrameric arrangements are very similar to the ones
27
of PA-IIL [3].
Whilst calcium binding loop is fully conserved in
both lectins different specificity is based on three
different amino acids altered in the “specificity”
loop.
[1] Salanoubat, M., Genin, S., Artiguenave, F., Gouzy, J.,
et al. Nature. 415, 497-502 (2002)
[2] Gilboa-Garber, N.: Lectins of Pseudomonas
aeruginosa:
Properties,
biological
effects
and
applications in Microbial Lectins and Agglutinins:
Properties and Biological Activity (Mirelman, D., ed.),
255-269, John Wiley & Sons, New York (1996)
[3] Sudakevitz, D., Kostlánová, N., Blatman-Jan,
G.,Mitchell, E., Lerrer, B., Wimmerová, M. Katcoff, D.J.,
Imberty, A., Gilboa-Garber, N., Molecular Microbiology,
in press (2004)
Superimposition of α-Me-mannoside
in RS-IIL binding site and α-mannose
in PA-IIL binding site
IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA USED TO FERMENT DAIRY
PRODUCTS BY POLYMERASE CHAIN REACTION AND AMPLIFIED
RIBOSOMAL DNA RESTRICTION ANALYSIS
IDENTIFIKACE BIFIDOBAKTERÍ VYUŽÍVANÝCH V MLÉKÁRENSKÉM
PRŮMYSLU POMOCÍ POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE A RESTRIKČNÍ
ANALÝZY AMPLIFIKOVANÉ RIBOZOMALNÍ DNA
Křížová J., Španová A., Rittich B.
Masaryk University in Brno, Faculty of Science, Department of Microbiology
Tvrdého 14, 602 00 Brno
The genus Bifidobacterium comprises 30 species, of which only a few species can be used as
probiotics. Probiotic propertis can be characterised as a collection of favourable effects on
human´s organism as e.g. supression of lactose intolerance, prevention of gastrointestinal
diseases, reduction of cholesterol level, stimulation of immune system and anticancerogene
activity. The only species of human origine (especially gastrointestinal tract) have got
benefitial influence on human health. These species are used to ferment dairy products and
subsequently applied as oral probiotics. Therefore it is important to develope rapid and
accurate method for identification and differantiation of these bifidobacterial species.
The focus of this work was to verify the accuracy of the original identification of 14
bifidobacterial strains from the collection of dairy cultures Laktoflóra by molecular
biological methods.
The strains were cultivated on MRS medium with cysteine, anaerobically at 37oC for 24 or 48
hours respectively. DNA was isolated by phenol extraction. On the basis of cellular
morphology all the studied strains were tested whether they belong to the genus
Bifidobacterium by the genus specific PCR with primers Pbi F1 and Pbi R2 (Roy and Sirois,
2000) or to the genus Lactobacillus (primers LbLMA1-rev and R 16-1)( Dubernet et al.,
2002). Strains belonging to the genus Bifidobacterium were further examined by the species
specific PCR with primers Bi ADO-1,2; Bi BIF-1,2; Bi BRE-1,2; Bi LON-1,2; Bi INF-1,2; Bi
CAT-1,2 (Matsuki et al., 1999); Ban F2 and Pbi R1 (Roy and Sirois, 2000).
28
The second method used to clarify the original identification of the strains was the amplified
ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). This method is based on the amplification of
16S rDNA region by use of primers Pbi F1 and Pbi R2 and subsequent restriction of the genus
specific PCR product 914 bp by enzymes Bam HI, Sau3 AI and TaqI.
Identification of the studied strains by ARDRA method correspond with the results obtained
by the species specific PCR method.
On the basis of obtained results it is evident, that the ARDRA method and genus and species
specific PCR method are available for the differentiation and identification of some species
of bifidobacteria usually used in dairying.
1) Roy D., Sirois S. (2000). FEMS Microbiol. Lett. 191, 17-24.
2) Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H. (1999). Appl. Environ.
Microbiol. 65, 4506-4512.
3) Dubernet S., Desmasures N., Guéguen M. (2002). FEMS Microbiol. Lett. 214, 271-75.
GENETIC AND MOLECULAR ANALYSIS OF T-DNA MUTATIONS IN
ARABIDOPSIS THALIANA
GENETICKÁ A MOLEKULÁRNÍ ANALÝZA T-DNA MUTACÍ U ARABIDOPSIS
THALIANA
Zdeňka Kyjovská, Jana Řepková, Markéta Dudová
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra Genetiky a molekulární
biologie,Kotlářská 2, Brno 602 00
Embryogenesis in higher plants, that is, embryo development. Developing embryo of most
cotyledonous angiosperms proceeds through a series of shape changes, going from zygotic to
preglobular, through globular, heart and torpedo to the mature cotyledon embryo. Many genes
are expressed during this cascade process in a highly co-ordinated manner to ensure that the
zygote develops into an organised multicellular structure. Genetic approaches have been
particularly useful for identifying important genes involved in embryo development. Much of
the work in this field has been done thaliana L. (Heynh.) as a model for dicotyledonous
species. Genetic analysis of embryogenesis in plants has revealed a great number of genes
responsible for the formation of viable seeds.
In the study presented here, two different T-DNA embryonic lethal mutats of Arabidopsis
thaliana were analysed at the genetic and molecular level.The mutations were confirmed to be
monogenic and recessive-lethal by genetic analysis. Mutant embryos were blocked in certain
steps in the process necessary for embryo viability and development, therefor they belong to
the embryo-lethal class of mutants. The mutations were localised to the genetic map of A.
thaliana by DNA marker analysis. There were used SSR (Simple Sequence Repeats) and
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) markers. The results showed linkage of
the embryo-lethal mutant gene (1293 line) to nga63 marker on Arabidopsis chromosome one.
The gene from line name’s CoY 7 was located on chromosom four near to nga1139 SSR
marker.
29
PŘÍPRAVA KRÁLIČÍHO POLYKLONÁLNÍHO SÉRA PROTI
NÍZKOMOLEKULÁRNÍM LEKTINOVÝM RECEPTORŮM NK-BUNĚK
PREPARATION OF RABBIT POLYCLONAL SERA AGAINST LOWMASS
LECTINE RECEPTORS OF NK-CELLS
1
Ondřej Lukšan1, Karel Bezouška 1,2
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 8, 128 40
Praha
2
Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha
The preparation of polyclonal antibodies against recombinant proteins is often considred
to be a routine technique. Yet, successful immunisation resulting high titres of the produced
antibodies depends on many factors such as frequency and dose of injected antigen, use of
adjuvans, choice of animal, health of animal, etc…
In our laboratory we aimed to prepare polyclonal rabbit antibodies against recombinant
forms of NK cell receptors produced in E. coli . The use of soluble antigens was preferred to
immunisation with proteins in polyacrylamide gels.
3 rabbits were injected 3 times in 3-4 weeks periods by rat CD69, human CD69 and
human NKG-2D. The animals were bled 7-10 days after each partial immunisation. The
amount of antibodies was determined in isolated sera using methods ELISA, Western blot and
Dot blot.
RESULTS:
After 1st booster immunisation
rCD69
hCD69
hNKG-2D
Fig.1: Titration of antibody; dilution of antibody: control, 1:102, 1:5x102, 1:103, 1:2x103,1:5x103, 1:104,
1:5x104, 1:105, 1:5x105, 1:106, control; lower part – preimune sera, upper part – sera after 1st
booster immunisation
After 2nd booster immunisation
rCD69
hCD69
hNKG-2D
Fig.2: Titration of antibody; dilution of antibody:
control,1:102, 1:5x102, 1:103, 1:5x103, 1:104;
lower part – preimune sera, upper part – sera
after 1st booster immunisation
30
CONCLUSIONS:
Our method prooved usefull for the
production of high titer antibodies.
These antibodies will be used for the
characterisation of NK-cell receptors
especialy in membrane microdomains.
ZVÝŠENÁ DYNAMIKA MUP-I V PŘÍTOMNOSTI LIGANDU: DŮKAZ POMOCÍ
MD SIMULACE A NMR RELAXACE
INCREASED DYNAMICS OF MUP-I IN PRESENCE OF LIGAND: EVIDENCE
FROM MD SIMULATION AND NMR SPIN RELAXATION
1
Pavel Macek1, Petr Novák1, Hana Křížová1, Lukáš Žídek1, Vladimír Sklenář1
Masaryk University Brno, Faculty of Science, National Centre for Biomolecular Research
Kotlářská 2, 611 37 Brno
Nowadays it is accepted that the structure of proteins must be treated as a time-dependent
model, where fluctuations about an average structure are present. To gain insight into how
dynamical properties of major urinary protein (MUP-I) change in presence of a ligand, the
picosecond to nanosecond time scale dynamics of MUP-I have been studied by the MD
simulations and by the NMR spin relaxation experiments. Dynamic properties of MUP-I upon
ligand binding is in contrast with those that are typical for most proteins. Backbone NMR 15N
relaxation results show a small but significant increase of order parameters (S2), indicating
that the molecule maintains its overall molecular shape and structure upon the ligand binding,
while the backbone dynamics is inreased. Molecular dynamic simulations performed with and
without the ligand produce results consistent with NMR measurements and confirm X-ray
difraction results, showing qualitative agreement amongst these three methods. Furthermore
careful investigation of the MD simulations provides a potential molecular mechanism of the
increased backbone flexibility.
This work is supported by a research grant:
Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (LN00A016)
Grant Agency of the Czech Republic (203/00/0511)
ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA NATIVNÍHO A AGREGOVANÉHO
ALPHA-SYNUCLEINU, PROTEINU, KTERÝ SE ÚČASTNÍ NA
NEURODEGENERATIVNÍCH ZMĚNÁCH VEDOUCÍCH K PARKINSONOVĚ
CHOROBĚ
ELECTROCHEMICAL ANALYSIS OF NATIVE AND AGGREGATED ALPHASYNUCLEIN PROTEIN INVOLVED IN PARKINSON DISEASE
Michal Masařík1, Agata Stobiecka2, René Kizek3, František Jelen1, Wolfgang Hoyer4,
Thomas M. Jovin4, Emil Paleček1
1
Institute of Biophysics of the Academy of Sciences of the Czech republic, Kralovopolska 135,
612 65 Brno, CzechRepublic
2
Institute of Animal Reproduction and Food Research of the Polish Academy of Sciences,
Tuwima 10, 10 – 747 Olsztyn, Poland
3
Faculty of agronomy, Mendel University of agriculture and forestry, Zemedelska 1, 613 00
Brno, Czech Republic
4
Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Am Faßberg 11, D-37077 Göttingen,
Germany
Parkinson´s disease (PD) is characterized by a loss of dopaminergic neurons in the substantia
nigra, leading to the major clinical and pharmacological abnormalities that characterize the
disease. Some surviving nigral dopaminergic neurons contain cytosolic filamentous inclusions
known as Lewy bodies (LBs) and Lewy neurites (LNs) are also involved in pathogenesis of
31
Alzheimers disease (AD), multiple system atrophy (MSA) and amyotropic lateral disease
(ALS).
The major fibrillar material of LBs and LNs was shown to be alpha-synuclein (α-synuclein).
α-synuclein is a 14 kDa protein highly expressed in various parts of the brain and was first
described as a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve
terminals. Natively is unfolded but undergoes aggregation leading to fibrillar structures. The
aggregation of α-synuclein is promoted by a variety of agents including metal ions, lipids,
pesticides and conditions that generate oxidative stress.
Well known methods for determination α-synuclein aggregation are CD spectroscopy,
fluorescent measurement (Thioflavin T binding assay), electron microscopy and scanning
force microscopy.
In this work we studied oxidation of tyrosine residues in native and aggregated α-synuclein at
carbon electrodes and measured the so-called peak H at mercury electrodes. We observed
large differences in the behaviour of native and aggregated α-synuclein at both carbon and
mercury electrodes. Using peak H it was possible to detect subnanogram amounts of αsynuclein. We belive that electrochemical methods will significantly contribute to a better
understanding of α-synuclein properties.
The research is supported by GACR 204/03/0566
1. Hoyer W, Antony T, Cherny D, Heim G, Jovin TM, Subramaniam V. (2002) J. Mol.
Biol. 322: 383-393
2. Antony T, Hoyer W, Cherny D, Heim G, Jovin TM, Subramaniam V. (2003) J. Biol.
Chem. 278 (5): 3235-3240
3. Sulzer D. (2001) Nat. Med. 7 (12): 1280-1282
4. Trnková L., Kizek R., Vacek J. (2002): Bioelectrochemistry, 56: 57-61
5. Kizek R., Trnková L., Paleček E. (2001): Anal. Chem., 73: 4801- 4807
6. Strouhal M., Kizek R., Vacek J., Trnková L., Němec M. (2003): Bioelectrochemistry
60: 29-36
APPLICATION OF AFLP FOR TYPING OF SALMONELLA ENTERICA SEROTYPE
TYPHIMURIUM
VYUŽITIE METÓDY AFLP NA TYPIZÁCIU SALMONELLA ENTERICA SÉROTYP
TYPHIMURIUM
Eva Mikasová, Hana Drahovská, Ján Turňa
Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University,
Bratislava, Slovakia,
e-mail: [email protected]
The AFLP (amplified fragment length polymorphism) method was optimized for
typing of Salmonella Typhimurium strains. Firstly, chromosomal DNA was isolated from
bacteria by phenol extraction or alternatively by solid phase extraction with commercial
columns. Both methods gave sufficient amounts of high quality DNA, the later being faster
and more convenient. Chromosomal DNA was than digested simultaneously with restriction
endonucleases EcoRI and MseI and oligonucleotide adapters were ligated to the ends of DNA
fragments. After ligation DNA was amplified by PCR with primers complementary to the
ends of molecules. Optimized two step PCR protocol was used: firstly 20 cycles of
preamplification with primers E00 and M00 (without selective nucleotides) were employed
32
and then preamplification products were used as template in amplification with 3´extended
primers M02 (contained extra cytosine) and E01 (contained extra adenine and fluorescent dye
FAM). Protocol without preamplification was also tested, but many unspecific DNA
fragments were observed in AFLP profiles in this case. Fluorescent PCR products were
separated on capillary electrophoresis on DNA sequencer ABI310 (Applied Biosystems).
Molecular size standard TAMRA-500 was internally added to every sample. In evaluation the
molecular weight of DNA peaks was calculated, presence/absence of reproducible DNA
fragments (generally higher than 300 fluorescence units) was scored and Similarity between
profiles was calculated by coefficient of Dice. The high reproducibility of this AFLP protocol
was confirmed by repeated analyzing of chromosomal DNA from standard salmonella strain.
The variability of 28 strains of S. Typhimurium, isolated from food and animal
sources, was studied by optimezed method. We observed high strain to strain similarity as
Dice coefficients fell in the range of 94 – 100%. According to the presence of several DNA
fragments strains were separated to six AFLP groups. AFLP clustering corresponded with
antibiotic rezistance profiles and presence of integrons in strains.
NMR STUDY OF PACE11 FROM THE HYPERTHERMOPHILIC ARCHAEON
PYROCOCCUS ABYSSI
M. Nálezková1, D. Marion2, A. de Groot2, P. Gans2, L. Blanchard2
National Centre for Biomolecular Research, PřF MU, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech
Republic, 2L’Institut de Biologie Structural, 41, rue Jules Horowitz, 38027 Grenoble, France
1
The analysis of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi genome showed
that some proteins are highly conserved between Archaea and Eukaryotes. 32 proteins have
been listed and called the PACE proteins (Proteins of Archaea Conserved in Eukaryotes) (1).
The project is to study by NMR PACE11. This protein has been characterized recently as a
monomeric phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) involved in the Coenzyme A
(CoA) biosynthesis pathway (2). This pathway, consisting of 5 steps thus involving 5
enzymes, has been described in Bacteria and Eukaryotes but not in Archaea. PPAT is
involved in 4th step of the CoA biosynthesis, catalyzing the reversible transfer of an adenylyl
group from ATP to 4‘-phosphopantetheine giving dephosphoCoA (dPCoA). So far the 3D
structure of only a bacterial PPAT (from E. coli and T. Thermophilus) has been solved (3).
PACE11 shows very low sequence identity with these bacterial proteins.
PACE11 project is to get structural and dynamical information of this protein.
PACE11 is PPAT of Pyrococcus abyssi, which is composed of 157 residues. In order to get
enough protein for the NMR study a synthetic gene of PACE11 (having no E. coli rare
codons) was cloned into the pET28a plasmid and the expression of the gene was tested
showing a very good production of PACE11. A 15N sample was then prepared and the 1H-15N
HSQC recorded on this sample showed that PACE11 is well folded.
(1) Matte-Tailliez O, Zivanovic Y, Forterre P. (2000), Trends Genet 12, 533-536
(2) Armengaud J, Fernandez B, Chaumont V, Rollin-Genetet F, Finet S, Marchetti C,
Myllykallio H, Vidaud C, Pellequer JL, Gribaldo S, Forterre P, Gans P. (2003), J Biol
Chem 278, 31078-31087
(3) Izard T. (2002), J Mol biol 315, 487-495
33
VLIV REDOX STAVU PROTEINU p53 A MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK NA
SELEKTIVNÍ VAZBU p53 K NADŠROUBOVICOVÉ DNA
EFFECTS OF THE p53 REDOX STATE AND MONOCLONAL ANTIBODIES ON
p53 SUPERCOIL-SELECTIVE DNA BINDING
Hana Pivoňkováa, Marie Brázdováa, Kateřina Němcováa, Bořivoj Vojtěšekb, Miroslav Fojtaa
a
Laboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie, Biofyzikální ústav AV ČR,
Královopolská 135, 612 65 Brno, tel.: 541 517 197, e-mail: [email protected]
b
Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
Protein p53 is one of the best known tumor suppressors. The main function of this protein is
to maintain genetic integrity via controlling proliferation and cell cycle. The p53 ability to
bind DNA is essential for these functions. It is known that protein p53 can bind DNA
sequence specifically (in a p53 consensus sequence – p53CON) via its central (core) domain
and sequence nonspecifically via its C-terminal DNA binding site (CTDBS). Some time ago it
was found out that full length bacterially expressed p53 bind selectively supercoiled DNA
(scDNA) in dependence on presence of the CTDBS. DNA binding of p53 can be influenced
by the protein phosphorylation, acetylation and/or by binding of other proteins. We have
studied binding of full length p53 to DNA using 1) monoclonal antibodies mapping different
epitopes of protein p53 and 2) oxidation of cysteine residues in its central domain. We have
found that reduced protein p53 in absence of antibodies bound selectively to scDNA in
presence of 3 kb linear DNA or 20-mer oligonucleotide (with or without p53CON).
Complexes of p53 with monoclonal antibodies mapping the CTDBS bound equally sc and
linDNA without p53CON but preferred linDNA with p53CON. Such p53 immune complexes
could bind DNA only via its sequence specific site within its central (core) domain. The same
immune complex with oxidized protein did not bind DNA because oxidized p53 has no active
DNA binding site. Oxidized p53 bound selectively scDNA in absence of monoclonal
antibodies but with a lower preference than the reduced protein. On the other hand antibodies
mapping N-terminal domain of p53 did not change the ability of p53 bind scDNA regardless
of its redox state. These results suggest that C-terminal DNA binding domain of full length
protein is responsible for the selective binding to supercoiled DNA.
This work was supported by a grant of GACR No. 204/02/0734
INHIBICE OXIDACE SÍRY ARSENEM U BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS
FERROOXIDANS
INHIBITION OF ELEMENTAL SULFUR OXIDATION BY ARSENIC IN
ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Blanka Pokorná, Martin Mandl, Pavla Gavlasová
Katedra biochemie, PřF MU, Kotlářská 2, Brno 611 37
This work deals with the inhibitory effects of arsenic ions on the oxidation of
elemental sulfur by acidophilic chemolithoautotrophic mesophilic bacteria Acidithiobacillus
ferrooxidans. The bacteria play an important role in nature and biotechnology because they
are involved in the biodegradation of sulfide minerals, including arsenopyrite. Its biooxidation
is inhibited by arsenite and arsenate ions as well as by other toxic metals. Inhibition of
elemental sulfur oxidation by arsenic is a part of overall inhibitory reactions.
34
The kinetic analysis of the inhibition of sulfur biooxidation by As(III,V) in the
bacterial suspension demonstrated a non-competitive type of inhibition, which is summarized
in the following table:
As(III)
EC50 = 1,25 mmol l-1
Ki = 1,3 ± 0,3 mmol l-1
As(V)
EC50 = 80 mmol l-1
Ki = 46,8 ± 8,8 mmol l-1
It was found that the inhibitory effect of As(III,V) in the growing culture was much
lower than that in bacterial suspension obtained after bacteria separation from the growing
culture. Bacteria under active growth probably have a detoxification system and arsenic ions
are transported out of the cells. The absence of ATP could explain the inability of separated
bacteria to transport toxic ions.
We observed an As(V)-reductase activity which could increase the inhibitory effect of
As(V). In the growing culture, the concentration of As(III) remained identical all the time but
in samples that contained only As(V), As(III) started to appear after a few days. To explain
the As(V)-reductase activity, different chemical As(V) reductions were investigated using
possible sulfur metabolites. We assume that the As(V)-reductase activity is probably due to
the effect of Na2S2O3 and Na2SO3. In addition to these metabolites, there is another possibility
of As(V) reduction by iodinin, a metabolic pigment isolated by our group. The pH of
environment seems not to have any influence on the As(V)-reductase activity. The activity is
directly connected with the growing cells. When the bacteria stoped growing, the As(V)reductase activity was not observed. The observed As(V)-reductase activity could have an
unfavorable effect on the production of the more toxic As(III). The low rate of the As(V)
reduction indicates the low concentration of sulfur metabolite or a low rate constant of the
reduction reaction.
SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY – DIAGNOSTICKÝ A
PROGNOSTICKÝ NÁSTROJ K URČOVÁNÍ MÍRY PLODNOSTI
SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY – A DIAGNOSTIC AND
PROGNOSTIC TOOL FOR FERTILITY ASSESSMENT
Roman Rybář, Ludmila Faldíková, Martin Faldyna, Marie Machatková, Jiří Rubeš
Veterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno, Czech Republic
Analysis of sperm parameters is very important for predicting the outcome of assisted
reproductive techniques and is necessary for determination of fertility potential of males
tested for artificial insemination. In our study we have determined the level of bull and boar
sperm DNA damage by Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). This test is based on
increased susceptibility of altered DNA (strand breaks) in sperm nuclear chromatin to in situ
denaturation measured by flow cytometry after staining with acridine orange (AO). AO
associated with single (denaturated) and double (native) stranded DNA emits red and green
light, respectively. Chromatin damage is then quantified by red/(red + green) fluorescence.
Each semen sample contains the main population (spermatozoa with non-detectable DNA
Fragmentation Index – non-detectable DFI) and spermatozoa with increased chromatin
damage (spermatozoa with detectable DNA Fragmentation Index - DFI). Spermatozoa with
detectable DFI are divided into two subsets (moderate and high DFI, according to the level of
sperm chromatin damage). The next evaluated parameter is the percentage of immature cells
35
(HDS; cells with High DNA Stainability). We measured sperm SCSA parameters in a total of
37 bulls in two groups from different localities and 68 boar samples from one locality.
Significantly higher DFI was detected in six bulls (16.2% of all bulls tested) and a
significantly higher percentage of HDS (immature cell forms) was found in another six bulls
(16.2%) in comparison with all bulls. The means of high DFI and HDS of bulls from the
second group were statistically higher than those from the first group (P<0.01). Five
individual boars (7.4% of all boars tested) had significantly higher DFI and 18 boars (26.5%)
had significantly higher HDS compared to the other boars. Both DFI and HDS were
significantly higher in a single boar compared to the others. Boars tended to have significantly
higher percentages of high DFI and HDS (P<0.0001) in comparison to bulls. In bulls, the
highest DFI and HDS were 20.8% and 3.5%, respectively while for boars these were 17.6%
and 10.2%, respectively. No significant correlations were found between DFI and HDS. This
method has also been widely used in the field of infertility treatment in human medicine all
over the world as this method correlates poorly or does not correlate at all with standard
parameters of human semen quality. No correlations between standard semen characteristics
and SCSA parameters of 21 men suffering from infertility problems attending the centre for
assisted reproduction were found. This sensitive procedure seems to be convenient as
additional method for semen quality detection both in men and in farm animals before their
exploitation in breeding.
THE ROLE OF THE ARABIDOPSIS HOMEOBOX GENE KNAT1 IN SHOOT
DEVELOPMENT
Přemysl Souček1,2, Petr Klíma1,2, Alena Reková1, Břetislav Brzobohatý1,2
1 Institute of Biophysics AS CR, Královopolská 135, CZ-61265, Brno, Czech Republic
2 Dept. of Functional Genomics and Proteomics, Masaryk University, Kotlářská 2, CZ61137, Brno, Czech Republic
Plant homeobox genes participate in various developmental processes such as embryo
development, organogenesis, meristem maintenance etc. Based on their sequence similarity
the homeobox genes were sorted into several subclasses. KNAT1, the member of a subfamily
of the Knotted1-like homeobox genes, is involved in the formation of inflorescence stem
architecture, including internodes and pedicels elongation. The presence of KNAT1 transcripts
in the shoot apical meristem and altered leaf phenotype of KNAT1 overexpressing plants
indicate possible role in meristem growth regulation and leaf morfogenesis. Partial
phenotypical similarity of 35S-KNAT1 plants to cytokinin overproducing plants lead to
formulation of hypothesis, that cytokinins and homeobox gene KNAT1 act in the same
signaling pathway.
To verify this hypothesis we investigated the rate of KNAT1 expression in apexes, hypocotyls
and leaves of plants having both endogenously and exogenously increased levels of cytokinin.
A transcription activation system (pOp/LhG4) was used for raising the cytokinin production
by expressing the bacterial isopentenyltransferase (ipt). All tested lines carried marker gene
GUS downstream of KNAT1 promoter (this transgene has been established for histochemical
analysis). GUS staining technique of plants treated/untreated by artificial cytokinin
benzyladenin or of those expressing/unexpressing ipt shows negative correlation between
cytokinin level and KNAT1 expression in apexes. None of the plants show staining in leaves.
Thus serrated leaves of the cytokinin overproducing plants are not the result of the ectopic
expression of KNAT1 in blades.
36
In contrast to inflorescence stem, where KNAT1 expression is localized to cortical tissue, in
hypocotyls the staining is concentrated in vasculature or vasculature connected tissues. The
length of hypocotyl has been shown to be directed by light intensity. The weaker illumination
of the plants the longer hypocotyls they form. In our experiments we have shown that
cytokinins have the ability to cooperate in the process of hypocotyl elongation and that
KNAT1 gene is one of those, the expression of which depends on light illumination not only
in hypocotyls but also in apexes. Apperently, weaker light intensity leads to KNAT1 induction
as well as hypocotyl elongation.
This work was supported by grants MSM143100008 and LN00A081 from the Ministry of
Education of the Czech Republic and a grant IAA5004001 from the Grant Agency of the
Academy of Sciences of the Czech Republic.
APLIKACE METODY SDS-PAGE V TAXONOMII GRAMPOSITIVNÍCH KOKŮ
THE APPLICATION OF THE SDS-PAGE METHOD IN THE CLASSIFICATION
OF GRAM-POSITIVE COCCI
1
Vlastimil Štětina1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Česká sbírka mikroorganismů,
Tvrdého 14, 602 00 Brno
The analysis of protein profiles of bacteria belongs among methods useful for taxonomic
studies of both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The method is used in its
standardized form - the sds-page electrophoresis of whole-cell proteins is used. The capability
of the method for the identification purposes is comparable to the biochemical methods. In the
Czech Collection of Microorganisms the analysis of the protein profiles has been applied to
characterization of members of the Gram-positive group of bacteria, both catalase negative
cocci and catalase positive cocci. Examples of the using of the protein analysis method are
given: characterization of bacteriocins producing enterococci (Enterococcus faecium group),
characterization of representatives of novobiocin resistant, oxidase positive staphylococci,
unusual isolate - Staphylococcus piscifermentans identification, characterization of
macrococci-like isolates.
This work was supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 301/02/1505) and the
Ministry of Education of the Czech Republic (project "KONTAKT" 164/2002-2003).
37
PREPARATIVNÍ SDS-PAGE: PURIFIKACE NUKLEOKAPSIDOVÉHO PROTEINU
N VIRU REPRODUKČNÍHO A RESPIRAČNÍHO SYNDROMU PRASAT
EXPRIMOVANÉHO PROSTŘEDNICTVÍM BAKULOVIROVÉHO VEKTORU
V HMYZÍCH BUŇKÁCH
PREPARATIVE SDS-PAGE: PURIFICATION OF THE NUCLEOCAPSID PROTEIN
N OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS
EXPRESSED BY MEANS OF A BACULOVIRUS VECTOR IN INSECT CELLS
R. Tesařík, I. Pšikal, E. Kosinová, L. Rodák
Veterinary Research Institute, 621 32 Brno, Hudcova 70, Czech Republic
e-mail: [email protected]
Preparative SDS-PAGE of the recombinant nucleocapsid protein N (rN) of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was performed using a Prep Cell
Model 491 (Bio-Rad) connected to FPLC system (Pharmacia).
Protein N of the European serotype of PRRSV (V-516) was expressed using
a recombinant baculovirus expression system Bac-N-Blue (Invitrogen). Complete protein N
gene was cloned into pBlueBac4.5 transfer vector that contain strong polyhedrin promotor,
signals for termination of transcription, polyadenylation and other sequences neccesary for
homologous recombination. Transfer vector was co-transfected with linearised baculovirus
Bac-N-BlueTMDNA into insect cell (Sf-9) and after homologous recombination yielded
recombinant baculovirus that was able to replicate and infect insect cell. The selection of
recombinant baculoviruses (occ-) capable to express the protein N was done by
β-galactosidase assay.
The production and identity of the ~15kD recombinant protein N was tested by
SDS-PAGE under reducing condition and by immunoblotting with a PRRS-positive
polyclonal porcine blood serum.
The recombinant protein N was purified from the cell mixtures by preparative
electrophoresis. Denaturing polyacrylamide tube gels (37mm ID) for stacking (4%, 1cm) and
resolving (14%, 7.5cm) were used. After sample application (5 x 106 infected cells per 3ml of
SDS-PAGE sample buffer) the running conditions were set to constant power 12W for 12h.
Fractions of 2.5ml were collected and analyzed by SDS-PAGE and by immunoblotting.
Fractions including of pure nucleocapsid protein N were pooled and used as described above.
The concentrations of purified rN ranged from 80 to 250 µg/ml. Total yield of rN was 1mg
per one run (the purity above 95%).
An indirect ELISA using purified rN as the antigen (2µg/ml) was developed for
detecting antibodies against PRRSV in swine sera. Validation of this assay was done with 154
samples of sera previously tested by the diagnostic set IDEXX HerdCheck® ELISA.
Specificity of indirect rELISA was 100% and sensitivity reached 90%. The results indicate
that expression of recombinant nucleocapsid protein N of PRRSV in insect cells followed by
preparative SDS-PAGE purification contribute to the high quality antigen preparation for
diagnostic use.
Acknowledgement: This work was supported by the Ministry of the Agriculture of the Czech
Republic (MZE-M03-99-01).
38
POSTERY
METABOLISM OF ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE
BY CYTOCHROMES P450
Dagmar Aimováa, Jitka Poljakováa, Zuzana Manhartováa, Anna Březinováa, Lucie BořekDohalskáa, Jan Sejbalb, Robert Owenc, Eva Freic and Marie Stiborováa
a
Department of Biochemistry, bDepartment of Organic Chemistry, Faculty of Science,
Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic;
c
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, In Neuenheimer
Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany
Ellipticine and several of its derivatives isolated from Apocyanaceae plants are alkaloids
exhibiting significant antineoplastic and anti-HIV activities. We described that cytochrome
P450 (CYP)-dependent metabolism of ellipticine leads to activation of this agent to more
efficient metabolite(s) forming DNA adducts iv vivo [1] and in vitro [2,3,4]. CYP3A4 and 1A
are the most efficient enzymes activating ellipticine to form DNA adducts. On the basis of
these data, ellipticine might be considered a drug, whose pharmacological efficiency and/or
genotoxic side effects are dependent on its metabolic activation in target tissues. The pattern
of ellipticine metabolites formed by CYPs has not been characterized so far. Therefore, here
we investigated the metabolites of this anticancer drug formed by CYP catalyzed reactions.
Five metabolites containing an oxygen atom in their molecules (M1-M5) were generated
from ellipticine by CYPs; two of them were identified to be 9-hydroxy- and 7-hydroxyellipticines. Both of these metabolites were predominantly formed by CYP1A1/2. The
metabolites M3 and M5 were identified to be 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of
ellipticine, respectively. The location of the hydroxy group in further ellipticine metabolite,
M2, has not been determined as yet. CYP3A is the major enzyme generating all three
ellipticine metabolites (M2, M3, M5). 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of ellipticine are
metabolites responsible for formation of two major ellipticine-derived adducts generated on
deoxyguanosine in DNA. The reaction mechanism of their formation is discussed.
References
[1] Stiborova M., Breuer A., Aimova D., Stiborova-Rupertova M., Wiessler M., Frei E.: Int.
J. Cancer 107 (6): 885-890 (2003).
[2] Stiborova M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem Pharmacol 62 (12): 1675-1684
(2001).
[3] Frei E., Bieler C.A., Arlt V., Wiessler M., Stiborová M.: Biochem Pharmacol 64 (2): 289295 (2002).
[4] Stiborova M., Stiborova-Rupertova M., Borek-Dohalska L., Wiessler M., Frei E.: Chem.
Res. Toxicol. 16 (1): 38-47 (2003).
Supported by Grant Agency of the Czech republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of
Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).
39
STUDIUM BIOLOGICKÉ AKTIVITY NAFTOCHINONŮ
STUDY OF BIOLOGICAL ACTIVITY OF NAPHTHOQUINONES
Petr Babula1, René Kizek2, Ladislav Havel3, Miroslav Strnad4, Zdeněk Sladký1
1
Ústav přírodních léčiv, VFU Brno, Palackého ¼, 602 00 Brno
2
Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1,613 00 Brno
3
Ústav botaniky a fyziologie rostlin, MZLU Brno, Zemědělská 1,613 00 Brno
,4Laboratoř růstových regulátorů UP a AV ČR, UP Olomouc, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc
Hledání nových antibakteriálních a cytotoxických látek se v době, kdy prudce
narůstá incidence civilizačních chorob, dostává do popředí zájmu mnoha vědních oborů. Mezi
nově zkoumané látky patří také naftochinony, mezi které patří také juglon, plumbagin a
lawson. Některé vystupují jako hlavní obsahové látky hospodářsky zcela nevýznamných
rostlin, jako je např. masožravá láčkovka Dionaea muscipula Ell.
V našich testech byly naftochinony ve formě extraktů z rostlin, které je obsahují,
podrobeny testování na potenciální antimikrobní a antifungální aktivitu, některé jednotlivě
izolované naftochinony pak byly podrobeny testům na potenciální cytotoxicitu a inhibici
některých tyrosinkináz.
Pro studium antimikrobní a antifungální aktivity extraktů byla zvolena disková
difůzní metoda, jako testované mikroorganizmy byly zvoleny Escherichia coli ATCC25922,
Staphylococcus aureus CCM4223 a Candida albicans GD8186. V našich testech byl zjištěn
výrazný efekt metanolického a petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. a Nepenthes
sp. na Staphyloccocus aureus a velmi výrazný antifungální efekt metanolického i
petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. na patogen Candida albicans. Testy
prokázaly jen malou citlivost Escherichia coli k testovaným extraktům. Plumbagin, juglon, 3hyroxy-1,4-naftochinon a lawson byly testovány na cytotoxické vlastnosti na nádorových
buněčných liniích K-562 (chronická myeloidní leukémie) a MCF7 (karcinom prsu).
Plumbagin, 3-hyroxy-1,4-naftochinon a juglon prokázaly velmi výrazný cytotoxický efekt
srovnatelný s efektem některých komerčně využívaných cytostatik. Proto byly tyto látky
testovány na inhibici kináz CDK1/CDK2. Efekt na inhibici těchto kináz byl ovšem málo
výrazný, jejich cytotoxický efekt nebylo možné připsat na vrub pouze inhibici těchto kináz.
Některé práce ukazují na schopnost naftochinonů interkalovat do DNA, jiné prokazují inhibici
inkorporace thymidinu do DNA nádorových buněk. Dle mého názoru je tento efekt
zprostředkován chemickými vlastnostmi naftochinonů spolu s výše popsanými jevy. Co se
vztahu struktury a cytotoxického efektu naftochinonů týká, ukazuje se, že roli zde hraje
substituent v poloze 2 naftochinonového skeletu.
Literatura
1.) Elangovan V., Ramamoorthy N., Balasubramanian S., Sekar N., Govinsamy S.:
Studies of antiproliferative effect of some naturally occuring bioflavonoidal
compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma – 180 cell lines, Indian
Journal of Pharmacology 26, 266-269 (1994)
2.) Plyta Z., Li T., Papageorgiu V., Mellidis A., Assimopoulou A.: Inhibition of
topoisomerase I by naphthoquinone derivates, Bioorg. Med. Chem. Letter 8, 23, 33853390 (1998)
3.) Fujii N., Yamashita Y., Arima Y., Nagashima M., Nakano H.: Induction of
topoisomerase II-mediated DNA claevage by the plant naphthoquinones plumbagin
and shikonin, Antimicr. Agents Chemother. 36, 12, 2589-2594 (1992)
40
4.) Muto N., Inouye K., Inada A., Nakanishi T., Tan L.: Inhibition of cytochrome p-450
linked monoogygenase systems by naphthoquinones, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 146, 2, 487-494 (1987)
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
VLIV GENŮ DOBY DO KVETENÍ NA EXPRESI GENU FLC.
INFLUENCE OF FLOWERING TIME GENES ON THE FLC GENE EXPRESSION.
Simona Balková, Pavel Lízal, Jiřina Relichová
Masarykova Univerzita Brno, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Česká republika
Cílem práce bylo zavedení metodiky a stanovení vlivu vybraných genů pozdnosti na expresi
genu FLC (Flowering Locus C) u modelového objektu Arabidopsis thaliana. Bylo vybráno
osm genů podílejících se na regulaci přechodu rostliny z vegetativní do reprodukční fáze
vývoje, které byly již dříve charakterizovány pomocí pozdně kvetoucích mutantů. Geny M63
a M73 byly na základě předchozích pokusů zařazeny do autonomní dráhy regulace doby do
kvetení a pomocí zbylých šesti genů (dn, L4, L5, L6-1, L6 a Spi) byla charakterizována nová
metylační dráha. Při přechodu rostlin do reprodukční vývojové fáze hraje významnou roli gen
FLC, jehož produkt působí jako inhibitor tohoto přechodu. V případě autonomní regulační
dráhy je znám indukční účinek mutantních genů této dráhy na expresi genu FLC. Cílem bylo
potvrdit tento indukční účinek u dvou pozdně kvetoucích mutací (M63 a M73) a zjistit jaký
vliv mají na expresi genu FLC mutantní geny metylační dráhy.
Byla zavedena metodika stanovení exprese genu FLC u mutantních linií metodou RT-PCR. U
standardních linií S96 a Di-G, které představují genetické pozadí použitých linií, nebyla
zjištěna přítomnost transkriptu genu FLC. Naopak u všech osmi pozdně kvetoucích mutantů
byl gen FLC exprimován. Analýzou jednotlivých orgánů mutantní rostliny Spi byla prokázána
exprese pouze v orgánech vegetativní vývojové fáze.
U mutantních genů autonomní regulační dráhy (M63 a M73) byl tedy potvrzen indukční vliv
těchto genů na expresi genu FLC. Dále bylo zjištěno, že mutantní geny nově charakterizované
metylační dráhy mají také indukční účinek na expresi genu FLC a byl tak potvrzen
předpoklad, že i geny této dráhy regulují přechod rostliny z vegetativní do reprodukční
vývojové fáze přes centrální inhibitor FLC. Bylo potvrzeno, že u pozdně kvetoucích rostlin
dochází při přechodu do reprodukční fáze vývoje k utlumení syntézy tohoto inhibitoru
kvetení.
Tato práce vznikla za finanční podpory grantového projektu Grantové agentury České
republiky č.521/02/P127.
41
STUDIUM VLIVU TĚŽKÝCH KOVŮ NA RŮST BAKTÉRIÍ
EFFECT OF HEAVY METALS ON GOWTH BACTERIA
Jana Batůšková1, Pavla Novotná1, Josef Zehnálek1, Jan Vacek1, Libuše Trnková3
René Kizek1
2
1
Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Ústav pro státní
kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv, Hudcova 56a, 621 00 Brno, 3Katedra teoretické
a fyzikální chemie PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno,
Nejrůznější zdroje znečištění přinutily mikroorganismy, rostliny i živočichy
k vytvoření ochranných mechanismů. V jejich životním prostředí je přítomna celá škála prvků
včetně těžkých kovů (Mr > 5 g.cm–3), které představují jednu z nejvýznamnějších skupin
toxických látek. Mechanismy detoxifikace a metabolismus těžkých kovů jsou intenzivně
studovány u různých organismů. Zenk uvádí, že experimentálně bylo po expozici ionty
kadmia studováno již 200 druhů rostlin. V naší práci jsme využili spektrální techniky pro
studium růstu bakteriálních kultur a pro stanovení těžkých kovů (kadmia a olova)
v biologické matrici bylo využito elektroanalytických technik. Elektrochemické analýzy byly
provedeny na přístroji AUTOLAB v tříelektrodovém systému zapojení VA-Stand 663
Methrom s pracovní rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE) – povrch kapky 0.4 mm2,
referentní Ag/AgCl/3 M KCl a pomocnou Pt-elektrodou. Pro stanovení nanomolárních až
pikomolárních koncentrací kadmia v buněčných extraktech jsme především využívali
diferenční pulzní anodickou rozpouštěcí voltametrii (Differential Pulse Anodic Stripping
Voltammetry - DPASV) ve spojení s visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE).
Baktérie Escherichia coli a Staphylococcus epidermidis byly kultivovány nejdříve na
živném agaru při teplotě 37 °C. Kadmium bylo do média přidáno v koncentraci 1, 5 a 10
µmol/l a médium bylo intenzivně třepáno. Růstové křivky byly sestrojeny změřením
absorbance při 600 nm na přístroji Hewlett Packard 8453. Na základě našich získaných
výsledků jsme pozorovali růstovou depresi u obou bakteriálních druhů. Obranné mechanismy
a vstup těžkých kovů do bakterií není stále plně objasněn, a zcela jistě zde bude hrát
významnou roli metallothionein a metallothioneinu podobné proteiny.
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
Literatura
1) Oehme I., Wolfbeis O.S., Mikrochim. Acta, 126, 177–192, 1997
2) Robards K., Starr P., Analyst, 116, 1247–1273, 1991
3) Macka M., Haddad P.R., Electrophoresis, 18, 2482–2501, 1997
4) Strouhal, M., Kizek, R., Vacek, J., Trnková, L., Němec, M., Bioelectrochemistry, 60, 29–
36, 2003
5) Kizek R., Trnková L., Ševčíková S., Šmarda J., Jelen F., Anal. Biochem., 301, 8–13, 2002
6) Kizek R., Vacek J., Trnková L., Klejdus B., Kubáň V., Chem. Listy 97, 1003–1006, 2003
42
PŘÍPRAVA VHODNÝCH SOND PRO IDENTIFIKACI T-DNA MUTANTŮ
ARABIDOPSIS THALIANA METODOU SOUTHERNOVA PŘENOSU.
PREPARATION OF SUITABLE PROBES FOR IDENTIFICATION OF T-DNA
MUTANTS BY SOUTHERN HYBRIDIZATION IN ARABIDOPSIS THALIANA.
Jana Bedřichová, Jana Řepková
Masarykova Univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 602 00 Brno
Arabidopsis thaliana je modelový organismus, často využívaný při inzerční mutagenezi
s cílem identifikovat jednotlivé rostlinné geny. Pomocí inzercí T-DNA lze sledovat lokalizaci
přerušeného genu a jeho důsledek pro organismus. Začlenění T-DNA do rostlinného genomu
vede k inzerční mutaci, která má genotypové i fenotypové projevy. Místo, kam se inzert do
genomu začlenil, můžeme zjistit na úrovni fenotypu, ale především na úrovni DNA
molekulárními metodami. K jednoznačnému důkazu identifikace primárních transformantů
slouží metoda Southernova přenosu. Touto metodou lze efektivně zjistit přítomnost či
absenci sekvencí inzertu, počet kopií inzertu a informaci o jeho možném přeuspořádání.
Cílem projektu bylo vytvořit vhodné sondy, které budou hybridizovat k pravé a levé hraniční
sekvenci inzertu a sondu pro oblast obsahující gen NPT II (neomycinphosphotransferase)
kódující rezistenci ke kanamycinu. Pro přípravu sond byl použit plazmidový vektor pBGF-0,
který byl naštěpen různými enzymy v restrikčních místech vyskytujících se na T-DNA a PCR
amplifikace s vhodnými primery nasedající na vnitřní oblast genu NPTII.
Rostlinná genomová DNA, která je výchozím materiálem pro Southernův přenos, byla
získána z transgenních linií KAT, které vznikly vakuovou infiltrací rostlin A. thaliana na
pozadí Wasiljevskaja bakteriemi Agrobacterium tumefaciens. Součástí inzertu těchto linií je
signální gen GFP se specifickým promotorem KAT1 zajišťující expresi genu v buňkách
průduchů.
Takto připravené sondy budou dále využity při identifikaci a podrobné analýze primárních
transformantů A. thaliana.
Výsledky uváděné v této publikaci byly získány za finanční podpory projektu MSM 143100008
uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.
STRESOVÁ ODEZVA KAROTENOGENNÍCH KVASINEK NA PŮSOBENÍ
EXOGENNÍCH STRESOVÝCH FAKTORŮ
STRESS RESPONSE OF CAROTENOGENIC YEASTS TO EXOGENOUS STRESS
FACTORS
Drábková M., Kočí R., Kubešová J., Márová I., Omelka L.
Technical University in Brno, Faculty of Chemistry, Department of Food Chemistry
and Biotechnology, Purkyňova 118, 612 00 Brno, Czech Republic
Different types of environmental and physiological stress conditions constantly challenge
all living organisms. Stress responses are of particular importance in microorganisms, whose
environment is highly variable and conditions such as temperature, osmolarity and nutrient
availability are far from constant.
In this work two strains of red yeasts (Rhodotorula glutinis, Sporidiobolus salmonicolor)
producing carotenoids as protective agents against oxidative stress and/or UV damage were
exposed to several types of exogenous stress: oxidative stress (2-10 mM H2O2), osmotic stress
43
(2-10% NaCl), heavy metals (3-5 mM NiCl2), temperature (20-45°C) and intensity
of aeration. During the experiment growth characteristics, production of carotenoids,
ergosterol and glycerol were followed.
Carotenoids were overproduced mainly under oxidative stress, but the other stresses also
led to changes in pigment formation. Both tested strains were very sensitive to higher
concentration of NaCl and NiCl2. In Sporidiobolus salmonicolor addition of 10 mM H2O2 into
production medium led to about 3-fold increase of -carotene production, while pigment
production by Rhodotorula glutinis was higher in medium with 5 mM H2O2. However,
in both strains, addition of low amount of NaCl (2 mmol/l) into inoculum medium followed
by addition of H2O2 (5 mmol/l) into production medium led to higher production
of carotenoids (3.5-times) and to increased tolerance not only to the same stress factor but
also to stress caused by other agents. Higher temperature (34 - 40°C) as well as optimal
amount of oxygene in cultivation medium led to increased of carotenoid production too.
The production of glycerol, which acts as osmoregulator was completely inverse to carotene production.
Overproduction of carotenoids in yeast cells increases their ability and/or adaptability
to grow under various stress conditions. Yeast cells exhibited cross-protection against
different stress agents, thus, carotenoids probably take part in general stress response of red
yeast.
TESTOVÁNÍ NOSIČŮ AKTIVOVANÝCH IONTY LANTHANOIDŮ PŘI ŠTĚPENÍ
PLAZMIDOVÉ DNA
TESTING OF CARRIERS ACTIVATED WITH LANTHANIDE IONS BY
CLEAVAGE OF PLASMID DNA
Magdaléna Dudová, Alena Španová, Bohuslav Rittich
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14,
602 00 Brno
Pro štěpení plazmidové DNA se využívají enzymy – restrikční endonukleázy. Kromě
přírodních enzymů lze ke štěpení použít i neenzymatické systémy, např. kovy vzácných
zemin – lanthanoidy. V případě použití volných lanthanoidových iontů je obtížné definovaně
ukončit reakci ( např. při použití EDTA bylo zjištěno, že vzniklé cheláty rovněž štěpí
plazmidovou DNA). Tento problém lze odstranit použitím nosičů funkcionalizovaných
chelátovými skupinami, které jsou aktivovány vhodnými ionty.
Bylo testováno použití nemagnetických nosičů, aktivovaných ionty lanthanoidů, při
štěpení plazmidové DNA pBR322. Jako nosiče byly použity: methakrylátový kopolymer se
skupinami EDTA (ethylen diamino tetraoctová kyselina) a Chelex 100 – polystyren se
skupinami IDA (iminodioctová kyselina). Nosiče byly aktivovány vybranými
lanthanoidovými ionty – Nd3+, La3+, Pr3+, Gd3+ a Eu3+.
Štěpící směs pro každý ion obsahovala 0,3 µl plazmidové DNA pBR322 (1 µg/µl), 2 µl
reakčního HEPES pufru ( 0,05 M), 10 µl nosiče aktivovaného příslušným lanthanoidovým
iontem a 7,7 µl sterilní vody. Štěpící reakce probíhala při 76°C.
Štěpení plazmidové DNA bylo sledováno pomocí gelové elektroforézy na agaróze, na níž
lze rozlišit různé strukturní formy plazmidu: nadšroubovici, relaxovanou formu vznikající po
ss zlomu v jednom řetězci a lineární formu vznikající po ds zlomu obou řetězců.
Bylo zjištěno, že ionty zavádějí do plazmidové DNA jak ss, tak ds zlomy. Rozdíly
v rychlosti štěpení plazmidové DNA lze vysvětlit různými vlastnostmi jednotlivých iontů i
použitých nosičů
44
IDENTIFIKACE A CHARAKTERIZACE GENŮ DETERMINUJÍCÍCH
EMBRYOGENEZI PROSTŘEDNICTVÍM T-DNA MUTACÍ ARABIDOPSIS
THALIANA
IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF GENES DETERMINING
EMBRYOGENESIS BY MEANS OF T-DNA MUTATIONS IN ARABIDOPSIS
THALIANA
Markéta Dudová, Zdeňka Kyjovská, Jana Řepková, Tomáš Kocábek2
MU v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2,
611 37 Brno
Jihočeská univerzita, České Budějovice2
Jedním z nejlépe prostudovaných zástupců rostlin v oblasti molekulární biologie a genetiky
je Arabidopsis thaliana, huseníček rolní. V roce 2000 bylo v rámci projektu The Arabidopsis
Geonome Initiative kompletně dokončeno sekvencování genomu této rostliny. V současné
době je v popředí snaha o identifikaci funkcí jednotlivých genů a jejich vzájemných vztahů.
Tato práce se zaměřila na genetickou a molekulární analýzu tří nových mutantních linií,
které byly indukovány T-DNA inzerční mutagenezí a nesou embryonální defekty. Inzert TDNA nese selektovatelný gen pro enzym hygromycinfosfotransferázu. U jednotlivých linií
byl mutantní fenotyp sledován prostřednictvím studia anatomie embryogeneze metodou
projasňování semen chloralhydrátem. U linie 1321 byl pozorován defekt embrya ve stádiu
zralosti doprovázený defektem tvorby pigmentu. U linie 1293 byla inhibována tvorba
listových primordií, jejímž důsledkem byla absence děloh u embrya. Atypické dělení buněk
v apikální části embrya od globulárního stádia vývoje bylo pozorováno u linie 1265.
Podrobná genetická analýza generací F1 a F2 potomstva křížení rostliny standardní a
heterozygotní pro sledované mutace potvrdila jejich monogenní a recesivní typ dědičnosti.
U linie 1293 bylo provedeno genetické mapování mutantní alely lokusu prostřenictvím
DNA markerů. Byla potvrzena vazba s mikrosatelitovým markerem nga 63 a pozice
sledovaného lokusu byla určena na 10,4 cM od začátku chromozomu 1.
Obsahem další analýzy bude ověření kosegregace T-DNA inzertu s mutací, což bude
rozhodující pro volbu strategie izolace jednotlivých genů.
Výsledky uváděné v této publikaci byly získány za finanční podpory projektů MSM 143100008
a FRVŠ 64/547 udělených Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.
ANALÝZA PROTEOMU POLYVALENTNÍHO BAKTERIOFÁGA 812
PROTEOME ANALYSIS OF THE POLYVALENT BACTERIOPHAGE 812
Eyer, L.1, Konečná, H.2, Zdráhal, Z.2, Preisler, J.3, Pantůček, R.1, Doškař, J.1
1
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
2
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a
proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno
3
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie,
Kotlářská 2, 611 37 Brno
Bakteriofág 812 je polyvalentní stafylokokový fág, lyzující široké spektrum druhů rodu
Staphylococcus, převážně pak kmeny druhu S. aureus. Pro své lytické vlastnosti je vhodným
kandidátem pro fágovou terapii, při níž jsou bakteriofágy využívány pro léčbu
45
stafylokokových infekcí, převážně těch, které jsou vyvolány kmeny rezistentními k
antibiotikům. V této práci se zaměřujeme na analýzu fágového proteomu, a to především na
strukturní a lytické proteiny, které mají vztah k rozmezí hostitele. Fág 812 byl pomnožen na
kmeni S. aureus SA812, purifikován ultracentrifugací v gradientu CsCl a dialyzován proti
vodě. DNA uvolněná z fágových částic byla odstraněna DNázou I. Fágové proteiny byly
denaturovány krátkodobým povařením s pufrem obsahujícím SDS a DTT a analyzovány
jednorozměrnou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Po obarvení gelu pomocí
Coomassie Brilliant Blue nebo stříbra bylo nalezeno přibližně 15 pruhů. 6 z nich bylo
výrazných. K identifikaci proteinů v 12 pruzích byla použita metoda peptidového mapování.
Proteiny byly podrobeny specifickému štěpení trypsinem a m/z získaných peptidů (peptidové
mapy) pro daný protein byly změřeny MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionisation Time-Of-Flight) hmotnostní spektrometrií. Tyto peptidové mapy byly
porovnávány s teoretickými peptidovými mapami již známých proteinů fága 812.
Aminokyselinové sekvence těchto proteinů byly získány přepisem známých sekvencí fágové
DNA. Z dosud analyzovaných proteinů byly identifikovány tři, z nichž dva jsou určeny jako
strukturní - hlavní kapsidový a hlavní bičíkový protein, funkce třetího proteinu zatím nebyla
zjištěna. V současné době studujeme rozdíly v proteomu fága 812 a příbuzných fágů SK311 a
U16 s cílem zjistit, jak tyto rozdíly souvisejí s jejich odlišným hostitelským rozmezím.
Práce byla podporována granty MŠM 143100008, GAČR 203/03/0515 a FRVŠ 796/2003.
ANALÝZA POSTTRANSLAČNÍCH MODIFIKACÍ PROTEINU P53, NA PANELU
BUNĚČNÝCH LINIÍ SE ZNÁMÝM STATUTEM P53, PO ÚČINKU CYTOSTATIK.
Šárka Helánová, Petr Müller, Roman Hrstka, Pavla Češková a Bořivoj Vojtěšek
Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
P53 je oligomerní fosfoprotein, který se váže na specifické sekvence DNA a tím
aktivuje nebo inaktivuje transkripci cílových genů jak in vivo tak in vitro. Různé funkce
proteinu p53 jsou regulovány sérií jeho postranslačních modifikací jako jsou fosforylace nebo
acetylace. Jedním z nejdůležitějších míst fosforylace proteinu p53 je serin 15 jehož
modifikace vede k rozrušení vazby mezi p53 a MDM2 a má za následek (i) stabilizaci
nemutované formy proteinu p53, (ii) porušení jeho transportu z jádra a (iii) stimulaci jeho
transkripční aktivity spojené se zvýšenou asociací s koaktivátorem p300. Druhou kritickou
modifikací proteinu p53 je fosforylace serinu 392 na C-konci. Studie podporující onkogení
účinek proteinu p53 ukázaly, že bodové mutace v genu kódujícím p53 protein mají za
následek vznik strukturálně odlišného proteinu 53. Tyto bodové mutace, které vykazují různé
biologické vlastnosti, byly rozděleny do dvou funkčních tříd: (i) mutace v místech, která
přímo ovlivňují kontakt s DNA a (ii) mutace podílející se na stabilizaci strukturální integrity
této domény. Přestože tyto fosforylace mohou ovlivnit konformační změny nemutovaného i
mutovaného proteinu p53 a tím rovněž změnit jeho DNA vazebnou aktivitu, skutečný význam
fosforylace p53 na serinech 15 a 392 ve vztahu k tumorigenezi lidských nádorů s aberantní
expresí mutované formy proteinu p53 je stále nejasný. Úloha různých typů používaných
cytostatik na posttranslační modifikace proteinu p53 je rovněž nejasná a je nutné provést
danou analýzu nejen ve vztahu k mutované a nemutované formě proteinu p53, ale také k typu
bodové mutace.
Cílem naší studie bylo zjistit zda existuje souvislost mezi statutem posttranslačních
modifikací proteinu p53 na obou výše zmiňovaných místech a reakcí nádorových buněčných
linií na používaná cytostatika. Naše výsledky ukazují, že vlivem použití rozdílných cytostatik
46
dochází k rozdílné fosforylaci proteinu p53 na serinu 15 a serinu 392. Tyto fosforylace však
neovlivňují DNA vazebnou aktivitu ani stabilitu proteinu p53 jak je známo u nemutované
formy proteinu p53. Dle získaných výsledků vyplývá, že typ bodové mutace může ovlivnit
výsledný stupeň modifikace.
Práce byla podporována granty IGA MZ ČR 7131-3/2002 a GA ČR 301/02/0831
VZTAH BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS OXIDUJÍCÍ
ANORGANICKÉ SIRNÉ LÁTKY K BIOOXIDACI PYRITU
Šárka Helánová1, Alena Španová2, Martin Mandl1, Pavel Bouchal1
1
Katedra biochemie, 2Katedra mikrobiologie,
Přírodovědecká fakulta MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Oxidace pyritu je důležitým procesem při biodegradaci sulfidových odpadů
kontaminujícím životní prostředí kyselinou sírovou. Ze sledování procesu biooxidace pyritu
pomocí minerální elektrody vyplývá, že bakterie rostoucí na síře nejsou schopné oxidovat
pyrit, naopak spíše dochází k vytvoření redukčních podmínek v roztoku s pyritem
v přítomnosti bakterií. Buňky Acidithiobacillus ferrooxidans dlouhodobě udržované na síře
jako substrátu postupně ztrácí schopnost okamžitě oxidovat pyritový koncentrát a Fe2+.
Oxidace nastává až po lag fázi zřejmě způsobené indukcí železooxidujícího systému. Délku
lag fáze ovlivňuje pH, buňky v lag fázi vykazují mnohem větší citlivost k aciditě. Zjištěným
limitujícím faktorem je dusík, malé množství NH4+ obnoví původní parametry rychlosti
oxidace pyritu.
Naše kinetická měření potvrzují předpoklady, že při dlouhodobé oxidaci síry dochází
ke ztrátě schopnosti A. ferrooxidans oxidovat Fe2+ a pyrit, tato pozorovaná fenotypová změna
byla již v literatuře popsána a byla klasifikována jako reverzibilní transpozomová mutace.
Tento závěr autoři učinili na základě kultivačních experimentů na pevném mediu . Případná
přítomnost lag fáze v důsledku indukce železooxidujícího systému nemohla být detekována.
Na základě našich výsledků se domníváme, že změny ve schopnosti oxidace jednotlivých
substrátů lze vysvětlit spíše adaptačními mechanizmy než mutací. Pro objasnění
metabolických změn u A. ferrooxidans v průběhu adaptace byla provedena analýza proteomu.
Předběžné výsledky svědčí o změnách v proteomovém složení u bakterií v jednotlivých
stupních adaptace ze sirného substrátu na Fe2+.
Jelikož průkaz přítomnosti A. ferrooxidans v kultuře je založen na schopnosti oxidovat
Fe2+, a právě tato schopnost se v důsledku dlouhodobých adaptačních procesů ztrácí, byla
nově zavedena a optimalizována molekulárně biologická detekce přítomnosti A. ferrooxidans
pomocí sekvence genu pro 16S RNA. Byla optimalizována lyze buněk kultivovaných na
pevném médiu s následnou izolací a purifikací DNA, byla optimalizována vlastní PCR
reakce, purifikace PCR produktů a probíhá optimalizace sekvenace amplifikovaného
fragmentu DNA o délce 1,4 kb.
Tato práce byla podporována grantem GAČR č. 525/04/1309
47
STUDIUM ODBOURÁVÁNÍ SÍŤOVANÝCH POLYSACHARIDŮ
MIKROBIÁLNÍMI PEKTINASAMI
THE STUDY OF THE DEGRADATION OF CROSS-LINKED POLYSACCHARIDES
BY MICROBIAL PECTINASES
Jančeková L., Omelková J., Bednář M.
Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Purkyňova 118, Brno 61200,
[email protected]
The enzymatic degradation of pectic acid, and its modified forms by polygalacturonase
from pectolytic complex Rohament P was studied. Pectic (polygalacturonic) acid (PGA) is
usually prepared from natural pectin by deesterification. Pectin and PGA are polysaccharides
existing in the cell walls of land-plant tissues, and seaweeds, where they function as an
intercell cementing material. They are the natural substrates of pectolytic enzymes. These can
be classified according to their mode of action on the galacturonan part of the pectin
molecule. Polygalacturonase catalyzes the hydrolytic cleavage of α(1→4) galacturonan
linkages of pectin. The modified water-insoluble forms were prepared from unmodified
biopolymers by crosslinking with 1,3-bis(3-chloro-2-hydroxypropyl)imidazolium hydrogen
sulphate. It was shown that insoluble forms underwent, similarly as with soluble ones, the
enzymatic degradation.
The enzymatic degradation of water-insoluble and water-soluble polymers was investigated
by analysis of the quantity of reducing groups. The results obtained by this method were used
to determine the kinetic constants of water-insoluble forms of polymer.
STUDIUM MEMBRÁNOVÉ TOPOLOGIE CYTOCHROMŮ P450 POMOCÍ
FOTOLABILNÍCH SLOUČENIN
STUDY OF MEMBRANE TOPOLOGY OF CYTOCHROMES P450 USING
PHOTOLABILE COMPOUNDS
1
Martin Karabec1, Miroslav Šulc1,2, Petr Hodek1
Charles University in Prague, Faculty of Nature Science, Department of Biochemistry,
Hlavova 2030, 128 43 Prague 2
2
Institute of Microbiology AV CR, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4
The cytochromes P450 are located in membrane of endoplasmic reticulum. The
membrane topology of the mammalian P450 cytochromes has been studied intensively by
computational approaches, proteolysis, chemical modification, genetic engineering, and
immunochemistry. Recent results shows, that cytochrome P450 core is hold in membrane by
one or two transmembrane helixes, located at the NH2- terminal end. And also part of enzyme
body might be inserted into membrane.
We are going to approach this topic by using photoaffinity labeling, which is a
chemical modification technique used to study protein structure and interactions. Highly
reactive intermediate which is able to modify amino acid residues of a protein is generated by
UV-light irradiation at certain place and exact time.
For phenobarbital-inducible cytochrome P450 2B4 was designed diamantane like
probe 3-azidiamantane [spiro-(diazirine-3,3’-diamantane)], whom high affinity is also proved
for cytochrome P450 1A1. Label is deuterized for easier identification by mass spectroscopy.
48
To examine topology of cytochrome P450 anchoring we use bilayer of
phosphatidylcholine as membrane substitute. Its high hydrophobic medium considers high
solubility of our hydrophobic label in this phospholipid bilayer. Upon photolysis (366 nm)
deuterized 3-azidiamantane gives highly reactive carbene intermediate, which modifies amino
acid residues, contained in transmembrane peptides or in part of body that might be fitted-in
to bilayer.
Modified enzyme and its transmembrane anchor are cleaved by proteases and labeled
peptides are separated on HPLC RP C18. Separated peptides are analyzed on MALDI TOF
and MS-DECA, where we search for double peaks differenced m/z=2, because our
photolabile probe was not deuterized for 100%, but there was used mixture of deuterized and
not deuterized 3-azidiamantane during our experiment.
This study was supported by Grant MSM-113100001 from Ministry of Education of the Czech
Republic.
PREPARATION OF SUBCELLULAR SYSTEMS OF YEAST CANDIDA
TROPICALIS AND THEIR PHENOLHYDROXYLASE ACTIVITY
PŘÍPRAVA SUBCELULÁRNÍCH SYSTÉMŮ KVASINKY CANDIDA TROPICALIS A
JEJICH FENOLHYDROXYLASOVÁ AKTIVITA
Jan Páca Jr.a, Veronika Sucháa, Michal Tureka, Veronika Kremláčkováa, Iva Mátlováa, Jan
Pácab, Marie Stiborováa
a
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40
Praha 2, Česká republika.
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5,
166 28 Praha 6, Česká republika.
Řada složek životního prostředí je v současné době kontaminována fenolickými látkami.
Zdroje kontaminace jsou především odpadní vody z rafinérií ropy, výroby celulosy, provozů
tepelného zpracování uhlí atd. Kvasinky rodu Candida tropicalis jsou schopné využívat
fenolu jako zdroje uhlíku a energie. Hydroxylace fenolu na katechol je prvním, limitujícím
krokem aerobní degradace fenolu. Následné přeměny tohoto produktu katalyzují enzymy
štěpící aromatické dihydroxyderiváty. Katechol-1,2-dioxygenasa (EC 1.13.11.1) oxiduje
katechol za vzniku kyseliny cis, cis-mukonové (ORTHO dráha), která se dále metabolizuje
na acetyl CoA a sukcinát. Pokud se na metabolismu katecholu podílí katechol-2,3dioxygenasa (EC 1.13.11.2), jedná se o META dráhu vedoucí k tvorbě semialdehydu kyseliny
2-hydroxymukonové, z které se dále tvoří pyruvát. Konečné produkty obou drah vstupují do
intermediárního metabolismu buňky. Eukaryotní mikroorganismy obecně preferují štěpení
aromatického kruhu katecholu ORTHO drahou. Cílem práce bylo poznat nejefektivnější
metodu pro dezintegraci buněk kvasinky Candida tropicalis k získání dostatečného množství
mikrosomální a cytosolární frakce těchto buněk. Obě subcelulární frakce jsou nutné pro
sledování enzymů účinných v prvém kroku biodegradace fenolu studovaným
mikroorganismem, hydroxylaci fenolu na katechol. V této práci byla tedy dále zjišťována
fenolhydroxylasová aktivita v obou získaných frakcích. Z kvasinek C. tropicalis, rostoucích
ve třech různých mediích v přítomnosti glukosy, fenolu nebo obou těchto zdrojů uhlíku, byly
nejvhodnější zjištěnou desintegrační metodou (tj. vymražováním buněk kapalným dusíkem
v kombinaci s mechanickou desintegrací) buňky desintegrovány a následně z nich izolovány
subcelulární kompartmenty, mikrosomy a cytosol. V obou těchto buněčných frakcích byla
sledována aktivita enzymů potenciálně schopných oxidovat fenol. Zatímco žádná aktivita
49
nebyla detekována v mikrosomech a cytosolu buněk rostoucích na glukose, buněčné
kompartmenty C. tropicalis, rostoucí v mediu obsahujícím fenol, vykazovaly
fenolhydroxylasovou aktivitu. V mikrosomech byla zaznamenána indukce hlavních složek
monooxygenasového systému se smíšenou funkcí, cytochromu P450 (EC 1.14.15.1) a
NADPH:cytochrom P450 reduktasy (EC 1.6.2.4), schopných hydroxylovat fenol. Stejně tak i
v cytosolu došlo působením fenolu k indukci flavoproteinové monooxygenasy, NADPHdependentní fenolhydroxylasy (EC 1.14.13.7). S využitím originálně vyvinuté metody HPLC
a pomocí hmotnostních analýz bylo zjištěno, že fenol je monooxygenasami C. tropicalis
oxidován na katechol. V práci porovnáváme účinnost hydroxylačních enzymů obou
buněčných kompartmentů s cílem jejich potenciálního využití v bioremediacích.
Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM
1131 00001).
CLONING AND EXPRESSION OF CRT GENES FROM ERWINIA CAROTOVORA
KLONOVÁNÍ A EXPRESE CRT GENŮ Z ERWINIA CAROTOVORA
Kubešová J., Pokorná J., Drábková M., Márová I., Omelka L.
VUT- Fakulta chemická, Purkyňova 118, 612 00 Brno
The bacteria Erwinia carotovora is gram-negative epiphytic non-photosynthetic
bacterium with aerobic metabolism, which produces carotenoids (phytoene, lycopene, βcarotene, β-cryptoxanthin, zeaxanthin, zeaxanthin glucosides) and pectinolytic, cellulolytic
and proteolytic enzymes. Caroteinds are industrially significant pigments with antioxidant
activity, which act as protective agents against reactive oxygen species and UV irradiation.
Carotenoid production in E. carotovora is encoded by crt gene cluster containing 6 genes
localized on dsDNA. In this work possibility of cloning and expression of crt gene cluster
isolated from Erwinia carotovora in recipient strain E.coli DH5α was tested. Isolation of crt
genes was proved using XbaI, EcoRI and HindIII restriction endonucleases. Plasmid vector
pHSG298 with insert on size about 900 bp was used for transformation of chemically
competent E.coli DH5α cells. Transformants were selected based on genotype as well as
fenotype changes: a) resistance of transformants to kanamycin encoded by pHSG298, b)
formation of orange-coloured E.coli colonies, c) isolation and analysis of size of recombinant
plasmid, d) HPLC analysis of carotenoids produced by recombinant E.coli cells. In individual
transformants lutein, lycopene, β-carotene and phytoene were demonstrated. Amount of
carotenoids isolated from E.coli cells transformed by pHSG298crt was higher than those from
E.carotovora cells.
REACTIONS OF PLANT AMINE OXIDASES WITH N6-AMINOALKYL
DERIVATIVES OF ADENINE
Zbyněk Lamplot1, Marek Šebela1, Alessandra Padiglia2, Rosaria Medda2, Giovanni Floris2
and Pavel Peč1
1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783
71 Olomouc
2
Department of Sciences Applied to Biosystems, University of Cagliari, Città Universitaria, I09042 Monseratto (CA), Italy
50
Plant copper-containing amine oxidases (EC 1.4.3.6) catalyse the oxidation of various
amines. The best substrates of the enzymes are the diamines cadaverine (pentane-1,5-diamine)
and putrescine (butane-1,4-diamine). Once there was a hypothesis that the enzymes could
oxidise cytokinins - plant hormones derived from adenine [Hare, P.D. and van Staden, J.
(1994) Physiol. Plant., 91, 128]. However, detailed experiments on this topic did not confirm
this. Conversely, it has been shown that cytokinins are inhibitors of amine oxidases
[Galuszka, P. et al. (1998) J. Enzyme. Inhib. 13, 457].
We have synthesised several N6-aminoalkyl derivatives of adenine using an established
method. The synthesis was based on the reaction of 6-chloropurine with various C3 and C4
diamines (bases) in butanol by heating at 90-110 oC in the presence of triethylamine. Crude
preparations were purified by repeated crystallisation. The final purity of products was
checked by measuring the corresponding melting points, by elemental analysis and mass
spectrometry. The compounds prepared were as follows: N6-(4-aminobutyl)adenine, ABAD,
(from putrescine); N6-(3-aminopropyl)adenine, APAD (from propane-1,3-diamine); N6-(4amino-trans-but-2-enyl)adenine, ATBAD (from trans-but-2-ene-1,4-diamine); N6-(4-aminocis-but-2-enyl)adenine, ACBAD (from cis-but-2-ene-1,4-diamine) and N6-(4-aminobut-2ynyl)adenine, ABYAD (from but-2-yne-1,4-diamine).
The above-mentioned compounds were tested in reactions with three plant coppercontaining amine oxidases isolated from grass pea (Lathyrus sativus), lentil (Lens esculenta)
and a Mediterranean shrub (Euphorbia characias). First, reaction rates of conversion were
measured to decide between substrate and inhibitory properties of the compounds toward the
enzymes. For substrates (ABAD, ATBAD), Km values and the reaction stoichiometry were
measured. For inhibitors (APAD, ACBAD, ABYAD), kinetic measurements were performed
to determine the inhibition type and potency. APAD and ACBAD seem to be competitive
inhibitors of all three enzymes. For ABYAD, the mechanism of inhibition is still uncertain.
Anaerobic absorption spectra measured after the additions of ABAD and ATBAD to the
enzymes clearly confirmed their interaction with the cofactor topaquinone. This interaction
leads to the formation of the semiquinone radical form of the cofactor showing characteristic
absorption maxima as it is for any usual substrate.
This work was supported by the grants MSM 153100010 and 14 BI3 (within the Czech-Italian
co-operation) from the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic.
DETECTION OF CYP1A1 PROTEIN IN HUMAN HEPATIC MICROSOMES AND
ITS RELATIONSHIPS WITH ENZYME ACTIVITY
Marie Stiborová, Václav Martínek, Helena Rýdlová, Tomáš Koblas, Petr Hodek
Department of Biochemistry,Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128
40 Prague 2, The Czech Republic, [email protected], [email protected]
Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) has been implicated in the conversion of numerous
polycyclic aromatic hydrocarbons into reactive species capable of binding covalently to DNA
and has therefore been postulated to be involved in the initiation of carcinogenesis [1]. To
date, there is conflicting evidence for the expression of CYP1A1 protein in human liver. In
this study, western immunoblotting employing a partially purified polyclonal chicken anti-rat
CYP1A1 antibody having extremely high efficiency to recognize human CYP1A1 was used
to detect CYP1A1 in human hepatic microsomes. The used antibody did not cross-react with
human CYP1B1, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2E1 and 3A4, but did strongly recognize
51
CYP1A1. However, there was a very weak cross-reactivity of the antibody with human
CYP1A2, ~80-fold less compared with CYP1A1. A detection sensitivity of western blot
analysis with this antibody was as low as 0.005 pmol CYP1A1 per lane. Human hepatic
microsomal samples from nine American Caucasian donors were analyzed for the CYP1A1
expression. In immunoblots, the anti-rat CYP1A1 antibody reacted with two immunoreactive
bands in most analyzed human hepatic microsomal samples. The faster migrating protein
band was CYP1A1 as shown by N-terminal sequencing previously (Stiborová et al. Cancer
Res. 62, 5678-5684, 2002). CYP1A1 expression levels varied significantly among the
different human microsomes (0.03 - 0.4 pmol/mg protein). Significant correlations between
the immunoreactive content of human CYP1A1 and activities selectively catalyzed by this
enzyme (oxidation of Sudan I in the presence of a CYP3A4 inhibitor, ketoconazole)
corroborated the content of enzymatically active CYP1A1 protein in human microsomal
samples analyzed in our study. In conclusion, CYP1A1 appears to be expressed in human
liver at low levels, being present at ~0.65% of the total hepatic CYP complement.
References
[1] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer
Res. 2002, 62, 5678-5684.
Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of
Education of the Czech Republic (MSM 113100001).
GUANYL ARYLATION OF TRANSFER RNA BY CARCINOGENIC SUDAN I (1PHENYLAZO-2-HYDROXYNAPHTHALENE, SOLVENT YELLOW 14)
ACTIVATED BY PEROXIDASE
Marie Stiborová1, Václav Martínek1, Marcela Semanská1, Jan Seibal2, Heinz H. Schmeiser3,
Eva Frei3
1
Department of Biochemistry, 2Department of Organic Chemistry, Faculty of Science,
Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic,
[email protected]
3
Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, In Neuenheimer
Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany
1-(Phenylazo)-2-hydroxynaphthalene (Sudan I, Solvent Yellow 14) is a liver and urinary
bladder carcinogen in mammals. Peroxidases in presence of H2O2 oxidize Sudan I to reactive
intermediates (radicals), which are able to covalently modify DNA, RNA and proteins [1].
This covalent adducts differ from those formed from Sudan I activated by cytochromes P450
[2]. Present study is focused on further characterization of the major adduct formed in nucleic
acids.
Transfer RNA (tRNA) was reacted with Sudan I activated by peroxidase, and the adducts
formed were analyzed by 32P-postlabelling technique. Two enrichment procedures (1-butanol
extraction and nuclease P1 digestion) of this technique were employed for detection and
quantitation of the adducts formed in tRNA. Co-chromatographic analyses of adduct spots
obtained by reaction with tRNA or homopolyribonucleotides showed that the major Sudan ItRNA adduct was formed by reaction of peroxidase-activated Sudan I with guanosine.
Because amount of adducts isolated from modified tRNA was insufficient for further
characterization, enzymatic synthesis of appropriate standard was carried out. Guanosine 5´monophosphate, guanosine and/or deoxyguanosine was incubated with Sudan I in presence of
52
horseradish peroxidase and H2O2. The adduct corresponding to that found in tRNA was
isolated utilizing combination of extraction, TLC and HPLC methods.
These adduct standards were characterized by UV/Vis absorbance spectroscopy and mass
spectrometry. It is evident that the whole Sudan I molecule (with the intact conjugated
system) is bound to (deoxy)guanosine residues. More detailed structural characterization of
the major Sudan I adduct was conducted using NMR. Free radical localized in position 4 of
Sudan I molecule attacks either 2N or 6O atom of guanine part of the (deoxy)guanosine
molecule. To finalize the structural characterization of the major Sudan I adduct in tRNA,
other techniques including IR spectrometry will be utilized.
References
[1] Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M., and Hradec, J. Carcinogenesis,
11: 1843-1848, 1990.
[2] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer
Res. 2002, 62, 5678-5684.
Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of
Education of the Czech Republic (MSM 113100001).
STUDY ON BINDING OF PEROXIDASE-MEDIATED RADICALS OF 1PHENYAZO-2-NAPHTHOL (SUDAN I) AND ELLIPTICINE TO GLYCOPROTEINS
Václav Martínek1, Karel Bezouška1, Eva Frei2, Marie Stiborová1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128
40 Prague 2, The Czech Republic, [email protected], [email protected]
2
Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, In Neuenheimer
Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany
1
Glycosylation is one of the major naturally occurring modifications of the covalent
structure of proteins. Although much is known about the structure and biosynthesis of
oligosaccharides in glycoproteins, the central question of how glycosylation contributes to the
glycoprotein structure and function is not entirely clear. Many specific effects have been
observed, such as regulation of intracellular traffic and localization of proteins, modulation of
their immunological properties, participation in cell-cell interactions, stabilization of protein
conformation, protection of proteins from proteolysis, enhancement in their solubility, and
many others [1]. In the present work, we show another role of carbohydrate moiety of
glycoproteins; it might also contribute to protect proteins from covalent modification of their
molecules by radicals.
To study this subject, several model proteins with different degree of glycosylation were
examined for their modification by radicals generated from two xenobiotics [1-phenylazo-2hydroxynaphthalene (Sudan I) and ellipticine]. Both these chemicals form radicals during
their oxidation by peroxidases. Sudan I is a liver and urinary bladder carcinogen in mammals.
This carcinogen is metabolically activated by cytochromes P450 and peroxidases to reactive
species binding covalently to nucleic acids and proteins [2,3]. Ellipticine is an alkaloid
exhibiting significant antineoplastic and anti-HIV activities. This anticancer agent is oxidized
by peroxidases via a radical mechanism and this reaction might participate in enhancing its
pharmacological efficiencies [4]. The levels of binding of radicals generated from both
xenobiotics by peroxidases are dependent on degree of protein glycosylation, being highest
for non-glycosylated proteins: human serum albumin, bovine serum albumin and lysozyme,
53
and followed by asilofetuin > calf fetuin > chicken ovomucoid > Tamm-Horsfall glycoprotein
and 1-acid glycoprotein. The results showed in the study demonstrate for the first time a
novel role of carbohydrate parts of glycoprotein molecules, namely, their protective effects
against modification by xenobiotic-derived radicals.
References
[1] Wang C, Eufemi M, Turano C, Giartosio A: Biochemistry 35, 7299-307 (1996).
[2] Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M., and Hradec, J. Carcinogenesis,
11: 1843-1848, 1990.
[3] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer
Res. 2002, 62, 5678-5684.
[4] Frei E., Borek-Dohalska L., Wiessler M., Stiborova M.: Proc. Am. Assoc. Cancer Res.
42, 252 (2001).
Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of
Education of the Czech Republic (MSM 113100001).
VYUŽITÍ AVIDIN-BIOTINOVÉ TECHNOLOGIE PRO ELEKTROCHEMICKOU
DETEKCI NUKLEOVÝCH KYSELIN
USING OF AN AVIDIN-BIOTIN TECHNOLOGY FOR ELECTROCHEMICAL
DETECTION OF NUCLEIC ACIDS
Michal Masařík1, René Kizek2, Jan Vacek2, Libuše Trnková3, Ladislav Havel4,
František Jelen1
1
Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, Královopolská 135, 612 65 Brno
2
Ústav chemie a biochemie MZLU Brno
3
Katedra teoretické a fyzikální chemie PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno
4
Ústav botaniky a fyziologie rostlin MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno
Bakterie Streptomyces avidinii produkuje streptavidin (STV), který váže biotin ze
svého okolí. STV je tetramer o čtyřech identických podjednotkách složených z osmi
antiparalelních β-skládaných listů STV (Mr 16 500) je složen ze 159 aminokyselin (obsahuje
6 molekul tyrosinů a 6 tryptofanů).
Nedávno jsme publikovali modifikaci uhlíkové pastové elektrody STV. Elektrodový
systém se skládal z modifikované pastové uhlíkové pracovní elektrody (uhlík:minerální olej;
STV), Ag/AgCl/3M KCl (referenční elektroda) a pomocné platinové elektrody. Množství
uhlíku a minerálního oleje ovlivňuje elektrochemickou odpověď STV přítomného v pracovní
elektrodě. Zjistili jsme, že maximální signál 10 µg/mL STV přítomného v pracovní elektrodě
získáme při poměru 70 : 30% (uhlík:minerální olej). Elektrochemické měření technikou
adsorptivní přenosové square wave voltametrie (AdT SWV) bylo provedeno v prostředí
acetátového pufru. Studovali jsme vliv různých koncentrací (5 – 500 ng/mL) STV přidaných
do pastové elektrody. Zaznamenané výšky oxidačních signálů STV vykazovaly lineární
závislost vyjádřenou rovnicí: y = 1.0043x + 9.0444 (R2 = 0.996). Limit detekce STV
přítomného v pracovní elektrodě byl pod 5 ng/mL. Změnou výšek elektrochemických signálů
STV bylo možné pozorovat vazbu STV s biotinem. Biotin vázající se na STV vede
k rychlému poklesu oxidačního signálu STV. Tohoto jevu jsme využili k analýze nukleových
kyselin značených biotinem. Analyzovaný vzorek biotinylované nukleové kyseliny byl
adsorbován z 6 µL a elektroda omyta v 80% ethanolu (odmytí nespecificky vázané DNA).
AdT SWV poskytovala tři oxidační signály. Kolem potenciálu 0.6 V byl sledován signál STV
54
přítomného v elektrodě, kolem potenciálu 0.8 V byl pozorovatelný oxidační signál guaninu a
kolem 1.0 V se objevuje oxidační signál adeninu. Studované elektrochemické signály STV,
guaninu a adeninu se mění v závislosti na jejich koncentraci. Se vzrůstající koncentraci
biotinylem značené nukleové kyselin signál STV klesá a signály guaninu a adeninu vzrůstají.
Nejnižší detekované koncentrace biotinylované nukleové kyseliny se pohybovaly kolem
5 µg/mL.
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
Literatura:
Gonzales M. et al.: J. Biol. Chem. 272, 11288–11294, (1997).
Kurzban P.G. et al.: J. Biol. Chem. 266, 14470–14477, (1997).
González M. et al.: Biol. Eng., 16, 67–72, (1999).
Buckley E. et al.: Electroanal., 3, 43–47, (1991).
Masarik M, Kizek R, Kramer KJ, Billova S, Brazdova M, Vacek J, Bailey M, Jelen F, Howard JA.:
Anal. Chem., 75, 2663-2669, (2003).
Kizek R, Vacek J, Trnkova L, Klejdus B, Kuban V.: Chem. Listy, 97, 1003-1006, (2003).
Kizek R, Havran L, Fojta M, Palecek E.: Bioelectrochemistry, 55, 119-121, (2002).
Fojta M, Havran L, Billova S, Kostecka P, Masarik M, Kizek R.: Electroanal., 15, 431-440, (2003).
STANOVENÍ ISOFLAVONŮ POMOCÍ VYSOKO-ÚČINNÉ KAPALINOVÉ
CHROMATOGRAFIE S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ
ISOFLAVONE DETERMINATION BY HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION
Radka Mikelová1, Jitka Petrlová1, Bořivoj Klejdus1, René Kizek1, Josef Zehnálek1, Vojtěch
Adam1, Jan Vacek1, Libuše Trnková2 a Vlastimil Kubáň1
1
Ústav chemie a biochemie, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Zemědělská 1, CZ611 37 Brno
2
Katedra teoretické a fyzikální chemie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy university,
Kotlářská 2, CZ-611 37 Brno
Přírodní rostlinné metabolity můžeme rozdělit do tří hlavních skupin: terpeny, alkaloidy a
fenylpropanoidy a jim příbuzné fenolické sloučeniny. Jednou z nejvýznamnějších skupin
fenolických sloučenin jsou flavonoidy. Skupina zahrnuje více než 4 500 sloučenin obsahující
podskupinou isoflavonoidů. Mezi nejznámější isoflavony patří aglykony daidzein, genistein,
formononetin a biochanin A, jakož i jejich glykosidy daidzin, genistin, ononin a sissostrin.
Bylo prokázáno, že tyto chemické sloučeniny mají estrogenní účinek u řady druhů savců a
vyvolávající falešnou říji. Řada studií prokázala na pokusech se zvířaty i na tkáňových
kulturách významnou roli těchto fytoestrogenů v přijímané potravě v prevenci osteoporosy,
menopausy, nádorových a srdečních onemocnění.
Flavony jsou zastoupeny především v čeledích Fabaceae a Viciacae. V menší míře se
vyskytují také v řadě dalších čeledí jako jsou Papilionaceae, Iridaceae, Myristicaceae,
Compositae, Amaranthaceae a Rosaceae. Bobovité rostliny jsou jedny z nejvýznamnějších
složek potravy ve světě. Tato skupina rostlin je velmi intenzivně zkoumána, protože v nich
byly prokázány vysoké koncentrace isoflavonů, jako je daidzein a genistein.
V naší práci jsme stanovovali rostlinné isoflavony pomocí elektrochemických (square wave
voltammetry) a chromatografických metod (high-performance liquid chromatography with
55
multidimensional coulometric detection) pro stanovení daidzeinu a genisteinu v biologické
matrici. Vyvinuli jsme velmi senzitivní a reprodukovatelnou metodu pro detekci významných
rostlinných isoflavonů v lidské moči. Limit detekce na kolonu (LOD 3.S/N) byl 5 pg (19
fmol). Detekční limit byl závislý na potenciálu aplikovaném na detekční elektrody.
HO
HO
O
OH
O
OH
Genistein
Daidzein
O
O
OH
Literatura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Mitani, K., Narimatsu, S., Kataoka, H.: (2003) J. Chromatogr. A, 986, 169-177
Nurmi, T., Adlercreutz, H.: (1999) Anal. Biochem., 274, 110-117
Klejdus, B., Štěrbová-Vitamvásová, D., Kubáň, V.: (2001) Anal. Chim. Acta, 450, 81-97
Liggins, J., Bluck, L.J.C., Coward, W.A., Bingham, S.A.: (1998) Anal. Biochem, 264, 1-7
Klejdus, B., Štěrbová, D., Stratil, P., Kubáň, P.: (2003) Chem. Listy, 97, 530-539
Klejdus, B., Kizek, R., Vacek, J., Zehnálek, J., Trnková, L., Kubáň, V.: (2003) J. Chrom. B,
odesláno
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
HUMAN ENZYMES INVOLVED IN METABOLISM OF CARCINOGENIC 2NITROANISOLE: EVIDENCE FOR ITS OXIDATIVE DETOXICATION BY
HUMAN CYTOCHROMES P450
Markéta Mikšanováa, Miroslav Šulca, Helena Rýdlováa, Heinz H. Schmeiserb, Eva Freib and
Marie Stiborováa
a
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40
Prague 2, The Czech Republic,
b
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer
Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany
2-Nitroanisole (2-NA) is an important industrial pollutant and a potent carcinogen for
rodents. Determining the capability of humans to metabolize 2-NA, and understanding which
human cytochrome P450 (P450) enzymes are involved in its activation and/or detoxification
is important in the assessments of individual susceptibility to this environmental carcinogen.
We compared the ability of hepatic microsomal samples from different species including
human to metabolize 2-NA. Comparison between experimental animals and human P450
enzymes is essential for the extrapolation of animal carcinogenicity data to assess human
health risk. Human hepatic microsomes generated the pattern of 2-NA metabolites
reproducing that formed by hepatic microsomes of rats and rabbits. An O-demethylated
metabolite of 2-NA, 2-nitrophenol, and two ring-oxidized metabolites of this metabolite (2,6dihydroxynitrobenzene and 2,X-dihydroxynitrobenzene) were produced. No nitroreductive
metabolism leading to the formation of o-anisidine was evident with hepatic microsomes of
all species. Likewise, no DNA binding of 2-NA metabolite(s) measured with either tritiumlabeled 2-NA or the 32P-postlabeling technique was detectable in microsomes. Therefore,
hepatic microsomal P450s are enzymes responsible for detoxification of this environmental
carcinogen. Using hepatic microsomes of rabbits pre-treated with specific P450 inducers,
microsomes from Baculovirus transfected insect cells expressing recombinant human P450
56
enzymes, purified P450 enzymes, and selective P450 inhibitors we found that human
recombinant P450 2E1, 1A1 and 2B6, as well as orthologous rabbit P450 enzymes are the
most efficient enzymes metabolizing 2-NA. The role of specific P450 enzymes in the human
hepatic microsomal metabolism of 2-NA was investigated by correlating the P450-dependent
catalytic activities in each microsomal sample with the levels of individual metabolites
formed by the same microsomes and by examining the effects of agents that can inhibit
specific P450 enzymes in 2-NA metabolism. Based on these studies, we attribute most of 2NA oxidation metabolism in human microsomes to P450 2E1. These results, the first report
on the metabolism of 2-NA by human P450 enzymes, clearly demonstrate that P450 2E1 is
the major human enzyme detoxifying this carcinogen in human liver.
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/03/0283) and the Ministry of
Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).
IDENTIFICATION OF GENOTOXICITY OF o-ANISIDINE AND ITS
CARCINOGENIC POTENTIAL FOR HUMANS: EVIDENCE FOR o-ANISIDINEDERIVED DNA ADDUCT FORMATION IN RATS AND IN VITRO AFTER ITS
METABOLIC ACTIVATION BY HUMAN CYTOCHROMES P450
Marie Stiborováa, Markéta Mikšanováa, Miroslav Šulca, Lenka Vondráškováa, Andrea
Breuerb, Heinz H. Schmeiserb, Eva Freib
a
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40
Prague 2, The Czech Republic,
b
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer
Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany
2-Methoxyaniline (o-anisidine) is an important pollutant and a potent carcinogen for rodents.
The mechanism of its carcinogenicity was investigated in this study. Here, we used two direct
independent methods, namely 32P-postlabelling and 14C-labeled o-anisidine to show that oanisidine binds covalently to DNA in vitro after its activation by human hepatic microsomes.
We also investigated the capacity of o-anisidine to form DNA adducts in vivo. Male Wistar
rats, used as animal models, were i.p. treated with o-anisidine, and DNA samples from
various organs were analyzed by 32P-postlabeling. Two o-anisidine-specific DNA adducts,
identical to those found in vitro, were detected in urinary bladder, and to a lesser extent, in
liver, kidney and spleen. The highest level of DNA adducts was found in the target organ of
the o-anisidine carcinogenicity, the urinary bladder (4.1 adducts per 107 nucleotides). These
results, demonstrating o-anisidine covalent binding to DNA after metabolic activation in vitro
and in vivo, indicate a genotoxic mechanism of o-anisidine carcinogenicity. To provide
information on the nature of the adducts formed in vivo, they were co-chromatographed in
two independent systems with standardized deoxyguanosine adducts produced by reaction of
an o-anisidine metabolite, N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, with deoxyguanosine 3’monophosphate in vitro. Based on this analysis, two DNA adducts found in rats were
identified to be deoxyguanosine adducts derived from this o-anisidine metabolite. Formation
of o-anisidine-DNA adducts during the o-anisidine oxidation by human hepatic microsomes,
identical with those formed in rat in vivo indicates a potential of human hepatic microsomal
enzymes to activate this carcinogen in human. Indeed, the proximate carcinogenic metabolite
of o-anisidine, N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, is produced by oxidation catalyzed with
human hepatic microsomes. Understanding which human enzymes are involved in such
metabolic activation is useful in evaluating individual susceptibility to this environmental
57
carcinogen. We compared the ability of nine human hepatic microsome samples to catalyze oanisidine oxidation. The role of specific cytochrome P450 (CYP) enzymes in the human
hepatic microsomal metabolism of o-anisidine was investigated by correlating the CYPdependent catalytic activities in each microsomal sample with the levels of individual
metabolites formed by the same microsomes and by examining the effects of agents that can
inhibit specific CYP enzymes in o-anisidine metabolism. Based on these studies, we attribute
most of o-anisidine oxidation in human microsomes to CYP2E1. Using microsomes from
Baculovirus transfected insect cells expressing recombinant human CYP enzymes and
purified CYP enzymes, the participation of this enzyme in o-anisidine oxidation was
confirmed. The results of our study, the first report on the potential of the human microsomal
CYP enzymes to contribute to the activation of o-anisidine, strongly suggest a carcinogenic
potency of this rodent carcinogen for humans.
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/03/0283) and the Ministry of
Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).
POLYGALAKTURONÁZY PRODUKOVANÉ V PRIEBEHU RASTU
AUREOBASIDIUM PULLULANS IZOLOVANÉHO Z LESNEJ PÔDY A ICH
PRAVDEPODOBNÝ VPLYV NA FYTOPATOGÉNNOSŤ MIKROORGANIZMU
POLYGALACTURONASES PRODUCED DURING GROWTH OF
AUREOBASIDIUM PULLULANS FROM THE FOREST SOIL AND THEIR
POSSIBLE INFLUENCE ON THE PHYTOPATHOGENITY OF MICROORGANISM.
Jiřina Omelková¼, Helena Čigašová, Emília Breierová and Eva Stratilová
Faculty of Chemistry of Technical University of Brno, Purkyňova 118, CZ-612 00 Brno
Institute of Chemistry of Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 9, SK-845 38
Bratislava
¼
Aureobasidium pullulans is an yeast-like microorganism able to utilize pectin as a single Csource. This ability is bound with the production of pectolytic enzymes. Polygalacturonases,
enzymes with random action pattern on polymeric substrate (pectate) and
exopolygalacturonases, enzymes cleaving this substrate from nonreducing end and forming Dgalactopyranuronic acid as the sole product are considered to be the main pectolytic enzymes
produced by Aureobasidium pullulans.
Identical conditions of cultivation of Aureobasidium pullulans isolated from forest soil and
pathogenic fungus Aspergillus niger on pectin medium were used in aim to compare the
production of polygalacturonases by these two microorganisms and find the possible
explanation for the pathogenic character of fungus and saprophytic character of
Aureobasidium.
Aspergillus niger produced both endo- and exoenzymes during the whole cultivation, while
Aureobasidium pullulans produced endopolygalacturonases only in the first phases of
cultivation. These enzymes may support the colonization of plant material by microorganism
because of their destruction effect on the plant cell wall. Only the presence of extracellular
exopolygalacturonases without marked effect on the cell walls was detected in the later phases
of growth. The first phase characterized by the production of endoenzymes was prolonged in
the presence of some stress factors and the behaviour of Aureobasidium pullulans responded
the behaviour of pathogenic fungus Aspergillus niger.
Acknowledgement. This work was supported by the VEGA grant No. 2/3160/23.
58
PHENOL BIODEGRADATION BY MIXED MICROBIAL POPULATION IN FLOW
REACTORS
BIODEGRADACE FENOLU SMĚSNOU MIKROBIÁLNÍ POPULACÍ
V PRŮTOČNÝCH REAKTORECH
Jan Páca Jr.a, Jan Pácab, Alena Kostečkováb, Marie Stiborováa
a
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40
Praha 2, Česká republika, Tel: +420-221951285, Fax: +420-2219521283, e-mail:
[email protected]
b
Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5,
166 28 Praha 6, Česká republika; Tel: +420-224353785, Fax: +420-224355051, e-mail:
[email protected]
V současné době je vedle fyzikálně chemických či chemických způsobů odstraňování
škodlivých látek z prostředí platnou variantou také biologické čištění, avšak za podmínky, že
dané látky jsou biologicky rozložitelné. Biologické čištění je ekonomicky výhodnější oproti
fyzikálně chemickým a chemickým procesům při stejné účinnosti čištění. Fenol patří mezi
aromatické polutanty, které jsou přítomny v průmyslových odpadech, a to hlavně z výrob
koksárenských, petrochemických, farmaceutických a z výrob umělých hnojiv, barviv,
výbušnin, fungicidů a fenolformaldehydových pryskyřic. Z odpadních vod je fenol vzhledem
k rychlejšímu a všestranějšímu metabolismu mikroorganismů lépe odstraňován v aerobním
prostředí.
Práce se zabývá problematikou degradace fenolu z vodného prostředí. K degradaci byly
použity náplňové reaktory. Pro imobilizaci buněk byla použita kokosová vlákna, dva druhy
pěnového polyuretanu, porézní skleněné kuličky a expandovaná břidlice. Jako biokatalyzátor
sloužila speciálně připravená směsná mikrobiální populace. Byly používány dva typy
bioreaktorů. Degradace probíhaly při teplotě 30 °C a pH 7,2.
Testováno bylo, který z použitých materiálů je pro imobilizaci buněčné populace
nejvhodnější, dále vliv vstupní koncentrace fenolu a z toho plynoucí vliv organické zátěže na
provozní charakteristiku bioreaktorů.
Výsledky ukázaly, že degradační aktivita biosystému závisí na velikosti vstupní zátěže a
na materiálu náplně reaktorů.
Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM
1131 00001).
FUNCTIONAL MORPHOLOGY OF NASAL MUCOUSE MEMBRANE
FUNKČNÍ MORFOLOGIE NOSNÍ SLIZNICE
Hana Pácováa, Jaromír Astla, Jindřich Martínek b
a
Klinika Otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku, 1. lékařská fakulta, Univerzita
Karlova, V Úvalu 84, 150 00 Praha 5, Česká republika, Tel.: +420-224434397, e-mail:
[email protected]
b
Ústav pro histologii a embryologii, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 4,
128 01 Praha 2, Česká republika, Tel.: +420-224968127, e-mail: [email protected]
59
Aktuální stav životního prostředí, jež je díky civilizační zátěži znečištěno chemickými i
biologickými polutanty, do značné míry ovlivňuje všechny organizmy včetně člověka. Za
normálních okolností je to právě nosní sliznice, která jako široká brána pravidelné výměny
dýchacích plynů přichází s těmito látkami do bezprostředního kontaktu. Proto je v literárních
datech i v zaměření vědeckých prací věnována značná pozornost nejen klasické morfologii,
ale stále aktuálněji, a to v souvislosti s rozvojem molekulárně biologických aspektů
vědeckého výzkumu, funkci jednotlivých složek této významné součásti horních dýchacích
cest.
Zatímco fyzikálním a chemickým vlivům na stavbu nosní sliznice byly věnovány početné
patofyziologické studie, dosud otevřenou otázkou zůstává průběh, regulace a výsledky
obranných reakcí v nosní sliznici. V širokém slova smyslu sem patří slizniční imunita, kterou
můžeme rozdělit na celulární a humorální složku. Rozhodujícím faktorem pro nastartování
obranné reakce je detekce antigenů, na níž se podílejí membránové receptory kompetentních
buněk. Protože pro T a B lymfocyty musí být antigen předložen v imobilizovaném stavu,
zajímalo nás, zda se v nosní sliznici vyskytují tzv. antigenprezentující elementy, které ve
vazivu představují především makrofágy, kdežto v epitelu se kromě prostupujících
fagocytujících bloudivých buněk mohou nalézat též tzv. dendritické buňky. Tyto elementy se
nám podařilo prokázat na submikroskopické úrovni jako buňky se zpravidla světlejší
cytoplazmou a často dlouhými výběžky, které zasahují na značnou vzdálenost mezi buňkami
víceřadého cylindrického epitelu výstelky nosních průduchů.
Pro plasticitu humorální odpovědi na přítomný antigen, či komplex antigen imunoglobulin,
svědčí nálezy možnosti diapedézy lymfocytů z postkapilárního řečiště mezi specializovanými
vysokými endotelovými buňkami. Podobně byla dokumentována transformace B-lymfocytů
v efektorové plazmatické buňky jako přímé producenty imunoglobulinů.
Použití molekulárního markeru, v podobě značeného chřipkového viru, dovoluje
identifikovat jako významnou komunikační cestu v nosní sliznici i oblast vývodů drobných
seromucinózních žlázek, které patří k normální výbavě nosní sliznice.
Výsledky ukázaly, že nosní sliznice představuje významnou cestu, jejímž prostřednictvím
může být nejen nastartována obranná reakce organizmu, ale v případě jejího selhání i zdroj
alergických rekcí, jak to dokládají nálezy heparinocytů nejen ve slizničním vazivu, ale i
v epitelu.
Podporováno grantem IGA MZČR č. NC 7487-3.
METABOLISM OF BROMIDE IS INFLUENCED BY SODIUM INTAKE
Stanislav Pavelka
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 611 37 Brno and
Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, 142 20 Prague 4
We have tested our hypothesis [1] that the biological half-life of bromide depends on
the magnitude of sodium intake rather than on the intake of chloride, as it is generally
assumed in the literature, and that it would depend on the physiological state of the animal. In
the present paper, we have demonstrated the parallel course of the excretion rates of sodium
and bromide ions in adult male rats administered simultaneously with 24Na-sodium chloride
and 82Br-bromide. These excretion rates were inversely proportional to the magnitude of
sodium intake in the animals.
60
In addition, we investigated the biological half-life of bromide in animals situated in
very different physiological states, namely in lactating and non-lactating female rats as well as
in young rats of varying ages (2, 4, 6, and 10 weeks of age). The radioactivity retained in
mothers and in whole litters was measured in vivo at appropriate time intervals (up to 240 h)
after the application of 82Br-bromide to the mothers. The time course of the changes in the
82
Br radioactivity of the young was calculated as the difference between the rate of 82Br intake
in mother’s milk and the 82Br excretion through the kidneys into the urine [2]. Non-weaned
young rats (12 d-old) had the longest half-life (269 h) and lactating dams the shortest (44 h).
The determined values obviously reflect a struggle of the animal’s organism for maintaining
constancy of the internal milieu. The values demonstrate that non-weaned young apparently
conserve sodium, while lactating dams, due to their large food intake, waste sodium.
References
[1] Pavelka S. (2003) In: Trace Elements in Human: New Perspectives (Ermidou-Pollet S.,
Pollet S., eds.), University of Athens, Athens, Part I, pp 615-624.
[2] Babický A., Vobecký M., Pavelka S. (2004) Food Chem. Toxicol., submitted.
HORIZONTAL TRANSFER OF THE ETA GENE IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Pekarová Mária., Růžičková Vladislava
Department of Genetics and Molecular Biology, Faculty of Science, Masaryk University,
Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic,
The genes encoding virulence factors in Staphylococcus aureus are generaly located
on the variable genetic elements such as prophages, transposons, plasmids or pathogenicity
islands. Exfoliative toxins A and B are the main cause of the toxic epidermolyses, ranging
from localised blisters to extensive exfoliation, affecting primarily newborns, young children
and immunosuppressed adults with underlying disease [1]. Gene for ETA is located on a
prophage genome integrated into the bacterial host chromosome whereas etb gene is located
on a large plasmid [2, 3].
The aim of this work was to demonstrate the transfer of eta gene carried by phage into
the chromosome of new bacterial host. Three temperate bacteriophages 435, 557 and
531 of serological groups A and B respectively, were used for the horizontal tranfer of eta
gene. These phages were isolated by means of UV induction from the genomes of three
clinical strains of S. aureus involved in two outbreaks of pemphigus neonatorum in maternity
hospitals of two geographically distant towns in 1998. The recipient strain of S. aureus termed
1039 doesn´t produce DNase nor restriction enzyme and doesn´t carry any prophage therefore
it will be available to recieve extraneous DNA [4]. This strain was infected by phages 435,
557 and 531. PCR detection proved transfer of eta gene and presence of the prophages in
the genomes of lysogens 1039. The SmaI macrorestriction fragments of the lysogens were
compared with those of recipient strain and the integration site of eta gene was detected. We
found that 557 and 531 integrated into the same SmaI macrorestriction fragment (365 kb).
Integration of 435 into the fourth largest fragment resulted in its change in size from 310 kb
to 360 kb.
Our results demonstrate a way of the horizontal transfer of the genes encoding
exfoliative toxin A among the strains of Staphylococcus aureus. They also contribute to
61
elucidate the evolutionary processes considering the role of the mobile genetic elements such
as bacteriophages occuring in natural environment of these pathogens.
References:
[1] Ladhani, S., Joannou, C. L., Lochrie, D. P., Evans, R. W., Poston S. M. (1999) Clin.
Microbiol. Rev. 12, 224-242.
[2] O'Toole P. W., Foster T. J. (1987) J. Bacteriol. 169, 3910-3915.
[3] Warren, R. L. (1980) Infect. Immun. 30, 601-606.
[4] Yoshizawa, Y. (1985) Jikeikai Med. J. 32, 415-421.
Supported by the grant No. CEZ: J07/98:143100008, Ministry of Education, Czech Republic.
POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ PRO ANALÝZU OBRAZU RŮSTU EMBRYÍ
SMRKU ZTEPILÉHO (PICEA ABIES /L./ KARST.)
COMPUTER PROCESSING FOR IMAGE ANALYSIS OF GROWTH OF EMBRYOS
OF NORWAY SPRUCE (PICEA ABIES /L./ KARST.)
Jiří Petřek1, Helena Vlašínová1, René Kizek2, Jan Vacek2, Jan Víteček1, Ladislav Havel2
1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno,
Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected]
V našich experimentech byly využity klony smrku ztepilého (Picea abies (L.) Karst.) a
smrku pichlavého (Picea pungens Engelm.). Somatická embrya byla kultivována v klastrech
tvořící skupiny raných somatických embryí SRSE na pevném médiu. Růst SRSE byl studován
jak vážením tak pomocí počítačové obrazové analýzy. Ke snímání obrazu byla použita
CCD-kamera (CCD, Sony, UVP–GDS 8 000) pevně fixovaná ke stativu a počítačové
programy GRAB-IT a Image-Pro. CCD-kamera digitalizuje skupiny raných somatických
embryí (SRSE) a poskytuje údaje o jejich ploše se střední relativní chybou 0.31 %. Při
různém nastavení objektivu kamery byly programem IMAGE-PRO PLUS vypočítány různé
velikosti ploch u totožných SRSE smrku. Zjistili jsme, že se stoupajícím rozlišením klesá
velikost plochy jednotlivých SRSE. Při rozlišení 2.8 až 3.6 pixelů na mm2 je digitalizovaná
plocha nadhodnocena asi o 16% a hodnoty plochy jsou velmi variabilní neboť není správně
nerozeznán okraj SESE. Jak se ukázalo při vyšším rozlišení kritického detailu se variabilita
výrazně snižuje. Pro naše další experimenty bylo vybráno rozlišení kritického detailu 5 pixelů
na mm2, což je zajišťuje dobré určení hodnoty plochy SRSE a je vhodné pro konstantní
nastavení metody. Námi vytvořené konstantní nastavení metody nám umožnilo studovat
pouze změny plochy SRSE. Metoda umožnila velmi rychle a snadno vypočítat plochu všech
digitalizovaných SRSE při jejich automatickém načtení v programu. SRSE P. abies klonu
2/32 byla současně vážena a snímána CCD-kamerou. Průměrné relativní přírůstky hmotnosti
a plochy SRSE v průběhu čtrnáctidenní kultivace vykazovaly lineární trend (y = 14.872x 9.6697 R2 = 0.99; y = 9.0561x - 6.0197 R2 = 0.9833) avšak směrnice jejich přímek se od sebe
výrazně liší. Pozorovali jsme, že hmotnost SRSE v porovnání s jejich plochou roste rychleji, a
to po celou dobu kultivace. Pozorované rozdíly jsou pravděpodobně způsobeny výraznějším
růstem SRSE do výšky. I přes zjištěný rozdíl obou metod je určení plochy SRSE vhodným
nástrojem pro stanovení růstové charakteristiky SRSE.
62
Literatura
(1)
Petřek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Vacek, J.; Víteček, J.; Havel, L. MendelNET,
Brno, 2003; p 32.
(2)
Petřek, J.; Vacek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Havel, L. Plant Cell Rep. 2004,
submitted.
(3)
Petřek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Vacek, J.; Víteček, J.; Havel, L. Lesnická práce
2004, in press.
(4)
Vacek, J.; Petřek, J.; Havel, L.; Klejdus, B.; Kizek, R. VII. Pracovní setkání
biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2003; p 64.
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
TESTOVÁNÍ VLIVU MAGNETICKÝCH NOSIČŮ NA BÁZI CELULÓZY NA
PRŮBĚH PCR
TESTING OF CELLULOSE BASED MAGNETIC CARRIERS ON THE PCR
COURSE
Kateřina Petrová, Alena Španová, Bohuslav Rittich
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14,
602 00 Brno
Magnetické nosiče na bázi celulózy nacházejí uplatnění v řadě molekulárně diagnostických
metod. Při jejich použití v PCR však nesmějí interferovat s komponentami PCR, protože
interference by vedla ke snížení citlivosti PCR, případně k falešně negativním výsledkům
reakce.
Bylo testováno 8 magnetických nosičů: A57 (celulóza-ferrit), A58 (celulóza-magnetit), A59
(kyselina alginová-magnetit), A101 (ferrit), A109 (ferrit modifikovaný 4-aminofenylovými
skupinami), A110 (ferrit modifikovaný 2-aminoethylovými skupinami, A112 (ferrit
modifikovaný kyselinou alginovou), A114 (magnetit modifikovaný kyselinou alginovou).
Byl testován vliv těchto magnetických nosičů, případně komponent používaných pro jejich
syntézu, na průběh PCR. Testování bylo prováděno s DNA izolovanou z bakterií rodu
Bifidobacterium. V PCR směsi byly k amplifikaci použity čtyři různé koncentrace DNA a
rodově specifické primery Pbi F1 a Pbi R2, které jsou komplementární ke konzervativním
sekvencím v oblasti pro 16S rDNA (1). Specifický PCR produkt o délce 914 bp byl detekován
pomocí agarózové gelové elektroforézy.
Výsledky PCR reakcí byly srovnávány s pozitivními kontrolami. Jako pozitivní kontrola
sloužila DNA rodu Bifidobacterium ve čtyřech různých koncentracích, která byla přidávána
do PCR směsi bez magnetických nosičů. Na základě srovnání intenzit pásů na gelu bylo
zjišťováno, zda magnetické nosiče snižují citlivost PCR, případně zda reakci úplně inhibují.
Výsledky ukázaly u různých nosičů změnu citlivosti PCR, případně úplnou inhibici PCR.
Dále ukázaly na rozdíl mezi magnetickými nosiči s inkorporovaným ferritem nebo
magnetitem.
Použitá literatura:
(1) D.Roy, S.Sirois, FEMS Microbiol. Lett. 191(2000), 17-24.
63
ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE IS OXIDIZED BY PEROXIDASES TO
REACTIVE SPECIES BINDING TO DNA
Jitka Poljakováa, Jan Sejbalb, Miroslav Šulca, Eva Freic and Marie Stiborováa
a
Department of Biochemistry, bDepartment of Organic Chemistry, Faculty of Science,
Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic,
c
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer
Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany
Ellipticine and its more soluble derivatives exhibit promising results in the treatment of breast
cancer and acute myeloblastic leukemia. The inhibition of topoisomerase II after intercalation
into DNA was considered an important property for its cytotoxicity. The CYP-dependent
activation leading to DNA adducts formation, we found to be generated in vitro and in vivo, is
a novel mechanism for the ellipticine pharmacological action [1,2,3]. Target tumor cells
express, beside CYP1A1, 1B1, 3A4, also peroxidases (myeloperoxidase or lactoperoxidase).
Since the participation of peroxidases in metabolism of ellipticine has not been identified yet,
the aim of the present work is to extend our knowledge on this issue. Lactoperoxidase,
myeloperoxidase and a model plant peroxidase (from horseradish) were used in our study.
Ellipticine is oxidized by all these peroxidases via a radical mechanism. Using mass
spectrometry (MALDI-TOF, EI) and NMR we found that ellipticine is primarily oxidized to a
one-electron reaction product (radical) producing a dimer as the major metabolite. Peroxidase
attacks a nitrogen atom of a pyrrole ring of the ellipticine skeleton to form a radical, which is
subsequently bound to carbon C9 in the second molecule of ellipticine. Its formation of
ellipticine is inhibited by radical trapping agents (glutathione, NADH) and by DNA or
deoxyguanosine 3’-monophosphate. Another ellipticine metabolite formed by peroxidases is
N(2)-oxide of ellipticine. The same metabolite is formed also by CYP-mediated reactions.
During oxidation of ellipticine by peroxidases, two ellipticine-DNA adducts, which were
generated by CYP-mediated reaction [1,2], are also formed. An identity of adducts formed by
CYPs and peroxidases were confirmed by co-chromatography on TLC and HPLC.
Deoxyguanosine was determined as a target deoxynucleoside for ellipticine covalent binding
in DNA. The involvement of myeloperoxidase and lactoperoxidase in an increase of
ellipticine pharmacological efficiency in the target tumor tissues is discussed.
REFERENCES
1. Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675-1684
(2001).
2. Frei E., Bieler C.A., Arlt V.M., Wiessler M., Stiborová M.: Biochem. Pharmacol., 64,
289-295 (2002)
3. Stiborova M., Breuer A., Aimova D., Stiborova-Rupertova M., Wiessler M., Frei E.:
Int. J. Cancer, 107, 885-890 (2003).
Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of
Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).
64
DETERMINATION OF BOND BETWEEN PROTEIN P53 AND DNA BINDING
SEQUENCE USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH
ELECTROCHEMICAL DETECTION
STANOVENÍ VAZBY PROTEINU P53 NA DNA VAZEBNOU SEKVENCI POMOCÍ
VYSOKO-ÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE
S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ
David Potěšil1,2, Jitka Petrlová1, Jan Vacek1, Marie Brázdová3, Jana Zelená1, Přemysl Lubal2
René Kizek1
1
Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno, 2Katedra analytické
chemie, PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno, 3Heinrich Pette Inst Expt Virol & Immunol, Dept
Tumor Virol, Univ Hamburg, D-2000 Hamburg, Germany
Již v roce 1979 byl objeven velmi důležitým nádorovým supresorový gen p53. Jeho
označení p53 vychází z hodnoty jeho molekulové váhy (Mr 53 000). Je proteinem
transkripčním, je složený ze čtyř pod-jednotek (celkem 393 aminokyselin), které jsou v buňce
běžně přítomny ve velmi nízké koncentraci. Nastane-li poškození buněčné DNA, např.
účinkem radiace, genotoxickými sloučeninami, lékem a pod., podjednotky p53 se začnou
shlukovat a vytvářet aktivní formu p53. Tato forma je pak schopna regulace (indukce nebo
inhibice) pomocí vazby na poškozenou DNA. Indukuje např. transkripci proteinů, které
zastavují buněčný cyklus (p21WAFI, gadd-45), opravují poškozenou DNA (p53R2), nebo
aktivují či inhibují apoptózu (aktivace: Bax; inhibice: BCL-xL). V buňce se však mohou
objevovat látky, které na tvorbu p53 působí negativně. Příkladem takových látek může být
MRP (multidrug resistence – associated protein), který způsobuje odolnost nádorových buněk
k některým cytostatikům, nebo protein VEGF (Vascular endothelial growth factor), jehož
působením je indukována tvorba nových cév nutných pro vyživování rostoucího nádoru.
V poslední době bylo zjištěno, že vznik aktivní formy p53 je závislý na přítomnosti iontů
zinku v buňce, které v proteinu p53 koordinačně stabilizují specifickou doménu afinitní k
DNA. Uvnitř centrální domény proteinu p53 je vázán vždy jeden atom zinku
aminokyselinovými zbytky cysteinu a histidinu (Cys176, His179, Cys238 a Cys242). Odstranímeli zinek s proteinu chelatačními činidly dojde ke změně konformace s neschopností tvořit
vazbu s DNA, což vede ke ztrátě regulačních schopností proteinu p53. Podobný efekt má i
záměna atomu zinku za jiný kovový kation, jako je např. Cd(II) a Co(II). Možnosti
analytického stanovení interakce proteinů a nukleových kyselin jsou značně omezené a
nebyly prozatím do všech podrobností popsány. I když hlavním současným nástrojem studia
interakcí může posloužit gelová elektroforéza na polyakrylamidovém či agarózovém gelu, je
u ní značná nevýhodou poměrně zdlouhavá příprava vzorků a obtížná reprodukovatelnost
získaných výsledků. Zjednodušení a zautomatizování analýzy bez destrukce vzorku nabízí
kombinace elektrochemie a vysoko-účinné kapalinové chromatografie.
Literatura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Uldrijam S., Kotala, V., Vojtěšek, B. Chem. Listy, 96, 2002, 145-149.
Rejthar, A., Vojtěšek, B.: Obecná patologie nádorového růstu, Grada 2002.
Masařík, M., Kizek, R., Kramer, KJ. et al.: Anal. Chem. 75, 2003, 2663-2669.
Brázdová, M. Kizek, R., Havran, L. et al.: Bioelectrochemistry, 55, 2002, 115-118.
Trnková L., Kizek, R., Vacek, J.: Bioelectrochemistry, 55, 2002, 131-133.
Kizek, R., Trnková, L., Paleček, E. Anal. Chem. 73, 2001, 4801- 4807.
Vojtěšek, B., Bartek J., Mydgley CA.: J. Imunol. Methods. 151, 1992, 237-244
Fischer, CJ., Gillett, CE., Vojtěšek, B. et. al.: Brit. J. Cancer. 69, 1994, 26-31
65
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
STUDY OF ANTIMUTAGENIC ACTIVITY OF SOME SORTS OF GREEN TEA.
STUDIUM ANTIMUTAGENNÍ AKTIVITY VYBRANÝCH DRUH ZELENÉHO ČAJE
Ptáček P., Mikulcová A., Macuchová S., Márová I., Pekař M.
VUT- Fakulta chemická, Purkyňova 118, 612 00 Brno
The term antimutagen is used to indicate any agent that reduces the number of
spontaneous or induced mutations. Important factors in the induction of mutagenesis and
carcinogenesis are oxygen free radicals, which are considered to be major contributors to
DNA damage. The diet contains a wide variety of compound appear to act as antioxidants and
antimutagens. Thus, the possibility to alter cell response to mutagen by dietary factors has
opened a new frontier for cancer control.
In this work biological effects of five sorts of green tea were analyzed using
antimutagenicity test with Sacchromyces cerevisiae D7 strain. In this test the frequency of
spontaneous convertants at the tryptophan locus (trp 5-12/trp 5-27) and revertants at the
isoleucine locus (ilv 1-92/ilv 1-92) was tested. Tea extracts (extracted by hot water, 10 – 30 g
of dry tea/ 100 ml) were allowed to be positive antimutagens based on their ability to inhibit
the mutagenic effect of standard mutagen 4-nitroquinoline-1-oxid. Content of tea catechins in
tested extracts was determined by RP-HPLC. Antioxidant capacity of extracts was analyzed
using Randox „Total antioxidant status“ kit.
Content of tea catechins in tested samples ranged in 500 – 2000 mg/100 g of dry tea
and 2000 – 3000 mg/100 g of (-)catechin and (-)catechin gallate, respectively. All tested
extracts exhibited high antioxidant capacity and high positive antimutagenicity. Treatment of
D7 cells by tea extracts led to 40 – 60 per cent on average of inhibition of trp convertants
frequence and to 40 – 50 per cent of inhibition of ilv revertants frequence. In most samples
significant dependence of antimutagenic effect on extract concentration was observed.
Catechin standards did not show so high antimutagenic effects as green tea extracts, so,
catchins probably are not major component responsible for complex antigenotoxic effects of
tea extracts.
DETEKCE MUTACÍ V GENU SCN5A ZAPŘÍČIŇUJÍCÍCH SYNDROM
PRODLOUŽENÉHO QT-INTERVALU
DETECTION OF SCN5A MUTATION WHICH CAUSE LONG QT-SYNDROME
Martina Raudenská, Ivo Papoušek, Karel Chroust
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Inherited long QT syndrome (LQTS) is caused by mutations in seven genes including
SCN5A, encoding the alpha-subunit of the human cardiac voltage-dependent sodium channel.
Long QT syndrome is an inherited disorder that results in lengthened cardiac repolarization. It
can lead to sudden onset of torsades de pointes, ventricular fibrillation, and death. In LQT3
(type of LQTS), various mutations in SCN5A were identified, which produce a gain of
66
channel function. Prolongation of the QT interval is a known risk factor for syncope, seizures
and sudden cardiac death. The most patients with QT prolongation have an acquired cause,
but congenital forms of QT prolongation are being increasingly recognized.
The aim of this study was to screen SCN5A for mutations in patients with the LQTS
phenotype and their relatives. Due to multiple loci and considerable size of these LQTS
genes, their mutation detection represents a challenge that is partially met by the
conventional screening method of single-stranded conformational polymorphism (SSCP).
SSCP enables fast and sensitive analysis of PCR-amplified DNA fragments. The aim of this
work was then to implementate and modify experimental parametrs of polymerase chain
reaction (PCR) and SSCP methodology. After verification of primer characteristics
optimalization of PCR for fragments of SCN5A gene was done. Particularly annealing
temperature was optimized. PCR products were analyzed by SSCP. Products, which contain
some discrepancy, were purified and subsequently sequenced. Total amount of 364 samples
was screened. No mutation causing LQTS was found.
Tato práce byla sponzorována grantem IGA NA 7424-3/2003 a FRVŠ 551/2003.
THE ENVIRONMENTAL POLLUTANT AND POTENT MUTAGEN 3NITROBENZANTHRONE INDUCES EXPRESSION OF CYTOCHROME P450 1A IN
RAT
Marie Stiborová1, Helena Rýdlová1, Lucie Kutnerová1, Jana Hájková1, Eva Frei2, Heinz H.
Schmeiser3
1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 12840
Prague 2
2
Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Heidelberg
3
Department of Nephrology, Hopital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Brussels
The environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone (3-nitro-7H-benz[d,e]anthracen7-one) is one of the most mutagenic nitroaromatic compounds identified in diesel exhaust and
airborne particulate matter1. It is suspected to be a human carcinogen1. After metabolic
activation it binds covalently to DNA that was documented by detection of specific DNA
adducts2,3. Understanding which enzymes are involved in 3-nitrobenzanthrone (3-NBA)
metabolism is important in the assessment of individual susceptibility to this molecule and its
mechanism of carcinogenity. In this work we studied influence of this pollutant on the
expression of various hepatic cytochromes P450, which have been found to be capable of
activating 3-nitrobenzanthrone4.
The expression levels of different cytochromes P450 (CYP1A1, 1A2, 2B, 2E1 and
3A4) were determined in hepatic and renal microsomal fractions of rats pre-treated
intraperitoneally with 0.4, 4.0 or 40.0 mg of 3-NBA/kg of body weight and compared with
those of untreated control rats. Western blotting and consecutive immunoquantification
employing chicken polyclonal antibodies raised against these CYPs were utilized. Evident
increase in content of hepatic CYP1A1 and 1A2 was detected, being 10 times higher in rats
pre-treated with 40.0 mg of 3-NBA/kg than in control samples for both CYPs. The increase in
content of CYP1A1 itself in this sample seemed to be even higher (~ 15-fold). The level of
renal CYP1A1/2 was also enhanced, namely, 4-fold. To support these results, we examined
specific catalytic activities of several cytochromes P450 in all hepatic microsomal fractions,
using marker substrates of individual CYPs. EROD (7-ethoxyresorufin O-deethylation)
activity, corresponding to both CYP1A1 and 1A2, was significantly increased in rats pre-
67
treated with highest dose of 3-NBA. Our results demonstrate that 3-nitrobenzanthrone largely
induces the expression of cytochrome P450 1A1 and 1A2 in rats.
References:
1
Enya T., Suzuki H., Watanabe T., Hirayama T., Hisamatsu Y.: Environ. Sci. Technol. 31,
2772-2776, 1997
2
Bieler Ch. A., Wiessler M., Erdinger L., Suzuki H., Takeji E., Schmeiser H. H.: Mutation
Research 439, 307-311, 1999
3
Arlt V. M., Bieler Ch. A., Mier W., Wiessler M., Schmeiser H. H.: Int. J. Cancer 93, 450-454,
2001
4
Arlt V. M., Stiborová M., Hewer A., Schmeiser H. H., Phillips D. H.: Cancer Research 63,
2752-2761, 2003
THERMOSTABLE CONJUGATES OF PLANT AMINE OXIDASES WITH βCYCLODEXTRIN PRESERVE THE ORIGINAL ENZYMATIC ACTIVITY
Marek Šebela1, David Kopečný1, Zbyněk Lamplot1, Jan Havliš2, Henrik Thomas3 and Andrej
Shevchenko3
1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783
71 Olomouc, Czech Republic
2
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2,
CZ-611 37 Brno, Czech Republic
3
Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Pfotenhauerstrasse 108, D01307 Dresden, Germany
Plant copper-containing amine oxidases (EC 1.4.3.6) catalyse the oxidation of various
amine substrates to form the corresponding aldehydes, ammonia and hydrogen peroxide. The
enzymes from garden pea (PSAO, Pisum sativum) and grass pea (GPAO, Lathyrus sativus)
can be both isolated in high yields as homogeneous preparations with high specific activity.
They show a relatively good thermostability, however, prolonged incubations at temperatures
above 60 oC result in a drop in the catalytic activity.
We have prepared conjugates of PSAO and GPAO with the oligosaccharide cyclodextrin (BCD) to improve their thermostability. The conjugation was performed using
an established method. BCD was first oxidised by sodium periodate to obtain a reactive
polyaldehyde. Then the polyaldehyde reacted with the enzymes via free lysyl groups in a
buffered solution containing sodium cyanoborohydride as a reducing agent. Biochemical
properties of the obtained conjugates (BCD-PSAO and BCD-GPAO) were characterised.
The prepared BCD-conjugates were active in amine oxidation but they showed partially
decreased specific activities in comparison with those of the original enzyme samples.
Conversely, Km values for the substrates putrescine and cadaverine remained unchanged. The
thermostability was increased. Both BCD-conjugates could be incubated at 65oC for 30 min
without any dramatic loss in activity. Some activity (around 5%) was still detectable even
after the incubation at 75 oC. The conjugates contained around 30% of neutral sugars in their
molecules (measured by a colorimetric method with glucose as a standard). Mass spectra
patterns of trypsin digests of BCD-PSAO and BCD-GPAO were completely different from
those of the native enzymes. Molecular mass values for BCD-PSAO and BCD-GPAO were
determined using gel chromatography. SDS-PAGE could not give reliable results because the
conjugates migrated only very slowly and remained at the top of a conventional 10% running
gel. Whereas both native PSAO and GPAO showed a molecular mass value of 145 kDa, their
68
BCD-conjugates provided a higher value of about 180 kDa. This was in a good agreement
with the amount of modified lysyl groups determined by a spectrophotometric method.
The described BCD-conjugates of PSAO and GPAO thus represent good candidates for
biotechnological applications, where amine oxidation is needed to be performed at higher
temperatures.
This work was supported by the grants KONTAKT ME664 and MSM 153100013 from the
Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic.
POLYMORFISMUS PRIONOVÉHO GENU U OVCÍ VE VZTAHU KE SCRAPII
POLYMORPHISM OF THE SHEEP PRION GENE IN RELATION TO SCRAPIE
Jarmila Sedláčková, Ján Matiašovic, Petr Hořín
Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno,
Palackého 1-3, 612 42 Brno
Scrapie (klusavka) je smrtelné neurologické onemocnění ovcí, které spolu s BSE u
skotu patří mezi nejčastější zvířecí spongioformní encefalopatie. Tato nemoc se vyskytuje po
celém světě mimo Austrálii a Nový Zéland. Klusavkou trpí zejména ovce a kozy, ale
experimentálně se jí podařilo nakazit i jiné zvířecí druhy. Tímto onemocněním trpí samci i
samice většiny plemen s nejvyšším výskytem okolo 3,5 roku života.
Podstatou všech TSE (transmisibilní spongioformní encefalopatie) je hromadění
abnormálního patologického proteinu v nervových buňkách, kde posléze způsobí jejich zánik
a uvolnění do extracelulárního prostoru. Vznikají tak amyloidem tvořené plaky, které jsou
typické pro spongioformní degeneraci nervového systému.
Inkubační doba závisí na míře a typu infekce a genotypu prionového genu ovce.
Přesný způsob infekce není dodnes přesně znám, ale je jisté, že onemocnění se šíří poměrně
snadno. Infekce může přežívat v kotcích a krmivu a je velmi odolná vůči desinfekčním
prostředkům.
Cílem této práce bylo charakterizovat polymorfismus ve vybraném úseku (PrP)
prionového genu a to u plemen chovaných v ČR ve vztahu k národnímu programu na
ozdravení od scrapie. Vypracovat a standardizovat metodiku genotypizace PrP genu
použitelnou pro účely národního programu (PCR-SSCP), srovnat ji s výsledky PCR-RFLP
provedenými v SVÚ Jihlava a specifitu ověřit sekvenováním.
Gen o velikosti 31 412 bp se skládá ze tří exonů, CDS obsahuje 771 bp a výsledný
produkt genu obsahuje 257 aminokyselin. Pro studium scrapie je nutné znát částečnou
sekvenci 3. exonu PrP genu - je důležitá přítomnost určité aminokyseliny v polohách 136, 154
a 171.
V poloze 136 se může vyskytovat alanin (A) nebo valin (V), v poloze 154 arginin (R)
a histidin (H), v poloze 171 se může objevovat arginin (R), glutamin (Q) a histidin (H).
Prostřednictvím metody PCR se specifickými ovčími primery byl amplifikován úsek
dlouhý 227 bp a následnou vertikální chlazenou elektroforézou na 13 % PAA gelu s 5 %
glycerolem odděleno a jasně identifikováno pět odlišných SSCP vzorů. Tyto vzory byly
pojmenovány dle přítomnosti aminokyseliny v jednotlivých polohách – ARR, ARQ, ARH,
AHQ, VRQ - byly potvrzeny sekvenací a sloužily následně jako známé kontroly.
Podle National Scrapie Plan byly genotypy uspořádány do pěti skupin. První skupina
zahrnuje jen homozygoty ARR/ARR a jde tedy o ovce, které jsou geneticky nejvíce odolné ke
scrapii. Druhá skupina obsahuje heterozygoty ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ - ovce s
69
genetickou rezistencí ke scrapii, ale potřebnou selekcí při budoucím křížení. Ve třetí skupině
se nacházejí heterozygoti ARQ/ARH, ARQ/AHQ, AHQ/ARH a homozygoti AHQ/AHQ,
ARH/ARH a ARQ/ARQ - ovce s nízkou rezistencí ke scrapii, ale mohou být použity při
křížení až do konce roku 2004. Čtvrtá skupina zahrnuje jen ARR/VRQ - genotyp náchylný ke
scrapii, který lze výjimečně použít při kontrolovaném křížení ve schváleném programu.
Poslední skupinu tvoří ovce s genotypy AHQ/VRQ, ARH/VRQ, ARQ/VRQ, VRQ/VRQ s
vysokou vnímavostí ke scrapii, berani musí být kastrováni nebo poraženi.
Celkem bylo vyšetřeno 377 ovcí 9 plemen, vypočteny alelové frekvence. Na základě
získaných statistických dat lze považovat alelu ARR za alelu s ochranným efektem. Alela
ARQ je spojena s vnímavost ke scrapii a bude využita při selekci.
Na základě získaných výsledků lze konstatovat, že metoda PCR-SSCP je vhodná a
spolehlivá pro odhalení a určení polymorfismu PrP genu.
Práce byla částečně podporována grantem Svazu chovatelů ovcí a koz ČR.
VLIV RŮSTOVÝCH REGULÁTORŮ NA PROLIFERACI BUNĚK TABÁKU
(NICOTIANA TABACUM L.) BY-2
THE INFLUENCE OF GROWTH REGULATORS TO PROLIFERATION OF
TOBACCO BY-2 CELLS
Jan Sláma1, Lenka Andrýsková1, Ladislav Havel1, Jan Víteček1, Jan Vacek2, René Kizek2
1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno
2
Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno
Buněčná suspenzní kultura tabáku (Nicotiana tabacum L.) linie BY-2 byla testována na
předpokládaný vliv vybraných růstových regulátorů na indukci apoptosy. Byl sledován vliv
N6-benzylaminopurinu (BAP), 6-(γ,γdimetylallylamino)purinu - (2iP), kinetinu, thidiazuronu,
m-topolinu, zeatinu a 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D) na proliferaci buněk BY-2
v závislosti na koncentraci a době jejich působení.
Přímým počítáním buněk pomocí počítací komůrky bylo zjištěno, že při aplikaci
mikromolárních koncentrací těchto růstových regulátorů dochází ke snížení buněčné hustoty
vůči kontrole. Vliv studovaných látek na životaschopnost (viabilitu) byl testován pomocí
fluorescenčních barviv fluoresceindiacetátu (FDA) a propidium jodidu (PI). FDA vstupuje
přes intaktní cytoplazmatickou membránu do buněk, kde je hydrolyzován esterasami a při
pozorování pod fluorescenčním mikroskopem buňky vykazují intenzivní zelenou
fluorescenci. Naproti tomu, PI do živých buněk nevstupuje, takže jeho detekovatelný signál
značí poškození buněk (červeně fluoreskující buňky). Využitím tohoto způsobu barvení byl
zjištěn pokles počtu živých buněk BY-2 v rozmezí od 10 – 100% ve srovnání s kontrolní
variantou. Došlo k výraznému zpomalení nebo dokonce zastavení buněčné proliferace. Námi
testované deriváty purinu - BAP, 2iP, kinetin a zeatin v koncentracích řádově desítek
mikromolů blokovaly buněčnou proliferaci a bylo možné pozorovat typické morfologické a
biochemické znaky apoptosy, včetně smršťování protoplastu, kondenzace chromatinu a
degradace jaderné DNA na oligonukleosomy. Zatímco vliv m-topolinu na snížení počtu
živých buněk nebyl tak výrazný. V případě, že buňky BY-2 byly kultivovány v přítomnosti
nepurinového růstového regulátoru thidiazuronu, nebyl pozorován výraznější rozdíl ve
srovnání s kontrolní variantou.
Pokud byla 2,4-D aplikována v desítkách mikromolů k jednotlivým růstovým regulátorům,
byl u BAP, 2iP a zeatinu pozorován řádově o desítky procent vyšší počet živých buněk, což
70
bylo pravděpodobně způsobeno protektivním účinkem 2,4-D na buňky BY-2 vystavené vlivu
těchto těchto zmíněných růstových regulátorů.
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
Literatura
1) Havel L, Durzan DJ, Bot. Acta, 109, 268-277, 1996
2) Havel L, Durzan DJ, J. Int. Plant. Sci., 157, 8–16, 1996
3) Kasparovsky T, Milat ML, Humbert C, Blein JP, Havel L, Mikes V, Plant. Physiol.
Biochem., 41, 495-501, 2003
4) Gahan PB, Wang L, Bowen ID, et al., Plant Cell Tiss Org. 72 (3): 237-245 MAR 2003
5) Vermeulen K, Strnad M, Krystof V, et al., Leukemia, 16 (3): 299-305 MAR 2002)
3-NITROBENZANTHRONE, THE ENVIRONMENTAL POLLUTANT AND
POTENT MUTAGEN, FORMS DNA ADDUCTS AFTER METABOLIC
ACTIVATION BY HUMAN HEPATIC CYTOSOLS: EVIDENCE FOR ACTIVATION
BY NAD(P)H:QUINONE OXIDOREDUCTASE AND SULFOTRANSFERASES 1A1
AND 1A2
Marie Stiborová1, Volker M. Arlt2, Heinz H. Schmeiser3, Eva Frei3, David H. Phillips2
1
Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2,
2
Institute of Cancer Research, Section of Molecular Carcinogenesis, Brookes Lawley
Building, Cotswold Road, Sutton, Surrey SM2 5NG, UK,
3
Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg
Determining the capability of humans to metabolise the suspected carcinogen 3nitrobenzanthrone (3-NBA) and understanding which human enzymes are involved in its
activation are important in the assessment of individual susceptibility to this environmental
contaminant found in diesel exhaust and ambient air pollution.
We compared the ability of twelve human hepatic cytosolic samples to catalyse DNA
adduct formation by 3-NBA. Using two enrichment procedures of the 32P-postlabelling
method, nuclease P1 digestion and butanol extraction, we found that all hepatic cytosols were
competent to activate 3-NBA. DNA adduct patterns with multiple adducts, qualitatively
similar to those found recently in vivo in rats [1,2] were observed.
To define the role of human cytosolic reductases in the activation of 3-NBA, we
investigated the modulation of 3-NBA-DNA adduct formation by cofactors or selective
inhibitors of the NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) and xanthine oxidase (XO).
Based on these studies, we attribute most of the activation of 3-NBA in human hepatic
cytosols to NQO1, although a role of cytosolic XO cannot be ruled out. With human
recombinant NQO1 and XO from butter milk, the major role of NQO1 in the formation of 3NBA-DNA adducts was confirmed. The role of conjugation enzymes [sulfotransferases
(SULTs) and N-acetyltransferases (NATs)] of human cytosolic samples was also examined,
using cofactors of these enzymes. On the basis of this analysis, we found the major and minor
roles of hepatic SULTs and NATs in activation of 3-NBA, respectively. Using cytosols
containing individual human recombinant SULTs, participation of SULT 1A1 and, to a lesser
extent, SULT1A2 in 3-NBA activation was found. These results demonstrate for the first time
71
the potential of human NQO1 and SULT 1A1 and 1A2 to contribute to the metabolic
activation of 3-NBA.
References
1) Arlt V. M., Bieler C. A., Mier W., Wiessler M., Schmeiser H. H.: Int. J. Cancer, 93, 450454 (2001).
2) Arlt V.M., Stiborová M., Hewer A., Schmeiser H.H., Phillips D.H.: Cancer Res., 63,
2752-2761 (2003).
Supported by Cancer Research UK, Ministry of Education of the Czech Republic (Grant MSM
113100001) and Baden-Württemberg (BWPLUS, BWB 20003).
PROTEKTIVNÍ ÚČINEK FLAVONOLIGNANŮ PROTI OXIDATIVNÍMU STRESU
VYVOLANÉMU PEROXIDEM VODÍKU V LIDSKÝCH KERATINOCYTECH A
FIBROBLASTECH
PROTECTIVE EFFECT OF FLAVONOILIGNANS AGAINST H2O2-INDUCED
OXIDATIVE STRESS IN HUMAN KERATINOCYTES AND FIBROBLASTS
Alena Svobodová, Jitka Psotová, Daniela Walterová
Institute of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine, Palacký University,
Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic; [email protected]
UV skin exposure induces extensive generation of reactive oxygen species (ROS). These can
react with DNA, proteins, fatty acids, and saccharides causing oxidative damage. Such
injuries result in a number of harmful effects: disturbed cell metabolism, morphological and
ultrastructural changes, attacks on the regulation pathways, alterations in the differentiation,
proliferation and apoptosis of skin cells. These processes can lead to photoageing and skin
cancer development. Hydrogen peroxide is one of the most frequent form of ROS produced in
dermal cells after UV exposure, mainly as a result of UVA action (320-400 nm). For this
reason H2O2 is often used as an experimental agent to simulate cell UV damage.
One approach to protecting humans from the harmful effects of UV irradiation is the use of
active photoprotectives. In recent years naturally occurring herbal compounds such as
phenolics have gained considerable attention as protective agents. In this study we have
investigated the effects of the selected flavonolignans – silybin and dehydrosilybin, on H2O2induced keratinocyte and fibroblast damage.
The normal human keratinocyte cell line (HaCaT; 1×105 cells/cm2) was incubated in
Dulbecco’s modified Eagles’s medium supplemented with 7% fetal calf serum (FCS) for
48 h. Human dermal fibroblasts (BALB; 1×105 cells/cm2) were incubated in Dulbecco’s
modified Eagles’s medium supplemented with 5% FCS and 5% newborn calf serum (NCS)
for 24 h. The HaCaT/BALB were pretreated with test compounds (10-50 µM) in a medium
without serum for 30 min and then H2O2 (0.50 / 0.25 mM; 4 h) was applied. The
cytoprotective effect of the test compounds against H2O2 was evaluated using following
parameters: neutral red retention, MTT reduction, LDH leakage, and intracellular GSH level.
Test compounds exhibited the ability to reduce H2O2-induced keratinocytes and fibroblasts
damage. Protective effect of dehydrosilybin was higher than of silybin. At the tested
concentration range (1-50 µM) silybin had no cytotoxic effects. Dehydrosilybin from 50 µM
in HaCaT and 25 µM in BALB showed low cytotoxicity (10-20%). However, dehydrosilybin
at lower concentrations (10-25 µM in HaCaT and 10 µM in BALB) proved much more active
72
than silybin in both cells. The double bond in ring B (C2 = C3) of dehydrosilybin is
responsible for its better cytoprotectivity.
ACKNOWLEDGEMENT:
This work was supported by the internal LF UP grant No. 11501109, GA ČR grant No.
303/02/1097 and Ministry of Education grant MSM 151100003.
PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF ANTIPEPTIDE CHICKEN
ANTIBODIES RECOGNIZING CYTOCHROME P-450 73A1 FROM TULIPA
FOSTERIANA
PŘÍPRAVA A CHARAKTERIZACE ANTIPEPTIDOVÝCH SLEPIČÍCH
PROTILÁTEK PROTI CYTOCHROMU P-450 73A1 Z TULIPA FOSTERIANA
Soňa Tomková, Petr Hodek
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128
40 Praha 2, Česká republika
Cytochromy P-450 (CYP) (EC 1.14.14.1.) patří mezi klíčové enzymy metabolismu
cizorodých látek (xenobiotik) i látek endogenních. Vyskytují se jak u živočichů tak u rostlin.
Koncentrace rostlinných CYP jsou často nižší než 0,1 nmol/mg proteinu, což je až 30x méně
než hladiny pozorované např. v krysích játrech. CYP 73A1 (EC 1.14.13.11.) katalyzuje 4hydroxylaci kyseliny trans-skořicové na kyselinu p-kumarovou. 4-hydroxylasa kyseliny
skořicové(C4H) takto katalyzuje první oxidativní krok ve specificky rostlinné metabolické
dráze, vedoucí k syntéze ligninu, flavonoidů, kumarinů a dalších derivátů kyseliny
fenylpropanové. Ke studiu CYP jsou často používány protilátky. Cílem této práce bylo
navodit produkci, izolovat a charakterizovat protilátky proti dvěma peptidům (MAP)
cytochromu P-450 73A1. Dále sledovat jejich hladinu pomocí metody ELISA a potvrdit jejich
specifitu proti CYP 73A1 v mikrosomálních preparátech Tulipa fosteriana (kultivary Stressa a
Red Emperor) metodou „Western-blot“. Důvodem, proč chceme slepičí protilátky proti CYP
73A1, je možnost detekce tohoto enzymu. K navození produkce protilátek slouží imunizace
Důvodem, proč byl u slepic jako imunogen použit pouze peptid a ne celý protein, je fakt, že
izolace CYP 73A1 rostlin je náročná a poskytuje velmi malý výtěžek. Protože u tulipánu není
známa sekvence CYP 73 A1 (C4H), bylo navíc třeba použít antigenní sekvence C4H
z příbuzného druhu: Helianthus tuberosus (Jeruzalémského artyčoku). Protilátky proti těmto
peptidům byly použity k detekci C4H (CYP 73A1) z cibulí tulipánu (Tulipa fosteriana).
Vybraným peptidům byla zvětšena relativní molekulová hmotnost metodou „Multi Antigen
Peptide“ (MAP), aby byly rozpoznány imunitním systémem slepice. Z původních čtyř MAPů
a čtyř slepic byly vybrány a přiřazeny dva antigeny dvěma slepicím na základě co nejmenší
reaktivity slepičích protilátek s antigeny. Slepice 3 byla imunizována antigenem C: (HLAQSFEYNYG)8Lys7-OH a slepice 4 antigenem A: (H-PEEFRPERF)8Lys7-OH. Testem
ELISA byla detekována hladina specifických protilátkových frakcí s použitím MAP A
(slepice 4) a MAP C (slepice 3) jako antigenů. Metodou ELISA jsme ověřili specifitu
protilátkových frakcí vůči peptidovým antigenům. Metodou „Western-blot“ byla ověřována
specifita protilátkových frakcí vůči celým proteinům (CYP 73A1). Touto metodou bylo u
slepice 3 potvrzeno, že protilátka připravená proti MAPu C velmi specificky reaguje s tímto
antigenem. Protilátka rozpoznala specificky jedinou zónu o RMH asi 58 000, která může
odpovídat CYP 73 A1 (C4H) Tulipa fosteriana pomocí srovnání s RMH C4H Jeruzalémského
artyčoku, která je 57 920 (dle Swiss-Prot. DB). Kontrolní protilátka nereagovala se žádným
vzorkem C4H. U slepice 4 byla zjištěna menší specifita vůči MAPu A, směs protilátek
rozpoznávala i další proteiny. Proto byla frakce s nejvyšší hladinou protilátek afinitně
73
purifikována. Afinitní chromatografie s imobilizovaným peptidem (MAP) je nová technika.
Afinitní purifikací byly získány monospecifické protilátky proti MAP A. ELISA test prokázal
porovnáním srovnatelných koncentrací původní protilátky a afinitně purifikované protilátky,
že schopnost protilátky rozpoznat antigen se minimálně 9x zvýšila. Protilátka poté rozpoznala
specificky jednu zónu o RMH asi 58 000, která může odpovídat CYP 73 A1 (C4H) Tulipa
fosteriana. Podařilo se připravit specifické protilátky rozpoznávající cytochrom P-450 73A1.
ROSTLINNÉ ESTERASY JAKO MARKER PRO KONSTRUKCI RŮSTOVÉ
KŘIVKY
PLANT ESTERASES AS A MARKER FOR GROWTH CURVE ESTIMATION
Jan Víteček1, René Kizek2, Jiří Petřek1, Jan Vacek2, Ladislav Havel1
1
Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta
MZLU, Zemědělská 1, 613 00 Brno, ČR
Literatura
{ Relativní aktivita
intracelulárních esteras (%)
50 µm
140
120
100
80
60
40
20
0
100
80
Podíl mrtvých buněk (%)
Snímek buněk BY-2
§
Pro dávkovou kultivaci představuje růstová křivka klíčový parametr. K její konstrukci
se velmi často využívá sledování svěží hmotnosti nebo sušiny. Tento postup je mnohdy
nevýhodný kvůli nutnosti sklidit dostatečně velké množství kultury. Alternativou může být
přímé mikroskopické počítání buněk prostřednictvím počítací komůrky. Technika je však
časově náročná, vykazuje značnou experimentální chybu a v některých případech ji nelze
realizovat kvůli vzniku velkých shluků buněk. Další metody (např. měření optické hustoty a
sledování sedimentačních charakteristik) nejsou pro stanovení růstové křivky vždy vhodné
neboť v průběhu kultivační doby může dojít ke značným změnám morfologie buněk.
Intracelulární esterasy jsou již delší dobu využívány jako marker buněčné životaschopnosti.
Kromě toho novější práce naznačují, že aktivita intracelulárních esteras v dané kultuře závisí
pouze na počtu životaschopných buněk.
Cílem naší práce bylo vyvinout experimentálně nenáročnou metodu stanovení aktivity
intracelulárních esteras v rostlinné suspenzní kultuře a ověřit, zda lze intracelulární esterasy
využít jako marker pro konstrukci růstové křivky. Pro tyto účely jsme použili buněčnou
suspenzi tabáku (linie BY-2) a dva substráty vhodné pro detekci esteras: p-nitrofenylacetát a
fluoresceindiacetát. Esterasy štěpí p-nitrofenylacetát za vzniku barevného produktu –
p-nitrofenolu, který lze detekovat spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm. Tento postup
nevyžaduje nákladné laboratorní vybavení. Dosažená citlivost metody je však nižší než při
použití fluoresceindiacetátu, který při štěpení esterasami poskytuje produkt detekovatelný
fluorimetricky ( excitace 490 nm a emise 514 nm). Druhý zmíněný postup umožňuje stanovit
aktivitu esteras v malém množství biologického materiálu. Výsledky získané oběma
metodikami potvrzují možnost využití intracelulárních esteras jako markeru pro konstrukci
růstové křivky.
60
40
20
0
0
50
100
Doba kultivace (h)
Amano T. a kol. (2003) Analytical Biochemistry 314:1-7
Choi Y.-J. and Lee B. H. (2001) Bioprocess and Biosystems Engineering 24:59-63
Natagata a kol. (1992) International Review of Cytology 132:1-30
74
Steward N. a kol. (1999) Plant Cell Rep 19:171-176
Vitecek J. a kol. (2004) Plant Tis Org Cultur.,submitted.
Víteček J. a kol. 5 th International Symposium in the Series Recent Advances in Plant
Biotechnology 2003, Stará Lesná, Slovak Republic: 159.
Víteček J. a kol. 3. Metodické dny 2003, Ždárské vrchy - Milovy: 73.
Víteček J. a kol. MendelNET 2003, Brno: 47.
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA METICILIN REZISTENTNÍCH KMENŮ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE FAKULTNÍ NEMOCNICI BRNO-BOHUNICE
MOLECULAR DIAGNOSTICS OF METHICILLIN-RESISTANT
STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN FACULTY HOSPITAL BRNO-BOHUNICE
Voborníková Marie, Pantůček Roman, Doškař Jiří
Katedra genetiky a molekulární biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
v Brně
Meticilin rezistentní kmeny Staphylococcus aureus (MRSA) jsou jednou z nejčastějších
příčin nozokomiálních nákaz. Ve FN Brno-Bohunice byl první epidemický kmen MRSA
izolován v roce 1996 a i když se jej začátkem roku 2000 podařilo eradikovat, byl nahrazen
kmeny novými, které jsou studovány v této práci. Z celkově 90 izolátů S. aureus z FN BrnoBohunice z let 1998-2003, identifikovaných pomocí testu citlivosti k antibiotiku jako
meticilin rezistentní, je předmětem této práce soubor 27 vybraných kmenů, v němž jsou
zahrnuty izoláty pocházející jak přímo od pacientů, tak z nemocničního prostředí. Pomocí
PCR u nich byla ověřena přítomnost genů mecA a femA kódujících proteiny nezbytné pro
meticilinovou rezistenci. Pro genotypizaci všech kmenů byla použita metoda pulzní gelové
elektroforézy (PFGE). Porovnání SmaI makrorestrikčních spekter umožnilo rozdělit kmeny
do 10 skupin. Byl určen typ stafylokokové chromozomální kazety mec (SCCmec), což je
mobilní genetický element obsahující zejména geny podmiňující různé typy rezistence. Dále
byl v genomech těchto kmenů pomocí multiplex PCR určen obsah profágů séroskupin A, B,
Fa a Fb.
V testované skupině izolátů byly nejčastější zcela identické podskupiny kmenů
označené podle typu makrorestrikčního spektra a typu SCCmec jako 1a/IIIA (6 izolátů shodně
z popáleninového centra z let 1999 a 2000), 2e/IV (2 izoláty z různých oddělení z let 2001 a
2002) a 2e/III vykazující odlišnosti v obsahu profágů (9 izolátů). Zbylé kmeny měly
jedinečný genotyp. Na základě epidemiologických šetření lze vyslovit hypotézu, že zdrojem
kmenů může být centrum pro popálené a nejčastější cestou přenosu ruce ošetřujícího
personálu. Studium genotypu kmenů MRSA přispívá k objasnění původu a cest šíření těchto
kmenů.
Tato práce byla podporována grantem GA ČR č. 301/02/1505.
75
EXPRESE REKOMBINATNÍHO XPA PROTEINU POMOCÍ BEZBUNĚČNÉHO RTS
SYSTÉMU
2
M. Vojtíšková1, I. Sedlářová2, K. Stehlíková1 , Brabec V. 1
1
Biofyzikální ústav AV ČR, 61265 Brno
Katedra genetiky a mol. bioologie, Přírodovědecká fakulta MU v Brně
Pro studium mechanismu nukleotidové excisní reparace (NER) na vzorcích DNA
modifikovaných chemoterapeutickým účinnými látkami ( např. cis-diamminodichlorplatinou,
cis DDP) jsme zavedli metody pro expresi a purifikaci rekombinantního XPA proteinu.
Plasmid pET15b. XPA (1) s klonovanou cDNA byl použit pro in vitro syntézu proteinů v
translačním systému (RTS, Roche) pro rychlou přípravu rekombinantních proteinů, které
nevyžadují následnou postranslační modifikaci. RTS využívá standartními metodami
purifikovanou DNA příslušného rekombinantního plasmidu v množství cca 10 – 15 ug
templátu. Princip metody spočívá v simultánní transkripci a translaci v 1 ml pracovním
prostoru a s10 ml zásobní částí reakční kyvety, umístěné do RTS přístroje s nastavitelnou
teplotou, časem a měnitelnými otáčkami magnetického míchadla. Reakční produkt,
rekombinantní protein, je následně koncentrován v pracovním prostoru. Podmínky reakce se
řídí typem proteinu, obvykle ale je dosaženo množství až stovek ug v průběhu několika
hodin. Naše zkušenosti s využitím přípravy rekombinantních proteinů v RTS budou
diskutovány.
Literatura:
(1) Missura M., et al. : EMBO J., 20 (2001) 3554 – 3564
Tato práce byla podpořena grantem GAAV č. A5004101
MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR IDENTIFICATION
OF EXFOLIATIVE TOXIN-PRODUCING STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS
Voller Jiří, Růžičková Vladislava
Department of Genetics and Molecular Biology, Faculty of Science, Masaryk University,
Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic
Exfoliative toxins A (ETA) and B (ETB) are the principal causative agents of
staphylococcal epidermolyses. Bullous impetigo and its generalized form staphylococcal
scalded skin syndrome (SSSS) usually affect newborns, although adults with underlying
disease, such as immunodeficiency and renal failure, can be affected as well [1, 2].
Characteristic intraepidermal cleavage leading to blistering is caused by toxin-mediated
proteolysis of desmoglein 1, a protein critical for integrity of desmosome [3].
The aim of this work was to optimize multiplex PCR for detection of the genes
encoding exfoliative toxins ETA and ETB, gene for the holin and for a part of the nucleotide
sequence unique to Staphylococcus aureus described previously [4]. For amplification of
these loci we used primers originally designed for conventional one-step PCR [5, 6]. The
conditions of the multiplex PCR were optimized according to the criteria described previously
[7]. The multiplex PCR assay was tested on the DNA templates of the set of 36
exfoliatin-positive strains of S. aureus isolated in various maternity units where outbreaks of
pemphigus neonatorum had been reported during years 1998 - 2002. Using the multiplex PCR
assay, we were able not only to identify the virulence genes eta and etb, but also to detect in
76
one-tube reaction the variable elements carrying these genes, i.e., prophages belonging to the
phage serogroup B and a plasmid.
We conclude that the simultaneous amplification of more than one locus in the same
reaction makes the reported multiplex PCR a rapid and convenient screening assay for
reliable identification of exfoliatin-producing strains of S. aureus.
References:
[1] Ladhani S., Joannou C.L., Lochrie D.P., Evans R.W., Poston S.M. (1999) Clin. Microbiol.
Rev. 12, 224-242.
[2] Farrel A.M. (1999) Lancet 354, 880-1.
[3] Hanakawa Y., Schechter N.M, Lin C., Garza L., Li H., Yamaguchi T., Fudaba Y.,
Nishifuji K., Sugai M., Amagai M., Stanley J. R. (2002) J. Clin. Invest. 110, 53-60.
[4] Štěpán J., Pantůček R., Růžičková V., Rosypal S., Hájek V., Doškař J. (2001) Cell.
Probes 15, 249-257.
[5] Yamaguchi T., Hayashi T., Takami H, Nakasone K., Ohnishi M., Nakayama K., Yamada
S., Komatsuzawa H., Sugai M. (2000) Mol. Microbiol. 38, 694-705.
[6] Johnson W.M., Tyler S.D., Ewan E.P., Ashton F.E., Pollard D.R., Rozee K.R. (1991) J.
Clin. Microbiol. 29,426-30.
[7] Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. (1997) Biotechniques
23, 504-11.
Supported by the grant No. CEZ: J07/98:143100008, Ministry of Education, Czech Republic.
SLEDOVÁNÍ TOXICITY A GENOTOXICITY HALOGENOVANÝCH
ALIFATICKÝCH UHLOVODÍKŮ U DROSOPHILA MELANOGASTER
TOXICITY AND GENOTOXICITY OF HALOGENATED ALIPHATIC
HYDROCARBONES IN DROSOPHILA MELANOGASTER
Veronika Zajíčková, Karel Chroust
Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární
biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno
Halogenated hydrocarbons are organic substances used especialy in industry and
agriculture. They can threaten human population and whole ecosystem by their potential toxic
and genotoxic effects.
Two of them: 2-chloroacetonitrile and 2-chloropropane were evaluated for toxic activity
and chloroacetonitrile also for genotoxic activity.
Somatic mutations and recombinations test (SMART) in the wings of Drosophila
melanogaster was adopted. Third-instar larvae trans-heterozygous for the third chromosome
recesive markers multiple wing hairs (mwh) and flare-3 (flr3) were exposed to different
concentrations of the test substances for 48 hours. Than the 50% lethal concentration (LC50)
of the tested substances was determined. Genetic changes induced in somatic cells of the
wing`s imaginal discs lead to the formation of mutant clones on the wing blade. Induced
mutations and recombinations are detected as single or twin spots (mwh and flr phenotype) on
the wing of survived adults. Recording of the frequency and the size of different spots allows
quantitative determination of the mutagenic and recombinogenic effects.
It was confirmed that both hydrocarbons have toxic effects. Lethal concentrations of
2-choroacetonitrile - 1,24µg/l and lethal concentration of 2-chloropropane - 146,3µg/l were
77
defined. There was a significant difference between genotoxic activity of chloroacetonitrile
and negative control.
This work was supported by MSMT 14100008.
UREÁZOVÁ AKTIVITA V SEMENECH VYBRANÝCH DRUHŮ ROSTLIN
UREASE ACTIVITY IN SEEDS OF SELECTED PLANT SPECIES
Josef Zehnálek, Jitka Petrlová, Jana Zelená, Jan Hradecký, Jan Vacek, René Kizek
Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno
Enzym ureáza (EC 3.5.1.5, močovina amidohydroláza) je obecně rozšířeným
enzymem u rostlin a je přítomna u řady eukaryotických mikroorganismů a baktérií, u vyšších
živočichů nebyla prokázána. Močovina je nejvýznamnějším dusíkatým hnojivem rostlin
v řadě zemí (Čína, Indie, Spojené Státy). Enzym ureáza hraje klíčovou roli v katalýze
rozkladu močoviny za vzniku oxidu uhličitého a amoniaku.
H 2N
2 NH3 + CO2
C=O + H2O
H 2N
Ureáza je enzym, který vykazuje absolutní substrátovou specifitu, což znamená, že
hydrolyzuje pouze močovinu a nereaguje s žádnou jinou sloučeninou (ani se substituovanými
močovinami nebo biuretem). Pro stanovení aktivity enzymu byla vypracována řada přímých i
nepřímých analytických metod. Nejběžnější jsou detekce amoniaku reakcí s indofenolem,
stanovení 14CO2 a řada enzymatických reakcí spojených se spektrofotometrickým měřením
oxidace NADPH.
Ureázu můžeme získat přímou extrakcí ze semen některých vyšších rostlin a takto získaný
preparát použít k rozladu močoviny. V naší práci jsme optimalizovali extrakční postup izolace
enzymu ureázy z vybraných potravinářsky významných semen rostlin (bob, hrách, sója,
kukuřice a slunečnice). Testovali jsme extrakci ureázy ve vodě, ethanolu a fosfátovém pufru.
Mírou rychlosti enzymové reakce bylo pak množství amoniaku vzniklého za časovou
jednotku. Množství amoniaku bylo stanoveno spektrofotometricky na základě reakce s
Nesslerovým činidlem (tetrajodortuťnatan draselný). Vzniklý produkt má červenohnědé
zbarvení a lze jej stanovit měřením absorbance při 436 nm. Semenné extrakty získané
z různých druhů rostlin byly dále testovány a výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Nejvyšší
aktivitu ureázy vykazovala semena sóji a neočekávaně i slunečnice a kukuřice. Získané
výsledky naznačují, že v semenech řady potravinářsky využitelných rostlin je přítomna ureáza
ve vyšší koncentraci.
Aktivita ureázy
(%)
120.0
80.0
40.0
Slunečnice
Kukuřice
Sója
Hrách
Bob
0.0
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty
MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081,
Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.
78
Literatura:
Zehnálek J., Minár J., Honza J.: Rost. Výrob 36, 797–804, 1990
Zehnálek J., Minár J., Vicherková M.: Rost. Výrob 33, 653–662, 1987
Zehnálek J., Procházka S.: Rost. Výrob 32, 403–409, 1986
Witte C-P., Medina-Escobar, N.: Anal. Biochem. 290, 102-107, 2001
Witte C-P, Tiller S. A., Taylor M. A., Davies H. V.: Plant Physiol. 128, 1129-1136, 2002
79
AUTORSKÝ REJSTŘÍK
A
F
K
Adam · 55
Aimová · 39
Andrýsková · 70
Arlt · 71
Astl · 59
Faldíková · 35
Faldyna · 35
Floris · 50
Fojta · 6, 34
Fojtová · 7
Frei · 18, 39, 52, 53, 56, 57, 64,
67, 71
Karabec · 48
Kavan · 26
Kizek · 31, 40, 42, 54, 55, 62,
65, 70, 74, 78
Klejdus · 55
Klíma · 36
Koblas · 9, 51
Kocábek · 45
Kočí · 43
Konečná · 3, 12, 21, 23, 45
Kopečný · 68
Kosinová · 38
Kostečková · 59
Kostlánová · 27
Kovařík · 7
Kremláčková · 49
Křížová · 28, 31
Kubáň · 55
Kubešová · 43, 50
Kučera · 5
Kutnerová · 67
Kyjovská · 29, 45
B
Babula · 40
Balková · 41
Batůšková · 42
Bauerová · 22
Bednář · 48
Bedřichová · 43
Beneš · 3
Bezouška · 4, 26, 30, 53
Billová · 8
Blanchard · 33
Blažková · 22
Böhmová · 23
Borská · 15, 24
Bořek-Dohalská · 39
Bouchal · 5, 47
Brabec · 11, 76
Brázda · 26
Brázdová · 34, 65
Breierová · 58
Breuer · 57
Brichta · 24
Bryja · 19
Brzobohatý · 12, 21, 23, 25, 36
Březinová · 39
Budová · 20
Č
G
Gans · 33
Gautier · 20
Gavlasová · 34
Gilboa-Garber · 27
Glatz · 21
H
Hájková · 67
Havel · 21, 40, 54, 62, 70, 74
Havliš · 68
Havran · 6, 8
Helánová · 46, 47
Hodek · 9, 48, 51, 73
Horáková · 25
Hořín · 69
Hoyer · 31
Hrabal · 22
Hradecký · 78
Hradilova · 25
Hrstka · 13, 46
Hrušková-Heidingsfeldová · 10
Hyršová · 11
Ch
Češková · 46
Čigašová · 58
Chroust · 66
D
I
De Groot · 33
Dostál · 10
Doškař · 45, 75
Drábková · 43, 50
Drahovská · 32
Dudová Magdaléna · 44
Dudová Markéta · 29, 45
Imberty · 20, 27
E
Eyer · 45
80
J
Jagelská · 26
Janalíková · 11
Jančeková · 48
Janovská · 11
Jelen · 31, 54
Jovin · 31
L
Lamplot · 50, 68
Lang · 22
Lízal · 41
Lubal · 65
Lukšan · 30
M
Macek · 31
Macuchová · 66
Machatková · 35
Mandl · 34, 47
Manhartová · 39
Marion · 33
Márová · 43, 50, 66
Martínek · 51, 52, 53, 59
Masařík · 31, 54
Matějková · 13, 17
Matiašovic · 69
Mátlová · 49
Mayer · 15
Medda · 50
Merkerová · 10
Mikasová · 32
Mikelová · 55
Mikšanová · 56, 57
Mikulcová · 66
Mitchell · 20, 27
Mlejnek · 25
Mlejnková · 25
Müller · 13, 46
N
Nálezková · 33
Nejedlá · 12
Němcová · 34
Norris · 13
Novák · 31
Novotná · 42
Rodák · 38
Rubeš · 35
Ruml · 22
Růžičková · 61, 76
Rybář · 35
Rýdlová · 51, 56, 67
Ř
Řepková · 29, 43, 45
S
O
Omelka · 43, 50
Omelková · 48, 58
Owen · 39
P
Páca · 49, 59
Páca Jr. · 49, 59
Pácová · 59
Paděrová · 12
Padiglia · 50
Paleček · 6, 8, 26, 31
Pantůček · 45, 75
Papoušek · 66
Pavelka · 14, 60
Peč · 50
Pečinka · 26
Pekarová · 61
Pekař · 66
Petrlová · 55, 65, 78
Petrová · 63
Petřek · 62, 74
Phillips · 71
Pichová · 10, 22
Pivoňková · 34
Pokorná · 34, 50
Poljaková · 39, 64
Pospíšilová · 15, 26
Potěšil · 65
Preisler · 21, 45
Prodělalová · 16
Přecechtělová · 5
Psotová · 72
Pšikal · 38
Ptáček · 66
R
Raudenská · 66
Rauch · 22
Reková · 36
Relichová · 41
Rittich · 16, 28, 44, 63
Sabin · 20
Sedláčková · 69
Sedlářová · 76
Seibal · 52
Sejbal · 39, 64
Semanská · 52
Shevchenko · 68
Schmeiser · 52, 56, 57, 67, 71
Sklenář · 31
Sladký · 40
Sláma · 70
Slováčková · 16
Souček · 36
Stehlíková · 76
Stiborová · 18, 39, 49, 51, 52,
53, 56, 57, 59, 64, 67, 71
Stobiecka · 31
Stratilová · 58
Strnad · 13, 40
Suchá · 49
Svobodová · 72
Turňa · 32
V
Vacek · 42, 54, 55, 62, 65, 70,
74, 78
Van Amerongen · 22
Vaňhara · 19
Váňová · 23
Veverka · 22
Víteček · 62, 70, 74
Vlašínová · 62
Voborníková · 75
Vojtěšek · 13, 34, 46
Vojtíšková · 6, 11, 76
Voller · 76
Vondrášková · 57
W
Walterová · 72
Weinstock · 13
Wichers · 22
Wimmerová · 20, 21, 27
Z
Zábranský · 22
Zahradníčková · 3
Zdráhal · 3, 5, 12, 21, 23, 45
Zehnálek · 42, 55, 78
Zelená · 65, 78
Ž
Š
Žídek · 31
Šebela · 50, 68
Ševčíková · 19
Šmajs · 11, 13, 17
Šmarda · 3, 19
Španová · 28, 44, 47, 63
Štětina · 37
Štruncová · 15
Šulc · 48, 56, 57, 64
T
Táborská · 21
Tesařík · 38
Thomas · 68
Tichý · 15
Tomková · 73
Trbušek · 24
Trefil · 9
Trnková · 42, 54, 55
Turek · 49
81
SPONZORUJÍCÍ FIRMY
Bio-Consult Laboratories, spol. s r. o., Božejovická 145 P.O. Box 7, Praha 4, 142 01
Tel/fax: +420 2 4447 1239; e-mail: [email protected]
www.bioconsult.cz
Biotech a.s, Služeb 4, 108 52 Praha 10
tel a fax: 420 272 701 739, email: [email protected]
www.biotech.cz
East Port Praha s.r.o., Rubličova 1/969, 161 00 Praha 6
Bezplatná telefonní linka: 800100529
tel.: 235 31 81 77, fax: 233 31 24 28, email: [email protected],
kancelář Brno, tel: 51735 38 36, fax: 51735 38 36
www.eastport.cz
Knihkupectví MALÉ CENTRUM, Kotlářská 2, 611 37 Brno
tel: 420 541 129 202 (prodej), 420 541 129 544, 420 541 129 630 (kancelář)
fax: 420 541 129 630, email: [email protected]
www.malecentrum.sci.muni.cz
KRD s.r.o, Plzeňská 552/265, 155 00 Praha 5
tel: 251 626 019, fax: 271 769 852, e-mail: [email protected]
www.krd1.cz
M.G.P., s r.o., Kvítková 1575, 760 01 Zlín
tel.: 57-721 21 40; fax: 57-721 17 24; e.mail: [email protected]
Pražská kancelář: tel + fax: 2-244 362 37
www.mgp.cz
MERCI, s.r.o., Hviezdoslavova 55b627 00 BRNO
tel.: 548 428 411; fax 548 211 485; e-mail:[email protected]
www.merci.cz
Optoteam s.r.o., Kyjevská 6, 160 00 Praha 6
tel a fax: 224 315 650; e-mail: [email protected]
www.optoteam.cz
Sigma-Aldrich s.r.o., Pobřežní 46, 186 21 Praha 8
tel: 420 246 003 200, fax: 420 246 003 291, e-mail: [email protected]
www.sigma-aldrich.com
Top-Bio, s.r.o., J. Jovkova 3262, 143 00 Praha 4
Tel/Fax: 241 77 00 91; e-mail: [email protected]
www.top-bio.cz