I rostliny mají hormony

I rostliny mají hormony !
... co a jak s auxinem
Eva Zažímalová
Ústav experimentální botaniky AV ČR, Praha
Rostliny a tvarová (a vývojová) různorodost
Reakce na okolní prostředí
Reakce na nepříznivé podmínky
Živočich: reakce behaviorální
Vnitřní vývojový program
 geneticky daný
Vnější signály
 mnoho aspektů okolního
prostředí (fyzikální, chemické
i biologické)
 zásadně působí na vývoj
rostliny (růst)
(Buchanan et al., 2001)
Reakce na životní podmínky:
Živočich:
Rostlina:
behaviorálně
vývojově/růstově
Organogeneze není u rostlin ukončena v embryonálním stadiu
– rostlina NENÍ zelený živočich
Nutnost koordinace vývoje – časově, prostorově
Jak?
Signální molekuly !
Fytohormony
auxiny
cytokininy
gibereliny
kyselina abscisová
ethylen
brasinosteroidy
polyaminy
kyselina jasmonová
kyselina salicylová
systemin, atd.
Růstové regulátory rostlin
(fenolické látky)
syntetické regulátory
Fytohormony nebo růstové regulátory rostlin
???
"Klasické"
rostlinné
hormony
Nejvýznamnější typy fytohormonů - přehled
Organogeneze a morfogeneze – auxiny a cytokininy
Tvorba kořenů na mediu obsahujícím pouze auxin (IBA),
tvorba prýtů při vysokém poměru cytokinin (zeatin): auxin (IBA)
Objev auxinu
Fritz Went (1928)
koleoptile ovsa
Auxin
a jeho úloha v regulaci základních fyziologických procesů u rostlin
Regulace
buněčného dělení
a jeho polarity
Organogeneze
(Benková et al., 2003)
(Petrášek et al. 2002)
‘Patterning’
Fylotaxe
(Friml et al., 2002)
(Reinhardt et al., 2003)
Embryogeneze
Tropismy
(Friml et al., 2003)
(Friml et al., 2002)
Dostupnost auxinu
v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin

biosyntéza

(de)konjugace

degradace
metabolismus
příjem signálu a
jeho přenos


import (influx)
export (efflux)
intercelulární
tok
Transport of auxins at the cellular level:
Auxins = weak organic acids
HA
pH
IAA
H+
+ A-
pH
IAA-
pH = 5.5:
~ 20%
~ 80%
pH = 7.0:
~0
~100%
Struktury a procesy
podílející se na transportu auxinů do buňky a z buňky
20%
IAA
80%
IAA- + H+
pH 5,5
pH 7,0
IAA-
IAA-
Pasivní difuze
„IAA-influx(uptake)carrier“
+
H
„aniontová“
past
„IAA-efflux-carriers“
H+-ATPasa
IAA-
IAA
AUX1/LAX
Fyzikálně-chemické vlastnosti auxinové
molekuly určují, že:
IAAABCB
PIN
 Kapacita přenašečů auxinu z buňky (PINy, ABCB-transportéry, další?)
limituje tok auxinu buňkou  a tedy i jeho mezibuněčný tok
 Opakovaná a analogicky asymetrická lokalizace přenašečů auxinu z buňky
(PINy) v sousedních buňkách určuje směr toku auxinu mezi buňkami
 Přenašeče auxinu do buňky (AUX1/LAX, NRT1.1, další?) pomáhají zvyšovat
příjem auxinu do buněk ve specifických buněčných typech a fyziologických
situacích
Mutanty v genech pro typické auxinové transportéry
IAA
Mutant aux1
AUX1/LAX
agravitropní kořeny
IAA(Marchant et al. 1999)
ABCB
PIN
Mutant
mdr1/pgp19/abcb19
komplexní fenotyp, zakrslé
Mutant pin1
silný fenotyp v květních orgánech
(Palme & Gälweiler 1999,
modified)
(Noh et al. 2001)
WT mdr1/pgp19/abcb19
WT
pin1
Standardní auxinové transportéry:
predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně
(stejné „zvětšení“ !)
Jejich molekulární funkce ?
Kvantitativní parametry jejich aktivity?
Petrášek et al., in Transporters and Pumps in Plant Signaling, Springer 2011
Buněčné suspense
Experimentální model pro kvantitativní charakterizaci procesů na úrovni buňky
Linie BY-2 (Nicotiana tabacum L., cv.
Bright Yellow 2 ; Nagata et al. 1992)
 Auxin-dependentní
(nízká ‘interference’ s tvorbou endogenního
auxinu)
 Homogenní buněčná populace, vysoce
rozpadavá
(snadné určení buněčné density a velikosti buněk)
 Standardní růstový cyklus, axiální (polární
?) buněčný růst
(snadná detekce fenotypových změn)
 Snadná transformace a následné sledování
fenotypových změn
(Day 3)
Indukovatelná nadexprese AtPIN7 v buňkách BY-2 (linie GVG-PIN7)
Den 1, 24 h po indukci nadexprese AtPIN7 dexamethasonem
(DEX, 5 uM) (v pTA7002; Aoyama & Chua 1997).
BY-2
IAA-
GVG-PIN7 neindukované
PIN
Nepřímá imunofluorescence,
anti-PIN7 králičí
polyklonální protilátka.
Úsečka = 40 μm.
BY-2 + DEX
GVG-PIN7 indukované
Semikvantitativní RT-PCR
1h
6h
12 h
48 h
72 h
hours after DEX
application
PIN 7
Signál PIN7 je pouze v indukovaných buňkách GVG-PIN7
Petrášek et al., Science 2006
IAA-
Fenotyp buněčné linie GVG-PIN7
PIN
Indukce DEX (5 mM); den 3; Nomarski DIC; úsečky= 40 μm.
GVG-PIN7 neindukované
Cell number
(104 cells per ml)
BY-2
40
30
20
PIN7 induced
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Time (days)
BY-2 + DEX
GVG-PIN7 indukované
Lugol
Nadexprese PIN7 vede k zastavení buněčného dělení, k elongaci
a k nadprodukci amyloplastů (» auxinové „hladovění“)
Petrášek et al., Science 2006
Kinetika akumulace 3H-NAA v buňkách GVG-PIN7
24 h po indukci (DEX, 1 mM); 3H-NAA 2 nM;
1-naphthylphthalamová kyselina (NPA) 10 mM; úsečky = SEs, n=4
IAAPIN
4
Accumulation of [3H]-NAA
(pmol per million cells)
non-induced + NPA
3
induced + NPA
2
Totéž platí pro kvasinky
a HeLa-buňky !
non-induced
1
induced
0
0
5
10
15
20
25
30
Time (min)
Nadexprese PIN7 vede k poklesu akumulace NAA (» nárůst exportu NAA),
inhibitor exportu auxinu zvyšuje akumulaci auxinu v buňkách
Petrášek et al., Science 2006
IAA-
Fenotyp buněk linie GVG-PIN7, účinek NPA
PIN
Indukce DEX (5 mM); den 3; Nomarski DIC; úsečky = 40 μm.
GVG-PIN7 neindukované
Induced cells NPA-treated
non-treated
80
Cell diameter (mm)
GVG-PIN7 indukované + NPA
GVG-PIN7 indukované
60
40
20
0
50
100
150
200
250
Cell length (mm)
Po nadexpresi PIN7
a aplikaci NPA se fenotyp buněk neliší od kontroly
Mravec et al., Development 2008
Nadexprese auxinových transportérů
lokalizovaných na plasmatické membráně:
modulace intracelulární hladiny auxinu
 modulace toku auxinů mezi buňkami
změny ve vývoji buněk
Auxinové transportéry:
predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně
(stejné „zvětšení“ !)
Petrášek et al., in Transporters and Pumps in Plant Signaling, Springer 2011
Nadexprese AtPIN5 v kořenech Arabidopsis a v buňkách BY-2
PIN5 (signál GFP) je na endomembránách (endoplasmatické retikulum a endosomy) !
Mravec et al., Nature 2009
Heterologous overexpression of AtPIN5 in yeast
PIN5 is on PM
PIN5 has a capacity
to export auxin
from yeast cells
Mravec et al., 2009
Nadexprese AtPIN5 v buňkách BY-2 (tabák)
PIN5 na ER  může změnit
intracelulární distribuci auxinu
(… metabolické změny ?)
Nadexprese PIN5 mění
metabolický profil IAA v buňkách
(žádná volná IAA !)
PIN5 reguluje
intracelulární homeostázi auxinu
Buněčné komponenty účastnící se transportu auxinu
Auxinové transportéry:
predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně
PILS
Nadexprese AtPILS v buňkách BY-2 (tabák)
Také proteiny PILS (PIN-LIKES) jsou na ER
PILS2 mění metabolický profil
IAA v buňkách
- stabilizace oproti PIN5!
Nejen PIN5(6,8), ale také PILS13,5-7 regulují
intracelulární homeostázi auxinu
Regulace intracelulární homeostáze auxinu je nečekaně komplexní!
Buněčné komponenty účastnící se transportu auxinu
Dostupnost auxinu
v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin

biosyntéza

(de)konjugace

degradace
metabolismus
příjem signálu a
jeho
přenos
příjem
signálu a



jeho přenos
import (influx)
export (efflux)
intracelulární
redistruibuce
auxinu
intercelulární
tok
intracelulární
tok
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
TIR1
TIR1-dependentní signální dráha auxinu
JÁDRO
Vanneste and Friml, 2009
Regulace genové exprese v odpovědi na auxinový signál:
V odpovědi na auxin jsou represory AUX/IAA degradovány. Tím jsou uvolněny transkripční
faktory ARF, které aktivují transkripci genů odpovědi na auxin („auxin response genes“).
TPL = topless, transkripční korepresor.
Arabidopsis thaliana: genová rodina AUX/IAA (29 členů)
ARF (22 členů)
 celkem 638 možných kombinací
TIR1
Více auxinu
Málo auxinu
Calderon-Villalobos L I et al. Cold Spring Harb Perspect
Biol 2010;2:a005546
TIR1
AUX/IAA
Vazba auxinu a Aux/IAA na TIR1
auxin
auxin
I6P
TIR1
Calderon-Villalobos L I et al. Cold Spring Harb Perspect
Biol 2010;2:a005546
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
ABP1
ABP1-dependentní signální dráha auxinu
ABP1
http://www.rcsb.org/pdb/cgi/explore.cgi?job=graphics&pdbId=1LR5&page
ABP1:
 není membránový protein (žádná hydrofobní doména)
 struktura „b-barrel“ (cupin superfamily)
 C-terminální sekvence KDEL
 po vazbě auxinu dochází k rychlým změnám na plasmatické membráně
Schéma struktur a procesů,
podílejících se na transportu auxinů do buňky a z buňky
20%
IAA
80%
IAA- + H+
pH 5,5
pH 7,0
IAA-
H
Pasivní difuze
„IAA-influx(uptake)carrier“
+
„IAA-efflux-carriers“
BFA
IAA-
PIN
IAA-
Auxin
H+-ATPasa
Endocytosa PINů (i dalších proteinů na PM)
je inhibována auxiny !
Inhibice endocytosy auxiny
Auxiny (po navázání na ABP1) inhibují
endocytosu některých proteinů v PM
(PM-ATPasa, akvaporiny ... i PINy)
… a takto zvyšují jejich množství na PM …
ABP1 je součástí
endocytotického aparátu
ABP1
PM
… a jejich celkovou aktivitu na PM …
změny pH v buněčné stěně,
změny membránového potenciálu
... a zvýšený export auxinů samotných
(zpětná vazba !)
ABP1 je receptorem auxinu pro signální dráhu
regulující endocytosu některých proteinů na PM
Dostupnost auxinu
v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin

biosyntéza

(de)konjugace

degradace
metabolismus
příjem signálu a



jeho přenos
import (influx)
export (efflux)
intracelulární
redistruibuce
auxinu
intercelulární
tok
intracelulární
tok
Model gravitropní reakce
kořene
Vanneste and Friml, 2009
Auxin je do kořenové špičky dopravován středním válcem, je distribuován laterálně
symetricky z kořenového sloupku a transportován bazipetálně do elongační zóny kořene.
Gravitační stimulus: sedimentace statolitů ve sloupku ve směru gravitace a následně
relokalizace přenašečů auxinů z buňky (PIN3). Ty pak přenášejí auxin na spodní stranu
kořene; odtud je auxin transportován do elongační zóny, kde inhibuje růst buněk. Výsledkem
je ohyb kořene dolů ve směru gravitace (pozitivní gravitropismus).
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
Poděkování
Jan PETRÁŠEK
Klára HOYEROVÁ
Petr DOBREV
Milada Čovanová
Adriana Jelínková-Černá
Petr Klíma
Pavel Křeček
Martin Kubeš
Martina Laňková
Jiří Libus
Kateřina Malínská
Karel Müller
Daniela Seifertová
Sibu Simon
Petr Skůpa
Markéta Pařezová
Andrea Hourová, Nikola Drážná,
Jana Stýblová-Žabová
(Jakub Rolčík, Aleš Pěnčík)
PřF UK, Katedra experimentální biologie rostlin
a Katedra biochemie
FBMI, ČVUT – Petr Hošek, Marcel Jiřina
PřF MU – Jan Hejátko et al.
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR
– M. Hof and Jana Humpolíčková
Jiří FRIML and Eva BENKOVÁ et al.
(VIB, University Ghent, Belgie)
Angus MURPHY et al.
(Purdue Univ., Indiana, USA)
Richard NAPIER et al.
(Univ. of Warwick, UK)
Markus GEISLER et al.
(University of Zurich (Fribourg), Switzerland)
Cris KUHLEMEIER et al.
(Univ. Bern, Switzerland)
Christian LUSCHNIG and Jűrgen KLEINE-VEHN
(BOKU, Vienna, Austria)
Finanční podpora: MŠMT (projekt LC06034)
projekty GAČR, EU-INCO Copernicus