Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely

Transkript

Metodika izolace DNA a analýzy
molekulárních markerů pro účely popisu
genetických zdrojů řepky (Brassica
napus L.) a hodnocení jejich diverzity
Metodika byla vypracovaná jako výstup výzkumného projektu MZe NAZV
QI 111A075 „Využití biotechnologických metod, nových výchozích materiálů
a efektivních postupů ve šlechtění ozimé řepky“
Autoři: prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D., Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D.,
Ing. Eva Vondrášková, Ing. Vratislav Kučera, CSc., Ing. Miroslava
Vyvadilová, CSc., Ing. Miroslav Klíma, Ph.D.
České Budějovice, březen 2012
Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích
Zemědělská fakulta
molekulárních markerů pro účely popisu
genetických zdrojů řepky (Brassica
napus L.) a hodnocení jejich diverzity
Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného projektu MZe NAZV
QI 111A075 „Využití biotechnologických metod, nových výchozích materiálů
a efektivních postupů ve šlechtění ozimé řepky“
prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D.
Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D.
Ing. Eva Vondrášková
Ing. Vratislav Kučera, CSc.
Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc.
Ing. Miroslav Klíma, Ph.D.
České Budějovice, 2012
i
Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely popisu
genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity
Vladislav Čurn a kol.
[email protected]
Biotechnologické centrum ZF JU v Českých Budějovicích, České Budějovice
www.zf.jcu.cz, http://biocentrum.zf.jcu.cz
Vypracováno za podpory výzkumného projektu MZe NAZV QI 111A075 „Využití
biotechnologických metod, nových výchozích materiálů a efektivních postupů ve
šlechtění ozimé řepky“.
Text: ©2012 Čurn V. et al.
Foto: ©2012 Čurn V.
Vydáno bez jazykové úpravy
ISBN: 978-80-7394-251-9
ii
Čurn V. a kol. (2012): Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely popisu genetických zdrojů řepky
Obsah:
I. Cíl metodiky ...................................................................................................................... 1 II. Vlastní popis metodiky ................................................................................................... 3 II.1. Úvod ........................................................................................................................... 3 II.2. Metodika izolace DNA .............................................................................................. 5 Rostlinný materiál používaný pro izolaci DNA řepky .................................................... 5 Metody izolace DNA řepky ............................................................................................. 5 Izolace DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) .............................................. 5 Izolace DNA s použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK) ................................. 6 Izolace DNA pomocí CTAB (Williams et al. 1992) ........................................................ 7 Izolace DNA pomocí CTAB–PVP (polyvinylpyrrolidon) ............................................... 9 SDS extrakce podle Edwards et al. (1991)................................................................... 11 Porovnání jednotlivých metod izolace DNA ................................................................ 12 II.3. Metodika analýzy DNA markerů ............................................................................. 15 RAPD (random amplified polymorphic DNA) ............................................................. 15 SSR (single sequence repeat), mikrosatelity ................................................................ 17 ISSR (inter single sequence repeat), mikrosatelity....................................................... 19 AFLP (amplified fragment length polymorphism) ....................................................... 20 II.4. Metodika elektroforézy DNA .................................................................................. 25 Elektroforéza v agarózovém gelu ................................................................................. 25 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu ..................................................................... 27 Elektroforéza v SYNERGELu ....................................................................................... 29 Detekce DNA pomocí SYBR GREEN: .......................................................................... 30 II.5. Metodika analýzy molekulárních dat ....................................................................... 31 Digitální obrazová analýza .......................................................................................... 31 III. Srovnání aktuálnosti postupů .................................................................................... 33 IV. Popis uplatnění metodiky ........................................................................................... 34 V. Seznam použité související literatury .......................................................................... 35 VI. Seznam publikací, které předcházely metodice ........................................................ 39 VII. Příklady výstupů analýzy molekulárních markerů ................................................ 41 iii
iv
I. Cíl metodiky
Řepka (brukev řepka olejka, Brassica napus L.) patří mezi nejvýznamnější olejniny
a v současné době se ve světovém měřítku řadí na druhé místo hned za sóju (Ash
2012). V Evropě je z hlediska výměry nejvýznamnější olejninou, je pěstována na
60% (6,5 mil. ha) celkové plochy této skupiny plodin (10,8 mil. ha) (Kolektiv 2009).
Nejinak je tomu i v České republice, kde sklizňové plochy řepky olejky kolísají v
rozmezí 350-400 tis. ha. Řepka olejka je tak v ČR co do výměry třetí
nejvýznamnější plodinou (po pšenici a jarním ječmenu). Řepkový olej je velmi
kvalitní a téměř srovnatelný s vysoce ceněným olejem olivovým. V průběhu
šlechtění došlo k významným posunům ve skladbě mastných kyselin. V současné
době existuje také řada šlechtitelských programů cíleně zaměřených na získání
odrůd se změněnou skladbou mastných kyselin dle specifického využití dané
odrůdy.
Řepka patří mezi „mladé“ zemědělské plodiny s poměrně krátkou šlechtitelskou
historií. Jako kulturní plodina, pěstovaná pro olejnatá semena, se vyskytuje
v Evropě od 16. století, ale začátky intenzivnějšího šlechtění a využití
v potravinářství se datují až od přelomu 19. a 20. století (Fábry et al. 1992).
Intenzivním šlechtěním bylo dosaženo zásadní změny složení oleje a tím i jeho
převedení z kategorie nejedlého oleje vhodného jen pro technické účely, na olej
potravinářský s vhodnou skladbou mastných kyselin, který v mnohém předčí i
velmi kvalitní olej olivový (Baranyk et al. 2007). Odrůdová skladba a genetická
struktura pěstovaných odrůd procházela vývojem od krajových a odrůd populací
se standardním obsahem kyseliny erukové a glukosinolátů přes „0“ a „00“ liniové
odrůdy. V současnosti je velký důraz kladen na šlechtění hybridních odrůd řepky,
které zaujímají v České republice přibližně 50% osevní plochy (SPZO 2011).
Moderním trendem je také šlechtění hybridních transgenních odrůd a odrůd se
specifickými vlastnostmi (změněná skladba mastných kyselin, snížený obsah
glukosinolátů, žlutosemenné odrůdy) (Vašák et al. 1997, Baranyk 2007).
I když řepka olejka patří do skupiny relativně pozdě domestikovaných rostlin
(Soltis et al. 1998), její šlechtění bylo v posledních několika desetiletích velmi
intenzivní. Úzce zaměřeným šlechtěním jen na hospodářsky a agronomicky
nejvýznamnější parametry se zúžila genetická základna odrůd řepky a
znesnadnila charakterizace odrůd. Obdobná situace je i u dalších zemědělských
plodin a hodnocení na základě morfologických znaků se tak stává problematickým
(Nielsen 1985, Lombard et al. 2000).
Předkládaná metodika je zacílena na využití molekulárních markerů na bázi
analýzy DNA pro účely popisu a identifikace jednotlivých genetických zdrojů a
hodnocení jejich genetické diverzity. Použité postupy lze využít i pro popis a
charakterizaci odrůd, šlechtitelských materiálů a genových zdrojů používaných ve
šlechtění.
1
2
II. Vlastní popis metodiky
II.1. Úvod
Odrůda je považována za základ moderní hospodářské produkce a hlavním
zájmem ve šlechtění hospodářských plodin je tedy získávání nových odrůd, které
by se vyznačovaly vyššími výnosy, výhodnějšími kvalitativními znaky a rezistencí k
biotickým a abiotickým faktorům. V mnohých případech jsou donory těchto
zlepšujících znaků (kromě výnosu a kvality semene) plané druhy. Významným
faktorem při výběru rodičovských komponent pro tvorbu vysoce výnosných linií a
hybridů je genetická odlišnost (diverzita), kterou lze stanovit pomocí molekulárních
metod. Použití molekulárních markerů umožňuje efektivnější využití takovýchto
genetických zdrojů ve šlechtění (Sakai et al 2005).
Intenzivní šlechtění s sebou nese riziko zúžení genetické základny dané plodiny,
klesá míra genetické diverzity používaných genetických zdrojů a lze očekávat i
zvýšení obtížnosti identifikace jednotlivých odrůd řepky na základě jejich fenotypu.
Registrace a právní ochrana odrůd řepky spoléhá na poměrně malý počet
morfologických znaků, a jak se zvyšuje množství odrůd, klesá schopnost jejich
rozlišení pouze na základě morfologických znaků (Lombard et al. 2000). Ačkoliv
jsou morfologické znaky, kvalitativní parametry a výnosové charakteristiky v
současnosti využívány pro účely identifikace odrůd, a jako klíčové parametry i pro
jejich popis a ochranu (ISTA a UPOV direktivy), jsou nové markery dále vyvíjeny
tak, aby byla zachována účinnost registrace a DUS testů (Čurn and Žaludová
2007). V 80. letech byly pro tyto účely využívány zejména isoenzymy a zásobní
proteiny (Gupta a Röbbelen 1986, Mündges et al. 1990). Nevýhodou těchto
biochemických markerů je jejich relativně nízká úroveň polymorfismu,
pravděpodobně také jako výsledek genetické podobnosti moderních odrůd (Arús
et al. 1985, 1991, Lee et al. 1996). Isoenzymy však mohou velmi dobře odlišit
řepku od ostatních brukvovitých plodin (Brassica oleracea, Brassica rapa atd.),
např. při hodnocení příměsí osiva. Pro identifikaci jednotlivých odrůd řepky je ale
třeba využít doplňkového markerovacího systému pro přesný popis odrůd
(Ainsworth a Sharp 1989, Čurn a Sáková 1997).
Vhodným markerovacím systémem jsou DNA markery – jak pro účely popisu a
identifikace odrůd, DUS testování a právní ochranu odrůd, tak i jako systému pro
hodnocení genetické diverzity genetických zdrojů (Alphey 1997, Snowdon 2004) a
v neposlední řadě i jako nástroje pro zkvalitnění šlechtitelského procesu a využití
systémů molecular marker assisted selection (MMAS) nebo genotypic selection
(GS) (Paterson et al. 1991, Heffner et al. 2009). Ve srovnání s morfologickými
znaky mají molekulární markery mnoho výhod a jsou úspěšně používány nejen při
uznávacím řízení, určování pravosti odrůd a kontrole odrůdové čistoty hybridních
odrůd (Marshall et al. 1994), ale i při detekci transgenů (Hájková et al. 2005).
Markerovací systémy se odlišují v obsahu informací, počtu výsledných
polymorfismů, stupni automatizace, pracnosti a výší finančních nákladů (Čurn a
Žaludová 2007).
3
Prvními z DNA markerů, které byly používány u řepky a dalších brukvovitých
plodin byly RFLP markery (polymorfismus délky restrikčních fragmentů, RFLP). I
když se tato technika ukázala být dostatečnou pro hodnocení genetického
polymorfismu u brukvovitých rostlin (Figdore et al. 1988, Dos Santos et al. 1994,
Hallden et al. 1994), její aplikace je pracná, nákladná a poskytuje jen omezený
počet markerů; využití techniky RFLP je navíc omezeno jen na speciální případy.
U řepky a dalších brukvovitých plodin jsou v současné době využívány zejména
modernější markerovací systémy založené na technice PCR – techniky RAPD,
SSR, AFLP. RAPD analýza byla široce používána pro detekci genetického
polymorfismu brukvovitých rostlin zejména na počátku 90.let (Kresovich et al.
1992, Jain et al. 1994, Mailer et al. 1994). Mikrosatelity (SSR markery) jsou
kodominantní, vysoce polymorfní markery založené na PCR a přestože je vývoj
lokus specifických oligonukleotidových primerů časově náročný a drahý, skýtají
značné možnosti pro popis a identifikaci odrůd (Kresovich et al. 1995, SzewcMcFadden et al. 1996, Uzunova a Ecke 1999). Poslední z častěji využívaných
technik pro popis genetických zdrojů, hodnocení genetické diverzity a pro účely
identifikace odrůd je technika AFLP (Vos et al. 1995). Studie, které porovnávaly
jednotlivé techniky DNA markerů za účelem identifikace odrůd řepky, pokládají
AFLP techniku jako nejslibnější ve srovnání s jinými dostupnými metodami (Powell
et al. 1996, Das et al. 1999, Lombard et al. 2000).
Cílem metodiky je předložit ucelený přehled metod izolace DNA, metod analýzy
DNA markerů a postupů pro hodnocení DNA markerů pro účely popisu a
charakterizování genetických zdrojů, šlechtitelských materiálů a odrůd řepky.
4
II.2. Metodika izolace DNA
Rostlinný materiál používaný pro izolaci DNA řepky


děložní lístky (1-2 týdny po vyklíčení)
plně vyvinuté pravé listy
DNA je izolována dle příslušného protokolu z čerstvého materiálu (odebraného
v laboratoři, ve skleníkových nebo v polních podmínkách a ihned zpracovávaného,
popřípadě uchovávaného do doby izolace na ledu po dobu max 2–4 hod) nebo
z materiálu zamraženého (po odebrání je materiál hluboce zmražen a uchováván
při teplotě -80°C, krátkodobě je možné uchování i při teplotě -20°C).
Metody izolace DNA řepky
DNA je izolována z materiálu čerstvého nebo zamraženého. O výtěžnosti, čistotě
a možnostech použití takto získané DNA se zmiňujeme v závěru této kapitoly.
DNA je možno izolovat mikroextrakčními metodami (komerčně dostupnými kity)
nebo pomocí standardních metod izolace DNA.
Izolace DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)
Metoda je založena na principu purifikace DNA pomocí specielních mikrokolon –
na první koloně dochází k zachycení proteinů, polysacharidů, detergentu a dalších
nečistot, na druhé koloně dochází k zachycení DNA a jejímu následnému vymytí
elučním roztokem.
Rostlinné pletivo můžeme rozdrtit v tekutém dusíku. Pokud nepoužíváme tekutý
dusík, rozdrtíme rostlinné pletivo homogenizátorkem přímo v mikrocentrifugační
zkumavce. Maximální množství rostlinného pletiva, které můžeme použít je
100 mg.
1. K homogenizovanému vzorku přidáme 400 µl pufru AP1 předehřátého na
65°C a 4 µl RNázy A (20 mg/ml). Důkladně protřepeme na vortexu. Směs
inkubujeme 10 min při 65°C, během inkubace mikrocentrifugační zkumavku 2–
3x převrátíme.
2. Přidáme 130 µl pufru AP2, promícháme a inkubujeme 5 min na ledu.
3. Lyzát přeneseme do QIAshredder kolonek a centrifugujeme 2 min při
8000 rpm. Při pipetování lyzátu do kolonek je nutné odstřihnout špičku pipety.
Přes filtr projde do sběrné nádobky i malá část mrtvých buněčných pletiv a
sraženin, kde vytvoří pelet.
5
4. Supernatant přeneseme do nových mikrocentrifugačních zkumavek. Většinou
získáme 450 µl supernatantu. Je-li ho méně, přepočteme množství roztoků
přidávaných v dalších krocích.
5. Přidáme 1,5 dílu pufru AP3 a promícháme pomocí pipety.
6. 650 µl směsi z kroku 5 (včetně sraženin) přeneseme do DNeasy kolonek,
centrifugujeme 1 min při  8000 rpm a odstraníme přefiltrovanou frakci.
7. Opakujeme krok 6 se zbývajícím vzorkem, odstraníme přefiltrovanou frakci i
centrifugační zkumavky.
8. DNeasy kolonky umístíme do nových centrifugačních zkumavek, přidáme
500 µl pufru AW do DNeasy kolonky, centrifugujeme 1 min při  8000 rpm a
odstraníme přefiltrovanou frakci.
9. Přidáme 500 µl pufru AW do DNeasy kolonky, centrifugujeme 2 min při
maximálních otáčkách až do vysušení membrány v kolonce, odstraníme
přefiltrovanou frakci i centrifugační zkumavky. DNeasy kolonky vyndáme
opatrně z centrifugačních zkumavek, aby nedošlo ke kontaminaci vzorku
etanolem obsaženým ve filtrátu.
10. DNeasy kolonky přeneseme do 1,5 ml (2 ml) mikrocentrifugačních zkumavek a
přidáme 100 µl pufru AE (zahřátého na 65°C) přímo na membrány kolonek a
centrifugujeme 1 min při  8000 rpm. Eluci můžeme zopakovat (do nové
mikrocentrifugační zkumavky).
Chemikálie:
 roztoky a kolony jsou součástí kitu
 kapalný dusík
 ethanol (čistý, 96 % ethanol nedenaturovaný)
 šupinkový led
Přístroje:
 centrifuga, sada automatických pipet, homogenizátory, vortex, třepací vodní
lázeň nebo třepací dry-blok, termostat, analytické váhy
Izolace DNA s použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK)
Metoda je založena na principu purifikace DNA pomocí specielních mikrokolon.
zkumavce. Maximální množství rostlinného pletiva, kterého můžeme použít je
100 mg.
1. V mikrocentrifugační zkumavce zhomogenizujeme cca 60 mg rostlinného
pletiva. Homogenát přeneseme do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a
přidáme 400 µl Lysis Buffer P a 20 µl proteinázy K. Vortexujeme a necháme
30 min inkubovat při 65°C. Během inkubace 2 – 3krát promícháme.
Připravíme si Spin Filter do 2,0 ml Receiver Tube.
6
2. Vzorky přeneseme na Spin Filter. Centrifugujeme 10 min při 12000 rpm.
Pokud je to nutné přidáme 40 µl Rnázy A (10 mg/ml), vortexujeme a necháme
5 min inkubovat při pokojové teplotě.
3. Přidáme 200 µl Binding Buffer P a vortexujeme.
4. Umístíme nové Spin Filter do 2,0 ml Receiver Tube, přeneseme vzorky a
1 min inkubujeme. Centrifugujeme 1 min při 12000 rpm.
5. Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0 ml Receiver Tube.
6. Přidáme 550 µl Wash Buffer I a centrifugujeme 1 min při 12000 rpm.
Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0 ml Receiver Tube.
7. Přidáme 550 µl Wash Buffer II a centrifugujeme 1 min při 12000 rpm.
Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0 ml Receiver Tube. Krok
opakujeme. Nakonec centrifugujeme 2 min při 12000 rpm kvůli odstranění
ethanolu.
8. Spin Filter umístíme do nových 1,5 ml Receiver Tube a přidáme 50 – 100 µl
Elution Buffer D předehřátého na 65°C. Inkubujeme 3 min při pokojové teplotě.
Centrifugujeme 1 min při 10000 rpm.
Pokud chceme vytvořit 1. a 2. eluát přidáme 50 µl Elution Buffer D předehřátého
na 65°C a inkubujeme 3 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min při
10000 rpm. Postup opakujeme znovu s dalšími 50 µl Elution Buffer D, ale do
nové 1,5 ml Receiver Tube. Vznikne nám tak 50 µl 1. a 2. eluátu.
Chemikálie:
 roztoky a kolony jsou součástí kitu
 kapalný dusík
 šupinkový led
Přístroje:
 centrifuga, sada automatických pipet, homogenizátory, vortex, třepací vodní
lázeň nebo třepací dry-blok, termostat, analytické váhy
Izolace DNA pomocí CTAB (Williams et al. 1992)
Tato metoda slouží k extrakci většího množství poměrně čisté DNA pro účely
standardizace metod a pro účely AFLP analýzy.
Metoda je založena na schopnosti CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) vytvářet
komplex s nukleovými kyselinami, který je při vysoké koncentraci solí rozpustný
(0,7 M NaCl), ale při snížené koncentraci solí (0,45 M NaCl) vytváří sraženinu
(Murray a Thompson 1980). CTAB zároveň působí jako detergenční činidlo, které
uvolňuje DNA z komplexu membrán a proteinů. Na základě rozdílné rozpustnosti
CTAB v porovnání s DNA je lze oddělit a získat dostatečně čistou rostlinnou DNA.
7
1. Připravíme si roztok 2x CTAB a 1 % merkaptoethanolu, na jeden vzorek
počítáme 500 µl roztoku. Připravený roztok dáme předehřát na 65°C.
2. Rostlinné pletivo můžeme rozdrtit v tekutém dusíku. Pokud nepoužíváme
tekutý dusík do sterilních 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek dáme
rostlinné pletivo (cca 100 mg), ze kterého chceme izolovat DNA. Pro lepší
drcení pletiva přidáme sterilní křemičitý písek.
 V případě lyofilizátu je vhodné tento krok provádět v 10 ml centrifugačních
tubách a na 100 mg lyofilizátu přidat 5 ml roztoku 2x CTAB a 1 %
merkaptoethanolu.
3. Ke každému vzorku přidáme 500 µl předehřátého pufru, pletivo rozdrtíme a
promícháme s pufrem. Necháme 45 min inkubovat při 65°C. Během inkubace
každých cca 15 min lehce promícháme.
4. Přidáme 500 µl směsi fenol–chloroform–IAA, či pouze chloroform-IAA 10 min
protřepáváme. Centrifugujeme 5 min maximální rychlostí při pokojové teplotě.
5. Do nových mikrocentrifugačních zkumavek odpipetujeme vodnou fázi.
Přidáme 500 µl směsi chloroform–IAA, 10 min protřepáváme. Centrifugujeme
5 min maximální rychlostí při pokojové teplotě.
6. Do nových mikrocentrifugačních zkumavek přepipetujeme vodnou fázi.
Přidáme 2/3 objemu isopropanolu (přibližně 250 µl). 2–3x lehce promícháme.
Dáme na 30 min do mrazáku (-20°C). Centrifugujeme 5 min při 4°C maximální
rychlostí. DNA by se měla zachytit na dně mikrocentrifugační zkumavky.
Odstraníme supernatant. Pelet usušíme.
7. Přidáme 300 µl 1x TE a necháme 30–60 min inkubovat při 37°C.
8. Přidáme 1/10 objemu 3 M octanu sodného a 600 µl ledového (z mrazáku)
96 % ethanolu. 2–3x lehce promícháme. Vzorky dáme do mrazáku (-20°C)
minimálně na 20 min, maximálně na 12 hodin (větší výtěžnost DNA).
9. Vzorky vyndáme z mrazáku a 10 min centrifugujeme maximální rychlostí při
4°C. DNA by měla vytvořit viditelný pelet na dně mikrocentrifugační zkumavky.
Odstraníme supernatant (pipetujeme 2x). Necháme dobře usušit.
10. Přidáme 400 µl ledového 70 % ethanolu. 2 – 3x lehce promícháme.
Centrifugujeme 2 min maximální rychlostí při teplotě 4°C. Okamžitě
odstraníme všechen supernatant. Vzorky necháme dobře usušit (cca 10 min).
11. Podle množství peletu (DNA) přidáme 20–200 µl 1x TE pufru nebo sterilní
vody.
Pro dokonalé přečištění můžeme zopakovat postup od bodu 5.
Přidáme 1 µl Rnázy A a necháme 30 min inkubovat ve 37°C.
Chemikálie:
 kapalný dusík
 šupinkový led
 2x CTAB extrakční pufr (2 % CTAB, 100 mM Tris–HCl, pH=8,0, 50 mM
EDTA, 1,4 M NaCl, 1 % 2-merkaptoetanol)
 2-merkaptoethanol
 fenol–chloroform–IAA (25 : 24 : 1)
 chloroform–IAA (24 : 1)
8





1x TE pufr sterilní
3 M octan sodný
isopropanol
70 % ethanol
Rnáza A 2 mg/ml
Přístroje:
 chlazená centrifuga, sada automatických pipet, homogenizátory, vortex,
třepací vodní lázeň nebo třepací dry-blok, termostat, analytické váhy, pH
metr, mrazák, digestoř
Izolace DNA pomocí CTAB–PVP (polyvinylpyrrolidon)
Tato metoda slouží k extrakci většího množství poměrně čisté DNA pro účely
standardizace metod a pro účely AFLP analýzy. Přidání PVP (polyvinylpyrrolidon)
odstraňuje kontaminanty a umožňuje získání čisté a kvalitnější DNA.
Metoda je založena na schopnosti CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) vytvářet
komplex s nukleovými kyselinami, který je při vysoké koncentraci solí rozpustný
(0,7 M NaCl), ale při snížené koncentraci solí (0,45 M NaCl) vytváří sraženinu
(Murray a Thompson 1980). CTAB zároveň působí jako detergenční činidlo, které
uvolňuje DNA z komplexu membrán a proteinů. Na základě rozdílné rozpustnosti
CTAB v porovnání s DNA je lze oddělit a získat dostatečně čistou rostlinnou DNA.
1. Připravíme si roztok 2x PVP–CTAB a 1 % merkaptoethanolu, na jeden vzorek
počítáme 500 µl roztoku. Připravený roztok dáme předehřát na 65°C.
2. Rostlinné pletivo můžeme rozdrtit v tekutém dusíku. Pokud nepoužíváme
tekutý dusík do sterilních 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek dáme
rostlinné pletivo (cca 100 mg), ze kterého chceme izolovat DNA. Pro lepší
drcení pletiva přidáme sterilní křemičitý písek.
 V případě lyofilizátu je vhodné tento krok provádět v 10 ml centrifugačních
tubách a na 100 mg lyofilizátu přidat 5 ml roztoku 2x PVP–CTAB a
1 % merkaptoethanolu.
3. Ke každému vzorku přidáme 500 µl předehřátého pufru, pletivo rozdrtíme a
promícháme s pufrem. Necháme 45 min inkubovat při 65°C. Během inkubace
každých cca 15 min lehce promícháme.
4. Po centrifugaci 12000 rpm 10 min se převede supernatant (500 µl) do nových
1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a přidá se 500 μl chloroformu s IAA,
směs se 10 min promíchává a následně centrifuguje 5 min při 12000 rpm.
5. Do nových mikrocentrifugačních zkumavek odpipetujeme vodnou fázi.
Přidáme 1/5 objemu 5 % CTAB a směs se promíchá, opět se přidá 500 µl
směsi chloroform–IAA a 10 min protřepáváme. Centrifugujeme 5 min
maximální rychlostí při pokojové teplotě.
6. Do nových mikrocentrifugačních zkumavek přepipetujeme vodnou fázi.
Přidáme 2/3 objemu isopropanolu (přibližně 250 µl) a 2–3x lehce promícháme.
Dáme na 30 min (až na noc) do mrazáku (-20°C). Centrifugujeme 5 min při
9
7.
8.
9.
10.
12.
4°C maximální rychlostí. DNA by se měla zachytit na dně mikrocentrifugační
zkumavky. Odstraníme supernatant.
Přidáme 300 µl 1x TE a necháme 30–60 min inkubovat při 37°C.
Přidáme 2 objemy (600 µl) ledového (z mrazáku) 96 % ethanolu, 2–3x lehce
promícháme. Vzorky dáme do mrazáku (-20°C) minimálně na 20 min,
maximálně na 12 hodin (větší výtěžnost DNA).
Vzorky vyndáme z mrazáku a 10 min centrifugujeme maximální rychlostí při
4°C. DNA by měla vytvořit viditelný pelet na dně mikrocentrifugační zkumavky.
Odstraníme supernatant.
Přidáme 1 ml ledového 70 % ethanolu, 2 – 3x lehce promícháme.
Centrifugujeme 2 min maximální rychlostí při teplotě 4°C. Okamžitě
odstraníme všechen supernatant, pro odstranění viditelných nečistot
opakujeme tento krok 2x. Vzorky necháme dobře vysušit (max. 3 hodiny).
Podle množství peletu (DNA) přidáme 20–200 µl 1x TE pufru nebo sterilní
vody (rozpustit 40 min při 37°C).
Pro dokonalé přečištění můžeme zopakovat postup od bodu 5.
Přidáme 1 µl Rnázy A a necháme 30 min inkubovat ve 37°C.
Chemikálie:
 kapalný dusík
 šupinkový led
 2x PVP–CTAB extrakční pufr (2 % CTAB, 100 mM Tris–HCl, pH=8,0,
20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1 % 2-merkaptoetanol, 1 % PVP–40000)
 2-merkaptoethanol
 5 % CTAB
 1x TE pufr sterilní
 isopropanol
 70 % ethanol
 Rnáza A 2 mg/ml
Přístroje:
 chlazená centrifuga, sada automatických pipet, homogenizátory, vortex,
třepací vodní lázeň nebo třepací dry-blok, termostat, analytické váhy,
pH metr, mrazák, digestoř
10
SDS extrakce podle Edwards et al. (1991)
zkumavce. Maximální množství rostlinného pletiva, které můžeme použít je
500 mg.
1. 0,5 g listového pletiva homogenizujeme ve 100 µl extrakčního pufru v
mikrocentrifugační zkumavce.
2. K homogenátu přidáme 300 µl extrakčního pufru a 5 s vortexujeme. Tato
extrakční směs může být ponechána při laboratorní teplotě i déle než
1 hodinu, dokud nejsou všechny vzorky homogenizovány.
3. Extrakt centrifugujeme 1 min při 13000 rpm a 300 µl supernatantu přeneseme
do čisté mikrocentrifugační zkumavky.
4. K supernatantu přidáme 300 µl isopropanolu vychlazeného na -20°C a směs
necháme 2 min srážet. Centrifugujeme 5 min při 13000 rpm.
5. Osušený pelet rozpustíme ve 100 µl TE pufru. DNA je stabilní ve 4°C déle než
1 rok.
Chemikálie:
 kapalný dusík
 200 mM Tris–HCl (pH=7,5)
 250 mM NaCl
 25 mM EDTA
 0,5 % SDS
 isopropanol
 TE pufr (10 mM Tris–HCl, pH=7,5; 0,1 mM EDTA)
Přístroje:
 centrifuga, sada automatických pipet, homogenizátory, vortex, analytické
váhy, pH metr, mrazák, digestoř
11
Porovnání jednotlivých metod izolace DNA
Vzhledem k tomu, že techniky analýzy DNA markerů mají být rutinně používány
v běžné praxi pro popis a identifikaci genotypů řepky, je pro šlechtitele zásadní,
aby byla k tomuto účelu vypracována taková metoda extrakce DNA, která bude
optimalizována pro toto cílové uplatnění. Za optimální je považována taková
metoda, která bude na straně jedné manuálně i ekonomicky nenáročná a na
straně druhé bude poskytovat dostatečný výtěžek DNA, která bude použitelná i
pro další hodnocení metodami genetického markerování. Pomocí vybrané
„kompromisní“, ale optimalizované metody pak je možné zpracovat maximální
počet vzorků za jednotku času (např. denně, týdně) při uspokojivé kvalitě DNA a
za současné ekonomické únosnosti.
Pro volbu vhodné techniky extrakce DNA byly použity dva druhy rostlinného
materiálu: 1/ čerstvé pletivo z děložních lístků, 2/ zdravé čerstvé listy vzrostlé
rostliny. Kromě izolace z čerstvé hmoty byla prováděna izolace ze zamraženého
materiálu jednak při teplotě -20°C a jednak -80°C.
V následující tabulce jsou porovnány sledované charakteristiky při hledání
optimální metody izolace DNA.
Tab. 1. Porovnání použitých metod izolace DNA
Metoda
Cena
[Kč]
CTAB
10
CTAB+PVP
SDS
INVITEK
QIAGEN
11
7
62
75
Doba
izolace
[h]
8
(2dny)*
8
(2dny)*
4 -6
1,5-2
1,5-2
Počet
vzorků
na
den**
Pracnost
***
Práce s
fenolem
Výtěžek
DNA [µg]
****
Průměrný
výtěžek
DNA [µg]
****
2 x 24
3
ne/ano
1 - 14
7
2 x 24
2 x 24
4 x 24
4 x 24
3
2
1
1
ne
ne
ne
ne
1 - 14
1 - 14
2 - 32
1 - 30
7
7
10
5
* osm hodin, ale rozloženo do dvou dnů
** standardní laboratoř, 1 pracovní linka, 1 centrifuga s rotorem pro 24 mikrozkumavek
*** 1 – nejméně náročné, 3 – nejnáročnější postup
**** při použití ~ 80 mg čerstvého rostlinného materiálu
Bylo testováno pět metod extrakce DNA: tři klasické metody izolace DNA - izolace
rostlinné DNA pomocí CTAB (Williams et al. 1992) a pomocí CTAB s přidáním
PVP, SDS extrakce (Edwards et al. 1991) a dvě metody, při nichž byl používán
komerčně dodávaný kit pro izolaci rostlinné DNA Invisorb Spin Plant Mini Kit
(INVITEK) a DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
12
Podle sledovaných charakteristik byla jako optimální metoda pro účely analýzy
DNA markerů vybrána izolace pomocí Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK),
která i přes nejvyšší cenu za vzorek nejlépe splňovala sledované vlastnosti.
Vysoká cena byla vyvážena faktem, že jsou získány standardní vzorky DNA,
opakovatelně a reprodukovatelně u celého spektra zkoušených šlechtitelských
materiálů. Druhou úspěšnou metodou izolace byla metoda CTAB-PVP, přičemž u
této techniky je finanční atraktivita vyvážena větší časovou náročností. Pomocí
těchto dvou izolačních technik je získaná DNA v požadovaném množství a kvalitě,
která umožňuje bezproblémovou analýzu širokého spektra DNA markerů. Tyto
metody představují vhodnou alternativu vyhovující požadavkům: (1) na
jednoduchou standardní a rychlou metodu, kterou bude moci uplatňovat v běžné
praxi, či (2) finančně dostupnou metodu poskytující kvalitní DNA, avšak na úkor
času.
Při srovnání izolace DNA z listů v různých růstových fázích byly nalezeny rozdíly.
Mladé děložní lístky poskytovaly kvalitnější DNA, ale i DNA z listů z plně
vyvinutých rostlin byla dostatečně kvalitní pro další zpracování, musí však být
kladen velký důraz na správné odebírání listové hmoty, odebírat jen absolutně
zdravé, nezažloutlé listy. Možnost odběru listů i v pozdější růstové fázi umožňuje
provedení analýzy z materiálu odebíraného přímo ze šlechtitelských parcel.
13
14
II.3. Metodika analýzy DNA markerů
RAPD (random amplified polymorphic DNA)
RAPD analýza je metoda založená na PCR technologii. Mezi její výhody patří
rychlost (je použitelná pro rychlý screening a identifikaci vzorků) a potřeba jen
velmi malého množství templátové DNA. Vzhledem k tomu, že při RAPD analýze
jsou využívány náhodně generované primery, není pro její provedení vyžadována
znalost cílových sekvencí a studovaného genomu. RAPD detekuje polymorfismus
v celém genomu (Oborník et al. 2000). RAPD markery byly úspěšně používány
v genetickém fingerprintingu při analýze odrůd různých druhů rodu Brassica
(Demeke et al. 1992, Jain et al. 1994), dále jsou využitelné při analýze původů
(Scott et al. 1992, Lerceteau et al. 1997) a genetickém mapování (Reiter et al.
1992, Uzunova et al. 1995). Chakrabarti et al. (2006) upozorňuje na jednu z
hlavních nevýhod této metody a to nestabilitu poskytnutých spekter v rámci
opakování a rovněž zjistil rozdíly ve spektrech v závislosti na izolovaném pletivu a
podmínkách kultivace.
Pro RAPD analýzu byly pro účely předkládané metodiky použity náhodné primery
(OPERON Technologies, CA), sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 2.
Tab. 2: Sekvence náhodných primerů používaných pro RAPD analýzu.
Primer
OPA-01
OPA-02
OPA-03
OPA-09
OPA-10
OPA-13
OPA-20
OPB-01
OPB-03
OPB-04
OPB-06
OPB-07
OPB-08
OPB-10
OPB-11
OPB-12
OPB-17
OPB-18
OPB-20
Sekvence ‘5—3’
CAGGCCCTTC
TGCCGAGCTG
AGTCAGCCAC
GGGTAACGCC
GTGATCGCAG
CAGCACCCAC
GTTGCGATCC
GTTTCGCTCC
CATCCCCCTG
GGACTGGAGT
TGCTCTGCCC
GGTGACGCAG
GTCCACACGG
CTGCTGGGAC
GTAGACCCGT
CCTTGACGCA
AGGGAACGAG
CCACAGCAGT
GGACCCTTAC
15
OPF-04
GGTGATCAGG
OPF-05
CCGAATTCCC
OPF-07
CCGATATCCC
OPF-08
GGGATATCGG
OPF-12
ACGGTACCAG
Sekvence dalších primerů Operon lze nalézt v databázi výrobce:
https://www.operon.com/stock/rapd_10mer_price.php
Protokol RAPD analýzy vychází z metodiky Williams et al. (1990) upravené na
pracovišti Biotechnologického centra ZF JU - Sobotka et al. (2004) a Čurn et al.
(2005).
PCR reakce probíhá v objemu 25 µl, v 1x reakčním pufru (10 mM Tris–HCl,
pH=8,3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1% Triton X-100), 100 µM dNTP, 10 pM
primeru (Operon Technologies, serie A, B, F, H a K), 1 U Taq polymerázy
(TAKARA) a 25 ng templátové DNA.
Schéma pipetování – systém TAKARA:
 2,5 µl 10x reakčního pufru
 2,0 µl dNTPs
 1 µl DNA
 2 µl primeru
 0,2 µl DNA polymerázy (1 U)
 17,3 µl dH2O (voda do objemu 25 µl)
Alternativně je možné použít komerčně dodávané „master mixy“. PCR reakce pak
probíhá v objemu 25 µl, v 1x reakčním pufru (75 mM Tris–HCl, pH=8,8, 20 mM
(NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 2,5 mM MgCl2,), 200 µM dNTP, 10 pM primeru
(Operon Technologies, serie A, B, F, H a K), 1,25 U Taq Purple DNA polymerázy
(PPP Master Mix, Top-Bio, CZ) a 25 ng templátové DNA.
Schéma pipetování – systém PPP MM Top-Bio:
 12,5 µl PPP master mixu
 1 µl DNA
 2 µl primeru
Amplifikace probíhá na MJ Research Thermocycler PTC 100, nebo Bioer XP
Cycler při následujícím teplotním profilu:
 počáteční denaturace
3 min
94°C
 45 cyklů:
1 min
94°C
2 min
35°C
3 min
72°C
 konečná elongace
10 min 72°C
 stop
–
4°C
16
PCR produkty se rozdělují na 1,5% agarózovém gelu v 1x TBE pufru. Podmínky
separace: 23 V 30min, 90 V 2hod a 30min. Jako marker se používá 100 bp DNA
ladder (NEB) a DNA fragmenty se vizualizují barvením pomocí ethidium bromidu
pod UV světlem. RAPD profily se zaznamenávají pomocí Epson Ultra Cam 3100Z
Imaging System.
RAPD fingerprinty se následně vyhodnocují pomocí specializovaného software
(BioProfil 1D+, Vilber Lourmat; GelManager for Windows, BioSystematica;
UltraQuant) a získaná primární data přítomnosti či nepřítomnosti daného markeru
se dále statisticky zpracovávají.
Chemikálie:
 DNA polymeráza, dNTP’s, 10x pufr, MgCl2 nebo PPP Master Mix
 templátová DNA
 primery
 dH2O (PCR dH2O, nebo Millipore dH2O)
Přístroje:
 PCR thermocykler, centrifuga, sada automatických pipet, mrazák
SSR (single sequence repeat), mikrosatelity
Za mikrosatelity se považují tandemově uspořádaná krátká opakování s délkou
motivu 2–4 párů bazí (Morgante and Olivieri, 1993). Di-, tri- nebo tetranukleotidová
opakování jsou uspořádána v tandemech po 5 – 50 ti kopiích. Ashkenazi et al.
(2001) odhadli při studiu pěti rozdílných motivů, že mikrosatelity mohou být
nalezeny každých 52 kb.
Markerovací systém využívající mikrosatelity u řepky ozimé je vhodným systémem
z důvodu řady známých specifických SSR primerů pro druhy rodu Brassica
(Kresovich et al. 1995, Szewc-McFadden et al. 1996, Uzunova and Ecke, 1999).
Pro analýzu genetických zdrojů řepky se používají i „cross-species“
mikrosatelitové primery, např. primery odvozené pro Arabidopsis, nga 129-1, nga
139-1 (Bell and Ecker 1994). Westman et al. (1998) analýzou potvrdili, že tyto dva
primerové páry amlifikovaly mikrosatelity i u B. napus. Pro analýzu odrůd, zejména
pak DH linií a později AI linií, byl testován SSR primer Bn9A z důvodu uváděného
vysokého stupně polymorfismu (Kresovich et al. 1995).
Pro SSR analýzu u řepky byly pro účely předkládané metodiky použity primerové
páry NMS0011, NMS0151, NMS0192, NMS0310, NMS0409, NMS0528,
NMS0535, NMS0661, NMS0668, NMS0693, NMS0725, NMS0776, NMS0879,
NMS0935, NMS1014, NMS1078, NMS1096, NMS1099, NMS1276 (Plieske,
TraitGenetics), Bn6A2, Bn9A (Kresovich et al. 1995), Bn12A, Bn19A, Bn25C2,
Bn26A, Bn35D, Bn38A, Bn59A1, Bn68/1, Bn72A, Bn80/3, Bn83/1 (SzewcMcFadden et al. 1996), nga129-1, nga139-1 (Westman et al. 1998).
17
Protokol SSR analýzy vychází z metodiky vypracované
Biotechnologického centra ZF JU (Sobotka et al. 2004).
na
pracovišti
PCR reakce probíhá v objemu 25 µl, v 1x reakční pufru (10 mM Tris-HCl, pH 8.3,
50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1% Triton X-100), 100 μM dNTP, 10 pM primeru, 1 U
DyNAzyme II Taq polymerase (Finzyme) a 50 ng templátové DNA.
Schéma pipetování:
 2,5 µl 10x reakčního pufru
 2,0 µl dNTPs
 1 µl DNA
 0,5 µl primer F
 0,5 µl primer R
 0,2 µl DNA polymerázy (1 U)
Amplifikace probíhá na Biometra T1 Cycler při následujícím teplotním profilu:
3 min
94°C
 30 cyklů:
30 s
94°C
30 s
54–57°C, dle příslušného primeru
1 min
72°C
10 min 72°C
 stop
–
4°C
PCR produkty se rozdělují na 4% agarózovém gelu nebo 10% PAGE v 1x TBE
pufru nebo na 3% Synergelu v 0,5x TBE pufru. Podmínky separace: 20 V 20 min a
60 V 2 hod a 30 min. Jako marker se používá 100 bp DNA ladder (NEB) a DNA
fragmenty se vizualizují barvením pomocí ethidium bromidu pod UV světlem.
Profily se zaznamenávají pomocí Epson Ultra Cam 3100Z Imaging System.
Profily SSR markerů se vyhodnocují pomocí specializovaného software (BioProfil
1D+, Vilber Lourmat; GelManager for Windows, BioSystematica; UltraQuant) a
primární data se dále statisticky zpracovávají.
Chemikálie:
 DNA polymeráza, pufr, nukleotidy
 primery
Přístroje:
18
ISSR (inter single sequence repeat), mikrosatelity
Technika ISSR markerů je modifikací techniky SSR markerů (Zietkiewics et al.,
1994; Kantety et al., 1995). Tato technika je založena na použití PCR amplifikace
s náhodně ukotveným mikrosatelitovým motivem. Na rozdíl od techniky SSR není
při ISSR nutná žádná předchozí znalost sekvence. Hantula et al. (1996), Charters
et al. (1996) a Zietkiewics et al. (1994) považují tuto metodu za přesnější a
opakovatelnější než metodu RAPD. Metoda ISSR markerů zároveň poskytuje
větší polymorfismus. ISSR markery jsou dominantní, ačkoli někteří autoři udávají i
jejich kodominantní charakter (Fischer et al., 1996).
Pro ISSR analýzu u řepky byly pro účely předkládané metodiky použity primery
UBC 880, UBC 810, UBC 845, UBC 812 a UBC 840. Sekvence primerů jsou
uvedeny v tabulce 3.
Tab. 3: Sekvence primerů používaných pro ISSR analýzu u řepky.
Primer
Sekvence 5‘—3’
UBC 880
UBC 810
UBC 845
UBC 812
UBC 840
GGA GAG GAG AGG AGA
GAG AGA GAG AGA GAG AT
CTC TCT CTC TCT CTC TRC
GAG AGA GAG AGA GAG AA
GAG AGA GAG AGA GAG AYT
*(R = A nebo G, Y = C nebo T)
Teplota
nasedání
52˚C
48˚C
52˚C
52˚C
52˚C
Protokol ISSR analýzy vychází z metodiky Prevost and Wilkinson (1999) upravené
na pracovišti Biotechnologického centra ZF JU Nováková et al. (2008).
PCR reakce probíhá v objemu 10 µl, v 1x reakčním pufru (75 mM Tris–HCl,
pH=8,8, 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs),
12,5 pmol primeru (IDT), 0,5 U Taq Purple DNA polymerázy (PPP Master Mix,
Top-Bio, CZ), 2x BSA a 50 ng templátové DNA.
Schéma pipetování – systém PPP MM Top-Bio:
 5 µl 2x PPP master mixu
 1 µl DNA
 0,25 µl primeru
 0,2 µl 100x BSA
 3,55 µl dH2O (do objemu 10 µl)
19
Amplifikace probíhá na Biometra T1 Cycler při následujícím teplotním profilu:
2 min
95°C
 40 cyklů:
20 s
93°C
1 min
48–52°C, dle příslušného primeru
20 sec 72°C
6 min
72°C
 stop
–
4°C
PCR produkty se rozdělují na 2% agarózovém gelu v 1x TBE pufru. Podmínky
separace: 40 V 20min, 80 V 4 hod a 40 min. Jako marker se používá 100 bp DNA
ladder (NEB) a DNA fragmenty se vizualizují barvením pomocí ethidium bromidu
pod UV světlem. ISSR profily se zaznamenávají pomocí Epson Ultra Cam 3100Z
Imaging System.
Profily ISSR markerů se vyhodnocují pomocí specializovaného software (BioProfil
1D+, Vilber Lourmat; GelManager for Windows, BioSystematica; UltraQuant) a
primární data se dále statisticky zpracovávají.
Chemikálie:
 PPP Master Mix
 primery
 BSA
Přístroje:
AFLP (amplified fragment length polymorphism)
Technika AFLP kombinuje principy technik RFLP a PCR (Vos et al., 1995).
Vysokomolekulární genomická DNA (nebo v případě cDNA–AFLP získaná cDNA)
se štěpí současně dvěma restričními endonukleázami. Na vzniklou populaci
restrikčních fragmentů se ligují adaptory o známé sekvenci a provádí se
preselektivní amplifikace. Primery pro tento amplifikační krok jsou komplementární
k adaptorům s dalším selektivním nukleotidem na 3’– konci. Selektivní amplifikace
se pak provádí s primery se třemi selektivními nukleotidy (v případě rostlin resp.
objektů s velkým genomem). U AFLP dochází ke kombinaci specifičnosti
restrikčního štěpení se snadností PCR. Polymorfismus se pak zjišťuje na základě
přítomnosti/nepřítomnosti a velikosti amplifikovaných fragmentů po separaci na
PAGE nebo na genetickém analyzátoru (sekvenátoru).
20
Oproti metodám RFLP a RAPD má technika AFLP řadu výhod, mezi nejdůležitější
patří generování velkého množství dominantních markerů pokrývajících celý
genom. Kromě využití pro identifikaci genotypů kulturních rostlin je cílena zejména
pro účely mapování významných kvalitativních a kvantitativních znaků. Tato
metoda nachází uplatnění také při studiu biodiverzity, přípravě markerů a
genetickém mapování (Ballvora et al., 1995; Meksem et al., 1995; Van Eck et al.,
1995).
Restrikce genomické DNA a ligace adaptorů (restrikčně ligační krok):
Restrikce (50 µl celkový objem):
40 µl vzorku DNA + 1x R/L pufr, 5 U EcoRI, 5 U MseI
Na 1 vzorek: 4 µl H2O, 5 µl 10x R/L pufru, 0,25 µl EcoRI = 5 U, 0,5 µl MseI = 5 U
(10 µl restrikčního master mixu se přidá ke 40 µl (250 ng) templátu DNA, promíchá
se a štěpí se 16 h při 37°C)
Ligace (60 µl celkový objem):
50 µl restrikční směsi + 1x R/L pufr, 5 pmol EcoRI 3’ adaptor, 5 pmol EcoRI
5’ adaptor, 50 pmol MseI 3’ adaptor, 50 pmol MseI 5’ adaptor, 1,2 pmol
ATP, 1 U T4 DNA ligáza
Na 1 vzorek: 1 µl 10x RL pufru, 0,1 µl EcoRI–3' adaptoru = 5 pmol, 0,1 µl EcoRI–
5' adaptoru = 5 pmol, 0,2 µl Mse–3' adaptoru = 50 pmol, 0,2 µl Mse–5' adaptoru =
50 pmol, 1,2 µl 10 mM ATP, 1 µl (1 U) T4 Ligase, 6,2 µl vody
(10 µl ligačního master mixu se přidá k 50 µl restrikční směsi, promíchá se a
inkubuje se 3 h při 37°C)
R/L směs se po ukončení ligace naředí 10x T0.1E pufrem (540 µl T0.1E pufru +
60 µl R/L směsi)
Pre-selektivní amplifikace (+1/+1) PCR
Preselektivní amplifikace (50 µl celkový objem):
5 µl vzorku (10x naředěný vzorek po R/L), 1x PCR pufr, 4 mM MgCl2,
200 µM dNTP’s, 75 ng EcoRI–A primeru, 75 ng MseI–A primeru, 1 U Taq
DNA polymerázy
Na 1 vzorek: 5 µl vzorku, 5 µl PCR pufru, 2 µl 50 mM MgCl2, 1 µl 10 mM dNTP’s,
0,15 µl EcoRI–A primeru (500 ng/µl), 0,15 µl MseI–A primeru (500 ng/µl), 0,2 µl
Taq (5 U/µl), 36,5 µl vody
(45 µl PCR master mixu se přidá k 5 µl vzorku)
21
Preselektivní amplifikace – teplotní profil PCR reakce:
2 min
94°C
 30 cyklů:
30 s
94°C
30 s
60°C
1 min
72°C
9 min
72°C
 stop
–
4°C
Po ukončení preselektivní amplifikace se 40 µl reakční směsi 20 x naředí (860 µl
TE + 40 µl templátu).
10 µl nenaředěného PCR produktu se použije na elektroforézu (1,2% agarózový
gel v 1x TBE/TAE pufru), pro ověření R/L a Pre-Amp kroku – přítomnost
fragmentů o velikosti 0 – 400 bp.
Selektivní amplifikace (+3/+3) PCR
Selektivní amplifiakce (10 µl celkový objem):
2,5 µl vzorku (20x naředěný vzorek po Pre-Amp), 1x PCR pufr, 1,5 mM
MgCl2, 200 µM dNTP’s, 5 ng EcoRI–ANN–FAM primeru, 30 ng MseI–ANN
primeru, 0,5 U Taq DNA polymerázy
Na 1 vzorek: 2,5 µl vzorku, 1 µl PCR pufru, 0,2 µl 10 mM dNTP’s, 0,087 µl EcoRI–
ANN–FAM primeru (10000 pmol), 0,095 µl MseI–ANN primeru (316 ng/µl), 0,1 µl
Taq (5 U/µl), 6,018 µl vody
(7,5 µl PCR master mixu se přidá k 2,5 µl vzorku)
Selektivní amplifikace – teplotní profil PCR reakce:
2 min
94°C
 10 cyklů:
30 s
94°C
30 s
65°C (-1°C/cyklus)
1 min
72°C
 25 cyklů:
30 s
94°C
30 s
56°C
1 min
72°C
15 min 72°C
 stop
–
4°C
22
Příprava vzorků na fragmentační analýzu:
Vzorky jsou připraveny do 96 jamkových destiček (ABI):
11 µl formamidu, 0,4 µl 400 HD Rox Size Standard (ABI), 1,0 µl vzorku (po
selektivní amplifikaci)
Vzorky se důkladně promíchají, musí být bez bublinek a jsou v cykleru
denaturovány – 4 min při 95°C. Ihned (!) po ukončení denaturace jsou položeny
na nejméně 2 min do cold bloku vychlazeného na -20°C, po té je provedena
fragmentační analýza (ABI – automatický genetický analyzátor – sekvenátor) dle
manuálu k sekvenátoru.
Chemikálie:
 10x RL pufr (10 ml zásobní roztok): 0,121g Tris–acetate do 8 ml H2O
(100 mM); upravit pH na 7,5 pomocí led. kys. octové; přidat 0,214 g MgAc
(octan hořečnatý) (100 mM); 0,491g KAc (octan draselný) (500 mM);
0,077g Dithiothreitol (DTT) (50 mM)
 ATP (10 mM, 100 µl alikvoty, uchovávat v -80°C): 0,06 g ATP do 8 ml H2O;
upravit pH na 7,0 pomocí 0,1N NaOH; doplnit do 10 ml
 T0.1E pufr: 5 ml 1 M Tris pH=7,5 (8,0), 100 µl 0,5 M EDTA, doplnit vodou
do 500 ml
 Hi-Di formamid (ABI)
 400 HD Rox Size Standard nebo 500 Liz Size Standard (ABI)
 restrikční enzymy (MseI, EcoRI – NEB)
 Mse a Eco adaptory, Mse a Eco preselektivní primery, Eco fluorescenčně
značené selektivní primery, Mse selektivní primery
Přístroje:
 PCR thermocykler, centrifuga, sada automatických pipet, mrazák, mrazicí
destička, genetický analyzátor
23
24
II.4. Metodika elektroforézy DNA
Klasickou metodou, univerzálně používanou k rozdělení makromolekul, je
elektroforéza. V elektrickém poli se makromolekuly s nenulovým elektrickým
nábojem pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové
hmotnosti, celkovém náboji a tvaru. DNA je kyselina, obsahuje záporně nabité
fosfátové skupiny. V elektrickém poli se pohybují fragmenty DNA od záporné
elektrody směrem ke kladné. K dělení fragmentů DNA se užívá nejčastěji
agarózový gel uložený horizontálně. Fragmenty o stejné délce postupují stejně
rychle a vytvoří proužek. DNA je na gelu vizualizována pomocí specifického
barvení ethidium bromidem (EtBr). Tato látka patří mezi interkalační barviva. Váže
se dovnitř dvoušroubovice a po ozáření ultrafialovým světlem (UV) oranžově
fluoreskuje. Vzhledem k tomu, že ethidium bromid je karcinogen, gely jsou po
vyfotografování skladovány ve zvláštní odpadní nádobě.
Elektroforéza v agarózovém gelu
Příprava gelu:
1. Agaróza se smíchá s vodou a pufrem v příslušném poměru v širokohrdlé
Erlenmayerově baňce a rozvaří se v mikrovlnné troubě (2+1 min na max.
výkon, nesmí zpěnit); agaróza musí být dokonale rozpuštěná, během
rozváření je nutné s Erlenmayerovou baňkou několikrát zamíchat.
2. Roztok agarózy je třeba zchladit na cca 55°C, přidá se odpovídající množství
ethidium bromidu, důkladně promíchá a nalije se do připravené vaničky;
nalévací vanička musí být dokonale vyrovnaná do vodorovné polohy. Agarózu
je nutné nalévat opatrně a plynule, bez tvorby bublin, případné bubliny je
zapotřebí eliminovat.
3. Po nalití agarózy se do vaničky umístí hřebínek a gel se nechá 30–60 min
ztuhnout.
4. Ztuhlý gel je umístěn do elektroforetické vany a pod hladinu pufru jsou do
jamek vkládány vzorky.
Nanášecí pufr – LB:
 0,25 % bromfenolové modři, 40 % (w/v) glycerolu nebo sacharozy ve vodě
 0,025 g bromfenolové modři, 4 g sacharózy – rozmíchat do 10 ml vody, pufr
se rozpipetuje do mikrocentrifugačních zkumavek a uchovává v lednici
Roztok ethidium bromidu – EtBr:
 10 mg ethidium bromidu se rozpustí v 1 ml destilované vody (pracovat
s rouškou v digestoři)
Marker – DNA ladder:
 100 bp DNA ladder (NEB) – 1 µl markeru, 10 µl vody, 2 µl LB se promíchá
a nanese na gel
Vizualizace DNA:
 gel je položen na UV transiluminátor a pod UV světlem je
zaznamenáno/vyfotografováno spektrum markerů
25
Příprava gelu a pufrů:
Gely o jiné hustotě se připravují podle schematu uvedeného v tabulce 5, podle
požadované koncentrace je zapotřebí přepočítat navážku agarózy!
Tab. 5: Složení 1,5 % agarózového gelu v TBE pufru.
Elektroforéza 1,5 % agarózový gel [pufr 5x TBE]
objem gelu
[ml]
množ. agarózy množ. vody
[g]
[ml]
množ. pufru
TBE [ml]
množ. Et. Br.
[µl]
50
0,75
40
10
5
100
1,5
80
20
8
150
2,25
120
30
8-10
200
3
160
40
12-13
Tab. 6: Složení zásobních roztoků TBE pufrů
5x TBE
Tris (Trizma)
0,5 M EDTA
kys. boritá
dH2O
54
20 ml
27,5
voda do 1 L
Chemikálie:
 agaróza (v kvalitě pro elektroforézu DNA)
 zásobní roztok TBE pufru
 roztok ethidium bromidu
 LB pufr
 DNA marker
 PCR reakce
Přístroje:
 mikrovlnná trouba, sada automatických pipet, jednotka horizontální
elektroforézy se zdrojem
26
Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
Příprava gelu:
1. Důkladně umyjeme elektroforetická skla (ve vodě a poté je otřeme
ethanolem), sestavíme aparaturu do „nalévacího stojánku“.
2. Ze zásobních roztoků připravíme směs – AC/BIS + voda + gelový pufr +
siřičitan, promícháme a přidáme persíran a TEMED, důkladně promícháme,
ale vyvarujeme se tvorby bublin v roztoku! a IHNED!!! nalijeme nebo 5 ml
automatickou pipetou naneseme mezi sestavená skla; roztok může i velmi
rychle „tuhnout“; vložíme hřebínek a necháme minimálně 1 hod. polymerovat.
3. Poté vyjmeme hřebínek, jamky propláchneme elektroforetickým pufrem,
naneseme vzorky a sestavíme komplet elektroforézy.
4. Nalijeme elektroforetické pufry a probíhá elektroforéza.
5. Po ukončení elektroforézy opatrně oddělíme skla, vyjmeme gel a přeneseme
jej do barvicí směsi (200 ml elektroforetického pufru a 20 μl roztoku ethidium
bromidu); barvení probíhá 10–30 min a poté jsou fragmenty vizualizované na
UV transiluminátoru.
Nanášecí pufr – LB:
 0,25 % bromfenolové modři, 40 % (w/v) glycerolu nebo sacharózy ve vodě
 0,025 g bromfenolové modři, 4 g sacharózy – rozmíchat do 10 ml vody, pufr
se rozpipetuje do mikrocentrifugačních zkumavek a uchovává v lednici
Roztok ethidium bromidu – EtBr:
 10 mg ethidium bromidu se rozpustí v 1 ml destilované vody (pracovat
s rouškou v digestoři)
Marker – DNA ladder:
 100 bp DNA ladder (NEB) – 1 µl markeru, 10 µl vody, 2 µl LB se promíchá
a nanese na gel
Podmínky separace:
 50 V po dobu 30 min a poté 220 V po dobu 2,5 – 3 hod.
Vizualizace DNA:
 po obarvení je gel položen na UV transiluminátor a pod UV světlem je
zaznamenáno/vyfotografováno spektrum markerů
Příprava gelu a pufrů:
Akrylamid je neurotoxický a kancerogenní, při práci s roztoky a gely je třeba dbát
zvýšené opatrnosti a používat ochranné pomůcky! Zvláštní opatrnosti je třeba
zejména při přípravě zásobních roztoků (práce s rouškou v digestoři).
27
Tab. 7: Složení nedenaturačního gelu pro elektroforézu DNA.
nedenaturační gel
SEPARAČNÍ GEL (7.5
%)
SEPARAČNÍ GEL (10
redestilovaná voda
AC/BIS
pufr TBE
siřičitan sodný
persíran amonný
TEMED
ml
ml
ml
µl
µl
µl
AC/BIS:
Na2SO3 :
(NH4)2S2O8:
SDS:
30 g acrylamid + 0,8 g BIS / 100 ml vody
nasycený vodný roztok
15 % roztok
10 % roztok
AC/BIS
gelové pufry
persíran
elektrodový pufr 1xTBE
33
15
12
160
300
30
%)
28
20
12
160
300
30
uchovávat ve tmě a chladnu, roztok stálý cca 3 týdny
uchovávat ve tmě a chladnu, stálé
lze uchovávat ve tmě a chladnu 1 týden
připravovat před použitím
Chemikálie:
 akrylamid a bis-akrylamid (v kvalitě pro elektroforézu DNA)
 roztoky pufrů
 nasycený vodný roztok siřičitanu sodného
 persíran amonný
 TEMED
 LB pufr
 DNA marker
 PCR reakce
Přístroje:
 jednotka vertikální elektroforézy se zdrojem, sada pro nalévání gelů, sada
automatických pipet
Alternativním postupem pro DNA PAGE je využití čipové elektroforézy Experion
(Bio-Rad) s čipy pro elektroforézu DNA. Postup je velmi rychlý, dostatečně citlivý a
precizní, nevýhodou je nutnost pořízení nákladné investice.
28
Elektroforéza v SYNERGELu
Synergel je přípravek, který po smíchání s agarózou vytváří gel a výrazně zvyšuje
separační možnosti agarózového gelu. Separované fragmenty DNA vytváří ostré
pruhy, dobře rozdělené. Je používán zejména pro separaci a detekci malých
fragmentů. Oproti PAGE gelu je zachována jednoduchost přípravy a provedení
gelu a jeho netoxičnost.
Výpočet množství synergelu, které přidáváme k agaróze – koncentraci synergelu
vypočítáme na základě následující ho vzorce:
concSynergel = (A-0,7) / 2
kde A je koncentrace agarózového gelu bez přídavku synergelu, který chceme
převést na synergel/agarózový gel
0,7 – je hodnota koncentrace základního agarózového gelu
např. v případě, kdy standardní 3 % agarózový gel nahrazujeme gelem
s přídavkem synergelu, je složení gelu následující:
A=3%
množství synergelu ve směsi: (3-0,7) / 2 = 1,15 %
1,15 % synergelu přidáme k 0,7 % agarózy, tj. pro přípravu 250 ml roztoku
použijeme 2,875 g synergelu a 1,75 g agarózy
Postup přípravy Synergel/agarózového gelu:
 Navážíme daná množství agarózy a synergelu.
 Přidáme takové množství 96 % ethanolu, aby došlo k rozmíchání (nesmí se
tvořit hrudky).
 Přidáme 250 ml 0,5x TBE pufru.
 Rozvaříme v mikrovlnné troubě.
 Přidáme 5 µl roztoku ethidium bromidu.
 Důkladně promícháme.
 Nalijeme do vany / formy na gel.
 Necháme ztuhnout – cca 1–1,5 hod.
Chemikálie:
 agaróza (v kvalitě pro elektroforézu DNA)
 Synergel (Roth)
 zásobní roztok TBE pufru
 LB pufr
 DNA marker
 PCR reakce
29
Přístroje:
 mikrovlnná trouba, sada automatických pipet, jednotka horizontální
elektroforézy se zdrojem
Detekce DNA pomocí SYBR GREEN:
V případě použití barviva SYBR GREEN (nižší toxicita, lepší vizualizace DNA na
gelu, nižší pozadí) se při přípravě gelu nepoužívá ethidium bromid. Po ukončení
PCR je ke vzorkům DNA přidán nanášecí pufr (LB) se SYBR GREEN. Vzorky jsou
naneseny na gel a probíhá elektroforéza. Po ukončení elektroforézy probíhá
vizualizace DNA fragmentů/PCR produktů na UV transiluminátoru. V případě
dokumentace gelů pomocí kamery nebo fotoaparátu je nutné použití zeleného
filtru namísto červeného filtru používaného u gelů barvených ethidium bromidem!
LB se SYBR GREEN:
0,025 g Bromphenol Blue
0,025 g Xylene Cyanol FF
3 ml glycerol
20 µl SYBR GREEN (koncentrovaný roztok, FLUKA)
doplnit dH2O do 10 ml
Rozpipetovat do alikvot a skladovat v temnu při -20°C, krátkodobě lze skladovat i
při +4°C.
30
II.5. Metodika analýzy molekulárních dat
Digitální obrazová analýza
Vyhodnocování získaných elektroforeogramů:
Pro vyhodnocování výsledků po elektroforéze - tj. spekter molekulárních markerů,
je používána řada metod. Mezi jednodušší metody, vhodné při malém množství
analyzovaných vzorků a malém počtu proužků, je ruční proměření gelů a
stanovení relativní pohyblivosti jednotlivých pruhů nebo srovnání jejich velikosti
(délky udané v pb) s velikostním markerem.
Poměrně dokonalých výsledků lze dosáhnout po důkladnější (ale značně časově
náročné) obrazové analýze gelů. Jsou dostupné komerčně dodávané záznamové
jednotky (scannery, příp. zařízení na bázi CCD kamery, s obslužným a
vyhodnocovacím softwarem - BioRad, Image Laboratory, Stratagene), ale
výsledků obdobné kvality lze dosáhnout i s méně finančně náročným zařízením.
Na našem pracovišti využíváme komplexní počítačové zpracování gelů - při využití
barevného stolního scanneru s vysokou rozlišovací schopností (min 600 dpi) nebo
digitálního fotoaparátu jako součásti GelDocumentation System. Po digitalizaci
jsou gely zpracovány pomocí speciálního software - GelManager® for Windows
(BioSystematica, U.K.), BioProfil 1D++ (Vilber Lourmat, Francie) nebo UltraQuant
6.0 (UltraLum, Inc., USA).
Tyto programy pro digitální obrazovou analýzu a zpracování elektroforetických
gelů umožní analýzu a objektivní porovnávání jednorozměrných elektroforetických
spekter. Umožňují konstrukci rozsáhlých databází ”fingerprintů”, které pak mohou
být porovnávány. Využití mají zejména v epidemiologických studiích, identifikaci
genotypů, systematice, ekologii, populační genetice, klinické biochemii a
biotechnologických aplikacích.
Postup obrazové analýzy gelů:
Následující kroky představují kostru postupu počítačového zpracování a
vyhodnocování elektroforeogramů






záznam gelu ze scanneru nebo digitálního fotoaparátu/kamery
úprava a optimalizace ”obrázku” - záznamu gelu
výběr pozice vzorku a záznam křivky optické hustoty vzorku
odstranění pozadí
korekce absorbančních profilů na základě referenčních spekter
kontrola a korekce pozice píků (proužků)
31




porovnání profilů (korelací profilů nebo porovnáním pozice proužků)
výpočet matice podobnosti (koeficienty podobnosti)
výpočet a grafické znázornění pomocí dendrogramu
identifikace nového spektra porovnáním s databází
Statistické zpracování dat
Pro účely komplexního hodnocení molekulárních markerů je vhodné využít
statistického zpracování dat. Metoda digitální analýzy pak představuje prostředek
pro primární zpracování elektroforeogramů a zaznamenání pozice pruhů na gelu.
Na základě takto zjištěných a korelovaných pruhů na gelu je možné sestavit
matice přítomnosti/nepřítomnosti pruhu v dané zóně a provést statistické
hodnocení (výpočet frekvence alel, výpočet koeficientů genetické identity, výpočty
genetických vzdáleností či podobností, clusterová /UPGMA – unweighted pair
group method averages/ a ordinační /PCO – Principal Coordinates Analysis/
analýza a sestavení dendrogramů a ordinačních diagramů). Pro tyto účely je
využíván program Statistica 6.0 (Statsoft), MVSP (Kovach Comp. Serv.) a DARwin
(CIRAD) (z důvodu možnosti výpočtu genetické distance dle Nei-Li metriky
koeficientů podobnosti).
32
III. Srovnání aktuálnosti postupů
Předkládaná „Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely
popisu genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity“
je aktuální a nová, protože v současné době není v ČR k dispozici dostupná
metodika zahrnující optimalizované pracovní postupy pro izolaci DNA a analýzu
molekulárních markerů u řepky. Dosud dostupné informace jsou jen dílčí a
rozptýlené ve vědeckých publikacích a monografiích, které se zabývají
problematikou molekulárních markerů, komplexní vyhodnocení použitelnosti
jednotlivých markerů pak dostupné není. Molekulární markery představují ve
srovnání s morfologickými či biochemickými markery kvalitativně nový přístup,
který má na jedné straně obrovský potenciál využití, avšak na straně druhé i své
limity. Reálná interpretace molekulárních dat obvykle vyžaduje kvalifikovanou
volbu vhodných a optimalizovaných postupů. Využití analýzy molekulárních
markerů pro popis a charakterizaci genotypů je předmětem předkládané metodiky.
33
IV. Popis uplatnění metodiky
„Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely popisu
genetických zdrojů řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity“ v první
části zahrnuje optimalizované postupy pro izolaci DNA. Uvádí nejen jejich přehled,
ale poukazuje i na přednosti jednotlivých postupů a hodnotí je z pohledu rychlosti,
pracnosti provedení, kvantity a kvality získané DNA. V další části jsou pak
představeny základní techniky a metody určené pro analýzu molekulárních
markerů.
Metodika představuje soubor optimalizovaných metod a postupů, na jejichž
základě lze provádět rutinní analýzy DNA markerů u řepky. Výstupem analýzy je
pak spektrum markerů (amplifikovaných fragmentů DNA), které jsou použitelné
pro charakterizaci analyzovaných genotypů. Molekulární markery nejsou dosud
standardně pro tyto účely používány, mohou být ale vhodným doplňkem
morfologického popisu (fenotypového hodnocení). Stanovení genetické diverzity
molekulárními metodami umožňuje šlechtitelům výběr vhodných rodičovských
komponent pro získání hybridních kombinací vykazujících heterozní efekt.
Uživatelé metodiky jsou pracoviště výzkumná a šlechtitelská, která mohou
s výhodou využít předností analýzy molekulárních markerů – rychlost analýzy,
vysoká míra polymorfismu a nízké ovlivnění faktory vnitřního a vnějšího prostředí.
Metodika bude uplatněna prostřednictvím šlechtitelské firmy OSEVA PRO s.r.o.
S tímto subjektem byla uzavřena smlouva o uplatnění metodiky.
34
V. Seznam použité související literatury
Ainsworth C.C., Sharp P.J. (1989). The poential role of DNA probes in plant
variety protection. Plant Varieties and Seeds 2: 27-3.
Alphey L. (1997). DNA Sequencing (Introduction to Biotechniques). Bios Scientific
Publishers, Oxford, UK.
Arús P., Shields C.R., Orton T.J. (1985). Application of isozyme electrophoresis for
purity testing a cultivar identification of F1 hybrids of Brassica oleracea.
Euphytica 34: 651-657.
Arús P., Chevre A.M., Delourme R., Eber F., Kerlan M.C., Margale E., Quiros C.F.
(1991). Isoenzyme nomenclature for eight enzyme systems in three Brassica
species. In „Proceedings of the Eighth International Rapeseed Congress.“
Saskatoon, July 9-10, 1991.
Ash M. (2012). Oil Crops Yearbook 2012. ERS-USDA, USDA Economics,
Statistics and Market Information System, Albert R. Mann Library, Cornell
University, USA.
Ashkenazi V., Chani E., Lavi U., Levy D., Hiller J., Veilleux E. (2001).
Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic
and fingerprinting analyses. Genome 44: 50-62.
Ballvora A., Hesselbach J., Niewohner J., Leister D., Salamini F., Gebhardt C.
(1995). Marker enrichment and high–resolution map of the segment of potato
chromosome VII harboring the nematode resistance gene Gro1. Mol. Gen.
Genet. 249: 82-90.
Baranyk P., Fábry A. (2007) Řepka: pěstování, využití, ekonomika, 1. Vydání,
Praha, Profi press, 208 s.
Čurn V., Sáková L. (1997). Využití biochemických markerů ve šlechtění řepky a
dalších brukvovitých plodin. Genetika a šlechtění 33: 281-305.
Čurn V. Žaludová (2007). Fingerprinting of Oilseed Rape Cultivars. In: Gupta S.
(ed.): Rapeseed Breeding. (Advances in Botanical Research, Volume 45).
Elsevier Publ., pp. 155-179.
Čurn V. et al. (2005). Molekulární markery – protokoly a návody pro cvičení.
Biotechnologické centrum ZF JU, Č. Budějovice.
Das S., Rajagopal J., Bhatia S., Srivastava P.S., Lakshmikumaran M. (1999).
Assesment of genetic variation within Brassica campestris cultivars using
amplified fragment length polymorphism and random amplification of
polymorphic DNA markers. Journal of Biosciences 24: 433-440.
Demeke T., Adams R.P., Chibbar R. (1992). Potential taxonomic use of random
amplified polymorphic DNA (RAPD): a case study in Brassica. Theor. Appl.
Genet. 84: 990-994.
Dos Santos J., Skroch P., Tivang J., Slocum M.K. (1994). Comparison of RAPD
and RFLP genetics markers in determining genetic similarity among Brassica
oleracea L. genotype. Theor. Appl. Genet. 87: 909-915.
Edwards K., Jihnstone C., Thompson C. (1991). A simple and rapid method for the
preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19:
1349.
Fábry A. et al. (1992) Olejniny, Ministerstvo zemědělství České republiky, 419 s.
35
Figdore S.S., Kennard W.C., Song K.M., Slocum M.K., Osborn T.C. (1988).
Assesment of degreeof restriction fragment length polymorphism in Brassica.
Theor. Appl. Genet. 75: 833-840.
Fischer P.J., Gardner R.C., Richardson T.E. (1996). Single locus microsatellite
isolation using 5´anchored PCR. Nucleic Acids Res. 24: 4369-4371.
Gupta S.K., Röbbelen G. (1986). Identification of rapeseed (Brassica napus)
cultivars by electrophoresis. Plant Breeding 96: 363-370.
Hájková P., Hrubý J., Pernová E., Čurn V., Žaludová J. (2005). Monitoring
pěstebních ploch, přenos a detekce transgenů geneticky modifikované řepky
olejky (Brassica napus L. var. napus). Sborník vědeckých prací VÚP
Troubsko 15: 93-100.
Halldén C., Nilsson N.-O., Rading T.M., Säll T. (1994). Evaluation of RFLP and
RAPD markers in a comparison of Brassica napus breeding lines. Theor.
Appl. Genet. 88: 123-128.
Hantula J., Dusabenygasani M., Hamelin R.C. (1996). Random amplified
microsatellites (RAMS) – a novel method for characterizing genetic variation
within fungi. Eur. J. Path. 26: 159-166.
Heffner E.L., Sorrels M.R., Jannink J-L. (2009). Genomic selection for crop
improvement. Crop Science 49: 1-12.
Chakrabarti S.K., Pattanayak D., Sarmat D., Chimote V.P., Naik P.S. (2006).
Stability of RAPD fingerprints in potato: effect of source tissue and primers.
Biol. Plantarum 50: 531-536.
Charters Y.M., Robertson A., Wilkinson M.J., Ramsay G. (1996). PCR analysis of
oilseed rape cultivers (Brassica napus L. ssp. Olifera) using 5´anchored
simple sequence repeat (SSR) primers. Theor. Appl. Genet. 92: 442-447.
Jain A., Bhatia S., Banga S.S., Prakash S., Lakshmikumaran M. (1994). Potential
use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the
genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to
heterosis. Theor. Appl. Genet. 8: 116-122.
Kantety R.V., Zeng X.P., Bennetzen J.L., Zehr B.E. (1995). Assessment of genetic
diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple
sequence repeat (ISSR) amplification. Mol. Breed. 1: 365-337.
Kolektiv (2009). Situační a výhledová zpráva. Olejniny. MZe, Praha.
Kresovich S., Williams J.G.K., McFerson J.R., Routman E.J., Schaal B.A. (1992).
Characterization of genetic identities and relationship of Brassica oleracea L.
via a random amplified polymorphic DNA assay. Theor. Appl. Genet. 85:
190-196.
Kresovich S., Szewc-McFadden A.K., Bliek S.M., McFerson J.R. (1995).
Abundance and characterization of simple-sequence repeats (SSRs) isolates
from a size-fractionated genomic library of Brassica napus L. (rapeseed).
Theor. Appl. Genet. 91: 206-211.
Lee D., Reces J.C., Cooke R.J. (1996). DNA profilig and plant variety registration
2. Restriction fragment length polymorphisms in varieties of oilseed rape.
Plant Varieties and Seeds 9: 181-190.
Lerceteau E., Robert T., Pétiard V., Grouzillat D. (1997). Evoluation of the extent
of genetic variability among Theobroma cacao accessions using RAPD and
RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 95: 10-19.
36
Lombard V., Baril C.P., Dubreuil P., Blouet F., Zhang D. (2000).
Geneticsrelationship and fingerprinting of rapeseed cultivars by AFLP:
Consequences for varietal registration. Crop Science 40: 1417-1425.
Mailer R.J., Scarth R., Fristensky B. (1994). Discimination among cultivars of
rapeseed (Brassica napus L.) using DNA polymorphisms amplified from
arbitrary primers. Theor. Appl. Genet. 87: 697-704.
Marshall P.J., Marchand M.C., Lisieczko Z., Landry B.S. (1994). A simple method
to estimate the percentage of hybridity in canola (Brassica napus) F1
hybrids. Theor. Appl. Genet. 89: 853-858.
Meksem K., Leister D., Peleman J., Zabeau M., Salamini F., Gebhardt C. (1995).
A high resolution map of the vicinity of the R1 locus on chromosome V of
potato based on RFLP and AFLP markers. Mol. Gen. Genet. 249: 74-81.
Morgante M., Olivieri A.M. (1993). PCR-amplified microsatellites as markers in
plant genetics. Plant J. 3: 175-182.
Mundges H., Kőhler W., Friedt W. (1990). Identification of rapeseed cultivars
(Brassica napus) by starch gel electrophoresis of enzymes. Euphytica 45:
179-187.
Nielsen G. (1985). The use of isozymes as probes to identity and label plant
varieties and cultivars. Isozymes: Current Topics in Biological and Medici
Research 12: 1-32.
Nováková A., Šimáčková K., Kubátová B., Čurn V (2008). Stability of different
molecular marker systems and their suitability for cultivar identification in
potato. Potato Res. (submitted).
Oborník M., Klíč M., Žižka L. (2000). Genetic variability and phylogeny inferred
from random amplified polymorphic DNA data reflect life strategy of
entomopathogenic fungi. Canadian Journal of Botany-revue Canadienne de
Botanique 78: 1150-1155.
Paterson A.H., Tanksley S.D., Sorrells M.E. (1991). DNA markers in plant
improvement. Adv. Argon. 46: 39-90.
Powell W., Morgante M., Andre C. H., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A.
(1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite)
markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.
Prevost A., Wilkinson M.J. (1999). A new system of comparing PCR primers
applied to ISSR fingerprinting of potato kultivar. Theor. Appl. Genet. 98: 107112.
Reiter R.S., Williams J.G.K., Feldmann K.A., Rafalski J.A., Tingey S.D., Scolnik
P.A. (1992). Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by
using recombinant inbred lined and random amplified polymorphic DNAs.
Proc Natl Acad Sci USA 89: 1477-1481.
Sakai T. Fujimoto H. Imai R. Imamura J. (2005). DNA markers in Brassica: use of
genetic information from arabidopsis and development of sequence tagged
site markers, In: Nagata T., Lörz H., Widholm J.M. (Eds.). Biotechnology in
agriculture and forestry, Molecular marker systems in plant breeding and
crop improvement 55: 353‐370.
Scott M., Haymes M., Williams S.M. (1992). Parentage analysis using RAPD PCR.
Nucleic Acids Res. 20: 5493.
Snowdon R.J., Friedt W. (2004). Molecular markers in Brassica oilseed breeding
current status and future possibilities. Plant Breeding 123: 1-8.
37
Sobotka R., Dolanská L., Čurn V., Ovesná J. (2004). Fluorescence-based AFLPs
occur as the most suitable marker system for oilseed rape cultivar
identification. J. Appl. Genet. 45: 161-173.
Soltis D.E., Soltis P.S., Doyle J.J. (1998). „Molecular Systematics of Plants II DNA
Sequencing.“ Kluwer Academic Publishers, Novell, MA.
Szewc-McFadden A.K., Kresovich S., Bliek S.M., Mitchell S.E., McFerson J.R.
(1996). Identification of polymorphic, conserved simple sequence repeat
(SSRs) in cultivated Brassica species. Theor. Appl. Genet. 93: 534-538.
Uzunova M., Ecke W., Weissleder K., Röbbelen G. (1995). Mapping the genome
of rapeseed (Brassica napus L.). I. Construction of an RFLP linkage map and
localization of QTLs for seed glucosinolate content. Theor. Appl. Genet. 90:
194-204.
Uzunova M.I., Ecke W. (1999). Abundance, polymorphism and genetic mapping of
microsatellites in oilseed rape (B. napus L.). Plant Breeding 118: 323-326.
Van Eck H.J., Van der Voort J.K., Draaistra J., van Zandrvoort P., van Enckevort
E., Segers B., Peleman J., Jacobsen E., Helder J., Bakker J. (1995). The
inheritance and chromosomal localisation of AFLP markers in a non-inbred
potato offspring. Mol. Breed. 1: 397-410.
Vašák J., Fábry A., Zukalová H., Morbacher J., Baranyk P. et al. (1997). Systém
výroby řepky, Česká a slovenská pěstitelská technologie ozimé řepky pro rok
1997- 1999, SPZO Praha.
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Freijters A.,
Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zebeau M. (1995). AFLP: a new technique for
DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414.
Westman A.L., Kresovich S. (1998). The potential for cross-taxa simple-sequence
repeats (SSR) amplification between Arabidopsis thaliana L. and crop
Brassicas. Theor. Appl. Genet. 96: 272-281.
Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1992). Genetics
analysis using RAPD markers. Method Enzymol. 260: 335-348.
Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990). DNA
polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.
Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535.
Zietkiewics E., Rafalski A., Labuda D. (1994). Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR)-anchored polymerase Chain reaction amplification.
Genomics 20: 176-183.
38
VI. Seznam publikací, které předcházely metodice
Čurn V., Žaludová (2007): Fingerprinting of Oilseed Rape Cultivars. In: Gupta S.
(ed.): Rapeseed Breeding. (Advances in Botanical Research, Volume 45). Elsevier
Publ., pp. 155-179.
Čurn V., Nováková A., Šimáčková K., Ondřichová B., Bárta J. (2008):
Molecular markers as a tool for plant breeding and variety identification. Prohnes
J., Badenes M.L.(eds): Modern variety breeding for present and future needs. 18th
Eucarpia General Congress, Valencia, 2008, p. 699-703.
Kukolikova B., Curn V., Koprna R., Novakova A., Simackova K. (2008): The
comparison of polymorphism and expressin of SLG gene in the varieties and
SI/SC lines of oilseed rape. XX Int. Congress Genetics, Berlin, July 12-17, 2008, p.
76.
Žaludová J., Kukolíková B., Čurn V. (2007): Marker-assisted selection of selfincompatible oilseed rape plants. Proc. 12th Int. Rapeseed Congress, Wuhan,
China, Sciense Press USA, pp.333-335.
Kukolikova B., Zaludova J., Curn V., Koprna R. (2007): Efficiency of marker
assisted selection of self-incompatible oilseed rape varieties. - 6th Plant Genomics
European Meetings, Tenerife, 3-6 October 2007, p. 801.
Žaludová J., Nix T., Čurn V. (2005): The utilization of SCR gene for detection of
self-incompatible plants of Brassica napus. - Proc. 27th Sci. Conf. Oilseed Crops,
Poznan, 12-13.04.2005, p. 63-64.
Žaludová J., Kukolíková B., Čurn V. (2006): Distribution of S-alleles in Brassica
napus. - Proc. 28th Sci. Conf. Oilseed Crops, Poznan, 12-13.06.2006, p. 35-36.
Hájková P., Hrubý J., Pernová E., Čurn V., Žaludová J. (2005): Monitorig
pěstebních ploch, přenos a detekce transgenů geneticky modifikované řepky
olejky (Rassica napus L. var. napus), Sborník vědeckých prací VÚP Troubsko 15:
93-100.
Sobotka R,. Dolanská L., Čurn V., Ovesná J. (2004): Fluorescence-based
AFLPs occur as the most suitable marker system for oilseed rape cultivar
identification. - Journal of Applied Genetics 45(2): 161-173.
Dolanská L., Čurn V. (2004): Analysis of SLG gene – the molecular marker in
hybrid breeding of oil seed rape. – Journal of Central European Agriculture 5: 2328.
Čurn V., Vyvadilová M., Dolanská L., Kučera V., Sobotka R. (2003): Utilisation
of molecular markers for screening of self-incompatible Brassica napus genotypes.
39
– Proc. 11th Int. Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 6. - 10. July 2003,
pp. 97-99.
Čurn V., Ovesná J., Sáková L., Sobotka R. (2002): Identification of oilseed rape
cultivars using AFLP markers. [Identifikace odrůd řepky olejné použitím AFLP
markerů] – Journal of Central European Agriculture 3: 285-292.
Sobotka R., Sáková L., Čurn V. (2000): Molecular mechanisms of selfincompatibility in Brassica. – Curr.Issues Mol.Biol., Caister Acad. Press, 2: 103112.
Sáková, L., Sobotka, R., Čurn, V. (2002): Molekulární základ sporofytické
autoinkompatibility. [Molecular principles of sporophytic self-incompatibility.]. –
Biologické listy 67: 41-57.
Sáková L., Čurn V., Sobotka R. (2000): Comparison of different DNA isolation
methods for RAPD, AFLP and PCR-RFLP analyses. - Coll. Sci. Papers, Fac.
Agric. České Budějovice, Ser. Crop Sci., 17: 83-91.
Sáková L., Čurn V. (1998): Identifikace a klasifikace vybraných odrůd
brukvovitých plodin a dihaploidních linií řepky pomocí RAPD markerů. – Czech J.
Genet. Plant Breed. 34: 61-67.
Sobotka R., Čurn V., Sáková L. (1998): Metodické aspekty analýzy polymorfismu
S–lokusu u řepky. Methodological approach to the analysis of S-locus in oil seed
rape. - Sborník Jihočeské univerzity, Zem. Fak. v Č.Budějovicích, Ř.
Fytotechnická 15: 41-49.
Čurn V. (2005): Molekulární markery - protokoly a návody pro cvičení.
Biotechnologické centrum ZF JU, Č. Budějovice.
Kubátová B., Čurn V. (2005): Soubor metodik a laboratorních protokolů. BC ZF
JU a Laboratoř molekulární biologie rostlin KB BF JU, Č. Budějovice.
40
VII. Příklady výstupů analýzy molekulárních markerů
RAPD markery – příklady výstupů RAPD analýzy:
Lambda
DNA/EcoRI+HindIII
B. hirta Zlata
B. napus Arabela
B. napus Sonata
B. napus Lirajet
B. napus Falcon
B. napus Solida
B. napus Ceres
B. rapa Rex
B. juncea Rumunská
Promega PCR marker
B. nigra Rumunská
Spektrum RAPD markerů – odrůdy řepek, řepice a hořčic, primer OPB-06
Lambda
DNA/EcoRI+HindIII
DH 5/96 SP
WRG 12/5 SP
WRG 12/3 SP
WRG 12/2 SP
OP 584/6 SP
OP 584/5 SP
OP 584/1b SP
OP 600/41 SP
OP 600/28 SP
OP 600/19 SP
Promega PCR marker
Spektrum RAPD markerů – dihaploidní linie řepek, primer OPB-06
(šipky označují polymorfní pruhy, které charakterizují skupiny sublinií)
41
42
Analýza RAPD markerů – statistické vyhodnocení RAPD markerů u souboru odrůd
řepky, řepice a hořčic, shluková analýza, UPGMA metoda.
Tree Diagram for 10 Variables
Ward`s method
Euclidean distances
CERNA
SAREPT
REX
ZLATA
CERES
FALCON
SOLIDA
ARABEL
LIRAJET
SONATA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Linkage Distance
WRG 12/5 SP
WRG 12/3 SP
WRG 12/2 SP
OP 584/6 SP
OP 584/5 SP
OP 584/1b SP
OP 600/41 SP
OP 600/28 SP
OP 600/19 SP
100 bp/ DNA Ladder
Analýza SSR markerů – příklad analýzy DH linií, primer Bn9A.
43
Arabella
Sonata
Lirajet
Falcon
Solida
SL5
SL4
SL3
SL2
SL1
Marker
Porovnání RAPD a AFLP analýzy, pět DH sublinií odvozených z odrůdy Slapská
Stela (SL1 – SL5), odrůdy Solida, Falcon, Lirajet, Sonata a Arabela.
Dendrogramy a PCO ploty na základě RAPD (a, c) a AFLP (b, d) analýzy
44
Analýza SSR markerů – příklad výstupu analýzy z fragmentační analýzy.
45
Na následujících obrázcích jsou uvedeny výsledky analýzy mikrosatelitů po
zpracování v programu MVSP (PCO analýza) - soubor 94 rostlin, hodnocení
molekulárních znaků (SSR, 19 lokusů). Kódy vzorků a barevné rozlišení odpovídá
tabulce genových zdrojů.
PCO case scores (Gower General Similarity Coefficient)
0.40
O1
0.32
O2
BN_0172
0.24
BN_0061
BN_0153
BN_0198
BN_0027
BN_0053
BN_0055
BN_0071
BN_0104
BN_0006
O5
BN_0154
BN_0003
BN_0009
BN_0161
BN_0033
Axis 2
BN_0147
BN_0066
-0.32
BN_0008
0.08
BN_0035
BN_0064
-0.24
-0.08
BN_0072
BN_0060
BN_0049
BN_0090
BN_0065
BN_0059
0.08
0.16
BN_0007
BN_0149
BN_0102
BN_0010
BN_0030
O7
BN_0215
BN_0212
BN_0152
BN_0029
BN_0024
-0.08
BN_0196
BN_0046
BN_0162
BN_0048
BN_0086
O10
BN_0075
BN_0182
BN_0087
BN_0151
BN_0052
BN_0067
BN_0051
-0.16
BN_0070
BN_0089
BN_0038
BN_0057
BN_0036 BN_0050
BN_0039
BN_0058
BN_0032
BN_0062 BN_0063
O6
BN_0002
BN_0040
BN_0056
O4
BN_0001
0.16
BN_0045
BN_0025
BN_0160
O3
BN_0004
BN_0068
BN_0034
BN_0069
0.24
BN_0031
BN_0157
0.40
0.32
BN_0005
BN_0156
CMSO
BN_0077
BN_0054
BN_0037
BN_0167
BN_0076
BN_0073
AIK
BN_0165
BN_0164
SL
BN_0163BN_0155
BN_0095
-0.16
BN_0169
BN_0159
BN_0148
K
O8
BN_0150
BN_0214
BN_0098
O9
-0.24
BN_0174
BN_0158
CMSS
BN_0173
-0.32
Axis 1
Skupina na obr. O (O1) O (O2) O (O3) O (O4) O (O5) NÁZEV Slapska Trebicska Mira Solida Sonata Silesia Aglona Slapska Stela Omikron Odila Navajo Idol Contact Omaha Californium Manitoba Labrador NK Fair NK Nemax Atlantic NK Passion Cadeli Ladoga NK Diamond Komando ES Alegria (EGC 631) Totem (HSN 757) Adriana Digger Mirage Remy Asgard Winner Robust Siska KATEGORIE kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar O (O6) O (O7) O (O8) O (O9) O (O10) SL Goya NK Morse Chagall Da Vinci Arot (NPZ 0711) Sherlock (1976‐
202) Wisent (SLM 0713) Bellevue Loreley Compakt Iwan Vittek King 10 Expres Falcon Oponent Oksana Opus Aplaus Benefit Mickey DK Cabernet Catana DK Casper Dangal Dar Laniv Sveta Zhongshuang 9 Astrid ES Venus OP 4947/07 C 567 C 542 C 547 SL 737 kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar kultivar šl. materiál šl. materiál šl. materiál šl. materiál šl. materiál K CMSS AIK CMSO DH 4729/09 DH 4736/09 SG‐C 768 SG‐C 2269 3338/i 4924/4 3196/1n 3258/1n ČŽL 24 ČŽL 20 S2 ‐CMS S3 ‐CMS OP 1 S7/1/2 AIK 20/9 AIK 21/55 AIK 22/17 128/1 4069/2 4108/3 A115 Rf 3372 Rf 3358 Rf 3388 šl. materiál šl. materiál šl. materiál šl. materiál kvalita kvalita kvalita kvalita kvalita kvalita CMS Shaan 2A CMS Shaan 2A CMS Shaan 2A CMS Shaan 2A AIK AIK AIK AIK CMS Ogu INRA CMS Ogu INRA CMS Ogu INRA CMS Ogu INRA CMS Ogu INRA CMS Ogu INRA 46
Analýza mikrosatelitů ukazuje na výrazné posuny ve spektru mikrosatelitů u
starých, krajových odrůd a moderních šlechtitelských materiálů. Poukazuje ale i na
shlukování genových zdrojů podle geografického původu.
Obdobný trend je zaznamenán i po analýze AFLP markerů. AFLP markery oproti
mikrosatelitům mají vetší pokrytí genomu a lépe mohou vypovídat o změnách, ke
kterým v průběhu šlechtění dochází.
Výsledky analýz jsou prezentované na následujícím obrázku, kde je patrný
původní rozsah genetické diverzity krajových a starých odrůd (žlutý ovál). Moderní
české odrůdy (modré ovály) se vyskytují na okrajích této zóny genetické diverzity.
Moderní německé odrůdy jsou znázorněny červenou barvou a červený ovál
zahrnuje současné odrůdy – v tomto případě je patrný výrazný posun v genetické
konstituci moderních resp. současných odrůd.
47
Název:
Čurn V. a kol. (2012):
molekulárních markerů pro účely popisu genetických zdrojů
řepky (Brassica napus L.) a hodnocení jejich diverzity.
Autorský kolektiv:
prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D.
Ing. Lenka Havlíčková, Ph.D.
Ing. Eva Vondrášková
Ing. Vratislav Kučera, CSc.
Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc.
Ing. Miroslav Klíma, Ph.D.
Vydal:
Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích
Zemědělská fakulta
Studentská 13
370 05 České Budějovice
Vydáno bez jazykové úpravy
Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR, dopisem ze dne
20.8.2012 (č.j. 127750/2012 MZE-17220), jako uplatněná metodika s doporučením
pro její využití v zemědělské praxi.
Kontakt na autory: [email protected]
ISBN:
978-80-7394-251-9

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely

Transkript

Podobné dokumenty

Výroční zpráva ÚEB AV ČR za rok 2005

CROSS-COUNTRY OLYMPIC 3

Materiály k výuce - oddělení molekulární biologie crh

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely

Metodika analýzy molekulárních markerů u jilmu, Ulmus L.

Využití molekulárních technik při selekci rodičovských komponent v

Metodika

Next Generation Sequencing

L. acidophilus

Metodika izolace DNA a detekce GMO

Name and Initials Rank Official Number Unit AARONS D Mne RM

Příručka pro sadu PAXgene Blood RNA

Low Throughput HLA Typing Protocol