Analýza komplexní odpovědi buněk na poškození DNA v kombinaci
Transkript
Analýza komplexní odpovědi buněk na poškození DNA v kombinaci s fenotypizací Karel Souček Šárka Šimečková Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: [email protected] tel.: 541 517 166 DNA damage DNA Damage and Repair BioFiles 2007, 2.4, 20. Targeting the DDR Examples of DDR inhibitors in clinical use or in development Stéphane Richard Cíl Vyvinout detekci metodu pro současnou – poškození DNA – syntézy DNA – Buněčného cyklu – Apoptózy – Životnosti v kombinaci s buněčnou imunofenotypizací Detekované parametry Parametry Markery Flourochrom Povrchové znaky CD133 PerCPeFluor710 CD44 APC/Cy7 Životnost buněk LIVE/DEAD kit Yellow Syntéza DNA Pacific Blue Click-it EdU Buněčný cyklus FxCycle FarRed Poškození DNA pH2AX PE apoptóza FITC M30 CD133/Prominin-1 Transmembránový glykoprotein popsaný jako typický znak nádorových kmenových buněk (NKB) stále kontroverzní z hlediska definice NKB funkce není detailně známa Yu X, et al. (2011). CD133, Stem Cells, and Cancer Stem Cells: Myth or Reality? Curr Colorectal Cancer Rep 7: 253-259. CD44 receptor pro kyselinu hyaluronovou funkce v regulaci mezibuněčné interakce, adheze a migrace exprese u řady buněčných typů včetně NKB prostaty a prsu Ponta H, Sherman L, Herrlich PA (2003). CD44: From adhesion molecules to signalling regulators. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 33-45. LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stains fluorescenční značky reagující s aminy – Živé buňky – pouze na povrchu – Mrtvé buňky s permeabilní membránou až 50x > fluorescence – Kompatibilní s formaldehydovou fixací – Kompenzace - ArC™ Amine Reactive Compensation Bead Kit EdU Click-It - Metoda pro analýzu syntézy DNA FxCycle Far Red značka pro detekci nukleových kyselin u fixovaných buněk pro detekci DNA nutno použít RNasu značka se po inkubaci neoplachuje gH2A.X (p-Ser139) Abundantní znak korelující s výskytem dvouřetězcových zlomů DNA Lukas J, Bartek J (2009). DNA repair: New tales of an old tail. Nature 458: 581-583. Detekce apoptózy M30 CytoDEATH antibody protilátka specificky rozpoznává fragment CK18 po štěpení kaspázami 3, 6, 7, 9 CK18, součást mikrofilament epiteliálních buněk Materiály, design experimentu Buněčné linie – HCT116 – (cE2) Použité látky – MLN-4924 • Inhibitor dráhy neddylace • ↑p27Kip1, Cdt1, … – TRAIL, MG132 (pozitivní kontroly) Design experimentu (Soucy et al. 2009) Shrnutí Podařilo se zavedení protokolu na víceparametrovou analýzu + Možnost komplexní analýzy cytokinetiky nádorových buněk ve smyslu detekce syntézy DNA, buněčného cyklu, poškození DNA, apoptózy v kombinaci s povrchovými znaky Limitace M30 ~ znak apoptózy pouze u lidských epiteliálních buněk – Náhrada např. anti-cleaved PARP (Asp214) Antibody (mouse or human specific) – TUNEL (?) hCD133 ab cross reaguje s intracelulárním epitopem CK18 – Nelze detekovat u mrtvých buněk vysoká svítivost FxCycle Far Red znesnadňuje kompenzaci s APC-Cy7 Vysoký CV u histogramů buněčného cyklu po fixaci PFA vysoké pozadí u kontrol u M30a gH2A.X omezený výběr konjugovaných Ab
Podobné dokumenty
Wordtemplate 2
průměru asi 5–6x obohacení, např. 10 ml krve s bílými krvinkami napočítá 6 x 10 buněk/ml
VíceKatalog-testy
gke Steri-Record Mini-Bio-Plus biologické indikátory s kultivačním médiem (SCBI) se používají pro rutinní kontrolu a validaci parních, etylenoxidových, formaldehydových a peroxidvodíkových / plazmo...
Víceelektroniku - RS Components
Více než 10W na kubický palec, účinnost přes 88%. Špičkoví konstruktéři používají nezapouzdřené EOS a externí adaptéry pro napájení zařízení v různých OEM aplikacích jako jsou lékařské přístroje, z...
VíceZápis z konference pořádané nadací Action Duchenne (formát PDF)
Street Hospital London až po nepříliš dobré v jiných regionech • Nadace Action Duchenne se bude snažit o prosazení rozpočtu vyhrazeného pouze pro vzácná onemocnění (ring fenced budget); ze kterého ...
Více