L. acidophilus

Komentáře

Transkript

L. acidophilus
L. acidophilus_(PSMM _ TIDE): 2010-04-06
Ivo Sedláček a Pavel Švec
Česká sbírka mikroorganismů
Přírodovědecká fakulta MU
Tvrdého 14, 602 00 Brno
Projekt FI-IM5/205
„… problematika taxonomie“
Polyfázová taxonomie
- taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami
- obsahuje dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace
- použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup –
tzv.
„polyphasic approach“
Fylogenetická klasifikace
 fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie
a o chemotaxonomické údaje
popis mnoha nových taxonů X co identifikovat?
 identifikace taxonu X mobilní genetické elementy (bakteriofágy, ostrovy patogenity,
chromozomové kazety, plazmidy), exoproteiny - genetický polymorfismus
„… problematika taxonomie“
DNA
Celková DNA:
% obsah G+C
restriční profil (RFLP, PFGE)
velikost genomu
DNA reasociace
RNA
RNA sekvencování
analýza nízkomolekulárních RNA
Úseky DNA:
PCR metody (rep-PCR,
RAPD, AFLP)
ribotypizace
DNA sondy
DNA sekvencování
Polyfázová taxonomie,
plazmidová DNA
fylogenetická příbuznost
Proteiny
Chemotaxonomické znaky
mastné kyseliny (FAME)
mykolové kyseliny
polární lipidy
chinony
elektroforetický profil
celobuněčných peoteinů
enzymový profil (MLEE)
www.bacterio.cict.fr
Fenotyp
morfologie
biochemie a fyziologie (API,
Biolog)
sérologie
Lactobacillus acidophilus komplex
•
Lactobacillus = 130 taxonů
•
probiotická mikroflóra; ?patogenita?
•
L. acidophilus – ústa, trávicí trakt,
vagina
•
L. acidophilus sensu stricto
•
L. acidophilus sensu lato (obligátně
homofermentativní)
 velice rozsáhlá skupina bakterií: L. acidophilus sensu stricto,
L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii
(Fujisava et al., 1992); L. jensenii (Gasser et al., 1970)
 fylogeneticky příbuzné x fenotypově podobné
 L. acidophilus sensu lato - vaginální sliznice?!
Lactobacillus acidophilus komplex
 externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
 cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu
 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C)
 presumptivní identifikace založena na:

rep-PCR (GTG5)

spolehlivá identifikace LAB
Lactobacillus acidophilus komplex: rep-PCR
Shluk I
„in house“ databáze > 1600 LAB
Shluk II
Neprůkazné pro L. acidophilus
komplex
Shluk IIIa
Lactobacillus acidophilus komplex
 externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
 cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu
 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C)
 presumptivní identifikace založena na:


rep-PCR (GTG5)
24 izolátů L. acidophilus sensu lato (20 žen)

biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně)

ribotypizace (RiboPrinter)

MALDI-TOF MS
Lactobacillus acidophilus komplex: biotypizace API
Kmen
01A
03A
04A
06A
10A
10E/1
11A
11B
14C/2
15B
17A
18C
19A
19C
21A
22A
28A
29B
30B
30C
32A
33A
34A
35A
API 50CH ID
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. brevis
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus
Fenotypizace
RiboPrinter MALDI-TOF MS
výborná, dobrá ID: 10
nejistá, nepřijatelná ID: 14
? růst při 45°C ?
variabilní bioprofil
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex: rozšířená biotypizace
Kmen
01A
03A
04A
06A
10A
10E/1
11A
11B
14C/2
15B
17A
18C
19A
19C
21A
22A
28A
29B
30B
30C
32A
33A
34A
35A
API 50CH ID
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. brevis
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
komplex
Lactobacillus sp.
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
4% NaCl
RiboPrinter MALDI-TOF MS
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex: dendrogram biotypizace
01A
06A
28A
04A
18C
32A
11B
21A
29B
35A
19A
10A
30B
17A
33A
03A
22A
14C/2
15B
11A
19C
34A
30C
10E/1
0%
10%
20%
Linkage Distance
30%
Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter
profil 1.
pheS
sekvencování
(a)
profil 2.a
L. gasseri
profil 2.b
Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter
Kmen
01A
03A
04A
06A
10A
10E/1
11A
11B
14C/2
15B
17A
18C
19A
19C
21A
22A
28A
29B
30B
30C
32A
33A
34A
35A
API 50CH ID
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. brevis
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
NI
NI
L. acidophilus komplex
NI
L. acidophilus komplex
komplex
NI
komplex
NI
Lactobacillus sp.
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
NI
komplex
NI
RiboPrinter MALDI-TOF MS
NI
L. gasseri
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex
 externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
 cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu
 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C)
 presumptivní identifikace založena na:

rep-PCR (GTG5)
24 izolátů L. acidophilus sensu lato (20 žen)




biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně)
ribotypizace (RiboPrinter)
MALDI-TOF MS
7 izolátů L. acidophilus sensu lato

sekvencování pheS genu
Lactobacillus acidophilus komplex: ribotypizace
pheS
sekvencování
(a)
Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS
Lactobacillus mucosae: MALDI-TOF MS
x104
4706
isolate 10E/1
]
u
s.[a
te
In
1.0
0.8
0.6
4491
0.4
0.2
2352
2742
5135
3145
3421
0.0
x104
6312
5304
3996
6842
4706
7989
9403
7450
L. mucosae CCDM 690T
]
u
s.[a
te
In
1.5
1.0
0.5
2350
4492
3144
2739
5136
5304
3687 3994
6313
6844
7453
9406
7990
0.0
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Fig. 2: Comparison between MALDI-TOF mass spectra of isolate 10E/1 identified as L. mucosae and the
corresponding reference strain L. mucosae CCDM 690T.
m/z
Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS
Kmen
01A
03A
04A
06A
10A
10E/1
11A
11B
14C/2
15B
17A
18C
19A
19C
21A
22A
28A
29B
30B
30C
32A
33A
34A
35A
API 50CH ID
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. brevis
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
NI
NI
L. acidophilus komplex
NI
L. acidophilus komplex
komplex
NI
komplex
NI
Lactobacillus sp.
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
NI
komplex
NI
RiboPrinter
NI
L. gasseri
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
L. crispatus
L. jensenii
NI
L. jensenii
NI
L. crispatus(a)
L. crispatus(a)
NI
NI
NI
L. jensenii
L. crispatus(a)
MALDI-TOF MS
L. crispatus(a)
L. gasseri
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. mucosae
L. jensenii
L. crispatus
L. jensenii
L. jensenii
L. crispatus
L. crispatus(a)
Finální ID
L. crispatus(a)
L. crispatus
L. frumenti
L. crispatus(a)
L. crispatus(a)
(a)
profil podobný L. ultunensis
Lactobacillus acidophilus komplex: finální identifikace
Kmen
01A
03A
04A
06A
10A
10E/1
11A
11B
14C/2
15B
17A
18C
19A
19C
21A
22A
28A
29B
30B
30C
32A
33A
34A
35A
API 50CH ID
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
L. brevis
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. acidophilus
L. acidophilus L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. acidophilus
L. acidophilus komplex
L. acidophilus L. gasseri
L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
L. acidophilus
Lactobacillus sp.
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. gasseri
L. gasseri
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
komplex
NI
NI
L. acidophilus komplex
NI
L. acidophilus komplex
komplex
NI
komplex
NI
Lactobacillus sp.
L. acidophilus komplex
L. acidophilus komplex
NI
komplex
NI
RiboPrinter
NI
L. gasseri
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
L. crispatus
L. jensenii
NI
L. jensenii
NI
L. crispatus(a)
L. crispatus(a)
NI
NI
NI
L. jensenii
L. crispatus(a)
MALDI-TOF MS
L. crispatus(a)
L. gasseri
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. mucosae
L. jensenii
L. crispatus
L. jensenii
L. jensenii
L. crispatus
L. crispatus(a)
L. crispatus
L. jensenii
L. crispatus(a)
L. jensenii (b)
L. crispatus
L. crispatus
L. crispatus
L. frumenti
L. crispatus(a)
L. crispatus(a)
L. jensenii
L. crispatus
profil podobný
L. ultunensis
(a)
Finální ID = fenotypizace + shluková analýza ribotypizace + MALDI-TOF MS
Finální ID
L. crispatus
L. gasseri
L. crispatus (b)
L. crispatus
L. crispatus
L. mucosae
L. jensenii (b)
L. crispatus
L. jensenii
L. jensenii
L. crispatus (b)
L. crispatus (b)
L. crispatus
(b)
L. crispatus
L. vaginalis (b)
L. crispatus
L. crispatus
sekvencování
pheS
(b)
Lactobacillus acidophilus komplex
24 studovaných izolátů z cervixu:
L. crispatus (63%)
L. jensenii (25%)
L. gasseri, L. mucosae, L. vaginalis
L. acidophilus sensu stricto
MALDI-TOF MS
ribotypizace
biotypizace
?databáze?
Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Lactobacillus

Lactobacillus Lactobacillus fermentum Beijerinck 1901 (Approved Lists 1980), species. Lactobacillus floricola Kawasaki et al. 2011, sp. nov. Lactobacillus florum Endo et al. 2010, sp. nov. Lactobacillus formose...

Více

E E E E ! Ffi fr [FE: E S g P # FE € H#E

E E E E ! Ffi fr [FE: E S g P # FE € H#E - t C) C) o o s g) o = - - E _+ _- oo oC) c)o -O O= B B A a a A a B ? = ? ? o B aAB 'uJ l t : t o o o

Více

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely

Metodika izolace DNA a analýzy molekulárních markerů pro účely Předkládaná metodika je zacílena na využití molekulárních markerů na bázi analýzy DNA pro účely popisu a identifikace jednotlivých genetických zdrojů a hodnocení jejich genetické diverzity. Použité...

Více

PCR

PCR využívá jeden či více krátkých primerů (o délce 8-12 nt) libovolné sekvence s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA a málo přísné podmínky pro připojení primeru

Více

Sekvenování genomů

Sekvenování genomů Klasifikace eukaryotické genomové DNA: • Geny kódují dující proteiny • asi 25 % genomu, genomu, z toho ale jen 5 % (1,4 % genomu) genomu) připadá ipadá na exony

Více

Sekvenování genomů

Sekvenování genomů Tandemově zmnožené geny kódující rRNA, tRNA a histony Repetitivní DNA Neklasifikovaná spacer DNA: • nerepetitivní, nekódující, nekódující, cca čtvrtina genomu. Zřejmě mrtvé transpozony tak mutované...

Více

Zjišťování autenticity českých odrůd chmele pomocí chemických a

Zjišťování autenticity českých odrůd chmele pomocí chemických a složek chmele kapalinovou chromatografií a prokázali značné odrůdové rozdíly v zastoupení některých složek, především glykosidů kaempferolu a quercetinu. Frakci nízkomolekulárních polyfenolů použil...

Více