Úvod do chemie léčiv

Úvod do chemie léčiv
Proč se zabývat chemií léčiv
Léčiva lze definovat různými způsoby. Jedna definice říká: Léčiva jsou něčím, co v nejlepším
případě může pouze přispět k prodloužení stavu, jehož příčinou je nechráněný pohlavní styk,
stavu, který může být velice bolestný a stejně vždy končí smrtí.
Má cenu se zabývat léčivy a jejich chemií neboli farmakochemií? Odpověď zní ano, protože ten stav, o kterém se
v definici hovoří je život. A ten stojí za to žít, i když může být bolestný a stejně vždy končí smrtí. Ano, protože
léčiva mohou bolesti života zmírnit a smrt oddálit.
Rozmach chemie léčiv v posledních desetiletích je obrovský. Chemie léčiv spolu s chemií materiálů patří mezi nejdynamičtěji se rozvíjející obory chemie.
Před poměrně krátkou dobou byla chemie léčiv založena jen na zkušenostech, intuici, šťastných náhodách nebo
metodě pokusu a omylu. Obrovský rozvoj v tzv. biodisciplinách (biochemie, molekulární a buněčná biologie)
umožnil racionální přístup k navrhování léčiv. Farmakochemie je interdisciplinárním oborem, který shrnuje poznatky chemické syntézy, molekulového modelování, farmakologie, chemické a farmaceutické technologie, analytické chemie, chemometrie a statistiky, biochemie a molekulové biologie, fyziologie a mediciny, ale i informatiky,
ekonomiky, zdravotní politiky, marketingu, patentového práva a v neposlední řadě i lékařské etiky.
Specifickým odvětvím chemie se farmakochemie stala až v posledních dekádách 20. století.
Ve středověku nebyla skutečně účinná léčba možná. Chirurgie byla pouhým ranhojičstvím, jako léčiva se používaly jen
některé anorganické látky a rostlinné extrakty. Jen málo z nich bylo dostatečně účinných, mnohé měly jen placebový
účinek a některé „léky“ byly jedy, které více škodily než pomáhaly. Nejúčinnější přírodní léky, např. opium k tišení bolestí
nebo kůra chinovníku pro léčbu horečnatých stavů, pocházely z teplých krajů a v Evropě si mohl dovolit jen málokdo.
Rostliny rostoucí v mírném pásmu obsahovaly látky méně účinné nebo obsah skutečně účinných látek v nich byl jen
nízký. Hygiena byla neznámým pojmem, šířily se infekce, které měly více obětí než války. V letech 1558 - 1626 podle
podrobných zápisů vedených zachovaných na londýnské faře u kostela svatého Botolpha přežilo ze 100 novorozenců jeden den
93, 1 měsíc 84, 1 rok 70, pět let 48 a 15 let pouze 27.
Situace se výrazně zlepšila až v 19. století, kdy se chemie konstituovala jako vědecký obor
s experimentálním i teoretickým aparátem.
V 19 století začala medicina stále více spoléhat na různé chemické látky a to vedlo k dramatickému poklesu úmrtnosti. Ignác Semmelweis, prosadil v r.1848, aby si porodníci myli ruce ve vodě s chlorovým vápnem. To vedlo k
poklesu úmrtí rodících žen na „horečku omladnic“ z 18% na 1,2-1,3%. Joseph Lister začal roku 1865 ošetřovat rány
„karbolem" (nečistý fenol). Do té doby umíraly více než tři čtvrtiny zraněných na sepsi ran, i malá zranění byla
často smrtelná. Použití etheru a chloroformu k narkóze přineslo průlom do chirurgie. Chemici se naučili izolovat
složky přírodních léčiv, vyčistit je a identifikovat. Byly získány „aktivní principy“ opia (morfin), kůry chinovníku
(chinin), tabáku (nikotin), kávy (kofein) apod., které byly mnohem účinnější, než původní extrakty nebo odvary.
Určení struktury přírodních látek otvíralo cestu k jejich syntetické přípravě nebo jejich modifikaci na deriváty
s lepšími vlastnostmi (např. aspirin). Vývoj léčiv a léčebných postupů významně ovlivnily objevy mikrobiálních
původců různých infekčních onemocnění.. Ale i zdánlivě malé objevy, jako bylo zkonstruování injekční stříkačky
v polovině 19. století, se staly důležitým mezníkem historie výzkumu, vývoje a výroby léčiv.
Další pokrok přineslo 20. století. Do lékařské praxe byla postupně zaváděna řada skutečně účinných léčiv. Zprvu byla úspěšná léčiva především tam, onemocnění mělo jednoduchou příčinu,
např. bakteriálního původce (sulfonamidy a pak antibiotika), ve druhé polovině století se pak
objevily účinné léky na nemoci způsobené nahromaděním různých faktorů (léčiva na onemocnění kardiovaskulárního a centrálního nervového systému, protinádorové léky apod.)
Význam moderních léčiv pro terapii lze ilustrovat na příkladu infekčních onemocnění v USA. Ještě v r. 1900 tam na
infekční onemocnění ročně umíralo 8.080 lidí na 1 mil. obyvatel. V éře sulfonamidů tento počet klesl na polovinu
(např. v r. 1940 to bylo 4.410 pacientů z milionu) a po zavedení antibiotik se úmrtnost na infekční choroby snížila
řádově (v r. 1990 to bylo pouhých 410 pacientů z milionu, z toho 313 zemřelo na zápal plic).
Dnes je možné úspěšně léčit chirurgickým zákrokem (včetně transplantací), fyzikální terapií
(včetně ozařování), psychoterapií, chemoterapií a imunoterapií (sem patří např. vakcinace).
Léčebné metody se vzájemně kombinují a ovlivňují - rozvoj chirurgie přinesl potřebu nových anestetik, transplantace byly umožněny objevem imunosupresiv, podávání léků proti srážlivosti krve snížilo riziko pooperačních embolií,
1
naopak podávání preparátů, které srážlivost krve zvyšují, snížilo v jiných případech riziko vykrvácení pacienta,
radioprotektiva chrání zdravé tkáně pacientů před ozářením a tím umožňují aplikovat vyšší dávky záření na nádorovou tkáň, antidepresiva pomáhají při psychoterapii pacientů, kteří přežili pokusy o sebevraždu apod. Výhodná může
být i kombinace různých typů léků - mnohé protinádorové léky mohou být podávány ve vyšších dávkách díky tomu,
že se po jejich aplikaci nasadí léky podporující krvetvorbu.
Boj s nemocemi však nekončí ani v 21. století. Objevují se nové (AIDS, legionářská nemoc aj.),
bakterie a viry, ale i nádorové buňky získávají rezistenci na léčiva. Se stárnutím populace se dříve vzácná onemocnění stávají běžnými.Léčiva pomáhají léčit poruchy, o nichž se dříve nepředpokládalo, že by mohly být medikamentózně ovlivněny (např. impotence, poruchy pozornosti spojené s hyperaktivitou, obezita, inkontinence apod.). Lidstvo sice dbá více na prevenci a
zdravý životní styl, ne však dostatečně. Zvyšuje se počet "civilizačních chorob" a onemocnění
způsobených environmentálními faktory (astma, alergie) nebo změnou životních podmínek.
Někdy přitom platí, že zlepšování kvality života nevede vždy ke zlepšení zdravotního stavu. Tak např. růst počtu pacientek s
nádory prsu, vaječníků, děložního těla nebo čípku je dáván do souvislosti s výrazným zvýšením počtu periodických změn hladiny
hormonů při ovulačním cyklu. V 19. století se ženy začínaly menstruovat až po 15. roce, většinou se vdávaly před dosažením 20
let a mívaly velký počet dětí, které kojily. Periodických změn hladiny ženských pohlavních hormonů spojených s ovulací a menstruací mívaly proto jen několik desítek. Dnešní ženy začínají menstruovat kolem 12 let, vdávají se kolem 30 let, mají 1-2 děti a
ovulačních cyklů prožívají proto v průměru 400. Zvýšený výskyt alergií v poslední době je podle jedné nedávné teorie dáván do
souvislosti s vyšší úrovní hygieny: malé děti rostoucí ve špinavějším prostředí se dostávaly do styku s mnohými alergeny dříve
než nyní a organismus jim "přivyknul" a při dalším kontaktu na ně nereagoval hypersenzitivně.
Do poloviny 20. století nebyla léčiva řádně testována, sledována byla jen jejich účinnost. Teprve
některé tragické události vedly k tomu, že se do popředí zájmu dostala i bezpečnost a s ní úzce
související kvalita léčiv. Legislativně byla kodifikována opatření zajišťující, že se na trh nedostanou nebezpečná léčiva.
V 19. století zkoušeli lékaři a chemici nejčastěji sami na sobě, dodnes je populární Freudův popis účinků kokainu.
Nikdo se nezabýval vedlejšími účinky léčiv, což mělo za následek pozdější komplikace a zákaz řady léčiv zpočátku
považovaných za téměř zázračné. Např. na konci 19. století byl do praxe s velkou slávou zaveden do lékařské praxe
heroin jako lék pro „hrdiny“, který účinně potlačuje bolest. Již o pár let později však musel být zakázán jako silně
návyková látka.
Ve 30. letech došlo v USA k řadě úmrtí pacientů léčených „sulfonamidovým elixírem“. Ukázalo se, že tato úmrtí
zavinil diethylenglyko obsažený v „elixíru. Aby se podobné případy neopakovaly, byl v USA přijat nový zákon o
léčivech, potravinách a kosmetice, v němž byly poprvé vytýčeny zásady analytické kontroly léčiv. Podobné zákony
pak byly přijaty i v dalších zemích.
Koncem 50. let se v řadě zemí narodilo mnoho dětí s nevyvinutými končetinami. V r. 1962 bylo zřejmé, že to bylo v
souvislosti s používáním thalidomidu (Contergan), který byl často předepisován těhotným ženám jako „bezpečné“
sedativum pro potlačení ranní nevolnosti. Thalidomid je sice výtečným sedativem a hypnotikem, je však současně
teratogenem, který negativně ovlivňuje růst embrya v děloze. Do té doby nikoho nenapadlo, že to, co u některých pacientů výtečně účinkuje, může jiné pacienty poškodit. Výsledkem bylo další zpřísnění lékové legislativy. Výrobci museli
před uvedením léčiva na trh prokazovat nejen jeho účinnost, ale i bezpečnost. Bylo rozšířeno preklinické testování a při
pokusech na zvířatech se mimo jiné musí zkoumat embryotoxicita a teratogenita. U nových léčiv se musí ještě po uvedení na trh sledovat vedlejší účinky (provádět tzv. farmakovigilanci) a občas dochází k tomu, že léčivo je po několika
letech z trhu staženo.
Velký důraz kladený na preventivní opatření směřující k tomu, aby se na trh dostala jen ta léčiva,
která jsou účinná, kvalitní a bezpečná, vyústil ve formulování tzv. správné výrobní praxe (SVP,
anglicky Good Manufacturing Practice, GMP), souboru zásad a opatření, kterými se musí řídit
každý výrobce léčiv a správné klinické praxe vymezující podmínky zkoušení léčiv.
Účinná prevence je drahá, takže ceny léků rostou.Do ceny léčiv se promítají náklady na výzkum a vývoj, kam patří i
klinické zkoušení. Průměrné náklady na vývoj nového léčiva od objevu až po povolení k prodeji se nyní vyšplhaly
až na 800 mil.$. Výrazně vzrostly náklady na technicky zabezpečenou a řádně zdokumentovanou výrobu podle
zásad SVP. Rostou i náklady na nové léčebné postupy a techniky, nové diagnostické postupy, na nové vybavení a na
mzdy zdravotníků. Objem prostředků, které má zdravotnictví k dispozici však roste mnohem pomaleji nebo i stagnuje.
Před zdravotnictvím prakticky všech zemí světa tak stojí neřešitelný problém, jak bez výrazného
nárůstu finančních nákladů zajistit široce dostupnou nejvyšší možnou léčebnou péči.
Nákladnost pokroku ve zdravotnictví lze ilustrovat tím, že mezi roky 1950 - 2000 vzrostly náklady na léčbu nemocí
asi 800 x. Různé země vynakládají v současné době na zdravotní péči 2-13% HDP. Nejvyšší podíl výdajů na zdravot2
nictví mají vyspělé státy - na konci 90. let to bylo v USA 12,7% HDP, v Evropě nejvíce v Německu (10,5%) a pak Švýcarsku
(9,8%). V ČR se podíl výdajů na zdravotnictví pohybuje kolem 6,5% HDP. Výši výdajů do jisté míry odpovídá stav zdraví:
např. v USA přežívalo 5 let po stanovení diagnózy nádorů prsu 82% pacientek, ve Švýcarsku 76%, zatímco ve Spojeném království s podílem výdajů na zdravotnictví pouze 6,9% HDP jen 63% pacientek.
Léčiva představují pouze menší část celkových nákladů na zdravotní péči.
V ČR to v minulých letech bylo asi 30%. V západních zemích, kde náklady na zdravotnictví ovlivňují mimo jiné
vyšší mzdy zdravotnického personálu a vyšší standard vybavení, je tento podíl menší.
To, že několik miligramů léčiva může stát tisíce korun, někdy vede k představě, že růst výdajů
na zdravotnictví lze zabrzdit hlavně šetřením na lécích. Nahrává tomu skutečnost, že spotřeba
léčiv roste rychlejším tempem než výběr pojistného a ještě rychleji rostou průměrné ceny léčiv
(nárůst spotřeby léčiv v "ddd", doporučených denních dávkách, je pomalejší, než růst spotřeby
léků vyjádřený finančně). Šetření na lécích je správné, nesmí se však šetřit za každou cenu.
Podle odborných odhadů, lze v ČR racionálnějším předepisováním léků ušetřit asi 10% jejich celkové spotřeby bez
významnějších dopadů na zdraví pacientů. Tato úspora se však do celkových nákladů na zdravotní péči promítne
pouze 3%. Podstatně větší úspory lze dosáhnout racionalizací sítě poskytovatelů zdravotní péče, omezováním zbytečných výkonů a snižováním doby hospitalizace pacientů.
Přes vysokou cenu se moderní léčiva většinou vyplácejí: zkracují dobu hospitalizace, umožňují
nahradit nemocniční léčbu ambulantní, mají menší nežádoucí vedlejší účinky.
Lék, který je sice několikrát dražší, ale na rozdíl od svého předchůdce se nemusí podávat několikahodinovou infuzí,
ale orálně ve formě tablet nebo kapslí, se může vyplatit, protože se pacient může léčit doma a ne v nemocnici. Náklady na léčbu může snížit i to, že nové léčivo má méně nežádoucích vedlejších účinků. V Německu si např. spočítali, že náklady na hospitalizaci pacientů zapříčiněnou vedlejšími účinky léků činí ročně přes 0,5 mld. €.
Místo omezování preskripce nových drahých léků je v boji proti zvyšování nákladů na zdravotní
péči daleko účinnějším opatřením to, že instituce, které léky schvalují a povolují, začínají vyžadovat u nových léčiv nejen zkoušky účinnosti a bezpečnosti, ale i provedení farmakoekonomických studií. Tyto studie jsou ekonomickým rozborem, který ukazuje, jak se léčba novým přípravkem promítne do celkových nákladů na zdravotní péči.
Farmakoekonomické posuzování je snadné u léků, které zkracují a zjednodušují léčbu. Jsou však léčiva, kde toto
kriterium nelze použít. Např. u protinádorových léků se výhodnost léčiva posuzuje podle toho, jak prodlouží dobu
přežití pacientů. V tomto případě je otázkou, jakou cenu lidskému životu přisoudit. Počítání s cenou života se může
jevit jako neetické. Prostředky na zdravotní péči však nejsou neomezené. To, že drahá léčba prodlouží život jednoho
pacienta o pár dní může znamenat, že budou scházet peníze na trvalejší léčbu jiného pacienta. V USA jsou náklady
na prodloužení života považovány za efektivní, jestliže nepřesáhnou 50 tis. $ na jeden člověkorok. Tato částka byla
na základě doporučení expertů odvozena z průměrných ročních nákladů na dialýzu pacientů se selháním ledvin.
Podle údajů o nákladovosti dialyzační léčby v ČR se tyto náklady v našich nemocnicích v r. 1997 pohybovaly mezi
300-400 tis. Kč, nyní to bude částka kolem 0,5 mil. Kč.
Vedle doby přežití je pro pacienty důležitá i kvalita života. Ta je odlišná u pacienta, který po
skončení terapie žije zcela normálním životem a jiná u pacienta, kterému léčba sice prodloužila
život, ale za cenu narušení funkce některého orgánu.
Ve farmakoekonomických studiích se proto doba přežití nevyjadřuje prostým časovým údajem, ale v tzv. jednotkách
QALY (Quality Adjusted Life Year), které jsou přepočtem na roky života se standardní kvalitou. Ta např. u pacienta
s jednou amputovanou končetinou se léta života přepočítávají na QALY vynásobením koeficientem 0,5.
Náklady na léčbu pacientů v posledním půlroce před smrtí jsou v průměru stejné, jako náklady
na zdravotní péči za celý zbytek života. Přesto nesmí lékařská péče polevit ani v tomto posledním období života. Farmakoekonomika musí přitom vždy kráčet ruku v ruce s lékařskou etikou.
Moderní medicína mnohdy dokáže prodlužovat život na velmi dlouhou dobu. Přitom však může překročit hranici,
kdy se smysluplné prodlužování života mění v neúčelné oddalování smrti. Jde např. o nákladné udržování životních
funkcí pomocí podpůrných přístrojů prakticky již nežijícího pacienta. U pacientů v terminálním stadiu nádorového
onemocnění musí onkologové řešit otázku, zda aplikovat další cykly chemoterapie, která způsobuje pacientovi obtíže a nakonec stejně nepomůže, nebo zda paliativní léčbou zbavit pacienta bolesti a zlepšit kvalitu jeho posledních
dnů. Podle doporučení onkologické společnosti J.E. Purkyně má o ukončení neprospěšné léčby rozhodnout odborný
tým, a to především na základě medicinských důvodů. Ošetřující lékař má o ukončení neúčinné chemoterapie informovat pacienta s tím, že léčba nekončí, ale že se soustředí na zlepšení kvality života
3
Základní pojmy chemie léčiv
Chemie léčiv (farmakochemie) se zabývá navrhováním a syntézou nových léčiv na základě
poznání jejich účinku na molekulární úrovni.
Léčiva jsou sloučeniny, které interagují s cílovými (bio)makromolekulami v organismu, přičemž tato interakce vyvolává biologickou odezvu → léčivo má farmakologický účinek.
Interakce léčiva s cílovou strukturou studuje farmakodynamika. Aby léčivo mělo farmakologický účinek, musí nejen
být schopné interakce s cílovou strukturou v organismu, ale musí se k této cílové struktuře dostat v dostatečně vysoké
koncentraci a působit na ni dostatečně dlouhou dobu. Studiem těchto aspektů se zabývá farmakokinetika.
Farmakologický účinek může být příznivý a nepříznivý. Vztah mezi prospěchem a poškozením
organismu je proto třeba u každého léčiva velmi pečlivě posuzovat. Cílem výzkumu a vývoje léčiv
je maximalizovat příznivý účinek a současně co nejvíce potlačit nežádoucí nepříznivé účinky.
Např. nádorová onemocnění jsou zapříčiněna selháním mechanismu kontroly růstu buněk. Některá léčiva mohou
nekontrolovaný růst buněk zastavit, jejich zásah však nemusí být dostatečně jemný. V dospělém organismu rostou
nové buňky jen velmi pomalu. Výjimkou jsou nádorové buňky, ale i krvinky, které se vytvářejí v kostní dřeni, buňky
vlasových kořínků nebo některých sliznic. Vedlejším účinkem protinádorových léčiv zastavujících růst nádorových
buněk proto bývá narušení krvetvorby, alopecie, zvracení apod. Někdy se stane, že vedlejší účinky neumožní, aby
léčivo bylo povoleno, jindy se vedlejší účinky mohou projevit i po uvedení na trh. Jsou-li tyto účinky závažné, může
dojít ke stažení léčiva. Nedávno se to stalo u cerivastatinu (Lipobay nebo Baycol), léku snižujícího hladinu cholesterolu. Předepsán byl asi 6 milionům pacientů. Naprosté většině pomohl, současně však zapříčinil smrt 52 z nich. Nejprve
se na balení léku objevilo varování, kterým pacientům nesmí být předepisován a když ani to nepomohlo, byl stažen
z trhu. Případ měl velkou publicitu, podobně však dříve bylo z trhu staženo více léků.
Ve vztahu k nemoci může mít léčivo účinek léčebný - kurativní, zmírňující - paliativní (nemoc
neléčí, ale zmírňuje její průběh, zvyšuje kvalitu života a dobu přežití), podpůrný, doplňkový - adjuvantní a ochranný - preventivní.
Farmakologický účinek, ať již příznivý nebo nežádoucí, má pravděpodobnostní charakter.
Žádný lék nepůsobí na všechny stejně - nemá stejnou terapeutickou odezvu. Mnohé nemoci, jako je rakovina, kardiovaskulární onemocnění, astma apod., mají multifaktoriální charakter - stejné onemocnění může být způsobeno
různými typy poruch, např. narušením funkce různých enzymů podílejících se na určitém biologickém procesu, např.
buněčném dělení. Určité léčivo obvykle interaguje pouze s jedním enzymem metabolické dráhy. Bude působit u pacienta, u něhož bylo onemocnění způsobeno narušením funkce tohoto enzymu, u jiného, kde poruchu ovlivnila funkce
jiného enzymu účinné nebude.
Organismus je složitým útvarem s individuálními odchylkami, které se mohou projevit i na
úrovni cílové struktury pro léčivo, např. u enzymů nebo receptorů.
Změny mohou být tak malé, že cílová struktura zůstane funkční, mohou však ovlivnit interakci léčiva s touto strukturou, čili účinek léčiva. Interakce může být usnadněná nebo naopak zhoršená. U jednoho pacienta pak bude stejné
léčivo působit silněji než u druhého. Změny v cílové struktuře jsou velmi často způsobeny bodovou mutací genů,
které mají za následek změnu jedné aminokyseliny v kódované bílkovině. Mutace tohoto typu jsou označovány jako
polymorfismus jednotlivých nukleotidů (Single Nucleotide Polymorphismus, zkratka SNP) a jejich zjišťování je
věnována značná pozornost v souvislosti s tzv. individualizovanou terapií.
Důležité jsou nejen rozdíly v interakcích léčiva s cílovou strukturou (tj. farmakodynamických
vlastnostech), ale i individuální odchylky v metabolismu léčiva způsobené odchylkami ve struktuře enzymů katalyzujících přeměny a odbourání léčiva (farmakokinetické vlastnosti).
Některý pacient může léčivo odbourávat (nebo naopak aktivovat) rychleji, jiný pomaleji. U prvního je pak třeba k
dosažení stejného účinku zvýšit dávku, u druhého se naopak může v důsledku zpomalené eliminace léčivo hromadit,
což může způsobit prohloubení nežádoucích vedlejších účinků. Metabolismus léčiva mohou ovlivnit nejen malé
změny ve struktuře degradujících nebo transformujících enzymů, ale i jiná léčiva, složky potravy, nikotin z tabákového kouře apod., které soutěží o stejný enzym, popř. mohou stimulovat nebo naopak inhibovat aktivující nebo
odbourávající enzymy
4
Výzkum a vývoj nových léčiv
Výzkum a vývoj nových originálních léčiv je zdlouhavý, velice nákladný a přitom značně rizikový.
Kompletní výzkum a vývoj si mohou dovolit pouze finančně velmi silné farmaceutické koncerny.
Zcela nových léčiv je proto uváděno na světový trh každým rokem jen poměrně málo.
V posledních letech to bývá každý rok jen 40-50 originálních léčiv. S tímto malým počtem kontrastuje velký počet publikovaných prací věnovaných přípravě nových potenciálních léčiv. Jejich autoři jsou často pracovníci akademických institucí nebo malých firem, kteří se domnívají, že výsledky své práce prodají formou licence k dokončení vývoje farmaceutickým
gigantům. Pravděpodobnost, že se jim podaří připravit nové léčivo je však jen velmi malá – z desetitisíců nových sloučenin
se léčivem stane jediná. Malá pravděpodobnost však neznamená nulovou pravděpodobnost, ale nutnost přistupovat
k výzkumu a vývoji léčiv racionálně. Zjistí-li se u nějaké látky zajímavé biologické účinky, je třeba učinit vše proto,
aby se ze slibné látky léčivo stalo. Objev nového léčiva je třeba ochránit (zapatentovat), zajistit si potřebné zdroje
účelnou spoluprací, postupovat rychle a účelně neopomenout nic, co rozhoduje o úspěchu.
Má-li být výzkum a vývoj léčiv úspěšný, je třeba si uvědomit, že jde o službu, která má různé zákazníky s různými zájmy, které je třeba uspokojit.
¾
¾
¾
¾
¾
Pacienti požadují, aby jim léčiva pomáhala zlepšit kvalitu života, tj. vyléčila onemocnění nebo alespoň odstranila
jeho symptomy a prodloužila dobu do dalšího projevu symptomů, prodloužila dobu života, zmírnila bolesti, zkrátila dobu neschopnosti, byla účinná a současně měla minimum vedlejších účinků, byla hrazená pojišťovnou nebo
alespoň byla levná a aby jejich podání bylo snadné a komfortní
Lékaři mají podobné požadavky na léčivo jako pacienti, navíc požadují minimum kontraindikací (stavů, kdy
léčivo nelze předpisovat), protože omyl může mít nepříznivé následky nejen pro pacienta, ale i lékaře
Lékárníci a distributoři léčiv požadují od léčiv reprodukovatelnou kvalitu a co největší stabilitu
Poskytovatele a plátce zdravotní péče (pojišťovny) chtějí, aby jejich finanční zátěž spojená s podáním léčiva
byla co nejnižší (nízká cena, vysoká farmakoekonomická výhodnost)
Vedení a akcionáři farmaceutické firmy mají zájem o široké uplatnění léčiva (rozsáhlé indikace, využitelnost u
nejčetnějších onemocnění, minimální konkurence), co nejdelší patentovou ochranu (u originálních léčiv), nízkou
nákladovost a vysokou ziskovost výroby a také o to,aby léčivo vytvářelo u veřejnosti příznivý obraz firmy.
Výzkum a vývoj nových léčiv lze rozdělit do několika fází. První fází u nových léčiv je fáze
objevu (Drug Discovery).
Přitom se nejprve určí cíl výzkumu, tedy nemoc nebo poruchu, kterou má nová látka léčit. Dále je třeba určit, jak bude
prováděn screening, tj. jak budou potenciální léčiva zkoušena. Zkoušení usnadní, je-li na molekulární nebo buněčné
úrovni známa cílová struktura (enzym, receptor apod.), která hraje při onemocnění závažnou roli a jejíž interakcí
s léčivem (např. inhibicí enzymu) lze ovlivnit průběh onemocnění. V takovém případě lze screening provádět in vitro,
„ve zkumavce“. Pak následuje hledání první (základní) účinné látky, vodítka – „lead compound“. Přitom lze zkoušet
řadu syntetizovaných látek nebo různé přírodní látky izolované z rostlin a živočichů. Pokud jsou k dispozici informace
o prostorové stavbě cílové struktury lze dokonce molekulu potenciálního léčiva nejprve navrhnout pomocí počítače a
teprve pak syntetizovat a ověřit, zda má předpokládané vlastnosti. V minulosti mnohdy napomohla nalezení účinných
látek šťastná náhoda (serendipita) a její podíl na objevech nových léčiv nelze vyloučit ani nyní (viz příklad Viagry).
Pokud systematická práce nebo i šťastná náhoda přinesla objev první účinné látky, vodítka, následuje druhá fáze, fáze návrhu (Drug Design). V této fázi se zkoumají analoga „vodítka“.
Tato fáze zahrnuje spoustu systematické práce v řadě oblastí. Obvykle se v této fázi provádí příprava velkého počtu
analog základní účinné látky a jejich testování. V minulosti byla tato fáze velmi pracná, v posledních letech však byly
vyvinuty postupy kombinatoriální chemie umožňující přípravu velkého počtu analog („knihoven látek“) naráz. Přípravu analog usnadňuje, mohou-li se na základě srovnání účinnosti několika látek odvodit strukturní rysy důležité pro
biologickou aktivitu, tzv. farmakofor. Vztah mezi strukturou a aktivitou (SAR, Structure-Activity Relationship) lze
modelovat i pomocí výpočetní techniky. Přitom se nesleduje jen základní účinnost, ale i toxicita, popř. další vedlejší
účinky. Synteticky se pak připraví jen několik analog, u nichž se při screeningu prověří správnost modelu. Model se
pak podle potřeby doladí. S růstem znalostí o vztazích mezi strukturou a aktivitou se výběr připravovaných látek zužuje. U vybraných látek s nejslibnějším farmakologickým profilem a nejnižší toxicitou se pak zahájí testování in vivo,
na pokusných zvířatech. Přitom se zjišťují jak základní farmakodynamické, tak i farmakokinetické parametry
(ADME, adsorpce, distribuce, metabolismus, exkrece). V případě nutnosti se pak modifikací molekuly léčiva, které je
sice vysoce účinné, ale má nevýhodné vlastnosti (např. malou rozpustnost, nedostatečnou lipofilitu, malou stabilitu
v kyselém prostředí žaludku apod.) tyto parametry upravují. Přitom se např. z léčiva připraví acylací, esterifikací a
jinými reakcemi „proléčivo“ (prodrug), derivát, který se na skutečně účinnou látku přemění až po proniknutí k cílové
buňce působením buněčných enzymů. Jinou možností je, že se nerozpustná molekula léčiva uzavře do inkluzních
komplexů nebo liposomů. V této formě se podá pacientovi a uvolní se opět až po dosažení cíle.
5
Vybraná molekula léčiva nakonec přechází do vývojové fáze (Drug Development).
V této fázi se optimalizuje postup syntézy léčiva a řeší technologické problémy (včetně otázek bezpečnosti práce a
ochrany životního prostředí): Vypracovaný postup se pak převede do výrobního měřítka (scaling up). Současně se
vyvíjí léková forma (tablety, injekce apod.) a postup její výroby, určí se jakostní parametry a vypracují postupy analytického hodnocení. Identifikují se nečistoty a případné rozkladné produkty a připraví se (izolací nebo synteticky)
jejich standardy, a provedou se zkoušky stability účinné látky i finální lékové formy. U nových léčiv se rozšíří rozsah
biologického testování na pokusných zvířatech, aby se získaly informace o farmakologickém profilu látky potřebné
pro povolení zahájení zkoušek na člověku. Pak se zahájí klinické zkoušky. Nejprve se v tzv. fázi I zjišťuje na malém
počtu dobrovolníků, jak závisí hlavní i vedlejší účinky na dávce léčiva. Poté se s vhodně zvolenou dávkou provede
zkoušení na menších nebo větších souborech pacientů (fáze II a III). Jedna část pacientů dostává nové léčivo, druhá
část neúčinnou napodobeninu (placebo) nebo v případech závažných onemocnění známé osvědčené léčivo. Pacienti se
do obou skupin dostávají náhodným výběrem (randomizovaná studie) a při zkoušení neví, zda nové léčivo dostávají
(zaslepená studie). Často to neví ani ošetřující lékař (dvojitě zaslepené klinická studie). Veškeré výsledky se pečlivě
dokumentují a po dokončení zkoušek se dokumentace předává registračním orgánům, které rozhodnou o povolení
nového léčiva. I když se klinické zkoušky provádí s velkým souborem náhodně vybraných pacientů, nemusí se při
nich vždy zjistit všechny vedlejší účinky. Práce na vývoji nového léčiva proto ještě nekončí, ještě několik let po uvedení na trh se musí provádět tzv. farmakovigilance, shromažďování informací o nežádoucích vedlejších účincích.
Časovou náročnost výzkumu a vývoje nového léčiva ilustruje následující přehled:
Patentové aktivity
Objev Návrh
1
Preklin.
zkoušky IND
10000 → 10
látek
1-3 roky
Technologie
Farmakologie
I Fáze II III
Klinické zkoušení
10 → 1-2
Analytika
Toxikologie
1 –3 roky
Registr.
NDA řízení
1 lék
Farmakovigilance
Zkoumání
metabolismu
3 – 6 let
Uvedení
na trh
1- 3 roky
5 let
IND = žádost o povolení klinického zkoušení (Investigational New Drug application, NDA = žádost o registraci nového léčiva (New Drug Application)
Zda VaV nového léčiva zahrne všechny zmiňované fáze, závisí na jeho inovativnosti.
Podle inovativnosti lze léčiva rozdělit do několika kategorií:
¾ Nová struktura, nové přínosy pro terapii
¾ Nová struktura, známé přínosy („me too“)
¾ Známá struktura, nové přínosy pro terapii („prodrug“, jediný enantiomer, nový typ soli, směrování, nové indikace, nové lékové formy)
¾ Známá struktura, známé přínosy (generika)
Náročnost, nákladnost i rizikovost výzkumu a vývoje klesá směrem dolů. Nejnáročnější (a nejdražší) je pochopitelně
vývoj zcela nových léčiv s novým typem účinku. Jejich výzkum a vývoj začíná již objevitelskou fází. Výzkum a
vývoj analog zavedených léčiv, avšak se zlepšenými vlastnostmi, jako jsou tzv. „me too“, „proléčiva“, liposomální
formy léčiv, enantiomery místo racemátů apod., zahajuje až ve druhé fázi, u generik – kopií zavedených léčiv – se
provádí pouze vývoj (třetí fáze).
Generika lze uvést na trh až po vypršení patentové ochrany originálního přípravku, podle nové
legislativy EU mohou však být vyvíjena již před skončením platnosti patentu (v ČR se zatím nesmí před vypršením patentu provádět ani vývoj generik). Vedle patentové ochrany je však třeba
brát v úvahu i tzv. ochranu farmaceutických dat.
Trvá-li ochrana farmaceutických dat i po vypršení platnosti patentu, je sice možné léčivo vyrábět, ale aby bylo povoleno, je třeba provést všechny předepsané preklinické a klinické zkoušky a výsledky předložit příslušné lékové registrační instituci (v ČR Státnímu ústavu pro kontrolu léčiv, SÚKL). To je ovšem velice nákladné. Výrobci generik
proto raději čekají až ochrana dat skončí (v ČR zatím za 6 let, v EU podle nové legislativy za 8 let). Pak je možné se
v žádosti o povolení odvolat na výsledky zkoušek originálního přípravku s tím, že se pouze provede průkaz bioe6
kvivalence generika. Tím může být výsledek porovnání výsledků podání generika a originálního přípravku u malého
souboru pacientů, u injekcí se registrační orgány mohou spokojit s porovnáním složení a stability léčiva.
Farmakodynamika
Farmakodynamika se zabývá studiem účinků léčiv na organismus.
V současné době stojí na začátku projektů výzkumu a vývoje léčiv určení místa terapeutického zásahu léčiva - cílové struktury. Při vazbě léčiva na cílovou strukturu se uplatňují různé
typy interakcí a vazeb Jedna molekula léčiva se přitom obvykle váže na cílovou strukturu v
důsledku interakcí více skupin stejného nebo různého charakteru.
• Iontové interakce mezi ionizovanými skupinami nesoucími opačný náboj jsou velmi silné. Hrají významnou
roli při účinku některých neurotransmitérů nebo hormonů, jako je např. dopamin nebo adrenalin (epinefrin)
s jejich receptory. Účinné látky přitom nesou v molekule aminoskupinu, která je ionizována a interaguje
s ionizovanou karboxylovou skupinou receptoru (např. adrenalin se iontově váže na aspartátový zbytek Asp 113
vazebného místa adrenergních receptorů).
• Vodíkové vazby se vytvářejí mezi skupinami majícími charakter donorů a akceptorů protonu. Přestože jsou
mnohem slabší než vazby iontové, hrají při interakcích účinných látek s jejich cílovou strukturou významnou roli. Při zmíněné vazbě adrenalinu na adrenergní receptor nehraje roli jen iontová vazba methylamoniové skupiny
na karboxylátový iont zbytku asparagové kyseliny, ale i vodíkové vazby mezi fenolickými hydroxyly molekuly
adrenalinu (donory) a hydroxyskupinami serinových zbytků 204 a 207 receptoru.
• Význam interakcí dipól-dipól pro vazbu léčiv na jejich cílovou strukturu je poměrně málo prostudovaný. Přesto
je zřejmé, že interakce látek, které mají charakter dipólu, s dipolárními skupinami strukturami ve vazebném místě cílové struktury účinnost léčiv významně ovlivňují. Pokud ze sterických důvodů nemůže dipolární látka ve vazebném místě zaujmout správnou orientaci, tak, aby opačně nabité části dipolů mohly vzájemně interagovat,
účinnost klesá. Ukázalo se to např. při studiu účinnosti analog cimetidinu, léčiva proti žaludečním vředům.
• Změny elektronové hustoty způsobené pohybem elektronů v nepolárních skupinách vedou k tomu, že se přechodně vytvoří místa s vyšší a nižší elektronovou hustotou, která můžeme považovat za přechodné dipóly. Přestože mají časově omezenou životnost, umožňují, aby docházelo k van der Waalsovským interakcím mezi místy, kde přechodně vzniká elektronový deficit s místy, kde je elektronová hustota krátkodobě zvýšena.
• Při interakcích léčiv s vazebnými místy cílové struktury hraje často velkou roli přítomnost alkylových a arylových skupin, které propůjčují molekule léčiva určitý hydrofobní charakter. Hnací silou hydrofobních interakcí
těchto skupin s „hydrofobními kapsami“, paralelně orientovanými planárními aromatickými skupinami cílové
struktury apod. jsou jednak van der Waalsovy síly, jednak entropické změny v systému vyvolané změnami
struktury vody v okolí hydrofobních skupin. Kapalná voda není zcela homogenní, ale jsou v ní místa se zvýšenou
uspořádaností. V okolí hydrofobních skupin je těchto uspořádaných míst více než v jiných místech objemu vody.
Přesný fyzikální popis změn struktury vody při hydrofobních interakcích by byl velmi složitý. Velmi zjednodušeně si místa se zvýšenou uspořádaností struktury můžeme představit jako mikroskopické „ledovečky“. Dojde-li
k interakci, pak celkový počet „ledovečků“ v systému klesne, protože se do prostoru v okolí interagujících skupin nevejdou. Část jich proto musí „roztát“. Tím se zvýší neuspořádanost systému, takže entropie vzroste. Hydrofobní interakce mezi aromatickým kruhem molekuly adrenalinu a fenylovým zbytkem fenylalaninu 290 je třetím typem interakcí, které se spolupodílejí na již zmíněné vazbě adrenalinu na adrenergní receptor.
• Většina léčiv se váže na cílové struktury nekovalentními vazbami. Jsou však známa i některá léčiva, která se
mohou na svoji cílovou strukturu vázat kovalentně. Patří mezi ně např. alkylační cytostatika, která mohou zablokovat buněčné dělení tím, že vytvoří irreversibilní kovalentní vazbu mezi zbytkem léčiva a nukleofilními
skupinami guaninu z molekuly DNA a tím znemožní transkripci a translaci genů.
Cílovými strukturami léčiv mohou být:
► Enzymy, které katalyzují metabolické přeměny v organismu. těle. Léčiva, jejichž cílovou
strukturou jsou enzymy, působí tak, že buď enzymy inhibují nebo naopak aktivují
Enzymy působí tak, že se do jejich aktivního místa naváže substrát, který je pak reakcí katalyzovanou enzymem přeměněn na produkt. Ten je z aktivního místa uvolněn. Při vazbě substrátu do aktivního místě se
uplatňují různé typy nekovalentních interakcí, jako jsou iontové nebo vodíkové vazby, interakce dipól-dipól
nebo van der Waalsovy síly. Aby enzymová reakce mohla proběhnout musí charakter aktivního místa umožnit dostatečně pevnou vazbu substrátu, avšak poměrně slabou vazbu produktu. Jinak by aktivní místo zůstalo
zablokované produktem. Aktivní místo nemusí mít vždy ideální tvar pro substrát, při interakci se substrátem
často dochází k indukované konformační změně. Při ní se tvar aktivního místa změní tak, aby nekovalentní
vazebné síly byly maximální měrou využity pro vazbu substrátu.
7
Æ
Kompetitivní inhibitory soutěží s přirozeným substrátem o aktivní místo enzymu.
Čím větší je koncentrace inhibitoru, tím více aktivních míst je obsazeno a tím menší množství substrátu
se může přeměnit. Naopak, čím větší je koncentrace substrátu, tím více se jej přemění na produkt.
Æ
Nekompetivní inhibitory se neváží v aktivním místě, ale na jiném místě enzymové molekuly, tzv. alosterickém místě.
Při vazbě nekompetivního inhibitoru do alosterického místa dochází ke změně tvaru celé molekuly enzymu, tedy i aktivního místa. Substrát pak je vázán slaběji nebo nemůže být navázán vůbec.
Kompetitivní i nekompetitivní inhibitory mohou být reversibilní nebo irreversibilní.
Reversibilní inhibitory jsou vázány poměrně slabě, takže mohou být z vazby na enzym vytěsněny přirozeným substrátem. Vazba irreversibilních inhibitorů je naopak velmi pevná, často kovalentní. Blokují aktivitu enzymu trvale, protože nemohou být z vazebného místa vytěsněny.
Æ
Aktivátory enzymů jsou látky, které naopak reakci enzymu se substrátem podporují
Aktivátory působí tak, že zlepšují podmínky pro přeměnu substrátu na produkt tím, že příznivě ovlivňují
prostorové uspořádání aktivního centra enzymu. Dochází k tomu zpravidla při vazbě aktivátoru do alosterického centra molekuly enzymu. Podobně jako inhibitory, mohou i aktivátory enzymů být reversibilní
nebo irreversibilní. Aktivace může být i nepřímá, prostřednictvím jiných enzymů. Ty mohou aktivovat
první enzym buď kovalentním navázáním vhodné skupiny, nejčastěji fosfátové (proteinkinasy) do alosterického centra nebo naopak odštěpením části molekuly, jejíž přítomnost průběh enzymatické reakce blokuje (patří sem např. přeměna neaktivních zymogenů na aktivní enzym, např. trypsinogenu na trypsin.
► Receptory. Jsou to bílkovinné útvary na povrchu nebo i uvnitř buněk, jejichž prostřednic-
tvím jsou buněčné funkce řízeny signály z vnějšího prostředí prostřednictvím signálních
molekul, tzv. chemických poslů, neurotransmitérů nebo hormonů. Přenos signálů může být
endokrinní (prostřednictvím hormonů sekretovaných endokrinními žlázami a transportovaných krevním oběhem k cílovým buňkám), parakrinní (uvnitř tkáně), kontaktní nebo synaptický (mezi dvěma zakončeními nervových buněk)
Při navázání signální molekuly změní receptor svůj tvar a tím umožní předání signálu buňce. Látky, které s receptorem interagují stejně jako přirozená signální molekula se nazývají agonisté. Antagonisté jsou látky, které
se na receptor sice mohou navázat, přitom jej však neaktivují, ale naopak zablokují a tím zablokují i přirozený
přenos signálu. Některá léčiva mohou ovlivňovat více typů nebo podtypů receptorů, což pak může být příčinou
vedlejších účinků těchto léčiv (např. antagonista jednoho receptoru může být agonistou druhého).
Receptory na povrchu buněk přenášející signály z vnějšího prostředí dovnitř buněk jsou trojího typu. Jsou to:
Æ iontové kanály otevírané ligandem (mediátorově ovládané iontové kanály) - regulují průchod iontů (Na+, K+, Ca2+, Cl-) buněčnou membránou.
Řada procesů v buňce je ovlivňována koncentrací iontů. Ionty nemohou normálně procházet buněčnou membránou. Ta je tvořena lipidickou dvojvrstvou a vytváří tak pro polární látky nepropustnou bariéru. K tomu,
aby se ionty dostaly do buňky nebo z ní ven slouží iontové kanály. Jsou to jakési "tunely" tvořené soustavou
bílkovin procházejících napříč buněčnou membránou. Nemohou být trvale otevřeny, protože průchod iontů
do buňky a zpět by byl nekontrolovatelný. V buňce by byly jen ty ionty, které jsou v jejím okolí a stejné by
byly i koncentrace iontů vnitř a vně buňky. Normálně jsou proto iontové kanály zavřené a otevírají se, až k
tomu dostanou signál. Ten jim zajistí „nasednutí“ určité řídící látky na receptorové místo jedné z bílkovin
iontového kanálu. Bílkovina přitom změní konformaci. Tím zahájí dominovým efektem změnu konformace
dalších bílkovin, iontový kanál se otevře a ionty mohou procházet buněčnou stěnou. Některá léčiva mohou
ovlivňovat funkce iontových kanálů. Příkladem mohou být "Ca blokátory" - léky snižující krevní tlak tím, že
blokují iontové kanály pro vápenaté ionty
Æ
receptory spojené s G-proteiny – zprostředkují přenos signálu z vnějšku do vnitřku buňky.
Aktivace těchto receptorů extracelulárními přenašeči signálů (obvykle to jsou hormony), vyvolává tvorbu
"druhých poslů", tj. molekul cAMP, IP3, DG apod., které přenáší různé signály uvnitř buňky. Jsou tvořeny
bílkovinou, která prochází buněčnou membránou. Vazebné místo pro ligand mají na extracelulární straně, uvnitř
buňky mají vazebné místo pro tzv. G-protein. Přenos signálu do buňky má dosti složitý mechanismus. Po nasednutí signalizační molekuly na extracelulární část receptoru se změní konformace bílkoviny a na intracelulární
straně se otevře receptor pro G-protein. G-protein je složen ze tří podjednotek a obsahuje GDP. Při navázání na
otevřený vnitrobuněčný receptor se změní charakter vazebného místa G-proteinu pro GDP. GDP se pak uvolní a
místo něho se nyní do vazebného místa G-proteinu naváže GTP. Tím se destabilizuje struktura G-proteinu, který
se rozpadne. Podjednotka α s navázaným GTP se uvolní a putuje buněčnou membránou, až se dostane k dalšímu
8
enzymu, adenylátcyklase a naváže se na něj. Přitom se změní struktura adenylátcyklasy a zpřístupní se její vazebné místo. V tom pak probíhá přeměna molekuly ATP na cAMP, vnitrobuněčnou signalizační molekulu, která
v buňce spouští kaskádu různých aktivačních reakcí. Po zpřístupnění vazebného místa pro ATP katalyzuje adenylátcyklasa přeměnu více molekul ATP na cAMP, čímž se signál uvnitř buňky zesiluje. Existují však i jiné typy G-proteinů: Gi protein, jehož podjednotka α naopak adenylátcyklasu deaktivuje nebo G-protein, který aktivuje fosfolipasu C. Ta štěpí fosfatidylinositoldifosfát na inositoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DG), které spouští
jiné signalizační dráhy v buňce. cAMP zprostředkovává v buňce přenos signálů řady nízkomolekulárních látek a
peptidických hormonů, jako je adrenalin, histidin, kortikotropin (ACTH), FSH a další, IP3 a DG se podílejí na
přenosu signálů od zprostředkovaných noradrenalinem nebo vasopressinem.
Æ
receptory s tyrosinkinasovou aktivitou
Tyto receptory-enzymy prochází buněčnou membránou. Na extracelulární straně je receptorové místo, uvnitř
buňky aktivní místo enzymu. Po navázání ligandu do receptorového místa se změní struktura receptoru a otevře
se aktivní místo enzymu a enzym začne katalyzovat fosforylaci intracelulárních bílkovin.Ligandy tyrosinkinasových receptorů jsou opět peptidické hormony (insulin), růstové faktory a cytokiny. V poslední době je v protinádorové terapii věnována velká pozornost receptorům pro epidermální růstový faktor (EGF). EGF aktivuje
prostřednictvím tyrosinkinasy svého receptoru celou řadu buněčných bílkovin, což vede k růstu a dělení buněk.
Ukázalo se, že při řadě nádorových onemocnění může docházet k fúzi některých genů, což pak způsobí, že tyrosinkinasa receptoru pro EGF je mimořádně aktivní. To má za následek rychlý růst nádorových buněk. Látky inhibující tyrosinkinasovou aktivitu receptoru pro EGF jsou proto potenciálně velmi zajímavými protinádorovými
léčivy. První z nich, imatinib (Glivec, Novartis), byl úspěšně zaveden do klinické praxe pro léčení chronické
myeloidní leukemie, další (gefinitib - Iressa, AstraZeneca a erlotinib - Tarceva, OSI Pharma) jsou v konečné
fázi klinického zkoušení.
intracelulární receptory - interagují se jako jsou steroidy, hormony štítné žlázy a retinoidy.
Tyto přenašeče signálu jsou lipofilní, takže mohou proniknout membránou do buňky.
Příkladem jsou estrogenní receptory v buňkách některých tkání, jako je prs nebo děloha. Vyskytují se tam ve
formě komplexu s jiným proteinem. Když dojde k interakci receptoru s ženským pohlavním hormonem estrogenem, komplex se rozštěpí. Uvolněný receptor s navázaným estrogenem pak může v buněčném jádře interagovat s aktivátory procesu transkripce genů regulujících růst a dělení buněk. To má velký význam pro vývoj organismu, estrogeny však aktivují i růst buněk některých nádorů prsu. Látky blokující estrogenní receptory (tamoxifen, toremifen) jsou proto používány jako protinádorová léčiva.
► Bílkovinné přenašeče (transportéry). Jsou to bílkoviny s lipofilním povrchem a hydrofilní duti-
nou. Do té mohou uzavřít hydrofilní látky a pak díky svému lipofilnímu povrchu procházet buněčnou membránu. S jejich pomocí se do buněk dostávají např. aminokyseliny nebo nukleotidy, ale i
některé signální molekuly jako jsou neurotransmitéry adrenalin (epinefrin) nebo dopamin.
Některá látky mohou dutiny přenašečů zablokovat, takže normálně transportovaná látka se do buňky nedostane.
Patří mezi ně některá léčiva onemocnění centrálního nervového systému, např. tricyklická antidepresiva, ale i
drogy. Jestliže např. přenašeč adrenalinu obsadí amfetamin, pak na povrchu nervových buněk je adrenalinu přebytek, protože nemůže být "stažen" zpět do buňky. Přebytečný adrenalin aktivuje více receptorů než normálně,
což zvyšuje adrenergní aktivitu organismu. Jiná léčiva bílkovinné přenašeče neblokují, ale využívají jako "černí
pasažéři" k proniknutí do buněk (např. antiparkinsonikum DOPA se tak dostává do buněk místo dopaminu).
Existuje i druhá skupina bílkovinných přenašečů, které naopak transportují některé látky ven
z buněk proti koncentračnímu gradientu.
Jsou to tzv. ABC přenašeče (ATP-Binding Cassette transporter), které získávají energii pro transport z molekul
ATP. Hrají důležitou úlohu při mnohočetné lékové rezistenci (MDR, MultiDrug Resistance), která se může vyvinout u některých nádorů a zapříčiňuje selhání chemoterapie. Patří mezi ně např. MRP1 (Multidrug Resistance Protein 1), BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) nebo P-gp1 (P-glycoprotein 1). Látky blokující aktivitu ABC
přenašečů mohou přispět ke zvýšení účinnosti chemoterapie nádorových onemocnění a jsou proto v poslední době
intenzivně studovány. Patří mezi ně např. deriváty cyklosporinu, léčiva používaného při transplantacích, nebo kardiovaskulárního léčiva verapamilu. Mechanismus jejich účinku zatím není dostatečně prozkoumán, některé z těchto
látek ovlivňují hladinu glutathionu, který se na transportu léčiv z buněk podílí.
► Strukturní bílkoviny jsou bílkoviny vytvářející vnější a vnitřní strukturu buněk a tkání. Patří
mezi ně např. kolagen a keratin. Obvykle nejsou cílem působení léčiv, výjimkou je tubulin
Tubulin je bílkovina, která uvnitř buňky polymeruje za vzniku miniaturních trubiček - mikrotubulů. Ty jsou
zodpovědné za integritu buněk a mobilitu struktur v buňkách - např. při dělení buněk vytváří "mitotické vřetánko" které se primárně podílí na rozdělení chromosomů a následně na dělení buněk. Po rozdělení buňky mikrotubuly depolymerují. Zablokování polymerace tubulinu (alkaloidy Vinca) nebo depolymerace mikrotubulů (paklitaxel) blokuje dělení buněk. Léky působící na mikrotubuly se proto používají v protinádorové terapii.
9
► Nukleové kyseliny. Jsou důležitou cílovou strukturou zejména pro řadu protinádorových léčiv.
Patří mezi ně řada léčiv, které na nukleové kyseliny působí různými mechanismy. Jsou to:
Látky síťující DNA - sesítěním je narušena normální funkce DNA a tedy i dělení buněk.
Mezi látky síťující DNA patří řada protinádorových léčiv. Jsou to v prvé řadě bifunkční nebo i vícefunkční alkylační činidla. Působí tak, že alkylují báze DNA, nejčastěji reagují s dusíkem v poloze 7 guaninu. Přitom dochází
k propojení řetězců dvojité spirály DNA, a to buď uvnitř jednoho řetězce nukleotidů (intrastrand cross-linking)
nebo k propojení bazí mezi dvěma řetězci (interstrand cross-linking). Podobným mechanismem působí platinová
cytostatika, která však nepropojují báze DNA kovalentní, ale koordinační vazbou s atomem platiny. U bifunkčních alkylujících látek dochází spíše k propojení bazí komplementárních řetězců, platinové deriváty reagují
přednostně se sousedícími guaninovými zbytky jednoho řetězce.
Interkalační látky - "vmezeřují" se mezi páry bazí v řetězcích DNA.
Interkalační látky mají planární molekulu, jinak by nemohly proniknout mezi spárované báze a jsou zpravidla
poměrně hydrofobní. Mají antimikrobní a protinádorové účinky, což je vysvětlováno tím, že brání působení enzymu topoisomerasy II, enzymu, který řídí prostorové uspořádání DNA. Patří mezi ně např. anthracyklinová protinádorová antibiotika, jako je široce používaný doxorubicin.
Mezi interkalační látky lze řadit i planární sloučeniny interagující s „G-kvadruplety“ na konci telomer.
Telomery jsou zvláštní struktury na konci chromosomů, které obsahují mnohonásobně se opakující sekvence
nukleotidů bohaté na guanin. Při každém buněčném dělení se konce telomer zkracují, zkrácení pod minimální
délku dává signál k buněčné smrti – apoptose. Telomery tak působí tak jako určité biologické hodiny. Zárodečné
a nádorové buňky obsahují aktivní formu enzymu telomerasy, který koncové struktury telomer prodlužuje, takže
ke zkrácení nedochází. V normálních buňkách dospělého organismu je telomerasa inaktivní. Předpokládá se proto, že inhibice telomerasy by mohla zastavit dělení nádorových buněk a inhibitory telomerasy jsou proto intenzivně studovány jako potenciální protinádorové léky. Účinek telomerasy lze však zablokovat i jiným mechanismem. Oligonukleotidové sekvence bohaté na guanin vytváří na konci telomer zvláštní struktury se čtyřmi paralelními řetězci oligonukleotidů, tzv. G-kvadruplety. Tyto struktury je třeba rozrušit, aby telomerasa mohla řetězce prodloužit. Potenciálním protinádorovými léčivy proto mohou být i takové látky, které G-kvadruplety pomáhají vytvářet nebo tyto struktury stabilizují. Podobně jako běžné interkalátory mají tyto látky planární strukturu a
blokují činnost topoisomerasy II, planární část jejich molekuly je však rozsáhlejší a s kvadruplexy interagují silněji než se zdvojenými řetězci standardní DNA.
Látky přerušující řetězce DNA se váží do malého žlábku dvojité spirály DNA, kde štěpí řetězec nukleotidů, obvykle za vzniku radikálů.
Do této skupiny patří endiiny, zajímavá skupina látek produkovaných mikroorganisny, která má výrazný protinádorový účinek (kalicheamycin, neokarzinostatin). V poslední době jsou zástupci této skupiny se zajímavou
strukturou intenzivně studovány, zatím však nejsou používány jako léčiva pro malou účinnost vůči běžným solidním nádorům a nepříznivé vedlejší účinky. Jejich endiinové seskupení cykloaromatizuje na aromatický biradikál, který se stabilizuje odstštěpením dvou vodíků z DNA. Přitom vzniká biradikál v molekule DNA, jehož reakce s kyslíkem vede k rozštěpení nukleotidového řetězce
Komplementární („antisense“) oligonukleotidy jsou řetězce nukleotidů vytvářející sekvenci,
která odpovídá sekvenci ve vybraném úseku m-RNA a může se tedy na něj vázat na základě
párování bází. Tím je zablokován přepis m-RNA do bílkoviny.
Komplementární oligonukleotidy nabízí vysoce specifický účinek v přerušení exprese některých genů (např.
"onkogenů") na jejich bílkovinné produkty. Studovány jsou již od 70. let, jejich využití v terapii však naráží na
řadu problémů se stabilitou a přípravou, které jsou postupně řešeny. Do klinického zkoušení se dostaly první
komplementární oligonukleotidy až v poslední době.
Za specifický druh komplementárních oligonukleotidů lze považovat i malé interferující ribonukleové kyseliny,
siRNA. Jsou to krátké zdvojené řetězce RNA s 21-25 nukleotidy, které mohou způsobit „postranslační umlčení
genů, tj. zablokovat přepis mRNA na odpovídající bílkovinný produkt. Působí tak, že asociují s nukleasovým
komplexem nazvaným RISC (RNA-induced silencing complex) a tím jej nasměrují k m-RNA se strukturou
komplementární k siRNA. RISC potom část m-RNA komplementární k siRNA rozštěpí. Zbytek molekuly se tak
stane vysoce náchylný k další degradaci. Studium siRNA se stalo jedním z nejžhavějších aktuálních témat molekulární biologie, výzkum v této oblasti však zatím je jen na samém počátku. Přesto se už objevují projekty zaměřené na potenciál siRNA v léčbě virových a nádorových onemocnění, genové terapii apod.
Látky inreagující s ribosomální RNA - blokují biosyntézu bílkovin v ribosomech.
Ribosomální RNA je cílovou strukturou účinku některých antibiotik, jako je streptomycin, tetracykliny nebo
chloramfenikol. Působí tak, že inhibují pohyb ribosomu podél mRNA a inhibují přenos rostoucího polypeptidového řetězce z jednoho zbytku tRNA na druhý.
10
► Lipidy jsou základní složkou buněčných membrán. Membrány jsou tvořeny dvěma vrstvami
fosfolipidů uspořádanými tak, že na vnějším povrchu jsou skupiny hydrofilní, zatímco uvnitř
dvojvrstvy jsou hydrofobní skupiny. Dvojvrstva fosfolipidů představuje bariéru mezi vnějším
a vnitřním prostředím buňky, která brání průchodu vody, iontů a polárních molekul a umožňuje, aby koncentrace těchto látek uvnitř a vně buněk byla odlišná.
Předpokládá se, že mnohá anestetika působí tak, že zvyšují fluiditu buněčných membrán a tím narušují přenos
signálů, především nervového vzruchu. Některá antibiotika a antimykotika vytváří spirálové struktury procházející buněčnou membránou. Ty pak fungují jako kanálky pro průchod iontů a polárních molekul membránou. Jiná
antibiotika slouží jako přenašeče iontů přes buněčnou membránu. Vankomycin - antibiotikum používané jako
poslední šance v těch případech, kdy jiná antibiotika selhávají, atakuje bakteriální přenašeče lipidů (přesněji stavebních bloků buněčných membrán sestávajících z lipidické, disacharidické a peptidické složky). Tím blokuje
výstavbu buněčných stěn rezistentních bakterií nezbytnou pro jejich růst a množení.
► Sacharidy (glykokonjugáty) na povrchu buněk. Konjugáty sacharidů s proteiny nebo lipidy
zakotvené v buněčné membráně mají velký význam pro rozpoznávání a komunikaci buněk.
Jsou rovněž důležité pro vzájemnou adhezi buněk mezi sebou v tkáních.
Na povrchu nádorových buněk jsou některé specifické glykoproteiny, které se nazývají nádorové antigeny. Protilátky proti těmto antigenům mohou být využity k přípravě tzv. cíleně směrovaných protinádorových léčiv. Konjugát
léčiva s protilátkou zařídí, aby léčivo bylo přivedeno přímo k nádorové buňce. Protilátky proti nádorovým antigenům mají určitý potenciál i jako protinádorové vakciny, v posledních letech dokonce připravených synteticky. Glykoproteiny povrchu buněčných stěn hrají velkou roli i v mechanismech virové nebo bakteriální infekce. Virus nebo
bakterie rozpoznají určitou glykoproteinovou strukturu na povrchu hostitelské buňky, adherují k ní a tím nastartují
proces infekce. Zablokování procesu rozpoznání nebo adheze může zabránit infekci. V poslední době se tímto směrem ubírá např. výzkum nových léků proti HIV. Látky, které blokující interakce tzv. selektinů, glykoproteinů buněčných membrán cévní výstelky, s povrchovými sacharidy bílých krvinek, mohou být novými protizánětlivými léky, jiné látky interagující s glykoproteiny zprostředkujícími buněčnou adhezi mohou být použity jako léky proti
nadměrné srážlivosti krve nebo i nové antikoncepční přípravky. Interakce glykokonjugátů povrchu buněk hrají velkou roli i při alergických a autoimunitních onemocněních.
Mezi cílovými strukturami mohou být malé, ale pro účinnost léků významné rozdíly. Stejné individuální rozdíly mohou být i mezi enzymy, které ovlivňují farmakokinetické vlastnosti léků,
především mechanismy jejich odbourávání a eliminace z organismu (viz dále). Tyto rozdíly jsou
způsobeny variabilitou genů, které enzymy, receptory a další buněčné struktury kódují. Individuální rozdíly ve struktuře genů kódujících stejný bílkovinný produkt jsou nazývány genový polymorfismus (pozor – nezaměňovat s polymorfií léčiv). Polymorfismus genů je způsoben zděděnými nebo nově vzniklými mutacemi.
V mnoha případech jde o rozdíly způsobené „bodovými mutacemi“, změnami jediné nukleotidu. U bílkoviny kódované
takto mutovaným genem se to projeví záměnou jedné aminokyseliny. V takovém případě hovoříme o jednonukleotidovém
polymorfismu (Single Nucleotide Polymorphism, zkratka SNP). Změněná bílkovina (enzym, receptor, strukturní bílkovina) přitom může zůstat funkční, ale v její funkci se mohou projevit rozdíly (např. enzymová reakce se zpomalí). To pak je
příčinou, proč některá léčiva někdy nepůsobí na některé pacienty tak, jak by měla, nebo jejich podání může dokonce některé pacienty ohrozit na zdraví. Rostoucí znalosti molekulární biologie umožňují definovat a zjišťovat stále více takových
individuálních rozdílů genomu pacientů a tato zjištění se začínají využívat v terapii.
Počet již nyní prováděných genetických vyšetření roste, testy umožňující zjišťování SNP budou
brzy zavedeny do biochemické diagnostiky. Očekává se, že široké uplatnění genové diagnostiky
se stane základem tzv. individualizované terapie, podávání léků "na míru". Ta je v zásadě možná již nyní, do běžné terapeutické praxe by měla být kolem zavedená roku 2020.
Farmakokinetika
Mnoho látek, které při zkouškách in vitro mají vynikající účinnost, tj. velmi dobře interagují se svojí cílovou strukturou, se nikdy nestane používaným léčivem. Je to proto, že účinné léčivo musí být pacientovi podáno, dostat se v dostatečné koncentraci do krevního oběhu a doputovat s krví k cílové struktuře, na níž působí.
Zatímco farmakodynamika studuje působení léčiva na organismus, o farmakokinetice lze říci, že
se zabývá působením organismu na léčivo, tj. osudem léčiva v organismu od podání k interakci s
cílovou strukturou. Farmakokinetika proto studuje u léčiv především tyto 4 faktory: absorpci, distribuci v organismu, metabolismus a vylučování z organismu, exkreci (ADME)
11
Většina léčiv se dostává k místu působení krevním oběhem. Přímé podání léčiva do krevního oběhu formou jednorázové injekce nebo pomalé podání infuzí je však nepohodlné, velmi často vyžaduje asistenci a v případě infuze i pobyt
pacienta na lůžku. Přednost je proto dávána neinvazivním způsobům podání, především orálnímu (tablety, kapsle),
popř. podání přes sliznice (čípky, nosní kapky, spreje a inhalační roztoky) resp. přes kůži (masti, krémy, tinktury,
léčivé náplasti).
Při těchto neinvazivních způsobech podání vystupuje do popředí absorpce léčiva.
Většina orálně podaných léčiv je absorbována v zažívacím traktu. Aby se dostala do krevního oběhu musí projít střevní sliznicí. Látky s velmi malou molekulovou hmotností (nanejvýš 200) se mohou přitom „protlačit“ mezi buňkami,
většina však musí proniknout do buněk lemujících střevní stěnu a odtud do krevních kapilár.
Léčivo přitom musí opakovaně pronikat buněčnými membránami tvořenými fosfolipidickou dvouvrstvou, která brání
průchodu polárních látek. Pomineme-li možnost průniku molekuly léčiva přes buněčnou membránu pomocí transportních
bílkovin, popř. jiným mechanismem (pinocytosa), pak tato molekula musí mít dobře vyváženou polaritu – musí být natolik polární, aby léčivo bylo dostatečně rozpustné ve vodném prostředí, současně však tak hydrofobní, aby se ve vnitřní lipidické části dvouvrstvy buněčné membrány „rozpouštělo“ a mohlo tak membránou proniknout. Vyváženost hydrofilnosti a hydrofobnosti léčiva je proto klíčovým parametrem ovlivňujícím absorpci. Jako obecné pravidlo přitom platí, že
by léčivo nemělo mít molekulovou hmotnost větší než 500 (látky s větší molekulou obsahují zpravidla větší počet polárních skupin), nemělo by mít více než 5 skupin, které jsou při tvorbě vodíkových můstků donory a ne více než 10 skupin,
které jsou akceptory. Polární léčiva, která tyto podmínky nesplňují, musí obvykle být podávána injekčně.
Jakmile léčivo pronikne do krevního oběhu, dochází k jeho distribuci v organismu.
Distribuce v krevním oběhu následuje prakticky okamžitě poté, co léčivo do něho pronikne. Přesto však léčivo nemusí
být v organismu rozloženo rovnoměrně, protože některé orgány jsou krví více zásobeny než jiné. Při distribuci léčiva
krevním oběhem hraje významnou roli i skutečnost, že některá léčiva se mohou reversibilně absorbovat na plasmatické
bílkoviny krve (albumin) i na různé další látky V krvi se pak ustaví rovnováha mezi absorbovaným a volným léčivem.
Účinná koncentrace volného léčiva v krvi je přitom snížena a do tkání a buněk ho může proniknout méně. Póry ve stěnách krevních kapilár proniká léčivo poměrně rychle z krevního oběhu do tkání. Od krevních kapilár ve většině tkání se
liší kapiláry zásobující krví mozek. Ty jsou tvořeny velice těsně uspořádanými buňkami, které nemají póry. Navíc jsou
lemovány buňkami s povrchem se zvýšenou lipofilitou, takže mnohá polární léčiva do mozkové tkáně nemohou vůbec
proniknout. Tato tzv.hematoencefalická bariéra chrání mozkovou tkáň před nežádoucími účinky některých léčiv a dalších
látek. Překonat ji mohou jen léčiva využívající transportní proteiny nebo speciálně navržená léčiva, která ve své molekule
mají minimum polárních skupin. Naproti tomu jiná přirozená tkáňová bariéra organismu, placentální bariéra oddělující
krev matky od krve plodu, musí být poměrně propustná, protože musí zajistit přísun živin k buňkám rostoucího embrya,
tak i odvod jejich rozkladných produktů. Léčiva proto touto bariérou pronikají velmi snadno, např. koncentrace barbiturátů v krvi matky a plodu je pak prakticky stejná. Stejně snadno proniká placentální bariérou alkohol, nikotin nebo drogy,
které mohou embryo s nevyvinutými detoxifikačními mechanismy značně poškodit.
Pokud léčivo nepůsobí na povrchové struktury buněk (receptory apod.), ale až uvnitř buňky, pak o jeho charakteru platí to,
co bylo řečeno v souvislosti s absorpcí léčiva. Aby se mohlo přes buněčnou membránu tvořenou fosfolipidickou dvouvrstvu
dostat ke svým cílovým strukturám v buňce musí mít vyvážený poměr mezi hydrofilitou a lipofilitou. U některých silně
polárních léčiv se k průniku do buněk musí využít určitý trik: Na polární skupiny se naváží lipofilní substituenty. Tím
vzniknou "proléčiva" neboli "profarmaka" (prodrug), prekurzory léčiv které již do buňky proniknout mohou. Sama o
sobě jsou proléčiva neúčinná, působením buněčných enzymů se z nich však uvnitř buňky uvolní účinné polární léčivo.
Příkladem mohou být fosfonátová analoga nukleotidů adefovir a tenofovir, léčiva proti hepatitidě B a AIDS vyvinutá dr.
Holým na ÚOChB AV ČR. Ta sama jsou příliš hydrofilní, proto se aplikují jako estery pivaloyloxymethanolu nebo isopropyloxymethanolu, které se v buňkách hydrolyticky rozštěpí na účinné látky.
Léčivo může v organismu podléhat různým metabolickým přeměnám katalyzovaných enzymy. S
některými enzymy přichází léčiva do styku již v zažívacím traktu nebo krevním oběhu.
Má-li léčivo dospět ke své cílové struktuře, musí jejich působení pokud možná odolávat. Metabolické přeměny v cílových
tkáních jsou důležité pro účinnost léčiv, která mají sama o sobě charakter profarmak..
Další metabolické přeměny jsou důležité pro exkreci, odstraňování léčiva z organismu.
Léčiva mohou být z organismu vylučována v nezměněné formě, častěji jsou však exkretovány jejich metabolity.. Z
enzymů různých tkání hrají v metabolismu léčiv klíčovou roli jaterní enzymy katalyzující reakce zvyšující polaritu molekul
léčiva. To exkreci usnadňuje, protože polárnější látky jsou vylučovány snáze než látky méně polární.
Metabolické reakce probíhající v játrech jsou někdy klasifikovány jak reakce fáze I a fáze II. Mezi
reakce fáze I patří především oxidativní přeměny léčiv a hydrolýza amidů a esterů, řazeny do této
skupiny jsou i redukce nitro a azosloučenin a reduktivní dehalogenace.
Oxidativní reakce jsou katalyzovány skupinou jaterních enzymů nazývaných cytochromy P 450. Jsou to červené
hemoproteiny obsahující porfyrinový kruh s centrálním atomem železa, které byly pojmenovány podle vlnové délky
jejich absorpčního pásu. Je známo nejméně 12 tříd těchto enzymů. Jejich primární úlohou je odstraňovat z organismu
12
škodlivé látky. Substrátem mohou být vedle léčiv i toxické látky obsažené v potravě nebo i chemikálie z životního
prostředí. Cytochromy jsou schopné oxidovat methylové skupiny na primární alkoholy, demethylovat aminy, oxidovat
aromatické uhlovodíky na fenoly a látky s dvojnými vazbami na epoxidy. Jejich role nemusí však být pouze pozitivní,
cytochromy např. oxidují polycyklické aromatické uhlovodíky na látky, které mohou iniciovat nádorové bujení. Velká
variabilita cytochromů P450 vede k tomu, že jejich aktivita je vysoce individuální. Metabolismus léčiv se u jednotlivých pacientů často značně liší. U někoho je léčivo oxidováno a dále odbouráváno velmi rychle, takže jeho hladina je
nízká a k dosažení potřebného účinku je třeba podat vyšší dávky nebo dokonce jiný lék. U jiného pacienta může být
naopak odbourávání značně zpomaleno, hladina léčiva v jeho organismu je proto vysoká a i malá dávka stačí k vysoké
účinnosti. Přitom se však zvyšuje i riziko nežádoucích vedlejších účinků. Účinnost různých cytochromů P 450 není
dána jen individuálními rozdíly, mohou ji ovlivňovat i některá léčiva. Tak např. fenobarbitáty aktivitu cytochromů
zvyšují, zatímco např. léčiva proti žaludečním vředům ji snižují. To pak znamená, že při současném podání více léčiv
může být jejich hladina odlišná od toho, když se lék podá samostatně. Takové lékové interakce proto mohou u léků s
úzkým terapeutickým intervalem (jako např. warfarin) vést k předávkování. Chemici zabývající se výzkumem léčiv se
proto snaží, aby nová léčiva aktivitu cytochromů P 450 výrazněji neovlivňovala. Vedle syntetických léčiv mají na
aktivitu cytochromů vliv i látky obsažené v některých léčivých bylinách (např. třezalce) nebo potravinách (např. růžičkové kapustě nebo šťávě grapefruitu).
Reakce fáze II zahrnují enzymově katalyzovaný vznik konjugátů léčiva.
Jde např. o vznik látek s navázanou kyselinou glukuronovou, kde se cukerná složka napojuje na hydroxylové nebo
aminové skupiny. Některé steroidy vytváří sulfáty, epoxidy nebo halogenderiváty reagují s cysteinovým zbytkem
tripeptidu glutathionu za vzniku derivátů merkapturové kyseliny.
Po játrech jsou nejdůležitějším orgánem pro exkreci léčiv ledviny. Léčiva a jejich metabolity však
mohou být z organismu vylučovány i přes pokožku nebo sliznice (potem, slinami, slzami), plícemi
(dechem), žlučové cesty (stolicí), ale i přes mléčné žlázy.
V ledvinách se krev obsahující léčiva a jejich metabolity dostává z přívodní tepny do uzlíků kapilár nazývaných glomeruly, které zapadají do kanálků nazývaných nefrony. Krev je v glomerulách pod tlakem, který působí tak, že je
ultrafiltrována. Přitom krvinky, ale i vysokomolekulární složky krve krevními kapilárami neprochází, zatímco nízkomolekulární látky, tedy i běžná léčiva a jejich metabolity ano. Protože jde o proces ultrafiltrace, nezávisí průstup látek
stěnou kapilár výrazněji na jejich polárním nebo nepolárním charakteru. Nefron je však obklopen hustou sítí vlásečnic, jejichž stěnami mohou být exkretované látky reabsorbovány a dostávají se do žilní krve. Zde již polarita látek
hraje důležitou roli. Přeměny vedoucí k produktům se zvýšenou polaritou proto mají za následek, že k reabsorpci
metabolitů léčiva buď nedochází nebo je tato reabsorpce silně potlačena.
Přes pokožku může být potem exkretováno až 10-15% léčiva. Plicní exkrece je důležitá pro eliminaci plynů podávaných anestezí, přes plíce jsou exkretovány i některé těkavé metabolity léčiv. Mnoho metabolitů vznikajících v játrech
přechází do žlučových cest, odkud se dostávají do zažívacího traktu. Část pak je v tenkém střevě reabsorbována,
zbytek přechází do stolice. Stolicí jsou exkretovány i ty podíly léčiva, které zůstaly při perorálním podání neabsorbovány. Možnost exkrece léčiv v mateřském mléce není ani tak významná z hlediska farmakinetiky jako ochrany zdraví kojence, protože vylučovaná léčiva a jejich metabolity mohou na nezralý organismus působit toxicky. Přes mléčné
žlázy může být vylučován i alkohol, nikotin a další drogy.
13
FARMAKOCHEMIE 2
Základní (vodítková) struktura léčiva a farmakofor
Při návrhu nového léčiva je výchozím bodem látka sloužící jako vodítko (lead compound), sloučenina, o níž víme, že je schopná interakce s cílovou strukturou a že tato interakce vyvolává určitou biologickou odezvu, která nás zajímá.
Sloučenina, kterou slouží jako vodítko, nemusí sama mít ani příliš velkou nebo specifickou (tj. bez vedlejších účinků) biologickou odezvu, protože se v terapii nemusí vůbec použít. Jde o pouze látku stojící na startovní čáře vývoje.
Může to být látka připravená syntézou nebo izolovaná z různých přírodních zdrojů (rostliny, živočichové, mikroorganismy, v poslední době velmi často i mořská flora a fauna), popř. to může být i již používané léčivo, k němuž má
být připraven analog s vyšší účinností, nižšími vedlejšími účinky, jinými výhodnými vlastnostmi nebo jen látka s
stejnou účinností, ale zatím patentově nechráněná. Někdy dokonce může být "vodítko" vybráno mezi přirozenými
látkami s přesně opačným účinkem, než má mít vyvíjené léčivo - např. při vývoji antagonistů určitého receptoru
může být vodítkem struktura příslušného přirozeného agonisty.
Základním předpokladem hledání jak vodítka, tak i dalších účinných látek s výhodnějšími vlastnostmi, je vypracování vhodného screeningového testu.
Nejvhodnější a nejrychlejší je screening v případě, že se podaří nalézt a navrhnout test na molekulární úrovni - např.
na základě inhibice některého enzymu, který je považován za významný v případě příslušného onemocnění. Pokud
je k dispozici izolovaná cílová struktura, lze pomocí některých moderních metod, jako je např. NMR, sledovat přímo i její interakce s molekulou zkoumané látky. V některých případech lze předběžný screening provádět i "in silico", tak, že se interakce látky s cílovou strukturou modelují počítačem. Rychlé jsou testy prováděné na buněčné
úrovni - např. zkoušky inhibice růstu nádorových buněk v tkáňové kultuře působením cytostatik nebo působení
antibiotik na cílový mikroorganismus. V některých případech však může být nutné provádět zkoušky i na úrovni
izolovaného orgánu nebo dokonce in vivo, na pokusných zvířatech. Zkoušky in vivo jsou nezbytné pro testování
užšího výběru látek v pokročilejších stadiích vývoje, při screeningu se používají jen výjimečně, když se nepodaří
nalézt jiný vhodný test, který by byl rychlejší a méně zatížený statistickými chybami.
Po nalezení vodítka pro další vývoj nastupuje obvykle práce chemika, který připravuje analoga
této látky s cílem zlepšit jejich účinnost a/nebo snížit nežádoucí vedlejší účinky a studuje na nich
vztahy mezi strukturou a biologickou účinností (Structure-Activity Relationship, SAR).
Vyšší účinnost mají zpravidla ty látky, které se mohou lépe vázat na cílovou strukturu díky svému sterickému uspořádání a přítomnosti funkčních skupin, které se účastní interakcí s funkčními skupinami cílové struktury.
Studium SAR umožňuje zjistit, které skupiny jsou nutné k vazebným interakcím léčiva s jeho
cílovou strukturu. Přitom se obvykle začíná s přípravou analog modifikováním nebo záměnou
funkčních skupin na látce s vodítkovou strukturou. Lze tak zjistit, které funkční skupiny jsou
nezbytné pro účinnost (tj. pro interakci s cílovou strukturou). Tento přístup je velmi starý, byl
využit již při přípravě aspirinu z kyseliny salicylové. Nevýhodou je, že počet funkčních skupin
vodítka je omezený a že u přírodních produktů mohou být analoga jen velmi obtížně dostupná.
Jako modifikační reakce se používají běžné reakce, jako je příprava esterů a etherů z alifatických alkoholů a fenolů,
alkylace aminů, esterifikace karboxylových kyselin nebo naopak zmýdelnění esterů, redukce dvojných a trojných
vazeb, ketonů, esterů, nukleofilní i elektrofilní substituce apod. Někdy je přitom nutné určité funkční skupiny chránit a po provedení modifikace chránící skupiny odštěpit. V případě některých přirozených látek je modifikace existujících funkčních skupin jedinou cestou, jak připravit postupy parciální syntézy vhodná analoga. Jindy lze žádané
látky připravovat totální syntézou. V poslední době se při přípravě účinnějších analog začínají využívat i biotransformace - přeměny látek využívající mikroorganismů nebo enzymů (např. penicillin G se připravuje tak, že se do
fermentačního média přidává kyselina fenyloctová, zatímco přídavek fenoxyoctové kyseliny vede ke vzniku penicillinu V. Z přirozených penicillinů lze také působením enzymu penicillinacylasy odštěpit karboxylovou skupinu, aniž
by byl narušen labilní laktamový kruh a uvolněnou aminoskupinu chemickými postupy acylovat. Připravuje se tak
např. ampicillin a další polosyntetické penicilliny.
Studie SAR umožňují zjistit, které funkční skupiny a stereospecifické charakteristiky molekuly
(vzájemná poloha a vzdálenosti funkčních skupin) jsou nezbytné pro vazbu látky na cílovou
struktury a tedy i účinnost léčiva. Tyto charakteristiky molekuly se nazývají farmakofor.
14
Farmakofor lze odvodit nejen na základě přípravy a studia analog, ale i porovnáním struktury skupiny známých léčiv se
stejným mechanismem účinku. Tak např. struktura farmakoforu opiátových analgetik vyplynula z porovnání struktur
morfinu, morfinanu a benzomorfonu.
Benzomorfany
Morfinany
Morfin a deriváty
HO
HO
HO
FARMAKOFOR
HO
O
H
H
N CH3
H
H
N
H3C
CH3
H
N
N
HO
MORFIN
Slovalgin, Doltard
PENTAZOCIN
Fortral
BUTORFANOL
Beforal
Porovnání struktury účinných látek a/nebo příprava a studium biologických vlastností analog ukáže,
které funkční skupiny jsou nutné pro biologickou aktivitu a jaké musí mít prostorové uspořádání.
Důležitý je především charakter funkčních skupin farmakoforu - zda jde o skupiny schopné ionizace (aminodusík, karboxylová skupina apod.), tvorby vodíkových můstků (charakter donoru a/nebo akceptoru - např. hydroxylová skupina může
být jak donorem, tak i akceptorem, kyslík karbonylové skupiny je pouze akceptorem vodíku), či hydrofobních skupin.
Neméně důležité je rozmístění těchto skupin v prostoru. U opiátových analgetik např. jde o vzdálenost aminodusíku od
středu aromatického kruhu a úhly, které svírá spojnice atomu a středu kruhu s osou nebo rovinou aromatického
cyklu).
H-donor/H-akceptor
Bázická skupina
y
HD/HA
Arom.kruh.
γ
x
β
y
Arom. kruh
x
α
Bázická skupina
Prostorové rozmístění funkčních skupin důležitých pro biologickou účinnost závisí i na konformaci molekuly.
U rigidních molekul není určení aktivní konformace složité. Horší je situace u flexibilních molekul. Údaje o prostorovém uspořádání pro jednotlivé konforméry lze vypočítat, stejně jako jejich energetický obsah. Problémem však je,
že konformace látky, která nejlépe odpovídá vazebnému místu cílové struktury, nemusí být nejstabilnější konformací. V některých případech může při hledání aktivní konformace pomoci příprava derivátů, u nichž je konformace
fixována a posouzení jejich biologické účinnosti. Příkladem může být studium účinnosti látek I a II odvozených od
dopaminu. Ukázalo se, že látka II je účinná, látka I nikoliv:
DOPAMIN
HO
BICYKLICKÁ ANALOGA
NH 2
HO
flexibilní konformace
(volná rotace kolem vazeb)
STRUKTURA
FARMAKOFORU
NH 2
HO
NH 2
NH 2
HO
HO
HO
I.
HO
HO
II.
aktivní konformace
fixovaná konformace (volná rotace zablokována)
K definování farmakoforu lze dospět nejen na základě znalosti struktury účinné látky a jejich
analog, možný je i opačný způsob. Pokud je známa cílová struktura a prostorové uspořádání její15
ho vazebného místa lze definovat farmakofor jako "negativ" této struktury. Správnost navrženého farmakoforu se pak může ověřit přezkoumáním, zda jej obsahují látky, o nichž je známo, že
se mohou vázat v aktivním místě cílové struktury.
Předpokládejme, že cílovou strukturou je bílkovina a vazebné místo vytváří karboxylová skupina asparagové kyseliny (karboxylátový aniont), hydroxylová skupina serinu, a aromatický kruh fenylalaninu. Léčiva, která mají interagovat s tímto vazebným místem by měly obsahovat skupiny schopné vytvářet iontovou a vodíkovou vazbu a účastnit se van der Waalsových interakcí s aromatickým jádrem, tj. aminoskupinu, skupinu působící jako donor nebo
akceptor vodíku a hydrofobní skupinu (podle G. Patrik, Medicinal Chemistry. Instant Notes. BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK, 2001)
Asp
Ser
FARMAKOFOR
COO
O
Báze nebo kladny náboj
Báze nebo kladný náboj
H
D onor nebo akceptor
Aromatické
vodíku
centrum
Vazebné místo
⎭
H donor/akceptor
Aromatické centrum
Phe
Koncept farmakoforu prožívá svoji renesanci v poslední době, kdy výsledky rengenografické
analýzy řady enzymů, receptorů a dalších cílových struktur resp. dokonce jejich komplexů
s léčivy na straně jedné a počítačové modelování na straně druhé umožňují získávat informace o
prostorové struktuře farmakoforu a využívat je při navrhování nových léčiv.
Prudce se rozvíjející discipliny molekulární biologie, genomika a proteomika, umožňují identifikovat zcela nové
cílové struktury, jejichž přirozené ligandy, agonisté nebo antagonisté nemusí být známy a navrhnout farmakofor
látek, které jsou potenciálně schopné s těmito strukturami interagovat. Prohledávání databází známých sloučenin
pak umožňuje zjistit, které látky obsahují struktury odpovídající navrženému farmakoforu. Využití obecně definovaného farmakoforu přitom může vést k tomu, že se zjistí podobný účinek mezi sloučeninami, které jsou chemicky
značně odlišné. Potvrdí-li experiment účinnost těchto látek, mohou se stát vodítkem pro vývoj nových léčiv.
Stereochemické aspekty syntézy léčiv
Koncepce farmakoforu ukazuje nejen na nutnost přítomnosti určitých funkčních skupin v molekule léčiva, ale i jejich určitého prostorového uspořádání, tj. správné konfigurace funkčních
skupin a správné enantiomerní struktury. Biologická účinnost závisí dokonce na převládající
konformaci molekul.
Nutnost zaujmout správnou konfiguraci je zřejmá. Je-li prostorová stavba cílové struktury taková, že interakce se může
účastnit jen jediný geometrický nebo isomer (např. s estrogenním receptorem může interagovat pouze trans neboli E
isomer tamoxifenu), pak druhý geometrický isomer je neúčinný nebo může mít i zcela jiné účinky, popř. dokonce může
zvyšovat nežádoucí toxicitu (o cis- neboli Z-isomeru tvrdí některé práce, že právě jeho malá příměs je příčinou vzniku nádorů děložní sliznice při dlouhodobém podávání přípravku). Podobná situace nastává i u optických isomerů:
C
D
B
C
D
C
A
A
A
B
C´
A´
C´
B´
Z-isomer
A´
A´
B´
E-isomer
B
A
B
R- enantiomer
C´
B´
C
A´
C´
B´
S- enantiomer
Enantiomer, který má vyšší biologickou účinnost, se někdy nazývá eutomer, méně účinný enantiomer je distomer. Poměr mezi biologickou aktivitou eutomeru a distomeru je označován jako
eudismický poměr.
16
Má-li eudismický poměr vysokou hodnotu, pak je účelné se při syntéze léčiva zaměřit na možnosti získání pouze
účinnějšího enantiomeru, eutomeru.
Standardní způsoby syntézy obvykle poskytují racemické směsi enantiomerů. Chceme-li z
takové směsi získat jediný enantiomer, je třeba racemickou směs rozdělit, provést resoluci.
V některých případech může jeden z enantiomerů spontánně vykrystalovat z roztoku racemické směsi. To je však
spíše výjimkou. Spíše se využívá převedení racemátu na směs diastereomerních sloučenin. Ty na rozdíl od enantiomerů mají odlišné fyzikálně chemické vlastnosti, čehož lze využít k dělení. Nejjednodušší je krystalizace diastereomerních solí připravených z racemátu a vhodné enantiomerní sloučeniny - pro látky s kyselým charakterem lze
např. použít některé chirální přirozené nebo syntetické aminy, z bázických racemátů lze připravovat diasteromerní
soli chirálních kyselin jako je kyselina vinná a její O-acyderiváty (nejčastěji kys. dibenzoylvinná), jablečná, mandlová, kafrsulfonová, v poslední době se používá kyselina 1,1´-dinaftyl-2,2´-fosforečná. Pokud racemát neobsahuje
kyselé ani bazické skupiny musí být pro dělení modifikován, např. reakcí racemických alkoholů s chloridem kyseliny kafrsulfonové lze připravit diastereomerní estery. Ty se liší svými fyzikálně chemickými vlastnostmi, čehož lze
využít k jejich rozdělení. Po rozdělení se navázaná skupina odštěpí.
V případě reakce racemátu s enantiomerně čistým činidlem lze k dělení využít i tzv. kinetickou
resoluci, při níž se využívá skutečnosti, že vznikají dva diastereomerní přechodové stavy s odlišnou stabilitou. Při reakci pak rychleji vzniká jeden diastereomerní produkt.
K dělení racemátů lze využít i enzymatickou resoluci, při níž se využívá stereospecificity enzymů. Např. Dfenylglycin, výchozí látka pro parciální syntézu ampicillinu se připravuje působením aminopeptidasy na racemický
fenylglycinamid. Přitom hydrolyzuje pouze L-enantiomer, takže vznikne směs L-fenylglycinu a D-fenylglycinamidu, který se pak chemicky hydrolyzuje na žádaný produkt.. Podobně lze rozdělit racemické estery pomocí acylas. Ty
selektivně rozštěpí pouze jednu enantiomerní formu esteru na alkohol a kyselinu.
Jiné možnosti dělení racemátů představuje chromatografie na chirálních fázích a tvorba inkluzních komplexů.
Speciálně připravované chirální fáze jsou drahé a používají se proto spíše v analýze (HPLC na chirálních fázích
bývá předepisována v lékopisech). V preparativní chromatografii lze využít některé přirozené chirální polymery
(triacetylcelulosa, sesítěný albumin) nebo silikagel impregnovaný vhodnou enantiomerní látkou jako je např. kyselina vinná. Chromatografickými technikami lze rozdělit i racemáty s neutrálními skupinami. Některé chirální fáze
obsahují navázané látky s dutinami, do nichž může být uzavřena pouze jedna enantiomerní forma produktu. Příkladem mohou být cyklodextriny navázané na silikagel. Cyklodextriny a další látky vytvářející inkluzní komplexy
mohou být využity i k dělení racemátů krystalizací.
Obecnou nevýhodou přípravy enantiomerů rozdělením racemátů je, že se získává pouze poloviční výtěžek účinné enantiomerní formy léčiva.
Ztráta poloviny produktu tvořeného nežádoucím enantiomerem přípravu chirálních léčiv resolucí racemátů prodražuje.
Dražší je resoluce racemátů i v případech, kdy lze odpadající enantiomer racemizovat a resoluci opakovat nebo převést
vhodným postupem na žádaný. Racemizace může být prováděna přes achirální meziprodukt (např. oxidací enantiomerního alkoholu na keton a jeho následnou redukcí na racemický alkohol). Např. výše zmíněný L-fenylglycin lze
racemizovat působením kyseliny sírové. Získaný racemát se pak převede na amid, který se znovu dělí pomocí aminopeptidasy). Příkladem převedení odpadního enantiomeru na žádaný je nukleofilní substituce probíhající s Waldenovým
zvratem: Nežádoucí R-formu alkoholu se tosyluje a R-tosylát podrobí hydrolýze SN2 mechanismem na S-alkohol.
Ekonomicky výhodnější proto mohou někdy být postupy asymetrické neboli enantioselektivní
syntézy, při nichž selektivně vzniká určitý enantiomer chirálního produktu. Přitom musí být při
reakci přítomen vhodný chirální element - chirální musí být buď výchozí látka nebo reakční činidlo, popř. se použije chirální katalyzátor. Dobrý postup asymetrické syntézy musí poskytovat žádaný produkt ve vysokém chemickém i optickém výtěžku. Optický výtěžek je vlastně mírou
enantioselektivity reakce. Optický výtěžek je někdy nazýván enantiomerní přebytek a označován v
reakčních schematech jako e.e. (z anglického enantiomeric excess).
Optický výtěžek se zjišťuje jako poměr mezi naměřenou otáčivostí produktu reakce a hodnotou otáčivosti čistého
enantiomeru. Jeho hodnota odráží poměr obou enantiomerů v produktu reakce. Např. optický výtěžek 40% znamená, že ve směsi je 40% čistého enantiomeru, zbývajících 60% je racemát nevykazující žádnou optickou aktivitu, tj.
směs 30% S- a 30% R- formy. Poměr jednoho enantiomeru ke druhému v produktu reakce pak je 70 : 30. V ideálním případě by e.e. měl být vyšší než 98%, což odpovídá obsahu čistého enantiomeru v produktu nad 99%. V praxi
se však bez další purifikace produktu tak vysoké enantioselektivity obvykle nedosahuje.
17
Nejsnáze lze dospět k chirálním produktům, pokud je k dispozici vhodná chirální výchozí látka.
Takovou látkou mohou být např. přirozené aminokyseliny nebo cukry. Nevýhodou je, že se přitom někdy syntéza
prodlouží o několik reakčních kroků a že musí být vyloučeny operace, při nichž by mohlo během syntézy docházet k
racemizaci (zahřívání na vyšší teploty, přítomnost silných kyselin nebo basí apod.).
V případě, že v molekule výchozí látky je již přítomno jedno nebo více chirálních center, pak při
reakci, při níž vzniká další chirální centrum, může být preferována určitá konfigurace produktu.
Obvykle se s tím setkáváme při parciálních syntézách léčiv vycházejících z přirozených produktů (alkaloidů, steroidů, cukrů apod.). Přítomnost chirálního centra nemusí však vždy vést ke vzniku enantiomerně čistého produktu. Je-li
nově vznikající chirální seskupení vzdálené, pak vliv původního centra chirality může být jen velmi malý.
K vnášení chirálního centra do achirálních molekul lze využít pestrou škálu chirálních činidel a
pomocných chirálních látek.
Je např. výhodné, přináší-li při asymetrické syntéze chirální informaci opticky aktivní katalyzátor, kterého se na rozdíl od chirálního činidla používá zpravidla jen velmi malé množství. Vysoce účinnými chirálními katalyzátory jsou enzymy, které lze
využít k přípravě enantiomerně čistých látek i v průmyslovém měřítku. Příkladem enantioselektivní enzymově katalyzované reakce může být příprava L-asparagové kyseliny, složky umělého sladidla aspartamu, z kyseliny fumarové
pomocí enzymu aspartasy. Enzymy přitom nemusí být isolované, podobné reakce jsou někdy katalyzovány imobilizovanými buňkami obsahujícími příslušný enzym.
Kvantitativní vztahy mezi strukturou a biologickou účinností
Struktura molekuly léčiva definuje její interakce s ostatními molekulárními strukturami organismu. To znamená, že bezpečnost a účinnost léčiva je funkcí jeho chemické struktury. Studium
kvantitativních vztahů mezi strukturou a biologickou účinností látek (Quantitative StructureActivity Relationships, QSAR,) umožňuje zjistit, jak fyzikálně chemické vlastnosti molekul
ovlivňují biologickou účinnost látek. Cílem tohoto studia je vypracovat algoritmy, které by byly
použitelné pro předpověď biologické účinnosti různých sloučenin a využít je k návrhu látek s
optimálními terapeutickými vlastnostmi. Tyto terapeutické vlastnosti jsou určovány jak schopností látky interagovat s cílovou strukturou, tak i k této cílové struktuře
Klasický přístup ke studiu QSAR vychází z přípravy řady látek se společným základním skeletem a rozdílnými
substituenty a studia jejich účinnosti. Ze zjištěných vztahů se vyvodí, jaké fyzikálně chemické charakteristiky skupiny jsou významné z hlediska žádaného účinku. To pak umožňuje navrhnout nové, ještě účinnější látky.
Studium QSAR ukázalo, že pro účinnost látky má největší význam hydrofobita (neboli jinými
slovy lipofilita), elektronový charakter a sterické parametry molekuly a/nebo jejích funkčních
skupin. Moderní léčiva mají ovšem velmi složitou strukturu, což predikci vlastností pomocí
QSAR znesnadňuje. Jednotlivé funkční skupiny molekuly se vzájemně ovlivňují, změna charakteru jedné skupiny má dopad na vlastnosti jiných funkčních skupin. Situaci navíc komplikuje to,
že účinnost sama není jediným faktorem ovlivňujícím úspěch léčiva, mnoho velmi účinných
látek selhalo při zkouškách in vivo pro omezenou rozpustnost nebo stabilitu, popř. vysokou nežádoucí toxicitu. Navrhování léčiv pomocí moderních počítačů, CADD (Computer-Assisted
Drug Design), proto stále ještě limituje složitost příslušných korelačních algoritmů.
Vztahy mezi strukturou látky a jejími vlastnostmi zajímají chemiky již od 19. století. V r. 1863 zjistil A.F.A. Cros,
že toxicita vyšších alkoholů roste s tím, jak se snižuje jejich rozpustnost ve vodě. Závislost toxicity organických
látek na jejich hydrofobním charakteru byla obecněji potvrzena v 90. letech Meyerem a Overtonem.
Význam hydrofobity pro biologickou účinnost byl později potvrzen dalšími studiem. Jako míra
hydrofobity se při studiu kvantitativních vztahů mezi strukturou a účinností využívá logaritmus
rozdělovacího koeficientu látky mezi n-oktanolem a vodou, logP.
Pro většinu léčiv platí, že čím větší je koncentrace látky v n-oktanolové fázi, tj. čím větší je hodnota P resp. logP,
tím větší je aktivita. Je to dáno tím, že vyšší hydrofobita znamená, že molekuly léčiva snáze pronikají přes buněčné
membrány ke svým cílovým strukturám. Neplatí to však neomezeně. Z experimentů s přípravou a studiem aktivity
řady analog výchozí vodítkové struktury vyplývá, že po příliš velkém zvýšení hydrofobity (např. zavedením velkých
objemných alifatických substituentů) se účinnost může naopak snížit.
18
Vztah mezi biologickou účinností a hydrofobitou látky je dán rovnicí:
log účinnosti = – k1 . (log P)2 + k2 . log P + k3,
kde k1, k2 a k3 jsou konstanty.
Je-li celková hydrofobita molekuly relativně malá, pak účinnost určuje především logP. U vysoce hydrofobních
látek určuje naopak výslednou hodnotu spíše (log P)2 , který je v rovnici vystupuje se záporným znaménkem, takže
účinnost klesá. Vztah mezi účinností a hydrofobitou molekuly se uplatňuje především in vivo, při sledování účinku
látky na živé organismy, kdy molekula látky musí ke svému místu působení pronikat přes buněčné membrány. Při
testech in vitro se látka může dostávat do interakce s cílovou strukturou přímo, takže tento vztah platit nemusí.
Rozdělovací koeficient popisuje celkovou hydrofobitu molekuly. Tuto celkovou hydrofobitu
molekuly je možné vyjádřit jako určitý součet příspěvků jednotlivých části molekuly.
Měřítkem hydrofobity jednotlivých substituentů je konstanta πx, kterou lze experimentálně stanovit porovnáním
logP standardní sloučeniny s derivátem, u něhož je vodík nahrazen příslušným substituentem (x):
,
kde PH je rozdělovací koeficient standardní sloučeniny a Px rozdělovací koeficient derivátu s příslušným substituentem. Je-li hodnota konstanty πx kladná, pak substituent je hydrofobnější než vodík, je-li záporná, je tomu naopak.
Znalost konstant πx pro různé substituenty umožňuje získat údaj informaci o celkové hydrofobitě
látky výpočtem.
Příkladem zjednodušeného výpočtu může být určení celkové hydrofobity látky podle vzorce:
log P = log PH + Σ πx
Je-li např. log PH benzenu 2,13, a π konstanty pro brom a methoxyskupinu 0,86 resp. –0,02, pak lze snadno vypočítat logaritmus rozdělovací konstanty pro p-bromanisol, který činí 2,97. Situace je však složitější. V úvahu je třeba
brát sterické uspořádání substituentů a zejména pak kolísání hodnot π konstant pro různé systémy. Uvedené π konstanty např. platí pro deriváty benzenu, ale již ne zcela pro různé heteroaromatické systémy. V ideálním případě by
měly být používány π konstanty platné pro určitý systém. To však není v praxi vždy možné, takže je třeba počítat
s určitými nepřesnostmi předpovědi.
Biologická účinnost však nezávisí pouze na schopnosti látek pronikat přes buněčné membrány,
ale i na schopnosti interagovat s cílovou strukturou. Při těchto interakcích se uplatňují i elektronické vlivy substituentů.
Mírou elektronických vlivů substituentů na vlastnosti látky s aromatickým charakterem jsou Hammettovy konstanty
σ, které odvozené na základě porovnání disociačních konstant nesubstituované kyseliny benzoové a jejich substituovaných derivátů. Hammettovy konstanty se běžně uplatňují v různých korelačních vztazích v organické chemii,
mají však vztah i k biologické aktivitě látky. Tak např. minimální inhibiční koncentraci C různých aromatických
sloučenin vůči bakteriím Escherichia coli lze vypočítat ze vztahu:
log ⎛⎜
1⎞
⎟ = 1,05 σ – 1,28
⎝C ⎠
Ze vztahu lze např. vyvodit, že deriváty se substituenty s elektronovým deficitem budou růst bakterií inhibovat více
než látky se substituenty s vlastnostmi elektron-donorů.
Vedle hydrofobity a elektronické struktury ovlivňují biologickou aktivitu i sterické faktory.
Objemné substituenty mohou snižovat biologickou účinnost tím, že brání molekule léčiva aby správně „zapadla“ do
vazebného místa své cílové struktury. V jiných případech však přítomnost objemných substituentů může fixovat
právě tu konformaci, která je pro interakci s cílovou strukturou nezbytná. K vyjádření sterických vlivů se používá
několik různých parametrů, nejčastěji Taftovy sterické faktory ES. Ty jsou odvozeny ze vztahu mezi objemem substituentu v řadě příbuzných sloučenin a rychlostí určité základní reakce. Jiným parametrem, který vyjadřuje míru
sterického vlivu, je molekulová refraktivita, která se vypočte z indexu lomu, hustoty a molekulové hmotnosti. Další
mírou sterického vlivu mohou být Verloopovy sterické parametry, které lze zjistit pomocí výpočtu z údajů o vazebných úhlech, délce vazeb, van der Waalsových poloměrech a předpokládané konformaci substituentu.
Vztahem, který při předpovědi biologické účinnosti bere v úvahu jak hydrofobitu látky, tak i její
elektronický charakter a prostorovou strukturu je Hantschova rovnice, základní rovnice QSAR:
log ⎛⎜ 1 ⎞⎟ = – k1 (logP)2 + k2logP + k3π + k4- + k5ES + k6.
⎝C ⎠
C je koncentrace látky potřebná k tomu, aby se projevil určitý účinek (např. byl z 50% inhibován určitý enzym). Čím je látka
účinnější, tím je pro dosažení příslušného účinku zapotřebí menší koncentrace látky a hodnota logaritmu 1/C je tedy vyšší.
19
Konstanty k1 – k6 se odvozují z údajů o aktivitě známých látek. Na výběru těchto látek pak závisí správnost předpovědi. Výběr usnadňuje pomůcka sestavená Craigem. Ten vynesl do grafu hodnoty σ a π pro různé substituenty. Osy
x a y dělí substituenty podle hodnot σ a π do 4 kvadrantů (+σ+π, +σ–π, –σ+π, –σ–π). Připraví-li se látky se substituenty z jediného kvadrantu (např. Cl, Br, I, CF3 a NO2, všechny s hodnotami +σ+π), bude pravděpodobně předpověď dosti špatná. Ke zjištění konstant Hantschovy rovnice by proto měly být použity látky pokud možná se substituenty, jejichž hodnoty patří do každého ze čtyř kvadrantů, např. CF3 (+σ+π), Et (–σ+π), CN (–σ+π) a OH (–σ–π).
Korelace mezi strukturou a aktivitou byly dále zlepšovány rozšířením Hantschovy rovnice o další fyzikálně chemické parametry. Podstatné zlepšení korelací přineslo trojrozměrné počítačové modelování
interakcí léčiva s cílovou strukturou umožněné výkonnými počítači a sofistikovaným software.
Návrhy nových léčiv „in silico“ stále ještě nemohou nahradit experimentátory. I ty nejlepší modely zatím často poskytují
zkreslené výsledky. V literatuře lze nalézt řadu příkladů léčiv, kdy predikce účinnosti pomocí výpočtů byla úspěšná, ale i
případy, kdy se naopak ukázalo, že léčiva interagují se svojí cílovou strukturou jinak, než bylo vypočteno. Výkonné počítače umožňují provádět výpočty interakcí protein-ligand ab initio, ani v tomto případě však nejsou zatím výsledky dostatečně spolehlivé. Je to proto, že naše znalosti o vztazích různých parametrů a strukturou látky jsou stále ještě jen omezené.
Situace se však rychle zlepšuje. Nejlepší výsledky počítačového modelování lze získat v případě, že je možné se opřít o
znalost detailního prostorového uspořádání cílové struktury (enzymu, receptoru apod.). Do r. 2000 byly známy detailní
prostorové struktury 460 enzymů, na konci roku 2003 to bylo už 1.900 struktur. Krystalografická studia usnadňují nové
techniky přípravy krystalických bílkovin. Ještě lepší výsledky se získají v případě, že z rentgenostrukturních nebo NMR
měření jsou k dispozici informace o detailní struktuře komplexu cílové struktury s určitým léčivem. Těchto případů je
zatím jen málo, ale jejich počet rychle roste.
Kombinatoriální syntéza a vysokokapacitní screening
Počítačové modelování umožňuje redukovat požadavky na syntézu sérií příbuzných látek. Přesto
se experimentální farmakochemie neobrací k přípravě a testování rozsáhlých souborů látek zády,
hledá však možnosti jak si tyto činnosti ulehčit a zrychlit. Mezi nástroje, které to umožňují patří
zejména techniky kombinatoriální syntézy a vysokokapacitního screeningu (high-throughput
screening).
Ještě na počátku v 90. let zajímala kombinatoriální syntéza jen pár chemiků a je proto překvapivé, jak rychle se
vyvinula v široce používanou rutinní metodu, kterou dnes žádná významná farmaceutická firma vyvíjející nová
léčiva nemůže ignorovat. V r. 1992 byla kombinatoriální syntéza využita k přípravě pouhých 3 „knihoven“ nových
látek, z čehož jen u 1 byla zjištěna terapeutická účinnost. V r. 1999 bylo takových knihoven látek připraveno již 292
a terapeutická účinnost byla zjištěna u 85 z nich. Na konci 90. let kromě toho pronikla metodologie kombinatoriální
syntézy i do dalších oblastí a byla využita i při hledání nových materiálů pro mikroelektroniku, agrochemikálií,
konzervačních látek, aditiv a dokonce i nových katalyzátorů.
Kombinatoriální syntéza se vyvinula ze syntézy v pevné fázi. Tato technika usnadňuje izolaci
produktů a umožňuje automatizovat pracovní postupy. Syntéza v pevné fázi je založena na tom,
že se výchozí látka naváže na inertní pevný nosič. Tím je obvykle vhodný polymerní materiál,
často ve formě malých kuliček, nosičem však může být i silikagel, porézní sklo apod.
Nosič však nemusí být jen pevný, podobně se mohou použít i rozpustné polymery uzavřené v komůrce se semipermeabilní membránou. Tou mohou procházet nízkomolekulární reagenty, ne však polymerní nosič s navázanými
meziprodukty a produkty. Nutnost použití membrán použití rozpustných polymerních nosičů komplikuje, jinak je
však výhodou hladší průběh reakcí v homogenním prostředí (eliminace difuzních jevů)
Některé typy nosičů již samy obsahují funkční skupiny vhodné pro navázání výchozí látky, např.
hydroxyl, karboxyl nebo aminoskupinu. Jiné nosiče je třeba pro vazbu výchozí látky upravit zavedením vhodných „linkerů“, tj. substituentů s koncovými reaktivními skupinami.
Linker musí umožnit snadné navázání výchozí látky i snadné odštěpení konečného produktu. Takovým linkerem je
např. chlormethylskupina, chlormethylovaný řídce síťovaný kopolymer styrenu s divinylbenzenem se někdy nazývá
Merrifieldova pryskyřice (podle průkopníka syntézy peptidů v pevné fázi, který tento nosič poprvé připravil a použil). Někdy je výhodné, jestliže reaktivní funkční skupina je od polymerního skeletu oddálena delším řetězcem,
„spacerem“, protože reakci navázané látky pak nebrzdí sterické vlivy.
Na nosič s navázanou výchozí látkou se pak působí roztokem vhodně zvoleného činidla. To se
obvykle použije ve velkém přebytku, aby reakce proběhla pokud možná kvantitativně. Vazba na
20
nerozpustný nosič umožňuje, aby produkt byl snadno oddělen od přebytečného činidla pouhou
filtrací a promytím. Produkt může být využit v dalším stupni k jiné reakci. Nakonec se konečný
produkt od nosiče vhodným postupem (hydrolýza, hydrogenolýza apod.) odštěpí.
funkcioX
vychozí
+
látka
nalizace
polymerní
nosič
reaktanty
linker
syntéza
odštěpení
nosiče
produkt
Syntéza v pevné fázi se např. využívá při přípravě peptidů. Na nosič, kterým jsou kuličky řídce sesítěného polystyrenu aktivované chlormethylací se naváže první aminokyselina. Její karboxylová skupina pak může být aktivována
pro reakci s aminoskupinou druhé aminokyseliny. Přitom vznikne navázaný dipeptid, který může být opakovaně
podroben reakci se sérií dalších aminokyselin, až se získá navázaný žádaný oligopeptid, který se nakonec od nosiče
oddělí. Syntézu je možné automatizovat, automatické syntezátory peptidů se využívají jak ve výzkumu, tak i při
výrobě. Podobné automaty slouží i k přípravě oligonukleotidů používaných pro genové manipulace.
Využití pevných nosičů umožňuje provádění paralelních syntéz, tj. provádět současně stejnou
reakci v různých reakčních nádobkách, ale s použitím různých reaktant a činidel. Nosič v každé
reakční nádobce přitom obsahuje jinou navázanou látku, na níž se může působit stejnými nebo
různými činidly. Nakonec se získá v sérii reakčních nádobek série látek, v každé reakční nádobce jedna individuální sloučenina.
Paralelní syntéza může urychlit přípravu série různých analog účinné látky s rozdílnými substituenty, např. sérií
etherů, esterů, aminů, amidů apod. Provádění paralelních syntéz usnadňují různé laboratorní automaty a syntezátory
Od paralelní syntézy vede přímá cesta ke kombinatoriální syntéze. V tomto případě reakční
nádobky neobsahují individuální látky, ale směsi různých produktů navázaných na nosiči, tzv.
knihovny sloučenin.
Množství látek tvořících „knihovnu“ může být značné, běžné jsou knihovny s desetitisíci látkami. V extrémním
případě může každá z kuliček nosiče obsahovat jednu navázanou individuální sloučeninu („one-bead-one compound“). Při přípravě takových kombinatoriálních knihoven se využívá metoda „smíchej a rozděl“ („mix and split
method“), kterou lze ilustrovat např. na přípravě knihovny tripeptidů tvořených třemi aminokyselinami. Nejprve se
na nosič s linkerem naváže ve třech nádobkách každá ze tří aminokyselin. Získané produkty se smísí a směs se rozdělí do tří nádobek. Do každé nádobky se přidá jiná aminokyselina, takže v každé nádobce vznikne směs tří dipeptidů se stejnou koncovou skupinou, celkem tedy 32, tj. 9 dipeptidů. Postup se pak opakuje, po 3. kroku kombinatoriální syntézy se již získá 33, tj. 27 různých tripeptidů:
1. krok
3 produkty
2. krok
6 dipeptidů
Alanin
A
Glycin
G
Valin
V
smísení, rozdělení směsi do 3 reakčních nádobek
Valin
Alanin
Glycin
AA
GG
VV
GA
AG
AV
VA
VG
GV
smísení, rozdělení směsi do 3 reakčních nádobek
21
Alanin
3. krok
AAA
GAA
VAA
GGG
AGG
VGG
GGA
AGA
VGA
celkem
27 tripeptidů
Valin
Glycin
VVA
AVA
GVA
AAG
GAG
VAG
VVG
AVG
GVG
AAV
GAV
VAV
VVV
AVV
GVV
GGV
AGV
VGV
Kdyby se místo 3 různých aminokyselin použilo všech 20 esenciálních aminokyselin, pak by počet připravených
tripeptidů činil již 203, tj. 8.000.
Postupy kombinatoriální syntézy nejsou omezeny jen na chemii peptidů, podobným způsobem byly
připraveny rozsáhlé knihovny nízkomolekulárních sloučenin, např. N-alkyl-N-acylaminokyseliny,
substituované s-triaziny, různé β-laktamy, deriváty isochinolinu, benzimidazolu apod.
Tak např. podle následujících schemat byla v USA připravena rozsáhlá knihovna analog protinádorově účinného
purinového derivátu objeveného českými vědci a nazvaného olomoucin:
1.
Cl
NHR 1
N
N
H
N
N
H
O
1
R NH 2
N
H
N
N
H
O
N
H
N
2.
R2OH
N
H
O
N
N
R NH 2
N
R
N
H
N
N
R2
HN
N
2
R OH
N
N
1
N
N
H
H
N
HN
1
N
N
H
N
H
N
HN
F
N
N
H
N
NHR 1
1
N
H
R
N
H
N
N
H
N
N
R2
3.
NHR 1
Cl
N
N
F
N
R1NH 2
F
N
N
NHR 1
N
N
2
R NH 2
R
N
O
O
N
N
2
N
H
N
N
O
U připravených látek pak byly zjišťovány inhibiční účinky na cyklin-dependentní kinasu 2, enzym, který hraje důležitou roli v mechanismu dělení buněk. Mezi připravenými deriváty byla látka nazvaná purvulanol B, která byla asi
tisíckrát účinnějším inhibitorem cdk2 než výchozí vodítková sloučenina olomoucin
COOH
N
N
HO
N
H
N
N
N
Cl
HN
HN
N
CH 3
Olomoucin
HO
N
H
N
N
Purvulanol B
Připravovat rozsáhlé knihovny sloučenin postupy kombinatoriální syntézy má význam, jen když je
možné tyto látky rychle otestovat a vybrat nejlepší kandidáty pro další vývoj. Na kombinatoriální
syntézu proto musí navazovat pečlivě navržené postupy vysokokapacitního screeningu.
Screeningové systémy bývají propracované tak, aby byly pokud možná eliminovány falešně pozitivní výsledky. V
ideálním případě se screening provádí přímo s látkami ještě navázanými na nosiči. Často je screening založen na vazebných interakcích navázaných látek s cílovým enzymem, receptorem apod. („binding assay“). Cílová struktura je
22
přitom opatřena „značkou“, navázanou barevnou nebo fluoreskující látkou, radioisotopem nebo enzymem, který reaguje s chromogenním substrátem (peroxidasa, alkalická fosfatasa) za vzniku barevného produktu. Po inkubaci kuliček
nosiče s označeným cílovým biopolymerem a promytí se pak kontroluje zbarvení kuliček nosiče. Kuličky poskytující
pozitivní reakci se pak oddělí. Vedle vazebných interakcí mohou být při screeningu knihoven látek na navázaném
nosiči využity funkční vlastnosti navázaných látek, např. schopnost inhibovat určitý enzym.
Jiné postupy screeningu se provádí v roztoku po odštěpení produktů od nosiče. Přitom se může např. použít destička se
souborem mikrofiltrů. Do každého mikrofiltru se vloží 100-500 kuliček nosiče, produkt se přídavkem vhodného činidla
odštěpí a odfiltruje od nosiče do mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Provede se inkubace a otestuje se biologická
aktivita roztoků v jamkách. Kuličky s produktem, který poskytl pozitivní reakci, se pak rozdělí a zkouší se v podstatě
individuálně (1 kulička na 1 jamku). Nakonec se produkty identifikují. V některých případech se screening v pevné fázi
a roztoku kombinuje.
Základním předpokladem úspěchu screeningu přitom je, aby zkouška byla dostatečně citlivá. Na jedné standardní kuličce o průměru 0,1 mm může být navázáno asi 100 pikomol produktu. Objem roztoku v jamce je asi 0,1 ml, takže
výsledná koncentrace látky je přibližně 1 μmol/l. Koncentraci produktu lze zvýšit snížením objemu roztoku v jamce
(např. použitím mikrotitračních destiček s 384 jamkami) nebo zvýšením množství navázaného produktu (zvětšení kuličky nosiče a/nebo jeho vazebné kapacity může umožnit až 100násobně zvýšit množství produktu). Moderní metody
umožňují, aby jeden pracovník během jednoho dne otestoval 107 kuliček nosiče, což je kapacita plně postačující pro
knihovnu s <3.106 permutacemi, tedy např. knihovnu pentapeptidů s 20 aminokyselinami. V případě heptapeptidů s
20 aminokyselinami (s 207, tj. 1,28.109 permutacemi) by však ani takto rychlý screening nemusel poskytnout požadovaný výsledek.
Po provedeném screeningu kombinatoriálních knihoven je třeba pozitivně reagující produkty
identifikovat. Prvním možnosti identifikace představuje analýza individuálního produktu na jednotlivé kuličce nosiče, druhou možností analýza směsného vzorku založená na statistickém hodnocení pravděpodobnosti výskytu produktu s pozitivními výsledky testování účinnosti.
Používané analytické techniky musí být dostatečně citlivé a přitom specifické, aby umožnily určovat látky vyskytující
se v mikromolárních koncentracích. K analýze a identifikaci se využívá zejména hmotová spektrometrie, infračervená
spektrometrie, kapilární elektroforéza nebo HPLC (často kombinovaná s hmotovou spektrometrií). K charakterizaci
individuálních produktů z knihoven peptidů nebo oligonukleotidů lze využít techniky mikrosekvenace.
Úspěch kombinatoriální syntézy závisí na pečlivém naplánování komplexních experimentů. To
se neobejde bez multidisciplinárního přístupu kombinujícího znalosti organické chemie, biochemie, biologie, analytiky, matematické statistiky a bioinformatiky.
Polymorfie
Postupy výroby léčivých látek musí být natolik propracované a robustní, aby poskytovaly produkty s uniformním chemickým složením i chemickými i fyzikálními vlastnostmi. Jen tak lze zajistit vysokou kvalitu finálních produktů, kterými jsou lékové formy. Vedle chemických charakteristik (čistota) se v poslední době dostává do popředí zájmu institucí
povolující výrobu léčiv otázka různých krystalových forem, tzv. polymorfie léčiv.
Polymorfie je schopnost látky vystupovat ve více než jedné krystalové formě, tj. schopnost molekul s
určitou strukturou zaujímat různá prostorová uspořádání a přitom vytvářet různé typy krystalové mřížky. Pseudopolymorfie (solvatomorfie) je pak schopnost tvořit různé krystalické solváty, z nichž
jsou nejdůležitější hydráty se zabudovanou molekulou vody. Solváty resp. hydráty resp. mohou mít
stechiometrické nebo nestechiometrické složení, nestechiometrické solváty jsou nazývány klathráty.
U stechiometrických solvátů jsou molekuly rozpouštědla integrální součástí krystalové mřížky a při
jejich odstranění sušením dochází ke změně krystalové formy. U nestechiometrických solvátů jsou
molekuly rozpouštědla vázány v krystalové mřížce volněji, takže při jejich odstranění sušením se
mřížka nezhroutí, ale místa po molekulách rozpouštědla zůstanou volná.
Voda zabudovaná do krystalové mřížky nemůže proniknout k hydrolyzovatelným strukturním skupinám látky, takže definované stechiometrické hydráty mohou dokonce být chemicky stálejší než látky bezvodé.
Pro farmaceutické chemiky je polymorfie velmi důležitá, zejména pokud je léčivá látka podávána
v pevném stavu ve formě tablet nebo kapslí.
Polymorfie hraje důležitou roli i u různých látek určených pro technické použití, např. jsou známy a různě využívány různé
polymorfní formy oxidu křemičitého, titaničitého nebo zirkoničitého. Ve farmacii vzrostl její význam zejména v posledních
10 letech a v současné době si žádná farmaceutická firma nedovolí otázky polymorfie léčiv ignorovat. Patentovou ochranu
23
různých polymorfních nebo pseudopolymorfních forem látky, jakož i různých typů solí léčivé látky s farmaceuticky akceptovatelnými kyselinami nebo bázemi využívají farmaceutické firmy k prodloužení patentové ochrany svých výrobků nebo
naopak k překonání patentových bariér konkurence. Situace je přitom složitá: Tak např. u acetylsalicylové kyseliny, aspirinu, byly popsány 4 polymorfní formy, u atorvastatinu však už 26 polymorfů a u sulfathiazolu dokonce 120 polymorfů a
pseudopolymorfů.
Různé polymorfní nebo pseudopolymorfní formy mohou mít rozdílnou rozpustnost (s níž u léčiv souvisí biologická dostupnost, popř. i toxicita), bod tání a někdy i zbarvení, chemickou a fyzikální stabilitu, hygroskopičnost, hustotu, sypnou hmotnost a zpracovatelnost (filtrovatelnost, stlačitelnost směsí,
mísitelnost s pomocnými látkami, soudržnost částic, smáčivost, tokové vlastnosti pevných směsí
apod.). Největší rozdíly ve vlastnostech mají obvykle krystalické a amorfní formy látek.
Použije-li se např. k přípravě tablet méně stálá polymorfní forma, pak během skladování tablet může dojít ke změně na
stálejší formu a to se může projevit rozpadáním tablet.
Látka krystalickém stavu má atomy nebo molekuly uspořádány v definované krystalové mřížce.
Amorfní nebo nekrystalické pevné látky mají naopak v pevných částicích molekuly uspořádané
nepravidelně, jejich vzájemné vzdálenosti a úhly kolísají v širokém rozmezí..
Krystalické látky mají rentgenová difrakční spektra se zřetelně odlišenými pásy nebo obrazci a v poli polarizačního
mikroskopu často vykazují dvojlom. Rentgenová difrakční spektra amorfních látek nemívají charakter diskrétních, ale
spíše difuzních obrazců. Různé polymorfní nebo pseudopolymorfních formy látky lze mnohdy rozpoznat pod mikroskopem podle různého tvaru krystalků, „krystalového habitu“ (jehlice, lístky, tyčinky apod.), který je určován vlastnostmi krystalové mřížky. Na různých krystalových mřížkách dochází k různému ohybu rentgenových paprsků. Rengenová difrakční spektra proto jsou jednoznačnou charakteristikou polymorfních forem. Polymorfní a pseudopolymorfní formy látky mají rovněž svá charakteristická 13C NMR spektra v pevné fázi.
Krystalické formy látek se získávají při chladnutí par sublimujících látek, ochlazování roztoků nebo
tavenin, odpařování roztoků a srážení, přičemž molekuly musí mít dostatek času na to, aby se mohly
uspořádat do krystalové mřížky. Při použití různých způsobů a postupů krystalizace látky mohou
vznikat různé polymorfní a pseudopolymorfní formy.Amorfní formy naopak vznikají při rychlém
srážení nebo rychlém ochlazení taveniny, rychlém odstranění rozpouštědla, popř. po zmražení vodných roztoků a odstranění ledu mrazovou sublimací (lyofilizací).
Lyofilizace je standardně využívána při přípravě tzv. suchých injekcí léčiv, které se před aplikací „rekonstituují“ přídavkem vody. Existují však i techniky lyofilizace, které umožňují vznik produktů s krystalickým charakterem.
Ještě donedávna mělo nalézání různých krystalových forem spíše náhodný charakter, systematický
přístup se prosazuje až v posledních letech. Screening polymorfních forem by měl být zahájen
v časných stadiích práce na projektu vývoje léčiva, protože znalost těchto forem je důležitým
vodítkem pro chemiky zabývající se vývojem procesů přípravy účinné látky i léčivých přípravků.
Cílem screeningu je nalezení co největšího počtu polyformních forem látky, které jsou za běžných teplot okolí stálé. Aby
bylo možné polymorfy řádně studovat, musí současně se screeningem probíhat vývoj metod analytického hodnocení
(analytika pevné fáze). Vedle studia různých polymorfních forem je třeba věnovat pozornost i otázkám souvisejícím
s velikostí částic, protože i tento parametr významně ovlivňuje farmaceutické charakteristiky finálních přípravků. Vznik
polymorfních forem závisí mnohdy na čistotě látky, ke screeningu by proto měl být použit co nejčistší produkt. Jinak by
mohlo být později nutné vliv přítomnosti nečistot ověřit a v krajním případě screening zopakovat s čistším léčivem.
Hledání stabilních pevných forem látky může být zahájeno studiem stárnutí suspenzí.
Přitom se připraví suspenze dostupné pevné látky v různých čistých rozpouštědlech nebo rozpouštědlech obsahujících definované množství vody a nechá se stárnout za definovaných podmínek skladování po dobu jednoho měsíce nebo i déle.
Pokud látka nevytváří solvát, po dostatečně dlouhé době by měla přejít na stabilní formu. Tvorbu stabilní formy lze urychlit
aplikací ultrazvuku, cykly zahřátí a ochlazení (za předpokladu, že nedojde k úplnému rozpuštění), popř. použitím oček
podobné látky. Zjistí-li se, že vznikla nová krystalová forma, studium stárnutí by se mělo opakovat se suspenzí této formy.
Jiný způsob hledání stabilních polymorfních forem nabízí studium tepelného působení.
Pokud se látka při zahřívání nerozkládá, zahřeje se až roztaje a pak se nechá chladnout rozdílnou rychlostí (rychle, středně,
pomalu) a sleduje se vznik krystalových forem. Jakmile vznikne pevný produkt, změří se jeho rentgenové spektrum, aby se
zjistilo, zda jeho krystalová forma je odlišná od původní. Při rychlém zchlazení vznikají spíše metastabilní formy, při dostatečně pomalém formy termodynamicky stálé. Při jiném metodickém postupu se látka zahřeje těsně pod bod tání, nechá
24
určitou dobu při této teplotě a zjišťuje se, zda dochází k přeměnám krystalové mřížky. Někdy se látka nechá vypařit a
zchladí se její páry. U sublimátu se pak zjišťuje, zda jeho forma se liší od původní látky.
Nejběžnějším postupem screeningu polymorfních forem je studium krystalizace látky z roztoku.
Zkouší se přitom rozpouštědla s různou polaritou, směsi rozpouštědel o různém složení a různé parametry, jako je
teplota, koncentrace roztoku, rychlost ochlazování, obsah vody, vliv míchání, pH a přítomnosti iontů. Podchlazené
roztoky se přitom mohou očkovat krystalky polymorfních forem získaných stárnutím suspenzí nebo působením tepla.
Ke studiu vzniku a přeměn polymorfů jsou vyvíjeny techniky (skenovací transitometrie), kdy se v krystalizačním
systému kontinuálně měří objemové a entalpické změny provázející fázové přechody.
Různé hydráty (resp. solváty) se připravují buď krystalizací z roztoků, obvykle obsahujících definované množství vody jako kosolventu, nebo působením vlhkosti.
Vliv vlhkosti se studuje pomocí mikrovah v komůrce s definovanou vlhkostí prostředí. Přitom se zjišťuje, zda látka vodu
absorbuje nebo naopak uvolňuje. Pokud se voda absorbuje, je třeba zjistit, zda dochází ke stechiometrické nebo nestechiometrické hydrataci. Vzniká-li hydrát je třeba vědět, zda vzniká přímo nebo přes meziprodukty s nižším obsahem vody.
Pokud může látka vytvářet hydrátů několik, může být systém velmi složitý a jeho studium náročné.
Polymorfní formy mají odlišnou krystalovou formu a tedy i různou energii krystalové mřížky.
Forma, která má za daných podmínek vyšší obsah Gibbsovy volné energie je termodynamicky
méně stálá a má snahu přecházet na formu s nižší energií. Znalost termodynamiky polymorfního
systému je důležitá pro návrh procesu krystalizace, při němž má vznikat žádaná forma.
Proces, který „jde proti termodynamice“ se jen obtížně definuje, je méně robustní a jeho výsledek závisí na pečlivém
dodržení kritických parametrů.
Stejně tak je pro návrh procesu přípravy definované polymorfní formy důležitá i znalost rychlosti
přeměn probíhajících v polymorfním systému – jejich kinetiky. Dobu konverze metastabilní formy
na stálejší je zatím třeba zjišťovat experimentálně, předpovědi zatím nejsou spolehlivé.
Některé metastabilní polymorfní formy mohou přecházet na stálejší formy velmi pomalu (extrémně pomalý je např.
přechod metastabilní formy uhlíku – diamantu – na stálejší grafit), jindy však může být přechod forem tak rychlý, že
některé metastabilní polymorfní formy nemusí ani být za běžných podmínek izolovatelné. U některých látek k takovému přechodu dochází již působením mechanických sil při mletí. Jinak lze k přechodu na stabilní formu využít i
metody odvozené od postupů screeningu polymorfů – např. zahřívání suspenze látky ve „špatném“ rozpouštědle.
Přechod metastabilního polymorfu na stabilní lze urychlit naočkováním krystalky stálejší formy. Pro přípravu finálních léčivých látek je důležitá znalost podmínek vzájemného přechodu polymorfních forem důležitá i vzájemné přeměny pseudopolymorfů, tj. různých typů hydrátů nebo solvátů.
Vývoj léčiv – vývoj výrobních procesů
Ve fázi objevu a návrhu léčiva bylo úkolem chemika připravit látku s optimální účinností, ve
vývojové fázi se cílem stává příprava látky optimálním postupem.
Vývoj procesu výroby je úkolem technologických laboratoří. Je zahajován, jakmile je na základě zkoušek nové látky nebo
marketingového rozboru vybráno léčivo, které má být vyráběno. Vývoj výrobního procesu léčiva vychází z laboratorního
postupu jeho přípravy, bylo by však chybou se domnívat, že jde o pouhé zvětšení měřítka. Výsledkem vývoje výrobního
procesu může být postup výrazně se odlišující od původního laboratorního postupu.
Výsledkem vývoje postupu přípravy léčiva musí být výrobní proces, který je účelný, účinný, levný, uskutečnitelný v reálných podmínkách, optimální a reprodukovatelný. Náročnost vývoje
procesu výroby léčiva se v současné době podstatně zvýšila.
¾ Molekuly léčiv jsou stále složitější – mají vyšší molekulovou hmotnost, komplikovanější strukturu, vyšší obsah
heteroatomů a chirálních center
¾ Požadavky na kvalitu léčiv a postupy jejího stanovení jsou stále náročnější – obvykle se vyžaduje, aby léčiva měly
čistotu vyšší než 99% a obsah nečistot se pohyboval pod 0,1%.
¾ Zvyšuje se počet sledovaných parametrů produktu (optická čistota, polymorfie atd.) i procesu
¾ Analytické hodnocení se stává nedílnou součástí vývoje procesu
¾ Současná farmaceutická legislativa klade vysoké nároky na dokumentovaný průkaz kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiva. S ohledem na rozsah požadované dokumentace jsou větší změny již vyvinutého procesu výroby léčiva
proveditelné jen obtížně a jsou náročné časově i finančně (nutnost provádění řady nových zkoušek). Pokud je substance léčiva je vyráběna pro externího odběratele, je nutné mu změny oznámit a nechat si je odsouhlasit.
25
Přes zvyšující se nároky je pro vývoj nových postupů a procesů k dispozici stále méně času – v
80. letech trval vývoj výrobních procesů v průměru 8-10 let, nyní je požadováno 4-6 let. Pro klinické zkoušky je zapotřebí připravovat léčiva již v poměrně velkých množstvích a v podstatě již
řádně vyvinutým procesem. Jakmile je produkt zaregistrován na základě klinických zkoušek
s přípravkem získaným určitým procesem, jakékoliv další změny ve specifikaci produktu (např.
obsah nečistot z přípravy) vyžadují finančně i časově náročné zkoušení a dokazovávání, že se nesnížila jakost, účinnost a bezpečnost produktu. Vývoj výrobních procesů proto často významně
ovlivňuje dobu uvedení léčiva na trh, jeho obchodní úspěch a nákladovost výroby.
Odpovědný přístup k vývoji procesů zahrnuje pečlivé plánování a integraci různých aktivit, využívání výpočetní
techniky při návrhu a hodnocení experimentů, automatizaci, řízení a monitoringu proměnných parametrů procesu, trvalé rozvíjení znalostí a dovedností a využívání všech možností výhodné spolupráce s externími pracovišti
(„outsourcing“).
Má-li být vypracován efektivní a dobře reprodukovatelný výrobní proces, je třeba znát, jak různé
proměnné faktory ovlivňují výtěžky, čistotu a stabilitu produktu, jakož i jeho farmaceutické vlastnosti a v neposlední řadě i jeho cenu.
Vývoj postupu výroby nového léčiva má obvykle několik etap. Poté co je nové léčivo objeveno, je třeba připravit kilogramové
množství látky pro vývoj analytických postupů, vývoj způsobu podání léčiva (perorálně, parenterálně) a preformulační zkoušky, testování akutní toxicity a předběžné zkoušky stability. V této etapě jde stále ještě více o rychlou přípravu, než o optimální
postup výroby, takže se často pouze zvětší měřítko původního laboratorního postupu. V druhé etapě je třeba látku připravit
v množství desítek kg pro pokračování toxikologických studií a vývoj lékové formy, někdy i pro fázi I klinického zkoušení.
V následující etapě se na poloprovozním zařízení vyvíjí již v podstatě konečný výrobní proces. Přitom se současně připraví
látka ve větším množství (až stovky kg) pro klinické zkoušení. Jakmile jsou zkoušky ukončeny a léčivo zaregistrováno zahajuje
pravidelná výroba, někdy až v tunových množstvích. Vyvinutý proces výroby by se přitom už neměl zásadně měnit.
Postup přípravy léčiva z 1. etapy vývoje se ještě může odlišovat od konečného postupu. I přitom je však třeba dbát na čistotu
a jakost produktu udávanou obsahem účinné látky, druhem nečistot a jejich zastoupením. Podle výsledků se totiž obvykle
navrhuje specifikace produktu, tj. určí se zkoumané parametry a metody provedení zkoušek, identifikují se nečistoty a určí
standardy látek, které budou zapotřebí pro analytickou kontrolu. Specifikace produktu je uváděna v žádosti o povolení klinických zkoušek. Specifikovaným limitům musí vyhovovat budoucí šarže léčiva, jinak by bylo třeba některé zkoušky opakovat nebo je alespoň doplnit o průkaz jejich bioekvivalence s produktem odpovídajícím původní specifikaci. Zdálo by se,
že řešení je jednoduché – určit velmi „měkké“ limity. To však není možné, specifikace musí splňovat určité obecné požadavky na jakost léčiv, které jsou dosti vysoké (např. obsah jednotlivé neznámé nečistoty nemá překročit 0,1%).
Prioritou vývoje procesu proto je poslední stupeň syntézy a zejména pak postupy čištění konečného
produktu (krystalizace, jiné způsoby purifikace), kdy se podle výsledků určuje kvalitativní specifikace.
Přitom je třeba sledovat nejen obsah účinné látky a nečistot, ale i parametry, které organičtí chemici někdy opomíjejí. Je to
např. obsah anorganických příměsí, které mohou být při HPLC, fotomerii apod. „neviditelné“, ale mohou snadno překročit
předepsané limity. Jde např. o obsah těžkých kovů (předepisován v tisícinách procenta) nebo některých aniontů. Pozornost
je třeba věnovat i krystalové struktuře (polymorfii) a velikosti částic produktu. Jde o důležité charakteristiky produktu, na
nichž může záviset rozpustnost a časový průběh rozpouštění (disoluční křivka), biologická dostupnost a stabilita léčiva.
První stupně procesu výroby léčiva se většinou optimalizují až je k dispozici optimalizovaný postup
provedení finálního stupně. K jednotlivým stupňům a krokům syntézy se přitom nepřistupuje izolovaně, ale jako k integrální součástí celého procesu výroby léčiva s cílem dosáhnout co nejlepšího celkového výsledku.
Jde např. o to, aby byl na minimum omezen počet prováděných operací a manipulace s materiálem. Je tedy třeba také zvážit,
který meziprodukt je třeba izolovat a čistit a kdy lze různé operace provádět v jednom zařízení („jednom hrnci“ – one-pot
synthesis/Eintopfverfahren), aniž by byla snížena kvalita konečného produktu. Dále je třeba se zaměřit na odstranění „úzkých hrdel“, které nepříznivě ovlivňují efektivnost procesu, tj. objem výroby za časovou jednotku a tím i cenu. Nemalou
pozornost je třeba během vývoje procesu věnovat organizaci práce a toku materiálu. Toky materiálu se nesmí křížit, aby
byla eliminována možnost chybného použití surovin a činidel. Dále je třeba vypracovat postupy čištění aparatur (včetně
analytických postupů hodnocení čistoty výrobního zařízení), postupy mezioperační kontroly a specifikovat kvalitativní
parametry surovin, činidel a meziproduktů a řešit i otázky nebo recyklace odpadů a omezení množství odpadů určených na
likvidaci a také i emisí těkavých látek.
Chemik zabývající se optimalizací prostupů přípravy léčiva se musí v první řadě důkladně seznámit
s problémem, který má přidělen a jasně si uvědomit cíle, kterých má dosáhnout. Těmito cíly jsou
26
v prvé řadě výtěžek a kvalita produktů, s nimiž úzce souvisí cena produktu. Vedle toho musí brát
v úvahu i bezpečnost práce a ochranu životního prostředí.
Je např. zbytečné se zabývat optimalizací postupu, při němž se použijí suroviny, činidla a pomocné látky, jejichž cena je jen
o málo nižší nebo dokonce převyšuje cenu konkurenčního výrobku srovnatelné kvality. Stejně tak nemá cenu optimalizovat
postup přinášející závažná bezpečnostní rizika, která za daných podmínek nelze minimalizovat. Takovým rizikem může být
např. práce s alkalickými kovy, pokud je k dispozici jen chlazení vodou nebo vysoce hořlavými rozpouštědly, jestliže dostupné zařízení není chráněné proti jiskření. Z environmentálního hlediska může být nevhodné použití chlorovaných rozpouštědel nebo procesy, při nichž dochází k velkému znečištění odpadních vod, nežádoucím emisím těkavých látek a vůbec
vzniku většího množství toxických odpadů. Výroba, při níž se používají látky nebo vznikají odpady se značným negativním
vlivem na životní prostředí, nemusí být veřejnoprávními orgány povolena.
Po stanovení cílů optimalizace je dalším krokem identifikace faktorů, které ovlivňují cílové parametry. Faktorů, které mohou mít přímý vliv na výsledek procesu, je celá řada.
Patří mezi ně zejména teplota a tlak, reakční doba, druh rozpouštědla, koncentrace reaktant, pořadí a rychlost přidávání
reaktant, rychlost ohřevu nebo chlazení, rychlost míchání, typ a množství katalyzátoru, pH, způsob purifikace apod.
Určení optimální hodnoty všech faktorů by bylo jen obtížné a nákladné, takže by vývoj procesu mohl
stál více, než by optimalizace přinesla. Je proto třeba uvážit, které faktory mají na výsledek velký nebo
jen malý vliv.
V ekonomice je znám Paretův princip, podle něhož jedna pětina výrobků přináší čtyři pětiny zisku. Tento princip lze aplikovat i na úvahy o významu jednotlivých faktorů, protože v prvém přiblížení lze tvrdit, že výsledky technologických procesů
jsou z ze 4/5 ovlivňovány 1/5 variabilních faktorů. Na základě zkušeností s podobnými procesy nebo i podle výsledků orientačních experimentů lze procesní faktory rozdělit do čtyř skupin. První tvoří faktory, které na dosažení cílových parametrů
mají nulový nebo jen nepatrný vliv. Při optimalizačních experimentech se tyto faktory zanedbávají. Další skupiny tvoří
kvalitativní faktory (typ rozpouštědla, katalyzátoru, extrakčního činidla atd.), kvantitativní faktory, které se mohou
v určitém rozmezí libovolně měnit (např. teplota, pH, doba reakce apod.), a konečně faktory „kategorické“ povahy, které
za daných podmínek lze buď aplikovat nebo vyloučit (např. míchání – ano/ne, světlo nebo tma apod.).
Z kvalitativních faktorů stojí v popředí výběr prostředí, v němž se reakce provádí
Volba rozpouštědla ovlivňuje výtěžky, průběh reakce, nákladovost výroby i environmentální dopady procesu. Při výběru je
nejprve třeba brát v úvahu kompatibilitu rozpouštědla s příslušnou reakcí. Např. Friedel-Craftsovy reakce nebo práce
s Grignardovými činidly lze provádět jen v určitých typech rozpouštědel. V protických rozpouštědlech probíhají dobře SN1
reakce, v polárních aprotických rozpouštědlech SN2 reakce. Rozpouštědlo může mít vliv i na selektivitu reakcí. Tak např. při
redukci tosylátu ω-bromundecylaloholu LiALH4 v etheru dochází k odredukování tosyloxyskupiny, v diethylenglykoldimethyletheru se naopak odredukuje brom. Důležitý je i bod varu – varem rozpouštědla se nejspolehlivěji reguluje teplota reakční směsi. Dále záleží na rozpustnosti výchozích látek, hlavních i vedlejších produktů reakce. Výchozí látka nemusí být
úplně rozpuštěná, stačí, když se rozpouští částečně a vznikem rozpustného produktu je porušována rovnováha mezi rozpuštěným a pevným podílem. Vylučování nerozpustného produktu může posouvat reakční rovnováhu žádoucím směrem, jindy
však může proces komplikovat např. vznikem méně kvalitního produktu nebo vylučovaný produkt může obalit a tím deaktivovat katalyzátor. V neposlední řadě je třeba brát v úvahu i bezpečnostní aspekty (např. kancerogenitu benzenu) a ochranu
životního prostředí (je třeba respektovat přísné předpisy týkající se použití chlorovaných rozpouštědel).
U faktorů kvantitativní povahy („procesních proměnných“) je třeba zvážit, jaké může být rozmezí
jejich hodnot a jaké jsou možnosti dosažení tohoto rozmezí z hlediska vybavení, finančních zdrojů,
personálních podmínek apod.
S růstem teploty roste rychlost chemických reakcí. To však platí i o nežádoucích vedlejších nebo rozkladných reakcích,
které zhoršují kvalitu produktu. Podobný vliv může mít koncentrace reaktant: Se vzrůstem koncentrace se zvyšuje reakční
rychlost jak hlavních, tak i vedlejších reakcí. U exotermních reakcí nemusí být při vysokých koncentracích zajištěn dostatečný odvod tepla a reakce pak může mít i nekontrolovaný průběh. Rychlostí přidávání reaktant lze průběh exotermních
reakcí zmírnit a zajistit tak často vyšší čistotu produktu, na pořadí přidávání reakčních komponent může záviset výsledek
reakce. Na poměru množství reaktant závisí poloha reakční rovnováhy. Přebytek jedné komponenty (obvykle levnější)
zajistí lepší výtěžek produktu a/nebo může významně přispět ke zvýšení jeho jakosti. Posun reakční rovnováhy lze zajistit i
odstraňováním žádaného nebo vedlejšího produktu reakce z reakční směsi – vylučováním v pevném stavu, oddestilováním
nebo vychytáním pomocnými činidly (např. odstraňováním vznikající vody azeotropním oddestilováním nebo sušidly).
Tlak pozitivně ovlivňuje rychlost takových reakcí, u nichž v přechodovém stavu klesá objem. Vedle reakcí s plynnými
reaktantami (hydrogenace, oxidace) jde např. o esterifikace a zmýdelnění esterů, kvarternizace aminů, nukleofilní substituce,
Diels-Alderovu reakci, Claisenův přesmyk apod.; významnější efekt se však v těchto případech většinou projeví až při řádových změnách tlaku. Reakční doba je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících efektivnost a cenu procesu. Cílem
optimalizace procesu proto nejčastěji je určit minimální dobu reakce potřebnou k dosažení co nejvyššího výtěžku. To platí
zejména pro rovnovážné reakce, protože prodlužovat reakční dobu po dosažení rovnováhy nemá smysl. Vedle výtěžku je
27
však třeba brát v úvahu i možnost vzniku nečistot při prodlužování reakční doby. Někdy je zapotřebí zastavit reakci dříve,
než dojde k výraznějšímu rozkladu produktu. Z technologického hlediska je žádoucí, aby reakční doba činila nejvýše 20
hodin, jinak neúměrně roste výrobní režie, jedna z důležitých položek kalkulace výrobních nákladů.
Ve většině případů závisí to, zda faktor je kategorické povahy, na okolnostech. Zatímco jeden typ
zařízení lze buď jen míchat nebo nemíchat, v jiném typu zařízení lze měnit otáčky. Kategorický faktor
se tak může změnit na kvantitativní, jehož hodnota může být přesněji specifikována. To však obvykle
je spojeno se zvýšením nákladů, takže je třeba zvážit, zda to je v daném systému potřebné a účelné
Míchání má velký vliv na průběh heterogenních reakcí, u reakcí probíhajících v homogenním prostředí zajišťuje míchání
pouze lepší odvod nebo přívod tepla a při postupném přidávání komponent promísení směsi.
Které faktory mají na výsledek procesu významný vliv se zjišťuje při faktorových experimentech
Při standardním (úplném) faktorovém experimentu se pro každý z faktorů, o nichž se předpokládá, že ovlivní výsledek,
zvolí dvě hodnoty, dolní a horní. Pak se experimentálně ověří, jaký vliv na výsledek tyto faktory mají. Je-li vybraných faktorů 5 a méně, může se provést úplný faktorový experiment, který zahrnuje 2n dílčích pokusů, při nichž se pro každý z faktorů
použije zvolená horní a dolní hodnota. Při výběru 4 faktorů (např. teplota, reakční doba, polarita rozpouštědla, míchání –
ano/ne) je těchto dílčích experimentů 16, u 5 faktorů 32. Se vzrůstem počtu vybraných faktorů počet dílčích experimentů
však již neúměrně narůstá (26 = 64, 27 = 128). Kromě toho faktorový experiment se 2 hodnotami proměnných je sice vhodný
pro screening vlivu faktorů na výsledek, neposkytuje však vždy relevantní výsledky pro optimalizaci. Vhodnější může být
např. studium vlivu teploty s použitím 3 hodnot proměnného faktoru (víceúrovňový faktorový experiment), pak však počet
dílčích experimentů již činí 32, 33, 34 atd., ke sledování 5 faktorů na 4 úrovních by bylo zapotřebí 1024 dílčích experimentů.
Aby se počet experimentů snížil, provádí se částečný faktorový experiment s menším počtem dílčích faktorů. Částečný
faktorový experiment samozřejmě poskytne méně informací než úplný. K tomu, aby ztráta informací byla minimalizována
se používají různé statisticky podložené chemometrické triky, optimalizační a vyhodnocovací počítačové programy. K
základnímu sledování 2 úrovní 6 faktorů tak např. postačí 28 dílčích pokusů.
Faktory, které mají zásadní vliv na výsledek se pak dále optimalizují. Při hledání hodnot vybraných
faktorů, při nichž se dosahuje nejlepší výsledek, lze provádět tak, že se postupně sleduje vliv vždy
jen jednoho faktoru na průběh dané reakce.
Tento postup je zdlouhavý, neefektivní a tedy i nákladný. V anglicky psané literatuře označuje příznačným akronymem
COST (=Change One Separate factor at a Time). Kromě toho ani nemusí přinášet správné výsledky.
Mezi jednotlivými faktory velmi často existují vzájemné vztahy, změna jednoho faktoru může působit
proti změně faktoru druhého nebo naopak může docházet k určité synergii. Postupné sledování vlivu
každého jednotlivého faktoru na výsledek proto nemusí vést k nalezení optimálního procesu. Vhodnější proto je sledovat kombinace různých faktorů. Přitom se využívají různé optimalizační postupy.
Jedním z nich je sekvenční simplexová optimalizace. Přitom sem provádí 3 dílčí experimenty s třemi různými hodnotami
2 sledovaných faktorů, 4 pro tři faktory atd. Zjistí se výsledky experimentů. Pak se provede další experiment, při němž se
proměnné volí tak, aby při grafickém znázornění byla jejich hodnota zrcadlovým obrazem hodnot proměnných při nejhorším experimentu.
E
hodnota
1. faktoru
D
5. experiment
4. experiment
C
3. experiment
A
1. experiment
B
2. experiment
hodnota
2. faktoru
To se pak opakuje několikrát, až se dosáhne nejlepší hodnoty procesní proměnné. Pokud by se hodnota proměnných
měla „zrcadlením“ vrátit na hodnotu odpovídající nejhoršímu výsledku, pak se vychází z druhého výsledku. Při modifikovné simplexové metodě se postupuje podobně, ale v případě, že by se „zrcadlením“ mělo dospět k horšímu výsledku, se průmět zkrátí. V posledních letech byla vyvinuta celá řada dalších optimalizačních postupů s příslušným
software pro rychlé nalezení a vyhodnocení optimálních podmínek reakce. Podrobnosti o různých metodách plánování
28
a vyhodnocování experimentů lze nalézt v řadě učebnic chemometrie, popř. matematické statistiky nebo na Internetu
(např. na adrese http://www.itl.nist.gov/div898/education/dex/optdesgn/optdesign.pdf).
Validace výrobních postupů
Léková legislativa vyspělých zemí vyžaduje, aby vypracovaný optimalizovaný postup výroby
léčiva byl validován. Vedle zpracování požadované výrobní dokumentace (Drug Master File,
technologický předpis, standardní operační postupy, záznamy o výrobě šarže) je validace poslední
etapou vývoje procesu výroby léčiva. FDA definuje validaci procesu výroby jako dokumentovaný
důkaz vysoké záruky toho, že proces bude trvale poskytovat produkt vyhovující předem určené
specifikaci. Řečeno jinými slovy, validace má zaručit, že příslušným procesem lze spolehlivě a
trvale vyrábět účinné, bezpečné a kvalitní léčivo.
Validace v podstatě je kontrolou reprodukovatelnosti a robustnosti postupu. Postup je validovatelný, jestliže běžné
kolísání hodnot různých faktorů negativně neovlivňují jakost výrobku. Pro kritické faktory se přitom stanoví rozmezí,
které nesmí být překročeno, má-li být dosažen požadovaný výsledek (např. ± 5°C u teploty, časové rozmezí přidávání
reagentu apod.). Čím užší je toto rozmezí, tím kvalifikovanější a zodpovědnější musí být obsluha, popř. jsou-li výrobní aparáty opatřeny řídicími a regulačními systémy, tím přesněji a citlivěji musí tyto systémy pracovat (což se samozřejmě promítne do jejich ceny).
Validace se provádí podle písemného řídícího plánu validace (Validation Master Plan).
Plán vymezuje zodpovědnosti jednotlivých pracovníků, vymezení předmětu a cílů, postupy provedení, způsob dokumentace výsledků ve validačním protokolu, odkazy na stávající dokumentaci, časový sled jednotlivých kroků, postupy
při změnách, mohou v něm být i specifikovány nároky na zdroje.
Validační aktivity začínají kvalifikací zařízení.
U nového zařízení se přitom nejprve provádí instalační kvalifikace, kdy se posuzuje, zda zařízení odpovídá specifikaci a je správně namontováno. Pak se provádí operační kvalifikace. Při ní se podle schváleného protokolu zjišťuje,
jak při provedení reálného nebo simulovaného procesu s příslušným zařízením lze dodržet předepsané parametry. Po
operační kvalifikaci následuje procesní kvalifikace, kdy se ověřuje, jak zařízení vyhovuje pro použití při navrhovaném procesu. Je-li např. pro proces nezbytné dodržení teploty v rozmezí ± 3°C a systém kontroly teploty v příslušném
zařízení umožňuje regulovat teplotu pouze v rozmezí ± 10°C, pak zařízení nelze kvalifikovat. Při kvalifikaci zařízení
se prověřují i měřící, monitorovací a záznamové přístroje a čidle, včetně stavu jejich kalibrace.
Je-li zařízení kvalifikováno, začíná samotná validace procesu. Ta může být prospektivní, prováděná před zahájením výroby, souběžná, při níž z praktických důvodů současně s validací probíhá
výroba prvních šarží a konečně retrospektivní validace vycházející z dokumentace o dosavadních vyrobených šaržích (10-30 šarží) u dobře definovaných procesů.
Optimalizace procesů výroby léčiva by měla vyústit v prospektivní validaci. Při ní se vychází z popisu výroby s přehledem kritických kroků a parametrů, jejichž změna může mít velký vliv na kvalitu produktu a které je proto třeba
prověřit. Validace prokazuje, že pokud se tyto kritické parametry pohybují ve specifikovaném rozmezí, získá se produkt se specifikovanou jakostí. Velikost šarže má být při validaci pokud možná stejná jako u výrobních šarží.
Výrobní proces lze validovat jen tehdy, jsou-li stanovena kriteria přijatelnosti konečného výrobku
i meziproduktů a k jejich kontrole ověřené a rovněž validované analytické postupy. Na validaci
výrobních procesů navazuje validace postupů čištění zařízení.
Zařízení používané univerzálně se musí dát prokazatelně vyčistit od zbytků předchozího výrobku, jinak může být
používáno jen pro jediný výrobek.
Prostory, systémy, procesy i postupy čištění musí být v pravidelných intervalech hodnoceny –
revalidovány, aby se prokázalo, že během času nedošlo k odchylkám od validovaného stavu.
Literatura pro další studium
Banker G.S., Rhodes ChT., Modern Pharmaceutics, Marcel Dekker, New York, 1996
Banwarth W., Felder E. (eds.), Combinatorial Chemistry, Wiley – VCH, Weinheim, 2000
Burger´s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Ed., Vol. 1, Principle and Practice (Wolff M.E., ed.), Wiley & Sons, New York, 1995
29
Foye W.O., Lemke T.L., Williams D.A. (eds.), Principles of Medicinal Chemistry, 4th Ed., William and
Wilkins, Philadelphia, 1996
Gadamasetti K.G., Process Chemistry in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker, New York, Basel, 1999
Katzung B.G., Základní a klinická farmakologie, H&H, Praha, 1994
King F.D. (ed.), Medicinal Chemistry. Principles and Practice, Royal Society of Chemistry, Cambridge,
1994
Lam K.S., Lébl M., Krchňák V., The „One-Bead-One-Compound“ Combinatorial Library Method.Chem.
Rev., 1997, 97, 411-448
Lincová D., H. Farghali, Základní a aplikovaná farmakologie, Galén, Praha, 2002
Lüllmann H., Mohr K., Wehling M., Farmakologie a toxikologie, Grada, Praha 2002
Lüllmann H., Mohr K., Ziegler A, Bieger D., Barevný atlas farmakologie, Grada, Praha, 2001
Mutscher E., Derendorf H., Drug Actions. Basic Principles and Therapeutic Aspects, Metpharm, Stuttgart, 1995
Patrick G., Instant Notes. Medicinal Chemistry. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 2001
Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M., Moore P.K., Pharmacology, Churchill Livingstone, Edingburgh, 2003
Thomas G., Medicinal Chemistry, An Introduction. Wiley, Chichester, 2001
Višnovský P., Farmakologie do kapsy, Maxdorf Jessenius, Praha, 1998.
30