Přírodní antioxidanty

Přírodní antioxidanty;
výzkum antioxidantů v ovoci
RNDr. Bílková Aneta
Co jsou antioxidanty?
•
látky, které omezují aktivitu volných radikálů, snižují
pravděpodobnost jejich vzniku nebo je převádějí do
méně reaktivních nebo nereaktivních stavů →omezují
proces oxidace v organismu
•
pomáhají ochránit imunitní systém
•
zpomalují proces stárnutí a preventivně působí proti
srdečním onemocněním, infarktu a rakovině
Podle původu: přírodní, syntetické
•
přírodní antioxidanty: vitamíny A, B2, B15, C,
E, karotenoidy, flavonoidy, třísloviny,
polyfenoly, glutation, taurin, sloučeniny zinku,
selenu, manganu, mědi, beta karoten, koenzym
Q10, pyknogenol, alfa-lipoová kyselina atd.
•
syntetické antioxidanty: BHA (E320), BHT
(E321) , TBHQ, galláty
Podle struktury: polyfenoly (jako jsou
flavonoidy, anthokyany, fenolkarboxylové
kyseliny, kumariny), karotenoidy (karoteny prekursory vitaminu A nebo xanthofyly) a
tokoferoly (vitamin E)
Přírodní antioxidanty
•
dostávají se do potravy z přírodních zdrojů.
•
nevýhodou - nízká odolnost proti kyslíku, a to zejména
v rámci expozice světlu, vysoké teplotě a sušení

Enzymové antioxidanty:
superoxiddismutáza, glutathion, kataláza...

Hydrofilní antioxidanty (rozpustné ve vodě),
které účinkují zejména v extracelulární tekutině:
vitamín C, kyselina močová, selen, bioflavonoidy –
resveratrol, jednoduché fenoly, fenolové kyseliny a jejich
deriváty - thymol a karvakrol (k uzení potravin – složky
kouře), kyselina chlorogenová - v kávě a v syrových
bramborách, lignany - v ovesných vločkách, lněných
semínkách, ječmeni či žitě, diterpeny a chinony – v
extraktech rozmarýnu a čaje
Lipofilní antioxidanty (rozpustné v tucích), které
účinkují hlavně na membráně a uvnitř buňky:
vitamín A, E, b-karoten, karotenoidy, ubichinon Q10...

Bioflavonoidy, flavonoidy, fenoly
ZDROJE:
jablka, cibule, pomeranče, grapefruity, česnek, zelí,
brokolice, lesní plody, čaj, víno, káva, ořechy, sója,
brambory, meruňky, hrušky, broskve
VÝZNAM V ORGANISMU:
prevenci nádorových onemocnění - inhibice proliferace a
indukce apoptózy, prevence kardiovaskulárních chorob
– antioxidační a protizánětlivý účinek, snižování exprese
adhezních molekul v cévách, inhibice agregace destiček
Antioxidanty a ovoce
Zajišťování chuti a barvy potravin, delší trvanlivosti
zpomalují ztrátu barvy ovoce a zeleniny
funkce při zabránění oxidace tuků a výrobků
obsahujících tuk, ochrana některých vitaminů a
aminokyselin před oxidací (tokoferol - vitamín E)
Zabraňuje hnědnutí jablek přídavkem malého
množství citronové šťávy
Kyselina askorbová (vitamin C) obsažená v mnoha
citrusových plodech, je přírodní antioxidant a je proto
často užívána v mnoha potravinářských výrobcích
(E300-E302)
Metody stanovení antioxidantů
HPLC – UV – VIS
HPLC - MS
HPLC ve spojení s detektorem CoulArray
GC - FID
MEKC – micelární elektrokinetická chromatografie
CZE – kapilární zónová elektroforéza - malá spotřeba
vzorku, krátká doba analýzy či velká separační
účinnost, analýza antioxidantů v kakau
Celková antioxidační kapacita - TEAC metoda, ORAC
metoda, FRAP metoda, Metoda s Folin-Ciocalteovým
činidlem
Fyzikálně-chemické metody - Elektronová spinová
rezonance, stanovení redox potenciálu,
chemiluminiscence
Antioxidační aktivita – celková antioxidační kapacita
porovnávání antioxidačních účinků →celková antioxidační
aktivita TAA (total antioxidant activity), která kvalifikuje
kapacitu vzorku biologického materiálu eliminovat radikály
schopnost sloučeniny (směsi látek) inhibovat oxidační
degradaci různých sloučenin (např. zabraňovat peroxidaci
lipidů)
Jde o poměr antioxidačního účinku vzorku k roztoku Troloxu
nebo kyseliny askorbové koncentrace 1 mmol/l.
Stanovení: →metody chemické: založeny na použití činidel
poskytujících s volnými radikály barevné produkty, jejichž
vzniku brání ve vzorku obsažené antioxidanty. Intenzita
zbarvení se většinou měří spektrofotometricky
→fyzikálně- chemické – sledují změnu fyzikálních
vlastností, které tyto procesy doprovází.
Metody stanovení polyfenolických látek
HPLC- UV – VIS
 - Vit. C - šípky, citronová šťáva ,
čerstvá a tepelně upravená zelenina
(brambory, brokolice, kapusta, pór,
petržel, paprika, rajčata…) a ovoce.
 Kyselina chlorogenová- šípky,
citronová šťáva , čerstvá a tepelně
upravená zelenina (brambory,
brokolice, kapusta, pór, petržel,
paprika, rajčata…) a ovoce.
 (-)-Katechin, kyselina gallovájahodník, maliny, borůvky, brusinky
 katechin, epikatechin, resveratrol,
kvercetin, rutin, antokyany a
antokyanidiny – vzorku červ. a bílého
vína
 BHA, BHT, TBHQ, galláty
HPLC ve spojení s detektorem
CoulArray
 - jedna z nejcitlivějších metod pro
stanovení přírodních antioxidantů
 k separaci se využívá systému
obrácených fází, kdy stacionární fáze
je nepolární a mobilní fází je polární
rozpouštědlo. Vodivost mobilní fáze se
zvyšuje přídavkem soli(pufry)
 citlivost, selektivita, možnost práce s
gradientovou elucí a využití poměru
signálů z cel s různými vloženými
potenciály k identifikaci látek.
 Meze detekce CoulArray detektoru se
pohybují řádově až v mg.l-1 v
závislosti na typu sledované
elektroaktivní látky
Přírodní antioxidanty v ovoci - jablka
Metody stanovení fenolických sloučenin v jablkách
• Nejčastěji konzumované ovoce
• HPLC – DAD
• Vysoké nutriční hodnoty, vysoká dostupnost,
moderní metody skladování – prodloužení
trvanlivosti ovoce až na 6 měsíců
(+) - katechin a (-) - epikatechin (flavan-3-oly nebo flavanoly),
phloridzin (DIHYDROCHALKON glykosidy), quercetin (flavonoly),
cyanidiny
• Není ovocem s největší antioxidační
kapacitou
(anthokyanidiny), kyanidin-3-O-galaktosid (antokyany),
chlorogenová kyselina fenolové kyseliny) a deriváty
hydroxaskořicové kyseliny(kumarová kyselina)
• variabilita polyfenolového profilu je ovlivněna
odrůdou (kultivarem),dobou zrání, etapou
vegetačního období, environmentálními
faktory, geografickou oblastí, výrobní
technologií a podmínkami skladování
• LC – MS
• GC – MS
Obecně: obsah polyfenolických sloučenin:
Účinky: phlorethin, phloridzin, quercetin – vliv
na hormony ŠŽ, katecholaminy, steroidy
19,6 a 55,8 (flavan-3-olů), 17.7-33.1 (flavonoly) a 10.6-80.3
(chlorogenová) mg na 1 plod
antimutagenní, protizánětlivé účinky
procyanidinů
nejnižší hodnoty byly zaznamenány pro phloridzin (1.0-9.3 mg na
plod) a anthocyaninu 0,1 až 6,5 mg na 1 plod
- Vyšší koncentrace i výskyt polyfenolických sloučenin ve
slupce než v dužnině
Stanovení individuálních polyfenolických látek
Instrumentace a podmínky:
- Agilent Technologies Infinity 1260
Kolona: Kinetex Core Shell Technology C18 (150 x 4,6
mm) 5µm Phenomenex, 35 0C,
Gradientová eluce: voda : ACN s 0,1% HCOOH, pH = 3
Detekce a kvantifikace: 255, 280 nm, 320 a 365 nm
Standardy:
chlorogenová kyselina
galová kyselina
kávová kyselina
kumarová kyselina
syringová kyselina
ferulová kyselina
hesperidin
phloridzin
phloretin
quercetin
myricetin
katechin
epikatechin
resveratrol
rutin
Obr 1: Chromatogram separace směsného vzorku
vybraných standardů fenolických látek
Stanovení individuálních polyfenolických látek v
reálných vzorcích LC - DAD
Příprava vzorku: v rámci optimalizace vyzkoušeny různé
varianty extrakce: 100% MeOH, 50% MeOH, 50% ACN a
100% ACN
Nejvyšší výtěžnost extrakce: extrakce v 100% MeOH
Závěr: vyvinuta metoda pro stanovení obsahu
antioxidantů, založena na stanovení vybraných standardů
pomocí kapalinové chromatografie s DAD
Provedena optimalizace metody pro stanovení reálných
vzorků a využití pro následnou validaci metody
Chromatogramy separace vybraných antioxidantů v
reálných vzorcích
Obr. 2: LC – DAD chromatogram slupky odrůdy
Golden Delicious při 255, 280, 325 a 360 nm
Obr. 3: LC –DAD chromatogram slupky odrůdy
Lady Sylvia při 255, 280, 325 a 360 nm
Stabilita fenolických látek v jablku během sklizně a
skladování
Kultivar, zrající etapa, vegetační období, agrotechnické zásahy, geografická oblast
Závislost: doba a teplota skladovacích prostor – plody skladované při teplotě 10C po dobu
60 dní snížení obsahu polyfenolů ve slupce o 20% a v dužnině až o 50%
Skladování při pokojové teplotě 200C - obsahy polyfenolů se téměř nemění
Skladování při teplotě 40C: dochází pouze k nepatrnému poklesu individuálních
polyfenolů
• Vitamín C: při pokojové výrazný pokles koncentrace vitamínu C než při skladování při
teplotě 40C
• Kyselina chlorogenová patří k nejvýznamnějším a nejvíce zastoupeným antioxidantům
flavonoidní povahy přítomným v plodech jablek - její pokles může být způsoben
podobně jako u askorbátu postupnými negativními změnami plodů spojenými s
dlouhodbým skladování, může dojít k postupnému rozkladu nebo i k vyčerpání vlivem
mobilizace antioxiačních systémů plodu.
• Hodnoty celkových polyfenolů – se při teplotě skladování 4, 8, 200C liší se pouze
minimálně. V průběhu skladování ve všech prostředích nejprve obsah celkových
polyfenolů vzrůstá, pak dochází k mírnému poklesu a ke konci uchovávání hodnoty
opět mírně stoupají. Souvislost se změnou koncentrace kyslíkupři uchovávání,
případně i s teplotou a stupněm zrání.
Stanovení individuálních polyfenolických látek v
reálných vzorcích LC - Coularray
 Ve srovnání s jinými detektory je
výrazně selektivnější a citlivější, odezva
je málo ovlivňována přítomností
interferujících látek →odpadá
zdlouhavá a náročná úprava vzorku
 Identifikace látek:
• na základě retenčních časů
• poměrů odezvy signálu detektoru při
různých vložených potenciálech na
elektrody, zejména z poměru ploch prea postdominantních píků k ploše píku
dominantního
 Charakteristika látky: pokud se oxiduje
při nízkém potenciálu je silnějším
antioxidantem
Chromatogramy fenolických látek v reálných vzorcích
Obr. 4: LC - Coularray chromatogram jablečné šťávy
odrůdy Florina
Obr. 5: LC - Coularray chromatogram jablečné šťávy
odrůdy Gala
Přírodní antioxidanty v ovoci - meruňky
 ovoce s vysokým obsahem přírodních antioxidantů – vitamín A (beta karoten),
vitamín C
 Bohaté na polyfenolické antioxidanty – flavonoidy (chlorogenová kyselina,
quercetin, proanthocyanidiny, katechin, epikatechin, hydroxyskořicová
kyselina, galová kyselina, kávová kyselina, kumarová kyselina, ferulová
kyselina)
Pro vysoký obsah zdraví prospěšných látek se meruňky začínají vysoce
atraktivním konzumovaným ovocem (antimutagenní, antikarcinogenní,
protizánětlivé a antibakteriální účinky)
Přírodní antioxidanty v ovoci – třešně, višně
Zrání souvisí se změnou barvy, kumulací polyfenolických sloučenin,
anthokyanů a degradací chlorofylu
Odlišná koncentrace polyfenolů v částech plodů – ve slupce vyšší
koncentrace – souvisí s organoleptickými vlastnostmi (chuť, svíravost)
anthokyany: cyanidin 3-glucosid, cyanidin 3-rutinosid, cyanidin 3sophorosid, pelargonidin 3-glucosid, pelargonidin 3- rutinoside, 3glucosid, peonidin 3-rutinosid
Fenolické kyseliny: neochlorogenová a p-kumaroylquinic. kyselina
• Flavonoly, flavan-3-ol: katechin, epikatechin, quercetin 3-glukosid,
quercetin 3-rutinosid, kaempferol 3-rutinosid
Zdravotní benefity:
Vysoký obsah anthokyanů a polyfenolů – působí proti onemocnění
srdce, diabetes a protirakovinné účinky
Přírodní antioxidanty v ovoci
OVOCE, produkty
OBSAHOVÉ ANTIOXIDANTY
jablečný džus
chlorogenová kyselina, phlorethin glycosid, vitamin C
jablečné výlisky
epikatechin (dimer procyanidin B2), quercetin glucosid, chlorogenová kyselina,
phloridzin, 3- hydroxyphloridzin
jablka
chlorogenová kyselina, phlorethin glycosid, vitamin C
broskvoně
chlorogenová kyselina, neochlorogenová kyselina
hrušně
chlorogenová kyselina
slivoně
chlorgenová kyselina, neochlorogenová kyselina
třešně
neochlorogenová kyselina, anthokyany, katechin, epikatechin
meruňky
chlorogenová kyselina, quercetin, hydroxyskořicová kyselina, galová kyselina,
kávová kyselina, kumarová kyselina, ferulová kyselina, vitamín A, C
borůvky
anthocyany, deriváty kyseliny hydroxyskořicové, flavonoidy
Budoucnost
Stanovení zdraví prospěšných látek v ovoci – antioxidanty,
vitamíny, alergeny
Výzkum a šlechtění odrůd ovoce s vysokým obsahem těchto
látek
Propagace a metodika stanovení zdraví prospěšných látek v
různých druzích ovoce
Děkuji za pozornost
Kontakt:
RNDr. Bílková Aneta
Oddělení genetiky a šlechtění
Výzkumný a šlechtitelský ústav Holovousy s.r.o
Email: [email protected]
+420 777 588 826