PCR v diagnostice Lymeské borreliózy

PCR v diagnostice Lymeské
boreliózy
Plíšková L.
Ústav klinické biochemie a
diagnostiky LF a FN Hradec Králové
Diagnostika lymeské boreliózy
Dobtížná
Dklinický obraz – velmi rozmanitý
Danamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %)
Dlaboratorní
l b
í - nejednoznačnost laboratorních
í nálezů
á ů
elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA),
western blot, imunofluorescenčníí analýza,
ý
PCR, …
DCSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm.
mononukleáry)
y , celkové bílkoviny
y (↑, někdyy ↑
gamaglobuliny) × někdy norm. nález
Molekulárně biologické metody (PCR)
Dvýhody – rychlost, citlivost, specifita, možnost
vyšetření v jakémkoliv materiálu
Dúskalí
ú k lí
D preanalytická
fáze – výběr pacientů, materiálů a
jejich načasování, podmínky transportu apod.
D příprava vzorků, izolace, uchování DNA
D výběr primerů, validace metody
D kontrola kvality
y (VKK,
(
, EHK))
Preanalytická fáze
Dvýběr pacientů – dif. dg.
D akutní
LB - genom. DNA ve vyšších konc.
D chronická LB – stopová množství genom. DNA (doplnit
plazmidové DNA)) ⇒ ↑ záchytnost
y
???
o detekci p
Dvýběr materiálů, načasování odběru
D materiály
– krev,
krev likvor,
likvor moč
moč, synoviální tekutina
tekutina, tkáň
tkáň,
vzorky kůže z EM apod. X klíště
D volba materiálu – dle příznaků, stádia a doby onem.
D transport – v chladu (nemrazit!!!) – vysoká teplota
snižuje
j p
procento pozitivity,
p
y, hemolytické
y
materiály
y
⇒ ↑ inhibicí
Materiály
Dkrev
k
– nízká
í ká senzitivita
iti it
D boreliémie
pouze krátkodobá, přechodná, pouze
v období diseminovaného onem
onem. (EM
(EM, neuroborelióza,
neuroborelióza
karditidy)
Dp
plazma
m (10)
( ) X sérum
m ((20)) X p
plná krev ((100
spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996
DCSF – neuroborelióza
D nepřímá
závislost na délce trvání onem. – do 2 týdnů
PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % Lebech et al.,
al Mol
Mol. Diagn.,
Diagn 2000
D možnost
adheze ke tkáním ⇒ nízká senzitivita
v pozdních stádiích,
stádiích význam PCR pouze v časných
stádiích
Materiály
Dmoč
č
D nižší
senzitivita, nereprodukovatelnost
D neodebírat 1. proud ranní moče
D centrifugace při 36 000 g (při 14 000 g všechny moče
negat.) – Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002
Dsynoviální tekutina – artritida
D vyšší
procento pozitivit
D závislost na antibiotické terapii
p –p
po léčbě negat.
g
PCR
v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB
v synoviální membráně
P i
Priem
et al.,
l A
Ann. Rh
Rheum. Di
Dis., 1998
Materiály
Dkůže
kůž – kožní
k ž í manifestace
f
D vysoká
senzitivita
Dléze EM - 36 až 88 %
Dpac. s chron. atrofickou akrodermatitidou – 54 až 100 %
D uchování
h á í
v transportním,
t
t í kultivačním
k lti č í médiu
édi – po 24
hod. migrace spirochét do média ⇒ izolace DNA
z kůže,
kůže ale i z média
Dklíště – výpovědní hodnota ???
D pozitivní
nález ⇒ nemusí znamenat nákazu (doba přisátí
klíštěte – odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi
nízké)
D význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie
Izolace
D co nejdříve (zamrazit max.
max 3 měsíce)
Dporovnání 3 izolací – Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect.
Dis., 2003
D fenol-chloroformová
extrakce, QIAamp DNA kity
(OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA
Pure (mg.
(mg partikule) ⇒ stejná citlivost u vzorků krve
krve, CSF
CSF,
synov. tekutiny X moč – horší citlivost u QIAamp DNA
kitu
DÚKBD – porovnání 2 izolací
DQ
QIAamp
p
DNA Mini Kit, MagNA
g
Pure LC DNA Isolation
Kit III ⇒ srovnatelná citlivost
DCSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd.
D centrifugace
max. otáčky ⇒ sediment
D uchování DNA – 2 až 8°C (↓ teplota - ↓ citlivost)
Výběr primerů
Dneobvyklý genom BB – lineární chromozom + různý
p
počet
lineárních a cirkulárních plazmidů
p
((BB jje mohou
„ztrácet“) ⇒ škála Ag specifit ⇒ výběr primerů
(schopnost detekce DNA BB)
G - transport a metabolizmus
sacharidů
J - translace,
t
l
ribosomální
ib
ál í
struktura a biogeneze
L - DNA replikace, rekombinace a
oprava
M – biogeneze buněčného obalu,
vnější membrány
R – hlavní funkce jje p
pouze
předpokládána
U – neznámá funkce
- Borrelia burgdorferi B31 –
NC 001318 lineární
NC_001318,
li á í dsDNA,
d DNA délka
délk
910 724 bp, 874 genů, 21 plazmidů
(9 lineárních a 12 cirkulárních)
- Borrelia afzelii PKo –
NC_008277, lineární dsDNA, délka
905 394 bp,
p 894 genů,
g
8 p
plazmidů
(6 lineárních a 2 cirkulárních)
- Borrelia garinii Pbi
NC_006156, lineární dsDNA, délka
904 246 bp, 904 genů, 2 plazmidy
(1 lineární a 1 cirkulární)
Výběr primerů
D1. PCR – 1989 (chromozomální gen)
pu
o áno mnoho ssekvencí
nc primerů
pr m rů z různých
Dpublikováno
genů
m z m
oblast
- chromozomální
D 5S/23S
rRNA, recA, flagellin
- plazmidová oblast
D OspC,
OspA
Dkomerční kity
D nejčastěji
D
flagelin gen (FlaB)
flagelin.
př. QIAGEN, GeneProof, Dynex …
Vývoj
ý j metody
y – nested PCR
Flagelinový gen
rDNA gen
Vývoj
ý j metody
y – rt PCR
HLA DQ
Flagelinový gen
QuantiFast + IC
Porovnání různých metod
Validace metody
Detekce DNA BB a IC v jjedné zkumavce
- flagelinový gen, QuantiFast Pathogen + IC
Specifita
Spec
f ta – B.gar
B.garinii,
n , B. afzel
afzelii,, B. burgdorferi
burgdorfer s.s.,
B.valaisiana
Mez detekce – 1 – 2 org. BB/ml, resp. 0,39 pg BB/ml
Opakovatelnost – CV = 1,35 %
Mezilehlá přesnost – CV = 11,35
35 %
Kontrola kvality – VKK, EHK
Kontrola kvality - VKK
chybovost
y
1 řádu
počet
procenta
1 řád
65
90,3
mimo 1 řád
7
9,7
celkem
72
Pozitivní, negativní, inhibiční kontrola
chybovost
1/2 řádu
počet
procenta
1/2 řádu
46
63,9
mimo 1/2 řádu
26
36,1
celkem
72
Kontrola kvality
DEHK - INSTAND e. V.
D mezilaboratorní
porovnání
(reprodukovatelnost)
D r.
r 2008 – 2010
100 lab.
lab
D ověření metody (validace)
Soubor pacientů vyšetřených metodou rtPCR na
přítomnost DNA Borrela burgdorferi sensu lato
rok
krev
likvor
2008
403/0 986/8
39/0
1428/8
2009
240/0 852/9
56/2
1148/11
2010
205/0 823/7
36/1
1064/8
131/3
3640/27
celkem 848/0 2661/24
punktát celkem
p
Závěr
DPCR není v dg.
g LB 100%
Dnegativní výsledky nevylučují onemocnění X
pozitivní výsledky onemocnění potvrzují
Dnutnost výběru pacientů, resp . načasování
odběru výběr biologického materiálu
odběru,
materiálu, dodržení
preanalytické fáze
Dv laboratoři udělat maximum (validní výsledky)
Dklinická korelace PCR je neuspokojivá
Děkuji za pozornost.