Vliv stresových podmínek na aktivitu telomer u Drosphila melanogater

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
Obor SOČ: 4. Biologie
Vliv stresových podmínek na aktivitu telomer
u Drosophila melanogaster
Eliška Kozáková
Kraj: Jihočeský kraj
České Budějovice 2015
Věda pro veřejnost / cesta k udržitelnému rozvoji (reg. č. projektu: CZ.1.07/2.3.00/35.0002)
STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
Obor SOČ: 4. Biologie
Vliv stresových podmínek na aktivitu telomer
u Drosophila melanogaster
Effect of stress conditions on telomeric activity
by Drosophila melanogaster
Autor: Eliška Kozáková
Škola: Česko – anglické gymnázium, s. r. o. v Českých Budějovicích
Kraj: Jihočeský kraj
Konzultant: Mgr. Michala Korandová
České Budějovice 2015
Věda pro veřejnost / cesta k udržitelnému rozvoji (reg. č. projektu: CZ.1.07/2.3.00/35.0002)
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracovala samostatně a použila jsem pouze
podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ.
Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné.
Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem
č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a
o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění.
V Českých Budějovicích
dne 12. 3. 2015
……………………………
Eliška Kozáková
Poděkování
V této části bych ráda poděkovala všem, kteří mi s prací jakkoliv pomohli. Můj
velký dík patří především mé konzultantce Michale Korandové, která mě při práci vedla
tím správným směrem, byla tu pro mě vždy, když jsem cokoliv potřebovala – ať už to
byla pomoc při pokusech, při hledání a sepisování informací či podpora, a hlavně se
mnou měla nevyčerpatelnou trpělivost.
Dále bych také chtěla poděkovat projektu Věda pro veřejnost / cesta
k udržitelnému rozvoji (reg. č. projektu: CZ.1.07/2.3.00/35.0002), který celou práci
financoval.
Anotace
Je předpokládáno, že stres způsobený vlivem vnějších i vnitřních stresových
podmínek má vliv na celkovou transkripci v genomu a délka telomer (koncových částí
chromozómů)
může
na tento
stres
reagovat.
Převážně
je
studován
vliv
environmentálního stresu na telomery člověka. Předpokládá se ale, že podobný vliv
existuje i u bezobratlých. Nebyly doposud však provedeny žádné detailní studie. Cílem
této práce tedy bylo přispět svými výsledky k lepšímu poznání vlivu stresových faktorů,
zde reprezentovanými změnou fotoperiody, na aktivitu telomer u modelového
organismu Drosophila melanogaster. Pro práci byly využity drozofily, které měly
ve svém genomu transgenní konstrukt HeTom s genem pro fluorescenční protein
Tomato. Získané výsledky naznačily, že čím kratší telomery byly, tím intenzivnější byla
fluorescence. Díky těmto výsledkům bude možné touto metodou dále získávat základní
přehled o vlivu jednotlivých stresových faktorů na to, jak moc jsou telomery vlivem
stresových podmínek zkracovány.
Klíčová slova: Drosophila melanogaster; telomery; fluorescence; protein Tomato; stres
Annotation
It is assumed that the stress caused by the influence of external or internal stress
conditions affects the transcription of the total genome and length of telomeres (end
parts of chromosomes) which can respond to this stress. Mainly, the impact
of environmental stress on human telomeres is studied. However, it is assumed, that
a similar effect exists even in invertebrates. Nevertheless any detailed studies haven´t
existed yet. The object of this work was to contribute results to a better understanding of
the influence of stress factors, represented here by changing photoperiod, on the
telomeric activity by the model organism Drosophila melanogaster. Drosophila, which
have in their genome transgenic construct HeTom with gene for a fluorescent protein
Tomato, were used for this study. The results indicated that the shorter telomeres were,
the more intense fluorescence was. With these results, basic knowledge about the
influence of various stress factors on how much telomeres are shortened due to stress
conditions can be further gained by this method.
Key words: Drosophila melanogaster; telomeres; fluorescence; protein Tomato; stress
Obsah
1
Úvod.......................................................................................................................... 1
1.1
1.1.1
Životní cyklus a rozmnožování................................................................... 2
1.1.2
Modelový organismus................................................................................. 3
1.2
Chromozóm ................................................................................................ 4
1.2.2
Genom D. melanogaster ............................................................................. 6
Telomery ............................................................................................................ 6
1.3.1
Telomery u D. melanogaster ...................................................................... 7
1.3.2
Retrotranspozice ......................................................................................... 8
1.4
Oxidativní stres .................................................................................................. 9
1.4.1
Vliv oxidativního stresu na délku lidských telomer ................................. 10
1.4.2
Vliv oxidativního stresu na délku telomer u D. melanogaster ................. 10
Cíle .......................................................................................................................... 12
2.1
3
Genom D. melanogaster .................................................................................... 4
1.2.1
1.3
2
Drosophila melanogaster ................................................................................... 1
Dílčí cíle ........................................................................................................... 12
Materiál a metody ................................................................................................... 13
3.1
Využité kmeny drozofil.................................................................................... 13
3.2
Sledování fluorescence v závislosti na pohlaví ................................................ 14
3.3
Posouzení vlivu fotoperiody ............................................................................ 14
3.4
Rozšíření sledování vlivu fotoperiody ............................................................. 14
3.5
Vliv fotoperiody u různých linií HeTom ......................................................... 15
3.6
Vliv fotoperiody ve třech po sobě následujících dnech ................................... 15
3.7
Vztah intenzity fluorescence a délky telomer .................................................. 15
3.8
Vyhodnocování intenzity fluorescence ............................................................ 16
4
Výsledky ................................................................................................................. 17
4.1
Sledování fluorescence v závislosti na pohlaví ................................................ 17
4.2
Posouzení vlivu fotoperiody ............................................................................ 18
4.3
Rozšíření sledování vlivu fotoperiody ............................................................. 19
4.4
Vliv fotoperiody u různých linií HeTom ......................................................... 20
4.5
Vliv fotoperiody ve třech po sobě následujících dnech ................................... 21
4.6
Vztah intenzity fluorescence a délky telomer .................................................. 22
5
Diskuze a závěr ....................................................................................................... 24
6
Použitá literatura ..................................................................................................... 27
6.1
Vědecké články ................................................................................................ 27
6.2
Internetové zdroje............................................................................................. 31
1 Úvod
1.1 Drosophila melanogaster
Octomilka obecná (Drosophila melanogaster), čeledi octomilkovití a řádu
dvoukřídlí, je lidově známá jako „ovocná nebo vinná muška“ především kvůli jejímu
hojnému výskytu na kvasícím ovoci, marmeládách, ovocných šťávách atd. Dokonce i
její larvy žijí přirozeně v hnijící dužině ovoce
(http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka_obecná).
Larvy
se
živí
kvasinkami
a
mikroorganismy rozkládajícími ovoce, dospělci poté hnijícími rostlinami, ovocem nebo
houbami (http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka).
Dnes můžeme octomilky obecně najít po celém světě (kromě Antarktidy),
obzvlášť pak v tropických oblastech. Jejich původním biotopem jsou euroasijské tropy,
do ostatních částí světa se rozšířily vlivem lidské činnosti (např. transportem ovoce).
Díky jejich velké přizpůsobivosti jsou schopné přežívat i v takových oblastech jako
pouště, vysoké hory nebo dokonce severní oblasti. Špatná snášenlivost chladu je ale nutí
stahovat se do lidských obydlí
(http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_melanog
aster.html). Některé ze severských druhů i hibernují
(http://www.priroda.cz/clanky.php?detail=2021). Přímo D. melanogaster se označuje již
za druh domestikovaný kvůli její pevné vazbě na lidi
(http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka).
Divoká forma octomilky obecné je žlutohnědě zbarvena a její oči mají
kontrastní, jasně červenou barvu
(http://www.biologydaily.com/biology/Drosophila_melanogaster). Typickým znakem
pro všechny octomilky je ochmýřená stopka (arista), která spojuje hlavu s hrudí
(http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka).
U
octomilek
se
objevuje
sexuální
dimorfismus. Samičky dorůstají 2 – 3 mm, samečci jsou oproti nim jen asi milimetroví,
dále jim pak kolem řitního otvoru a genitálií raší shluk tmavých chlupů a svrchní stranu
zadečku pokrývá výrazná černá skvrna (Obr. 1)
(http://www.biologydaily.com/biology/Drosophila_melanogaster).
1
Obrázek 1:
Sexuální
dimorfismus
u drozofily.
Samice
nahoře,
samec
dole.
(http://www.songbirdgarden.com/store/prodimages/FlightlessFlyMaleFemale.jpg)
1.1.1 Životní cyklus a rozmnožování
Octomilka obecná náleží do skupiny hmyzu s proměnou dokonalou, tzn. že její
životní cyklus lze rozdělit na období vajíčka, třech larválních instarů, kukly a dospělce
(Obr. 2). Délka vývoje velmi závisí na několika faktorech. Hlavní vliv má teplota.
Nejrychleji se vyvíjí při teplotě 25°C, kdy se larvy začínají kuklit již po uplynutí čtyř
až pěti dnů. Naopak při teplotách vyšších než 28°C a nižších než 20°C se vývoj
v důsledku teplotního šoku značně prodlužuje. Při ideálních 25°C se tedy larvy
z vajíček líhnou již po 20 hodinách od nakladení (i to závisí na teplotě – samičky
přestávají klást při teplotě nižší než 15°C) (Ashburner a Thompson, 1978; Ashburner a
kol., 2005; Bloomington Drosophila Stock Center). Larvy se během čtyř až pěti dní
vyvinou z prvního do třetího instaru a následně se zakuklí. V kukle se mění v dospělce
další čtyři dny a poté je vývoj ukončen (Ashburner a Thompson, 1978; Ashburner a
2
kol., 2005). Jedním z dalších faktorů je také množství jedinců pohromadě – při velkém
množství se octomilky vyvíjí pomaleji (Chiang a Hodson, 1950; Bakker, 1961).
Obrázek 2: Životní cyklus D. melanogaster
Samice jsou schopny rozmnožování již po 8 – 12 hodinách od vylíhnutí. Vše
začíná námluvním aktem – samec „tančí“ kolem samice a snaží se zaujmout
její pozornost
máváním
křídly.
Po námluvách
(http://www.priroda.cz/lexikon.php?detail=2021).
dochází
Samice
si
k samotné
v těle
kopulaci
přenechává
spermatické buňky od několika samců, aby z nich pak mohla vybrat ty s nejlepším
genotypem (Clark a kol., 1995; Hughes a kol., 1997). Po oplodnění je schopna klást
až 100 vajíček za den, nejčastěji ale klade zhruba 4 – 15. Doba kladení vajíček se
pohybuje
7 dnů
kolem
(Ashburner, 1989;
http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka#Rozmno.C5.BEov.C3.A1n.C3.AD).
1.1.2 Modelový organismus
Octomilka obecná je hojně využívána jako modelový organismus, a tak patří
k těm nejlépe prozkoumaným. První výzkumy provedl v roce 1901 William E. Castle
z Harvardské univerzity
spolu
se
3
svými
studenty
(http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1933/morgan-bio.html).
V roce
1906 publikoval spolu s Carpenterem, Clarkem, Mastem a Barrowsem první článek
„The effects of inbreading, cross-breading, and selection upon the fertility and
variability of Drosophila“ (Lakovaara, 1982).
Mnohem důležitější byl však Thomas Hunt Morgan, který s D. melanogaster
začal pracovat v roce 1906. Brzy nato představil světu prvního mutanta s bílýma očima,
zmapoval chromozómy divokého kmenu octomilky obecné a jejích mutantů a spolu
s dalšími
kolegy
vytvořil
nové
fenotypy
octomilek (http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1933/morganbio.html).
Hlavními důvody, proč je octomilka obecná modelovým organismem, jsou:
 Octomilky jsou malé a nenáročné na chov v laboratorních podmínkách.
 Doba vývoje jedince je krátká, trvá přibližně dva týdny.
 Velká produkce potomků (samice s dostatkem potravy je schopna naklást více
než 800 vajec za celý život) (Adams a kol., 2000).
 Má jen 4 páry chromozómů (jeden pár pohlavních chromozómů a tři páry
autozómů).
 Samci nemají meiotickou rekombinaci, což velmi usnadňuje genetické studie.
 Ve slinných žlázách larev třetího instaru se vyskytují polytenní chromozómy.
 Genom byl osekvenován a poprvé publikován v roce 2000 a je přístupný
v databázi Flybase (Adams a kol., 2000).
 Historické důvody (za již více než sto let je velmi dobře prozkoumaným
objektem a díky tomu lze provádět výzkumy složitějších fyziologických dějů)
(http://ceolas.org/VL/fly/intro.html).
1.2 Genom D. melanogaster
1.2.1 Chromozóm
V každém chromozómu je uložen úsek genetické informace. Jeden chromozóm
je tvořen dlouhou lineární molekulou DNA a proteiny – bazické bílkoviny (histony) a
kyselé bílkoviny nehistonového charakteru. DNA se obtáčí kolem histonů. Z takovýchto
4
osmi histonů vznikají nukleozómy, které se pak spiralizují do vlákna. Vlákno se
při buněčném dělení dále spiralizuje a chromozóm tak nabývá všeobecně známého
tvaru. V tomto tvaru je možné ho pozorovat pod mikroskopem (http://www.genetikabiologie.cz/chromozomy;
http://www.biomach.cz/genetika/-chromosomy). Komplex
DNA ve formě šroubovice s proteiny se nazývá chromatin. Chromatin má dva typy.
Euchromatin je dekondenzovaný, rozvolněný, málo spiralizovaný chromatin, jenž je
na rozdíl
od heterochromatinu
transkripčně
aktivní.
Heterochromatin
je
více
kondenzovaný a spiralizovaný než euchromatin a neobsahuje téměř žádné geny
(http://www.genetika-biologie.cz/chromozomy;
http://www.biomach.cz/genetika/-
chromosomy). V období interfáze je chromozóm v despiralizovaném (rozvolněném)
stavu (dlouhá, tenká, vzájemně propletená vlákna) a pod mikroskopem ho spatřit nelze
(http://www.genetika-biologie.cz/chromozomy;
http://www.biomach.cz/genetika/-
chromosomy).
Při buněčném dělení má chromozóm tyto části: 2 chromatidy, centromeru
(zúžená oblast mezi chromatidami, kde se na sebe chromatidy pojí), 4 telomery
(zakončení chromatid), krátké (p) a dlouhé rameno (q) (části chromatid rozdělených
centromerou)
(Obr. 3)
(http://www.genetika-biologie.cz/chromozomy;
http://www.biomach.cz/genetika/-chromosomy).
Obrázek 3: Struktura chromozómu při buněčném dělení. A – struktura metafázního chromozómu
s popisky (telomera, centromera, sesterské chromatidy, krátké a dlouhé raménko); B – chromozóm
v metafázi pod elektromikroskopem (http://www.biopedia.sk/bunka/cytomorfologia/chromozom.jpg)
Chromozómy se dělí na autozómy a gonozómy. Autozómy, jinak také somatické
chromozómy, tvoří shodné páry a jejich výskyt není příznačný pro určité pohlaví.
Oproti nim gonozómy, pohlavní chromozómy, určují pohlaví jedince. Značí se písmeny
5
X a Y, jak to známe například u člověka. Určení pohlaví u drozofily je ale jiné. Nezáleží
totiž na přítomnosti gonozómu Y u samce. O tom, zda se vylíhne samice či samec,
rozhoduje poměr gonozómů X ku autozomům. Pokud je poměr 1 (XX : AA), vylíhne se
samice. Pokud je poměr 0,5 (X : AA), vylíhne se samec (http://www.genetikabiologie.cz/chromozomy; http://www.biomach.cz/genetika/-chromosomy).
1.2.2 Genom D. melanogaster
Pod pojmem genom rozumíme soubor veškeré genetické informace konkrétního
organismu (http://cs.wikipedia.org/wiki/Genom). Genom octomilky obecné se skládá
z jednoho páru gonozómů X/Y a třech párů autozómů. Ty se značí jako 2, 3 a 4
(http://www.ceolas.org/fly/intro.html). Autozóm 4 nese gen white pro červenou barvu
oka drozofily, jinak ale není velmi prostudován. Obsahuje minimální počet genů a
je malý oproti ostatním chromozómům (Halligan a Keightley, 2006). Celý genom
se skládá ze 180 miliónů bází – 60 miliónů tvoří heterochromatin a 120 miliónů
euchromatin, který se objevuje hlavně na dvou největších autozómech a na gonozómu X
(Adams a kol., 2000).
1.3 Telomery
Koncové části chromozómů se nazývají telomery, které se u většiny organismů
skládají ze série krátkých opakujících se sekvencí (např. u hmyzu TTAGG, u člověka
TTAGGG,…). U octomilky je tomu ale jinak (viz níže) (Capkova Frydrychova a kol.,
2008). Telomery jsou nukleoproteinové struktury a jsou velmi důležité v mnoha
ohledech. Chrání konce chromozómů před vzájemnými chromozomálními fúzemi a
před nukleázami, odlišují konce chromozómů od dvouřetězcových zlomů a kompenzují
zkracování chromozómů při buněčném dělení (DNA polymeráza nedokáže zkopírovat
chromozóm až do jeho konce). Kompenzace zkracování telomer je zajištěna pomocí
enzymu telomerázy (Blackburn, 1991) .
Telomeráza je ribonukleový komplex fungující jako reverzní transkriptáza (Shay
a kol., 2001). Z molekuly RNA, kterou obsahuje, přepisuje DNA, jejíž krátké sekvence
váže k chromozómovým koncům a nahrazuje tak ztráty (Wyatt a kol., 2010).
Nejaktivnější je u embryí, novorozenců, ve varlatech a vaječnících dospělých jedinců a
6
v dělících se buňkách jako vlasové, nehtové a kožní buňky (Wright a kol., 1996).
Její zvýšená aktivita je spojena se vznikem nádorových onemocnění, snížená zase
s procesem stárnutí (Wright a kol., 1996; Zhu a kol., 2011).
1.3.1 Telomery u D. melanogaster
Drozofilí telomery nejsou tvořeny sérií krátkých opakujících se sekvencí. Tvoří
je větší množství kopií třech telomericky specifických non-LTR retroelementů (nonlong-terminal-repeat retrotransposable elements), jež jsou v telomeře nahodile seřazeny.
Těmito retroelementy jsou úseky HeT-A, TART a TAHRE. Celkově se tato oblast
označuje jako HTT (Mason a kol., 2008; Capkova Frydrychova a kol., 2009).
Element HeT-A je dlouhý 6 kb. Obsahuje jeden otevřený čtecí rámec ORF, který
kóduje protein Gag. Také u něj nalezneme délkově variabilní sekvenci oligo(A), která
je nezbytná pro připojení elementu ke chromozomálnímu konci (Biessmann a Mason,
2003; Pardue a DeBaryshe, 2003).
TART je dlouhý 12 kb a má na rozdíl od HeT-A dva čtecí rámce – ORF1 a
ORF2. ORF1 stejně jako u HeT-A kóduje protein Gag. Druhý čtecí rámec má za úkol
kódovat protein Pol s endonukleázovou doménou a funkcí reverzní transkriptázy
(Capkova Frydrychova a kol., 2009; Casacuberta a Pardue, 2005).
TAHRE je velmi podobný předchozímu elementu. Také obsahuje dva čtecí
rámce ORF1 a ORF2, které mají shodnou funkci jako u TART. Spekuluje se, že tyto dva
elementy mají společného předka (Shpiz a kol., 2007).
Celá oblast HTT je chráněna telomerickou čepičkou (Obr. 4). Ta má zajistit
stabilitu a celistvost genomu (Linger a Price, 2010). U drozofily se jedná
o multiproteinový komplex terminin. Složení drozofilí čepičky je opět jiné
než u člověka, jehož čepička je tvořena komplexem shelterin (Capkova Frydrychova a
Mason, 2013). Ovšem najdeme zde i pár proteinů, které mají drozofila s člověkem
společné – např. DDR, ATM, ATR proteiny (Cenci a kol., 2005). Terminin oproti
shelterinu není vázaný na specifickou telomerickou sekvenci. Díky tomu nemusí
u drozofily při poškození DNA dojít ke ztrátě stability genomu a buněčné smrti, protože
nová čepička se jednoduše vytvoří na konci zlomeného chromozómu (Capkova
Frydrychova a Mason, 2013).
7
Obrázek 4: HTT oblast s telomerickou čepičkou
1.3.2 Retrotranspozice
Octomilky nemají telomerázu, a tak retroelementy nahrazují ztráty na koncích
chromozómů prostřednictvím retrotranspozice. Retrotranspozice má několik kroků.
Nejdříve dochází k transkripci retroelementů (přepisu DNA na mRNA). Vzniklé
transkripty se jadernými póry přesouvají do cytoplasmy. Na ribozomech dochází
k translaci mRNA retroelementů na polypeptid Gag (překladu dědičné informace
v mRNA na protein). U elementů TART a TAHRE ještě probíhá translace reverzní
transkriptázy. Na transkripty retroelementů se pak navazuje protein Gag a ty jsou opět
transportovány do jádra. Pomocí 3' oligo(A) konce se připojí na chromozomální konec a
tam se reverzní transkripcí přetvoří na DNA (Obr. 5) (George a Pardue, 2003;
Biessmann a Mason, 2003).
Obrázek 5: Retrotranspozice. Nejprve dojde k transkripci retroelementů, poté k jejich přesunu
do cytoplasmy na ribozomy, tam se translatují na polypeptid Gag, Gag s transtkripty retroelementu
se transportují zpět do jádra na chromozomální konec, kde se reverzní transkripcí přetvoří zpět na DNA.
8
Telomery octomilek
se
ještě
prodlužují
i
genovou
konverzí,
avšak
retrotranspozice pořád zůstává hlavním mechanismem (George a Pardue, 2003;
Biessmann a Mason, 2003).
1.4 Oxidativní stres
Oxidativní stres je výsledkem nerovnováhy antioxidantů a volných radikálů
v těle. Antioxidanty mají za úkol odstraňovat volné radikály, snižovat jejich produkci a
vázat kovové ionty potřebné pro tvorbu radikálů (Ermak a Davies, 2002). Dělí se
na enzymatické (např. superoxiddizmutáza, kataláza, glutathion peroxidáza,…) a
neenzymatické (např. vitamíny E a C, karoteny, flavonoidy, kyselina močová, fytová,
nerulová,…), které musí být přijímány v potravě (Uttara a kol., 2009). Oxidativní stres
je zapříčiněn vyšším množstvím volných radikálů v těle než antioxidantů, které se tak
s radikály nestačí vypořádat. Volné radikály jsou takové látky, které mají ve valenční
vrstvě alespoň jeden nepárový elektron (Ermak a Davies, 2002). K tomuto stavu došlo
přijmutím nebo ztrátou elektronu nebo štěpením vazeb molekul. Takovými volnými
radikály jsou reaktivní formy kyslíku (ROS) či dusíku (RNS). Radikály vznikají
exogenním nebo endogenním vlivem. K exogenním vlivům řadíme UV nebo ionizující
záření, chemické a toxické látky, herbicidy, pesticidy, těžké kovy, léky, kouření, ozón,
znečištěné životní prostředí, teplotní šok a mnoho dalších (Ermak a Davies, 2002;
Abdollahi a kol., 2004; Cheng a kol., 2010). Endogenně vznikají např. dýchacím
řetězcem v mitochondriích (Chance a kol., 1979; Grigolova a kol., 1980; Ott a kol.,
2007) nebo napadením organismu patogenem (Cadenas a Sies, 1998; Yasunari a kol.,
2002), přičemž nejvíce ROS produkují právě mitochondrie. Radikály mohou
díky nepárovým elektronům ve valenční vrstvě reagovat s různými makromolekulami
jako tuky, bílkoviny a nukleové kyseliny a poškodit je tak (Cui a kol., 2011). Poškození
tuků nebo bílkovin není díky jejich zásobě a možnosti obnovení tak závažným
poškozením. Opakem je však DNA, která je pro buňku jedinečná a její poškození je
opravováno pouze reparačními mechanizmy. Oxidované báze, abazická místa, jedno- a
dvouřetězcové zlomy DNA patří k řadě poškození, ke kterým u nukleových kyselin
dochází (Krokan a kol., 1997). Mitochondriální DNA je poškozována až 10x rychleji
než nukleární, především pro stálou přítomnost volných radikálů, rychlejší replikaci a
méně účinným opravným mechanismům (Yang a kol., 1994). Takto poničené
9
mitochondrie uvolňují o to více radikálů a to vede k dalšímu poškozování DNA (Finkel
a Holbrook, 2000). Především konce chromozómů – telomery – jsou na oxidativní stres
velmi citlivé (Zglinicki, 2002). U člověka jsou radikály zodpovědné například
za kardiovaskulární onemocnění, cukrovku, rakovinu, Parkinsonovu a Alzheimerovu
chorobu apod. (Uttara a kol., 2009;Essick a Sam, 2010).
1.4.1 Vliv oxidativního stresu na délku lidských telomer
Kvůli vysokému obsahu guaninu, který je na oxidativní stres citlivější, jsou
telomery k poškození vlivem oxidativního stresu náchylnější (Zglinicki, 2002). Dochází
u nich častěji k jedno- a dvouřetězcovým zlomům, které jsou navíc opravovány
s mnohem menší účinností než u ostatních částí DNA. Mohou za to málo aktivní
reparační mechanizmy (Nasir a kol., 2014). Toto má za následek výrazné zkrácení nebo
dokonce odpadnutí celé telomery a následně tak buněčnou smrt (Bandyopadhyay a kol.,
1999; Tower, 1996). To pak způsobuje rychlejší stárnutí, kardiovaskulární onemocnění,
cukrovku, rakovinu, Parkinsonovu a Alzheimerovu chorobu apod. (Uttara a kol., 2009;
Essick a Sam, 2010).
Působení oxidativního stresu na člověka bylo zkoumáno i v různých pokusech.
Jeden z nich provedla Elizabeth Blackburn z University of California ze San Franisca.
Pro svůj pokus si vybrala 58 zdravých matek ve věku od 20 do 50 let. 39 matek mělo
potomka se závažným onemocněním (např. mozková obrna). Celý pokus začal otázkou,
jak jednotlivé matky vnímají svůj stres. Matky s vážně nemocným dítětem samozřejmě
pociťovaly mnohem
větší
stres
než matky s dítětem
zdravým.
Po dotazníku
Blackburnová odebrala matkám krev a zkoumala jejich telomery. Telomery
stresovaných žen byly ve stejném stavu jako telomery nestresovaných žen, které byly
však o deset let starší. Z této studie vyplývá, že kvůli působení stresových faktorů,
dochází k rychlejšímu stárnutí (http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=1036).
1.4.2 Vliv oxidativního stresu na délku telomer u D. melanogaster
Nejčastěji je zmiňováno zkracování telomer vlivem environmentálních faktorů
u lidí (Entringer a kol., 2011; Lin a kol., 2012). Stejný vliv lze předpokládat i
u bezobratlých živočichů. To, jaký má oxidativní stres vliv na délku telomer u hmyzu,
10
však nebylo zatím studováno. Jen díky výsledkům několika málo studií, které zkoumaly
vliv stresu na genom pakomára rodu Chironomus a dalších organismů, kteří mají
telomery tvořeny satelitními sekvencemi nebo retroelementy, lze předpokládat, co se
s telomerami při stresu děje. Byla pozorována zvýšená transkripční aktivita a zůstává
otázkou, zda se jedná o kompenzační mechanismus zkrácených telomer (MartínezGuitarte a kol., 2008; Capy a kol,. 2000). Objev, jak moc se telomery a za jakých
podmínek zkracují, by nakonec mohl napomoci i ke zkoumání vlivu oxidativního stresu
na telomery lidské.
11
2 Cíle
Hlavním cílem této práce bylo zjištění, zda vliv stresových podmínek
vyvolávaných změnou fotoperiody má vliv na délku telomer a aktivitu telomerického
elementu HeT-A u modelového organizmu D. melanogaster.
2.1 Dílčí cíle
1) Získání představy o rozdílné fluorescenci mezi pohlavími při pozorování larev
třetího instaru.
2) Porovnání fluorescence u stresovaných a kontrolních jedinců s využitím
fluorescence v testes larev třetího instaru.
3) Zjištění vlivu fotoperiody využitím fluorescence v testes larev třetího instaru
při změně fotoperiody mezi generacemi.
4) Porovnání intenzity fluorescence u jedinců s různě dlouhými telomerami.
12
3 Materiál a metody
3.1 Využité kmeny drozofil
V prostředí, kde se drozofily chovaly, byla po celou dobu udržována teplota
25°C. Jako živné medium byla použita směs kukuřičného šrotu, melasy (163 g
kukuřičného šrotu, 16 g agaru, 33 g sušených kvasnic, 200 ml melasy, 2,6 l vody) a
dezinfekčního roztoku (12 g kyseliny benzoové, 2,5 g kyseliny sorbové, 240 ml
denaturovaného etylalkoholu).
Kmeny byly jednak získány ze sbírek kmenů z Bloomingtonu a dále využitím
transgenní linie kmene HeTom, který byl vytvořen přímo pro laboratoř (Korandová,
2014). Ze sbírek v Bloomintonu byl použit divoký kmen Oregon R, který sloužil jako
kontrola. Dále pak kmen Su(var)20502.
Kmen HeTom byl vytvořen v rámci diplomové práce (Korandová 2014)
pro zjednodušení práce pro studium telomer u drozofily. Tento kmen obsahuje
transgenní konstrukt HeTom, který nese promotor elementu HeT-A a gen
pro fluorescenční protein Tomato (Korandová, 2014).
Použité kmeny a linie:
 Oregon R – divoký kmen bez jakýchkoliv mutací
 35HeTom – yw; transgenní konstrukt HeTom integrovaný na třetí chromozóm
do místa 86E
 2HeTom – yw; transgenní konstrukt HeTom integrovaný na třetí chromozóm
do místa 65E
 3HeTom – yw; transgenní konstrukt HeTom integrovaný na třetí chromozóm
do ísta 89E
 Su(var)20502 - In(1)w[m4h]; Su(var)205[2] / SM1 s bodovou mutací v genu
Su(var)205 v části kódující chromodoménu (způsobuje mutaci proteinu HP1,
který je mimo jiné transkripčním regulátorem a při jeho mutaci dochází
k nadměrnému prodlužování telomer (Cryderman a kol., 2005; Perrini a kol.,
2004; Capkova Frydrychova a kol., 2008)
13
3.2 Sledování fluorescence v závislosti na pohlaví
První částí práce bylo pozorování fluorescence mezi pohlavími. Bylo náhodně
vybráno 30 larev třetího instaru (larvy, které již lezou po skle vialky, larvy
těsně před zakuklením) linie 2HeTom, 3HeTom a 35HeTom, které se v laboratoři
nejvíce osvědčily. Tyto larvy byly po jedné umístěny do malých Petriho misek
na navlhčený filtrační papír, který měl zabránit vyschnutí larev a následně kukel. Larvy
byly sledovány pod mikroskopem a bylo zaznamenáváno místo fluorescence – hlavová
část, přední část střeva nebo gonády. Sledování probíhalo po celou dobu od larvy,
přes kuklu až po vylíhnutí dospělce, kdy bylo určeno pohlaví.
3.3 Posouzení vlivu fotoperiody
Pro práci byla zvolena linie 35HeTom. Dospělí jedinci z jedné vialky byli
rozděleni na tři stejně velké skupiny. První skupina byla ponechána ve fotoperiodě
16 hodin světla + 8 hodin tmy. Druhá skupina byla chována při stejném časovém
režimu, ale v rámci dne otočeném. Třetí skupina byla umístěna do 24 hodinové tmy.
Následně byly v další generaci vyhodnocovány testes larev třetího instaru. Vždy bylo
použito 30 jedinců z každého světelného režimu a následně vypočten průměr intenzity
fluorescence pro jednotlivé světelné podmínky. Pro vyloučení autofluorescence
byly použity larvy divokého kmene Oregon R.
3.4 Rozšíření sledování vlivu fotoperiody
Pokus byl obdobný jako předchozí s tím rozdílem, že vždy mezi jednotlivými
generacemi byli dospělci přemístěni do odlišného světelného režimu. Dospělci
ze světelné fotoperiody byli umístěni do 24 hodinové tmy a dospělci z 24 hodinové tmy
byli přendáni do fotoperiody 16 hodin světla + 8 hodin tmy. Jako kontrolní byli
používáni
jedinci
ponechaní
ve
světelném
14
režimu
předchozí
generace.
Po vyhodnocování bylo opět využito 30 testes třetího larválního instaru pro každý
světelný režim.
3.5 Vliv fotoperiody u různých linií HeTom
Protože
byla pozorována
určitá
variabilita
v intenzitě
fluorescence
i
mezi larvami ze stejné fotoperiody, bylo potřeba ověřit, zda se jedná o běžnou
variabilitu jedince nebo je intenzita fluorescence ovlivněna umístěním transgenního
konstruktu v genomu jedince.
Pro tuto práci byly vybrány linie 35HeTom, 2HeTom a 3HeTom, které se
v laboratoři osvědčily. Princip pokusu byl opět stejný jako v předchozím případě jen
s tím rozdílem, že sledování probíhalo dva po sobě jdoucí dny a původní linie byla
rozdělena pouze na dvě skupiny. Jedna byla ponechána ve světelné fotoperiodě 16
hodin světla a 8 hodin tmy a druhá umístěna do režimu 24 hodinové tmy. Opět
byly vyhodnocovány testes 30 larev třetího instaru pro každou linii a pro všechny
světelné podmínky.
3.6 Vliv fotoperiody ve třech po sobě následujících dnech
Jak již bylo zmíněno, byla pozorována určitá variabilita v intenzitě fluorescence
i u larev v rámci stejného světelného režimu. Byla proto přistoupeno k pozorování
fluorescence v testes larev třetího instaru tři po sobě jdoucí dny.
Opět byla využita linie 35HeTom, která byla rozdělena na poloviny a opět
umístěna do světelného režimu a do tmy. Následně byla sledována intenzita
fluorescence v testes 30 larev třetího instaru mezi jednotlivými světelnými režimy tři
po sobě jdoucí dny.
3.7 Vztah intenzity fluorescence a délky telomer
Aby byl ověřen vztah mezi intenzitou fluorescence a délkou telomer drozofily
bylo využito křížení linie 35HeTom a kmenu Su(var)20502 (Obr. 6). U tohoto kmene
15
bylo využito mutace v proteinu HP1, která má za následek nadměrné prodlužování
telomer. Takto byly získány tři linie A, B a C, které se lišily délkou telomer, přičemž
linie A měla telomery nejkratší a C nejdelší. U jednotlivých linií byla opět sledována
intenzita fluorescence v 30 testes třetího larválního instaru.
Obrázek 6: Schéma křížení linie 35HeTom s kmeny Su(var)205/SM1 pro vytvoření různě dlouhých
telomer v linii 35HeTom. Linie A je základní linie s nejkratšími telomerami. Linie B má středně dlouhé
telomery. Linie C má telomery nejdelší (převzato z Korandová, 2014).
3.8 Vyhodnocování intenzity fluorescence
Fluorescence byla pozorována u celých larev třetího instaru pod stereomikroskopem (Olympus, SZX12) s filtrem pro červené spektrum (fluorescenční protein
Tomato má excitační maximum při 554 nm a emisní maximum při 581 nm) a následně
fotografována pomocí fotoaparátu Olympus (E-600) při zvětšení 32 x 1,6 x 10 a
expozici -2. Fotografie se vyhodnocovaly programem Adobe Photoshop 11.0.2.
V programu se na jednotlivých snímcích označila oblast testes, kde byla fluorescence
nejsilnější, a poté byla určena její síla. Naměřené výsledky se zapsaly do programu
Excel, kde byly také porovnávány a zanášeny do grafu.
16
4 Výsledky
4.1 Sledování fluorescence v závislosti na pohlaví
První částí práce bylo získání přehledu o případném rozdílu fluorescence
mezi jednotlivými pohlavími. Ze zaznamenané fluorescence se zjistilo, že u samců i
samic vyzařují fluorescenci odlišné části těla v různou dobu vývoje. U samců první den
po zakuklení zářily hlavně gonády a poté se k nim začalo přidávat i břicho (Obr. 7).
U samic zase od samého počátku nejvíce vyzařovalo břicho, ke kterému se až večer
třetího dne pomalu přidávaly imaginální disky v hlavové části (Obr. 8, Obr. 9).
Nepodařilo se vyhodnotit všechny vybrané larvy, protože některé se nezakuklily anebo
se z některých kukel dospělec nevylíhl.
Obrázek 7:
Popis
částí
těla
larvy
třetího
instaru
http://rumredonlitp30.soup.io/post/404320549/ch-10-photosynthesis-quiz-unit-2-the).
17
(převzato
18.11.ráno 18.11.večer
Larva
19.11.ráno
19.11.večer 20.11.ráno 20.11.večer 21.11.ráno
(2-6)
G
G
G
G+B
B
G+B+D
G+B+D
(2-7)
G
G+B
G+B
G+B
G+B
G+B+D
G+B+D
(2-8)
G+B
G+B
G+B
B
B
B+D
G+B+D
(2-9)
G
G
G
G+B
G+B
G+B
G+B+D
(2-11)
B
B
B
B
B
B
G+B
(3-1)
G
G
G+B
G+B
G+B
G+B
G+B
(3-3)
G
G
G
G
G
G+B
G+B
(35-3)
G
G
G
G+B
G+B
G+B
G+B
(35-16)
G
G
G
G+B
G+B
G+B
G+B+D
Obrázek 8: Rozdíl ve fluorescenci v závislosti na pohlaví – fluorescence u samců. G = gonády; B =
břicho; D = disky. První číslo v označení larvy je určení linee HeTom (2HeTom, 3HeTom a 35HeTom) a
druhé číslo je určení konkrétní larvy.
18.11.ráno 18.11.večer
Larva
19.11.ráno
19.11.večer 20.11.ráno 20.11.večer 21.11.ráno
(2-1)
B
B
B
B
B
B+D
B+D
(2-4)
B
B
B
B
B
B+D
B+D
(2-10)
B
B
B
B
B
B+D
B+D
(2-12)
B
B
B
B
B
B
B+D
(2-13)
B
B
B
B
B
B+D
B+D
(3-2)
B
B
B
B
B
B
B
(3-5)
B
B
B
B
B
B
B
(3-6)
B
B
B
B
B
B
B
(3-7)
B+G
B+G
B
B
B
B
B
(3-8)
G
G
G
G+B
G+B
G+B
B+D
(3-9)
B+G
B+G
B
B
B
B
B
(35-2)
B
B
B
B
B
B
B
(35-5)
G
G
G+B
G+B
G+B
G+B
B+D
(35-6)
B
B
B
B
B
B+D
B+D
(35-7)
B+G
B
B
B
B
B+D
G+B+D
(35-10)
B
B
B
B
B
B
B
(35-17)
G
G+B
B
B
B
B
B
Obrázek 9: Rozdíl ve fluorescenci v závislosti na pohlaví – fluorescence u samic. G = gonády; B =
břicho; D = disky. První číslo v označení larvy je určení linee HeTom (2HeTom, 3HeTom a 35HeTom) a
druhé číslo je určení konkrétní larvy.
4.2 Posouzení vlivu fotoperiody
Další částí práce bylo zjištění, do jaké míry je pro drozofilu, v tomto případě
pro její larvy třetího instaru, stresující změna fotoperiody z běžného světelného režimu
16 hodin světla a 8 hodin tmy na 24 hodinovou tmu.
Po vyfotografování
a
vyhodnocení
fluorescence u larev třetího instaru
umístěných do různých fotoperiod vyplynulo, že největší vliv na intenzitu fluorescence
18
má perioda v naprosté tmě (Obr. 10). Fluorescence při zbylých dvou fotoperiodách byla
téměř srovnatelná, což naznačuje, že protein Tomato se na světle nevysvěcuje a je stálý
a nezáleží tedy, v kterou dobu jsou jedinci ze světelného režimu 16 hodin světla a 8
hodin tmy zkoumáni.
Obrázek 10: Vliv fotoperiody na intenzitu fluorescence. SVD = 16 hodin světlo + 8 hodin tma; SVN =
16 hodin světlo + 8 hodin tma, ale obrácené v průběhu dne proti SVD; TM = tma. Jednotlivé úsečky jsou
směrodatnými odchylkami získanými porovnáním mezi opakováními pokusu.
4.3 Rozšíření sledování vlivu fotoperiody
Díky nadějně vypadajícím výsledkům byl pokus s vlivem fotoperiody ještě
rozšířen. Toto rozšíření spočívalo ve sledování změny intenzity fluorescence u více
generací jedné linie po sobě, kdy se mezi generacemi změnil světelný režim.
Z naměřených hodnot vyšlo najevo, že změna fotoperiody mezi generacemi má
na intenzitu fluorescence poměrně značný vliv. Fluorescenci jedinců, jejichž perioda
byla změněna, jsme porovnávali s fluorescencí těch, jejichž perioda zůstala stejná.
Zatímco při změně ze tmy na světlo je vyzařování jen o něco málo vyšší než u jedinců
žijících po obě generace ve tmě, u změny ze světla na tmu je nárůst fluorescence
oproti generacím umístěných jen ve tmě výraznější. Oproti generacím jen ve světle je
rozdíl samozřejmě ještě více znatelný (Obr. 11).
19
Obrázek 11: Rozšíření sledování vlivu fotoperiody. SV-SV = jedinci ponecháni ve světelném režimu obě
generace; TM-TM = jedinci ponecháni ve tmě po obě generace; TM-SV = jedinci přemístěni ze tmy do
světelného režimu; SV-TM = jedinci přemístěni ze světelného režimu do tmy. Úsečky jsou opět
směrodatnými odchylkami získanými porovnáním mezi jednotlivými opakováními pokusu.
4.4 Vliv fotoperiody u různých linií HeTom
Protože byla pozorována určitá variabilita i mezi larvami jedné vialky a jednoho
světelného režimu, bylo potřeba zjistit, zda na rozdíl v intenzitě fluorescence reagují
všechny linie HeTom stejně nebo alespoň obdobně a zda na fluorescenci nemá vliv i
umístění transgenního konstruktu HeTom do genomu.
Ukázalo se, že fotoperioda má největší vliv na linie 35HeTom a 3HeTom, kde
byl velký rozdíl v intenzitě fluorescence mezi světelným režimem a režimem stálé tmy a
to jak první, tak i druhý den pokusu (Obr.12). Nicméně z pozorování dále vyplynulo, že
linie 2HeTom sice reaguje na změnu fotoperiody méně, je ale oproti linií 35HeTom a
3HeTom v průběhu dnů více variabilní. U této linie došlo druhý den oproti první dni
k nárůstu intenzity fluorescence jak u larev ze světelného režimu, tak u larev ze stálé
tmy. U linie 35HeTom také intenzita fluorescence lehce u obou světelných podmínek
narostla. Zato u linie 3HeTom nebyl zaznamenán žádný rozdíl mezi dny.
20
Obrázek 12: Vliv fotoperiody na linie 35Hetom, 2HeTom a 3HeTom. Jednotlivé linie jsou znázorněny
čísly 35, 2 a 3. Dny jsou označeny římskými číslicemi I a II. Žlutý sloupec znázorňuje fotoperiodu 16
hodin světla + 8 hodin tmy, modrý sloupec je režim stálé tmy. Jednotlivé úsečky jsou směrodatné
odchylky vypočtené z rozdílů intenzity fluorescence mezi jednotlivými pokusy.
4.5 Vliv fotoperiody ve třech po sobě následujících dnech
V dalším pokusu jsme se zaměřili na vývoj síly fluorescence ve třech dnech.
V intenzitě fluorescence larev ze tmy nebyl vidět žádný rozdíl, kdežto u fluorescence
larev ze světla tomu bylo přesně naopak. Ve druhém dni jejich fluorescence nečekaně a
nevysvětlitelně prudce stoupla a třetí den zase klesla skoro až na původní úroveň
(Obr. 13).
Obrázek 13: Vliv fotoperiody ve třech po sobě následujících dnech. SV znázorňuje intenzitu
fluorescence při světelném režimu 16 hodin světla a 8 hodin tmy. TM představuje intenzitu fluorescence
u jedinců ve stálé tmě. Číslice představují jednotlivé dny v průběhu pokusu. Úsečky znázorňují velikost
směrodatných odchylek získaných porovnáním výsledků z jednotlivých pokusů.
21
4.6 Vztah intenzity fluorescence a délky telomer
Poslední částí práce bylo určení, do jaké míry je intenzita fluorescence
ovlivňována délkou telomer. Pro tento pokus bylo využito křížení linie 35HeTom
s kmenem Su(var)20502 (schéma viz Materiál a metody – 3.7). Délka telomer u
jednotlivých linií A, B a C byla ověřena v rámci diplomové práce metodou kvantitativní
Real-time RT-PCR (Korandová, 2014) (Obr. 14).
Obrázek 14: Relativní telomerická délka u linií A, B a C. Jednotlivé sloupce znázorňují relativní počet
elementů HeT-A. Úsečky znázorňují směrodatné odchylky získané porovnáním jednotlivých opakování
pokusů (převzato z Korandová, 2014).
Tato část práce nám ukázala, že intenzita fluorescence opravdu nějakým
způsobem odráží délku telomer. U linie A jsou telomery nejkratší a intenzita
fluorescenčního signálu je největší, u linie B jsou telomery delší a fluorescence o něco
menší a u linie C, která má telomery nejdelší, pak intenzita signálu nejmenší (Obr. 15).
22
Obrázek 15: Intenzita fluorescence linií A, B a C vzniklých křížením linie 35HeTom a kmenu
Su(var)20502. Písmena označují jednotlivé linie. Úsečky opět znázorňují směrodatné odchylky získanými
porovnáním výsledných hodnot jednotlivých opakování.
23
5 Diskuze a závěr
Hlavním cílem bylo dokázat souvislost zkracování délky telomer s působením
oxidativního stresu. Experimenty, které jsme s octomilkami prováděli, nám do jisté
míry potvrdily naše prvotní předpoklady. Ovšem to se týkalo jen prvních měsíců
výzkumu. Od února nastaly ve vyzařování fluorescence náhlé neočekávané a
nevysvětlitelné změny. Zatím lze jen odhadovat, že na fluorescenci mají vliv i různá
roční období, což bylo navrhováno i v již dříve publikovaných studiích v rámci vlivu
na plodnost, velikost těla nebo zastoupení jednotlivých pohlaví v rámci jednoho kmene
drozofily (Drickamer, 1977; Drickmaner, 1990) nebo dokonce změnou frekvencí
spontánních mutací (Mason a kol., 1985). Aby bylo možno s větší jistotou říci, že se
jedná o sezónní vlivy, bylo by potřeba pokusy ještě několikrát zopakovat a to v celém
průběhu roku. Dále je však také možné, že i přes veškerou snahu udržet v laboratoři
konstantní podmínky, byly pokusy ovlivněny neznámými faktory z vnějšího prostředí.
Toto všechno už by ale mohlo být tématem pro další seminární práci na toto téma.
Pro průkazný výsledek by bylo třeba pokusy ještě zopakovat, případně je ještě rozšířit.
Obecně je znám u drozofily pohlavní dimorfismus a také rozdílná transkripční
aktivita u jednotlivých pohlaví. Proto nás zajímalo, jak je to s fluorescenci konstruktu
HeTom mezi pohlavími. Získané výsledky naznačily, že u samců je exprese nejdříve
v testes a naopak u samic nejdříve v imaginálních discích v hlavové části a v oblasti
přední části břicha. Důvodů tohoto rozdílu může být více. Jedním vysvětlením se zdá
být fakt, že v porovnání s testes jsou ovária samic hodně malá, a proto není možné slabý
signál pouze za použití stereomikroskopu detekovat. Dalším vysvětlením může být to,
že konstrukt HeTom obsahuje pouze jednu určitou DNA sekvenci počátku elementu
HeT-A. Přibývá však názorů, že právě variabilita exprese elementu HeT-A
v pozorovaných tkáních a orgánech může být způsobena různými sekvencemi právě
těchto počátků elementu HeT-A. Pro získání lepších výsledků by bylo potřeba ovária i
testes vypitvat a sledovat intenzitu fluorescenčního signálu například pod konfokálním
mikroskopem nebo využít jiné laboratorní metody pro získání hladiny transkripční
aktivity jednotlivých orgánů.
Umístěním larev do třech různých fotoperiod, se zjistilo, že na larvy má největší
vliv z hlediska stresu naprostá tma. Jedinci, chovaní ve tmě, tedy vyzařovali nejsilnější
fluorescenci, z čehož usuzujeme, že mají telomery stresem nejvíce poškozené – totiž
24
nejkratší. V ostatních dvou periodách byla intenzita fluorescence skoro stejná a to jen
potvrzuje, že protein Tomato se na světle nevysvěcuje a je stálý a nezáleží tedy,
v kterou dobu jsou jedinci ze světelného režimu 16 hodin světla a 8 hodin tmy
zkoumáni.
Stejné výsledky byly získány i při rozšíření pokusu na dvě po sobě jdoucí
generace, kdy byla fotoperioda druhé generace octomilek změněna. Byl opravdu
naznačen silný účinek stresu vyvolaného tmou. Z těchto pokusů ještě můžeme usuzovat,
že nejvíce stresující je změna fotoperiody z 16 hodin světla + 8 hodin tmy
na 24 hodinovou tmu. U drozofil, které zůstaly po obě generace při stálé tmě a u těch,
které byly přendány do světelného režimu, se zdá být stres menší. Můžeme spekulovat,
že si jedinci začali na nové světelné podmínky zvykat a režim přestává být tolik
stresující. Zatím se jedná o vysloveně prvotní výsledky a nelze z nich vyvozovat
jednoznačné závěry. Bylo by určitě potřeba pokusy zopakovat a určitě sledovat
drozofily po více generací. Nicméně i tyto výsledky jsou důležité, protože ukazují
případný možný směr dalších prací.
Důležité jsou také výsledky, kde byly na vliv světelného režimu testovány
jednak různé linie HeTom, jednak testování probíhající tři dny po sobě. Pokusy
s různými liniemi měly ověřit, zda všechny drozofily reagují na stres vlivem změny
světelného režimu podobně. Toto je důležité proto, aby bylo možné výsledky více
zobecnit a také ověření toho, že rozdílná fluorescence není způsobena rozdílným
umístěním transgenního konstruktu HeTom v genomu. Sledování rozdílné fluorescence
tři dny po sobě bylo důležité pro získání základního přehledu o jejím chování. Na
základě získaných prvotních výsledků můžeme spekulovat, zda náhlý a nečekaný nárůst
intenzity fluorescence v testes larev třetího instaru druhý den pokusu je způsoben
například počtem konkurenčních larev třetího instaru, kdy první a třetí den je larev
lezoucích po skle vialky méně. Druhý den se tedy může vlivem vyšší konkurence jednat
o další formu stresu. Opět se jedná pouze o domněnky, které bude potřeba potvrdit nebo
vyvrátit dalším opakováním a rozšířením pokusů.
O spojitosti mezi délkou telomer a sílou fluorescence jsme se ujistili
v posledním pokusu. Ten probíhal u larev třech linií A, B a C, z nichž každá měla různě
dlouhé
telomery.
Linie
A
s nejkratšími
telomerami
vyzařovala
fluorescenci
nejintenzivněji, linie B o něco méně a linie C s nejdelšími telomerami měla fluorescenci
nejslabší. Pro vysvětlení je potřeba si uvědomit, že konstrukt HeTom obsahuje jednak
gen pro fluorescenční protein Tomato, jednak pouze jeden počátek sekvence elementu
25
HeT-A, který je zodpovědný za transkripci celého elementu HeT-A. Konstrukt HeTom
měl za úkol právě zviditelnění místa a intenzity transkripční aktivity elementu HeT-A.
Dále si je potřeba uvědomit, že telomery u drozofily se skládají z různě se opakujích
retroelementů, jak bylo zmíněno v úvodu práce. Telomera tedy obsahuje větší počet
elementů HeT-A. Je tedy možné předpokládat, že pokud dojde k prodloužení telomer a
tedy k zvýšení počtu elementů HeT-A, dojde ke změně poměru těchto „neoznačených“
HeT-A a jednoho „označeného“ HeT-A, který je součástí konstruktu HeTom, který se
v genomu vyskytuje pouze jednou. Z tohoto důvodu můžeme předpokládat, že intenzita
fluorescenčního signálu je vyšší u kratších telomer.
26
6 Použitá literatura
6.1 Vědecké články
 Abdollahi M, Ranjbar A, Shadnia S, Nikfar S, Rezaie A (2004) Pesticides
and oxidative stress: a review. International medical Journal of Experimental
and Clinical Research 10(6): 141-147.
 Adams MD, Celniker SE, Holt RA, a kol. (2000) The genome sequence of
Drosophila melanogaster. Science 287 (5461): 2185–95.
 Ashburner M (1989) Drosophila a laboratory handbook. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
 Ashburner M, Golic KG, Hawley RS (2005) Drosophila: A Laboratory
Handbook., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 162–4.
 Ashburner M, Thompson JN (1978) The laboratory culture of Drosophila. In:
The genetics and biology of Drosophila. (Ashburner M, Wright TRF (eds.)).
Academic Press 2A: 1–81.
 Bakker K (1961) An analysis of factors which determine success in competition
for food among larvae of Drosophila melanogaster. Archives Neerlandaises de
Zoologie 14: 200–81.
 Bandyopadhyay U, Das D, Banerjee RK (1999) Reactive oxygen species:
oxidative damage and pathogenesis. Current Science 77.5: 658-666.
 Biessmann H, Mason JM (2003) Telomerase-independent mechanisms of
telomere elongation. Cellular and Molecular Life Sciences 60: 2325–2333.
 Blackburn EH (1991) Structure and fiction of telomeres. Nature, 350, s. 569573.
 Cadenas E, Sies H (1998) The lag phase. Free Radical Research 28(6):601-9.
 Capkova Frydrychova R, Mason JM (2013) Telomeres: Their structure and
maintenance. David Stuart (ed.) The Mechanisms of DNA Replication. Intech,
Open Access Publisher, Rijeka, Croatia, pp. 423-443.
27
 Capkova Frydrychova R, Mason JM, Archer TK (2008) HP1 is distributed
within distinct chromatin domains at Drosophila telomeres. Genetics 180: 121–
131.
 Capkova Frydrychova R, Mason JM, Biessmann H (2009) Regulation of
telomere length in Drosophila. Cytogenetic and Genome Research 122: 356–
364.
 Capy P, Gasperi G, Biémont C, Bazin C (2000) Stress and transposable
elements: co-evolution or useful parasites? Heredity 85: 101-106.
 Casacuberta E, Pardue M-L (2005) HeT-A and TART, two Drosophila
retrotransposons with a bona fide role in chromosome structure for more than 60
million years. Cytogenetic and Genome Research 110: 152–159.
 Cenci G, Ciapponi L, Gatti M (2005) The mechanism of telomere protection: a
comparison between Drosophila and humans. Chromosoma 114: 135–145.
 Clark AG, Aguade M, Prout T, Harshman LG, Langley CH (1995) Variation
in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in
Drosophila melanogaster. Genetics 139: 189–201.
 Cui H, Kong Y, Zhang H (2012) Oxidative stress, mitochondrial dysfunction,
and aging. Journal of Signal Transduction.
 Demerec M, Kaufmann BP (1996) Drosophila Guide. Carnegie Institution of
Washington. Washington,D.C.
 Drickamer LC (1977) Seasonal variation in litter size, bodyweight and sexual
maturation in juvenile female house mice (Mus musculus). Laboratory Animals
11: 159–162.
 Drickamer LC (1990) Seasonal variation in fertility, fecundity and litter sex
ratio in laboratory and wild stocks of house mice (Mus domesticus). Laboratory
Animal Science 40: 284-288.
 Entringer S, Epel ES, Kumsta R, Lin J, Hellhammer DH, Blackburn EH,
Wüst S, Wadhwa PD (2011) Stress exposure in intrauterine life is associated
with shorter telomere length in young adulthood. Proceedings of National
Academy of Sciences of the USA 108: E513–E518.
28
 Ermak G, Davies JAK (2002) Calcium and oxidative stress: from cell signaling
to cell death. Molecular Immunology 38(10): 713-21.
 Essick EE, Sam F (2010) Oxidative stress and authophagy in cardiac dinase,
neurological disorders, aging and cancer. Oxidative Medicine and Cellular
Longevity 3: 168-177.
 Finkel T, Holbrook NJ (2000) Oxidants, oxidative stress and the biology of
ageing. Nature 408: 239-247.
 George JA, Pardue M-L (2003) The promoter of the heterochromatic
Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, is active when moved into
euchromatic locations. Genetics 163: 625–635.
 Grigolava IV, Ksenzenko M, Konstantinob AA, Tikhonov AN, Kerimov TM
(1980) Tiron as a spin-trap for superoxide radicals produced by the respiratory
chain of submitochondrial particles. Biokhimiia 45: 75–82.
 Halligan D.L., Keightley P.D. (2006) Ubiquitous selective constraints in the
Drosophila genome revealed by a genome-wide interspecies comparison.
Genome Research 16 (7): 875–84.
 Hughes KA (1997) Quantitative genetics of sperm precedence in Drosophila
melanogaster. Genetics 145: 139–151.
 Chance B, Sies H, Boveris A (1979) Hydroperoxide Metabolism in Mammalian
Organs. Physiological Reviews 59(3): 527-605.
 Cheng SE, Lee IT, Lin CC, Kou YR, Yang CM (2010) Cigarette smoke
particle-phase extract induces HO-1 expression in human tracheal smooth
muscle cells: role of the c-Src/NADPH oxidase/MAPK/Nrf2 signaling pathway.
Free Radical Biology and Medicine 48(10): 1410-22.
 Chiang HC, Hodson AC (1950) An Analytical Study of Population Growth in
Drosophila melanogaster. Ecological Monographs 20: 173–206.
 Korandova M. (2014) Transkripční aktivita telomerického elementu HeT-A u
Drosophila melanogaster. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta, Jihočeská
univerzita, České Budějovice.
29
 Krokan HE, Standal R, Slupphaug G (1997) DNA glycosylases in the base
exciton repair of DNA. Biochemical Journal 325: 1-16.
 Lakovaara S. (1982) Advances in Genetics, Development, and Evolution of
Drosophila. Plenum Press, New York, USA.
 Lin J, Epel E, Blackburn E (2012) Telomeres and lifestyle factors: roles in
cellular aging. Mutation Research 730: 85–89.
 Linger BR, Price CM (2010) Conservation of Telomere protein complexes:
Shuffling through Evolution. National Institutes of Health Public Access. 44:
434–446.
 Martínez-Guitarte JL, Díez JL, Morcillo G (2008) Transcription and
activation under environmental stress of the complex telomeric repeats of
Chironomus thummi. Chromosome Research 16: 1085–1096.
 Mason JM, Capkova Frydrychova R, Biessmann H (2008) Drosophila
telomeres: an exception providing new insights. BioEssays 30: 25–37.
 Mason JM, Valencia R, Woodruff RC, Zimmering S (1985) Genetic drift and
seasonal variation in spontaneous mutation frequencies in Drosophila.
Environmental Mutagenesis 7: 663–676.
 Nasir NFM, Kannan TP, Sulaimann SA, Shamsuddin S, Ahmad A,
Stangaciu S (2014) Telomeres and oxidative stress. British Journal of Medicine
& Medical Research 4: 57-67.
 Ott M, Gogvadze V, Orrenius S, Zhivotovsky B (2007) Mitochondria,
oxidative stress and cell death. Apoptosis (5): 913-22.
 Pardue
M-L,
DeBaryshe
PG
(2003)
Retrotransposons
provide
an
evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annual
Review of Genetics 37: 485–511.
 Shay JW, Zou Y, Hiyama E, Wright WE (2001) Telomerase and cancer.
Human Molecular Genetics 10: 677-685.
30
 Shpiz S, Kwon D, Uneva A, Kim M, Klenov M, Rozovsky Y, Georgiev P,
Savitsky M, Kalmykova A (2007) Characterization of Drosophila telomeric
retroelement TAHRE: transcription, transpositions, and RNAi-based regulation
of expression. Molecular Biology and Evolution 24: 2535–2545.
 Tower J. (1996) Aging mechanisms in fruit flies. BioEssays 18.10: 799-807.
 Uttara B, Singh AJ, Zamboni P, Mahajan RT (2009) Oxidative stress and
neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant
therapeutic options. Current Neuropharmatology 7: 65-74.
 Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, Byrd W, Shay JW (1996)
Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.
Developmental Genetics 18: 173- 179.
 Wyatt HDM, West SC, Beattie TL (2010) InTERTpreting telomerase structure
and function. Nucleic Acids Research 38: 5609-5622.
 Yang JH, Lee HC, Lin KJ, Wei YH (1994) A specific 4977- bp deletion of
mitochondrial DNA in human aging skin. Archives of Dermatological Research
286: 386-390.
 Yasunari K, Maeda K, Nakamura M, Yoshikawa J (2002) Pressure promotes
angiotensin II-mediated migration of human coronary smooth muscle cells
through increase in oxidative stress. Hypertension 39(2):433-7.
 Zglinicki T (2002) Oxidative stress shortens telomeres. Biochemical Sciences
27: 339-344.
 Zhu H, Belcher M, van der Harst P (2011) Healthy aging and disease: role for
telomere biology? Clinical Sciene 120: 427–440.
6.2 Internetové zdroje
 Bloomington Stock Center - http://flystocks.bio.indiana.edu/
 http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_m
elanogaster.html, cit. 16. 4. 2014
 http://ceolas.org/VL/fly/intro.html, cit. 21. 4. 2014
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Genom, cit. 29. 4. 2014
31
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka#Rozmno.C5.BEov.C3.A1n.C3.AD,
cit. 27. 4. 2014
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka, cit 26. 4. 2014
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka, cit. 12. 4. 2014
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka, cit. 8. 4. 2014
 http://cs.wikipedia.org/wiki/Octomilka_obecná, cit. 8. 4. 2014
 http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1933/morgan-bio.html,
cit. 21. 6. 2014
 http://rumredonlitp30.soup.io/post/404320549/ch-10-photosynthesis-quiz-unit-2the, cit 23. 4. 2014
 http://www.biologydaily.com/biology/Drosophila_melanogaster, cit. 26. 4. 2014
 http://www.biomach.cz/genetika/-chromosomy, cit. 29. 4. 2014
 http://www.biopedia.sk/bunka/cytomorfologia/chromozom.jpg, cit. 22. 6. 2014
 http://www.ceolas.org/fly/intro.html, cit. 28. 4. 2014
 http://www.genetika-biologie.cz/chromozomy, cit. 29. 4. 2014
 http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=1036, cit. 14. 6. 2014
 http://www.priroda.cz/clanky.php?detail=2021, cit. 16. 4. 2014
 http://www.priroda.cz/lexikon.php?detail=2021, cit. 27. 4. 2014
 http://www.songbirdgarden.com/store/prodimages/FlightlessFlyMaleFemale.jpg,
22. 6. 2014
32