jen experiment nebo nové možnosti?

Blanka Říhová
Směrovaná léčiva a
imunostimulace…jen
experiment nebo
nové možnosti?
Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.
FARMAKOLOGICKÝ VÝZKUM
Imunitní systém hostitele
K čemu vlastně imunitní
systém potřebujeme?
STATISTIKA
40 % žen mezi 40 – 50 lety má potenciální
zhoubné nádory v prsu
incidence je 1%
55% mužů mezi 50 – 60 lety má potenciální
zhoubné nádory v prostatě
incidence je 1%
90% populace ve věku 60 – 70 let má
potenciální zhoubné nádory štítné žlázy
incidence je 0.1%
Elimination
(Cancer Immunosurveillance)
Equilibrium
γδ
NK
Genetic
instability/
immune selection
Protection
Effect of pulsed electromagnetic field (BEMER 3000) on the
survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma
(nude mice injected with 15 mg of DOX equiv. of
DOX-HPMAHYD)
tumor size (mm3)
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
140
days
3,5 µT
10,5 µT
21 µT
35 µT
B 732
controls
Transformed
p53
Rb
Ras
Carcinogens
Radiation
Chronic inflammation
Inherited
Viruses
Elimination
Cancer Immunoediting
e.G
„Danger“: uric acid,
ECM products
(Cancer Immunosurveillance)
nádor
nádorové
buňky
Rae-1
H60
(Mouse)
Normal
léčivo+EMF
10-12 dní
Tumor antigens
MICA/B
ULBP
(Human)
γδ
NKT
CD8+
CD8+
γδ
Mφ
φ
NKT
γδ
NK NK
IFNγγ
Perforin
TRAIL
NK
CD4+CD25+
Treg
IDO
Galectin-1
Innate & Adaptive Immunity
CD8++
CD4+ CD8+
Escape
Equilibrium
CD4+CD25+
Treg
sMICA/B
MHC-I
IFNγγ
resporse
Genetic instability/
immune selection
NK
CD8+
CD8+
NK
Protection
4 měsíce
nádor
nádor
nádorové
buňky
velikost nádoru
(mm3)
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
10
20
dny
30
40
50
Máme způsoby jak
Omezit působení léčiva
na zdravé
tkáně
podávání
není doprovázeno
nepříjemnými vedlejšími
účinky
Máme způsoby jak
Zvýšit akumulaci léčiva
v nádorové
tkáni
nádor
je vystaven agresivnější
terapii
Máme způsoby jak
Zcela nebo podstatně omezit
toxicitu vůči imunitnímu
systému
ten pak
může pomoci při konečné
likvidaci onemocnění
Paul Ehrlich
a jeho „ kouzelná střela“
Psal se rok 1906…………
Studies in Immunity, Plenum Press, New
York, 1906
OD VÝZKUMU K LÉČBĚ
50 000
nové látky
5 000
testy in vitro
500
testy in vivo
5
klinické testy
1
použití v klinické praxi
POŽADAVKY NA LÉČIVA NOVÉ GENERACE
musí se akumulovat v cílové tj. nádorové tkáni
- agresivnější léčba
vedlejší účinky musí být minimální
- podávání ambulantně
cirkulace v krevním oběhu musí být prodloužená
- podávání nemusí být tak časté
léčivo nesmí být během cirkulace toxické
- působení je omezeno jen na
postiženou tkáň/orgán
náklady nesmí být příliš vysoké
LÉČIVA NOVÉ GENERACE SE
SCHOPNOSTÍ PASIVNÍ NEBO
AKTIVNÍ AKUMULACE
a nerozpustné liposomy
b rozpustné imunotoxiny
c vodorozpustné polymerní systémy
SMĚROVANÁ
POLYMERNÍ
LÉČIVA
POLYMERNÍ NOSIČE
Dextrany
Polygalakturonová kyselina
Polyglutamová kyselina
PEG
Poly-L-lysin
Blokové kopolymery
N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid
(HPMA)
N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid
HPMA
HPMA NOSIČ
neimunogenní
nemitogenní
netoxický
neaktivuje komplement
neukládá se v organizmu
Volné léčivo
Směrované léčivo
volné léčivo
směrované léčivo
cílová buňka
cílová buňka
KONFERENCE
NIH/NCI-WASHINGTON
ZÁŘÍ 2002
a
aktivní směrování
b
pasivní směrování
SMĚRUJÍCÍ MOLEKULY
Monoklonální i polyklonální protilátky
IgG
Lektiny
Cukry
Růstové hormony
Transferin
STRUKTURA PROLÉČIV
PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ
PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ
STRUKTURA DOX-HPMA-Ig
DOX
Vazba
štěpitelná
katepsinem
Štěpení
katepsinem
B B
STRUKTURA PROLÉČIV
PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ
PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ
Struktura nesměrovaného DOX-HPMA (PK1)
DOX
Štěpení katepsinem B
a) Normální tkáň
intaktní endotel
lymfatická
drenáž
b) Maligní tkáň
diskontinuální endotel
omezená
lymfatická
drenáž
TESTOVÁNÍ
In vitro
prokazuje přímý
cytotoxický efekt
na nádorové buňky
In vivo
kromě přímého
cytotoxického efektu
na nádorové buňky se
účastní ještě další
systémy (imunitní,
nervový, hormonální..)
in vivo veritas
EXPERIMENTÁLNÍ
MODELY
A
B
Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD
Vyléčené myši byly
retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Immunostimulatory side effects of
HPMA-based anticancer drugs
1
2
3
4
5
6
7
Re-transplantation
Nu/nu immunocompromized mice
Winn´s assay
DC phagocytosis in vitro
DC phagocytosis in vivo
Metastatic infiltration of LN
Chronic x acute cancer
A
B
Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD
Vyléčené myši byly
retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Ochrana před sekundární
nádorovou atakou
Systemická resistence proti nádoru,
kterou navozuje léčba polymerními
cytostatiky, záleží na
dávce
času
imunitním systému hostitele
A
B
Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD
Vyléčené myši byly
retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Agresivnější léčba
nižší protinádorová resistence
Systemická resistence proti nádoru,
kterou navozuje léčba polymerními
cytostatiky, záleží na
dávce
času
imunitním systému hostitele
Přežití po léčbě den 3, 6, 9, 12 nebo 15
počet
et myší (%)
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
dny
den 3
den 6
den 9
den 12
den 15
kontroly
“vakcinační okno”
léčba započatá příliš brzy,
příliš agresivně nebo
příliš pozdě
vyvolává pouze omezenou
protinádorovou resistenci
Léčba začíná příliš brzy (nebo příliš
gresivně)
imunitní system není
vystaven dostatečnému množství
nádorových antigenů (nádorových
buněk)
Léčba začíná příliš pozdě
efektorové mechanismy imunitního
systému jsou vyčerpány
Systemická resistence proti nádoru,
kterou navozuje léčba polymerními
cytostatiky, záleží na
dávce
času
imunitním systému hostitele
Immunostimulatory side effects of
HPMA-based anticancer drugs
1
2
3
4
5
6
7
Re-transplantation
Nu/nu immunocompromized mice
Winn´s assay
DC phagocytosis in vitro
DC phagocytosis in vivo
Metastatic infiltration of LN
Chronic x acute cancer
Konvenční myši (B/6) mají
dokonale vyvinutý imunitní systém
s funkční vrozenou i získanou
imunitou
Imunodefektní (nu/nu) myši
nemají, v důsledku vrozeného
postižení, získanou imunitu
Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated
with hyperbranched conjugate BHYD or linear conjugate
Dox-HPMAAM - conventional mice
surviving mice (%)
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
days
Hyperbranched B/10mg
Hyperbranched B/15mg
Controls
Dox
Linear/15 mg
Linear/10 mg
80
Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated
with hyperbranched conjugate BHYD or linear conjugate
Dox-HPMAAM - nu/nu mice
surviving mice (%)
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
days
50
60
Hyperbranched B/10mg
Hyperbranched B/15mg
Controls
Dox
Linear/15 mg
Linear/10 mg
70
Konvenční myší
až stoprocentní resistence
Imunokompromitované
[(nu/nu) myši]
žádná resistence
Testování protinádorového léčiva
konvenční
myši
myši s poškozenou
imunitou
makrofág
(APC)
CD4 Th
lymfocyt
dendritická
buňka
CD8 CTL
NK buňka
(LAK buňka)
plasmatická buňka protilátka
sekretující protilátky
Immunostimulatory side effects of
HPMA-based anticancer drugs
1
2
3
4
5
6
7
Re-transplantation
Nu/nu immunocompromized mice
Winn´s assay
DC phagocytosis in vitro
DC phagocytosis in vivo
Metastatic infiltration of LN
Chronic x acute cancer
Winn´s assay
80
80
% surviving mice
100
% surviving mice
100
60
40
20
0
0
20
40
60
80
60
40
20
0
0
20
40
60
days
control
day 11, no therapy
control
day 21, no therapy
day 21, Dox-HPMA-HuIg
80
Winn ´s assay
120
survival %
100
80
60
40
20
0
0
10
.
20
30
40
50
60
days
DOX-HPMAAM-HuIg, tumor progression
naive cells
DOX-HPMAAM-HuIg, tumor regression
Doxorubicin, tumor regression
Při léčbě vznikají nádorově specifické
paměťové buňky, vznikající z populace
CD8+ cytotoxických lymfocytů
Immunostimulatory side effects of
HPMA-based anticancer drugs
1
2
3
4
5
6
7
Re-transplantation
Nu/nu immunocompromized mice
Winn´s assay
DC phagocytosis in vitro
DC phagocytosis in vivo
Metastatic infiltration of LN
Chronic x acute cancer
Metastatic infiltration to lymph nodes after treatment
with free doxorubicin a HPMA conjugates
GFP+/GFP-cells ratio
GFP+/GFP
70
60
50
40
30
20
10
0
control
doxorubicin
day 7
DOX-HPMAAM DOX-HPMAHYD
day 14
Immunostimulatory side effects of
HPMA-based anticancer drugs
1
2
3
4
5
6
7
Re-transplantation
Nu/nu immunocompromized mice
Winn´s assay
DC phagocytosis in vitro
DC phagocytosis in vivo
Metastatic infiltration of LN
Chronic x acute cancer
Acute x chronic
cancer
Acute
mice were injected once with
a lethal dose of cancer cells
(1x105 EL4 mouse T cell
lymphoma)
8 – 10 days a palpable tumor
chronic
mice were injected 5 times with
a low dose of cancer cells
(1x104 EL4 mouse T cell
lymphoma)
without palpable tumor
6th injection of a low dose of cancer cells
In 10 – 14 days a palpable tumor
% of surviving mice
Survival of mice suffering from acute or chronic cancer
(mouse EL4 T cell lymphoma)
Dox-HPMAHYD
Non-cleavable dendrimer
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
controls – acute cancer
10 mg Dox-HPMAHYD - acute cancer
40
50
60
70
80
days
controls – chronic cancer
10 mg Dox-HPMAHYD - chronic cancer
Polymerní léčiva na bázi
HPMA
cytotoxická
imunomodulační
složka
Cytotoxicita a imunomodulace
dvojí útok na nádorovou buňku při
léčbě polymerními cytostatiky
Pacient
nevyčerpaný imunitní
systém
vyčerpaný imunitní
systém
léčba je účinná
léčba má omezenou účinnost
účastní se
obě složky
polymerního léčiva
účastní se pouze
cytotoxická složka
polymerního léčiva
VÝHODY SMĚROVANÝCH LÉČIV
NA BÁZI HPMA
1
2
3
4
5
6
7
8
Definovaná vazba léčiva na nosič
Kontrolované uvolňování léčiva z nosiče
Aktivní akumulace specificky
směrovaného léčiva v cílové tkáni
Pasivní akumulace léčiva v nádorové tkáni
EPR efektem
Snížená imunogenicita směrující bílkoviny
Prodloužená cirkulace v krevním řečišti
Snížená toxicita vůči zdravým orgánům
Snížená imunotoxicita
Happy tumor
cells hidden
and growing in
defenceless
environment
Treatment with
HPMA-based polymeric
conjugates......
...has not only a direct cytotoxic
effect on cancer cells but also causes
their unmasking and exposing to
effector mechanisms of immune system
HPMA polymer
Nádorové buňky
citlivé S nebo
rezistentní R na
polymerní proléčivo
S
S
R
S
S
R
polymerní proléčivo
obsahující doxorubicin
S
S
R
S
S
S
R
R
R
S
„Imunogení“
buněčná smrt
a uvolnění
nádorových
antigenů
Navození protinádorové
immunity (aktivace
dendritických buněk,
přirozených zabíječů, T a B
lymfocytů)
Převzato z: Říhová a spol., Trends in Biotechnology 27, 11-17, 2009
Poděkování
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.
Karel Ulbrich
Tomáš Etrych
Martin Hrubý
Petr Chytil
Hana Krakovičová
Daniela Plocová
Robert Pola
Jiří Strohalm
Martin Studenovský
Vladimír Šubr
Poděkování
Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.
Jaroslav
Jan
Ondřej
Helena
Markéta
Martina
Jiřina
Marek
Lubomír
Veronika
Milada
Jakub
David
Betka
Bouček
Hovorka
Chmelová
Ibrahimová
Kabešová
Kovářová
Kovář
Kovář
Pakanová
Šírová
Tomola
Větvička
Děkuji
vám!
PRVNÍ ZKUŠENOSTI
S PODÁNÍM
U LIDSKÝCH PACIENTŮ
TAA – pacientka č. 6
cytokeratin
cytokeratin
NK A LAK AKTIVITA A ABSOLUTNÍ POČET
NK BUNĚK U PACIENTKY Č. 6
700
K 562
70
600
Daudi
60
Raji
500
NK abs
50
400
40
300
30
200
20
100
10
0
0
0
20
40
60
80
dny
dávka
1. 1.
dávka
dávka
2. 2.
dávka
dávka
3. 3.
dávka
100
120
abs. počet NK
% zabíjených cílových bun
buněk
ěk
80
Aktivita NK buněk u pacientů
podání
den
E.G.
J.K.
1
0
3
24
45
23
21
9
19
11
33
2
0
3
22
27
10
25
10
16
11
12
3
0
3
23
42
10
12
8
6
13
18
24
24
zdravý dárce
NK
% zabitých buněk linie K562
K.R.
K.H.
Koncentrace léčiva v krvi pacientky
E.G. po podání Dox-HPMA-HuIg
(% injikované dávky)
1. podání
2. podání
*
% podané dávky
den
1
3
7
14
21
doxorubicin
69*
11
6
1
0.6
1
3
7
14
21
N.D.
25
4
3
2
PŘEDBĚŽNÉ VÝSLEDKY U PACIENTŮ
a
podávání není doprovázeno nepříjemnými
vedlejšími účinky
b není nutná hospitalizace, léčivo se podává
ambulantně
c léčivo přetrvává v oběhu výrazně déle
d je dosahováno dlouhodobé stabilizace
onemocnění
e kostní dřeň a imunitní systém nejsou
poškozeny
f část laboratorních testů včetně nádorových
znaků je upravena dočasně nebo trvale,
další část vykazuje významné zlepšení
Apoptosis
immunogenic
non-immunogenic
cell death
cell death
„Imunogenní“ buněčná smrt
CRT
is a Ca2+ - binding lectin chaperone that is
mostly present in the ER lumen
Phagocytosis,
processing,
maturation,
cross-presentation
Translocation
of CRT to
cell surface
P
elF2α
α
Anthracyclins,
GADD/PP1
inhibitors
elF2α
α
PS turnover,
apoptosis
HMGB1 =
high mobility group box 1
(a)
Engulfed (c)
tumor cell
in phagosome
(b)
TLR4
Immature
DC
MHC Class I
Phagocytosis
Antigen
processing and
presentation
Scavenger
receptors
HMGB1
TLR4
Tumor
cell
Binding of HMGB1
to TLR4
Released HMGB
Cell surface
-CRT
Dying
tumor
cell
Anthracyclines
Anthracyclines
MHC Class II
Mature DC
Expression of calreticulin (CRT) and heat shock protein
(HSP) 110 on mouse EL4 T cell lymphomaa
sample
Expression
of
induction local/systemic
anti-cancer immune response
CRT
HSP 110
Dox - HPMAHYD
+
-
+
Dox - HPMAAM
-
+
+
free Dox
+
-
+c/-d
HuIg představuje
nejlevnější, nejsnazší
a všeobecně použitelné
směrování.
Proč?
HuIg
- obsahuje přirozené protilátky, z nichž
některé mohou reagovat s receptory
nádorů
- stimuluje produkci IL-12 a dalších
protinádorových a anti-angiogenních
cytokinů
- zvyšuje aktivitu NK buněk
- zvyšuje MW konjugátu (EPR efekt,
pasivní akumulace)
Apoptóza
je fyziologický proces.
Předpokládá se, že u lidí
takto hyne každý den
několik milionů buněk
STRUKTURA PROLÉČIV
ENZYMATICKY
pH-SENZITIVNÍ
AKTIVOVANÉ PROLÉČIVO
PROLÉČIVO
CH3
CH3
H2C C
H2C C
C O
x
C O
CH3
y
CH3
H 2C C
H 2C C
x
NH
Gly
C O
CH2
Phe
NH
X
Leu
CH2
NH
HC
OH
CH3
H3C
HC
Gly
HO
OH
CH3
NH
C O
N
O
OH
C CH2OH
O
OH
O
OH
O
OMe
OMe O
HO
CH2OH CH2
OH H
O
O
CH3
OH
O
y
OH
NH2.HCl
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg)
day velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A conjugate B
day
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
conjugate B
8
288
600
726
256
320
405
550
405
256
320
550
500
320
288
288
550
11
726
600
320
256
550
600
221
550
600
172
600
320
864
500
256
196
15
600
600
352
196
365
446
1186
75
196
75
108
172
787
14
14
196
18
550
486
1080
600
446
1268
75
6
126
32
14
14
108
787
0
0
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg)
day velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A conjugate B
day
22
25
28
2025
1080
1080
1080
2025
256
1080
4
6534
5400
6050
3468
10571
2816
5292
126
405
4
4
3240
172
0
0
0
1368
256
0
0
6912
2176
0
0
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
31
3324
3726
2304
1960
5566
2890
1437
14
6613
9216
8438
12393
12152
4050
10816
1099
conjugate B
1352
0
14
0
4400
864
0
0
2890
600
0
0
9375
3078
0
0
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg)
day velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A conjugate B
35
7497
650
9464
0
12166
0
6534
3564
1470
6200
6050
0
10140
0
ex
ex
day
42
45
5808
17298
ex
ex
ex
ex
ex
ex
0
0
0
0
2601
15857
10206
ex
38
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
10571
8750
9688
2432
ex
ex
ex
ex
17100
7142
ex
ex
ex
ex
ex
ex
conjugate B
0
6613
0
1014
0
0
11300
ex
0
0
0
0
3179
ex
ex
ex
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg)
day velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
conjugate B
day velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
conjugate B
49
10571
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
0
0
0
0
6613
ex
ex
ex
52
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
0
0
0
0
ex
ex
ex
ex
56
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
0
0
0
0
ex
ex
ex
ex
59
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
ex
0
0
0
0
ex
ex
ex
ex
Základní
pravidla
- během dvou - tří dnů po léčbě nádory
přestávají růst
- první náznaky jejich zmenšení jsou patrné
během 5 – 6 dnů po léčbě
- pokud nádory do deseti dnů nezaniknou nebo
se alespoň nezmenší, už na léčbu reagovat
nebudou a musí se uvažovat o další dávce
DC phagocytosis in vitro
300
*
*
*
% of Control
250
200
150
100
50
0
EL-4
Spleen
% of CFSE+Dendritic Cells
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
DC phagocytosis in vivo