Mikroskopická obrazová analýza

Transkript

Návod pro laboratorní úlohu z měřicí techniky
Práce O1
Mikroskopická obrazová analýza
0
1
Úvod:
Tato laboratorní úloha je koncipována jako seznámení se s principy snímání
mikroskopických obrazů a jejich následnou obrazovou analýzou pomocí vhodných
softwarových prostředků. Základním předpokladem pro úspěšné provedení obrazové analýzy
je správné sejmutí obrazu analyzovaného materiálu. Tento proces je ovlivňován mnoha
faktory, z nichž nejdůležitějšími jsou osvětlení, podklad a kvalita snímacích zařízení.
Výběr zařízení, pomocí kterých můžeme sejmout obraz analyzované směsi, je
v dnešní době velmi široký. Aby bylo možné obraz následně počítačově zpracovat, je vhodné
jej získat přímo v digitální formě. K tomuto účelu slouží digitální fotoaparáty a kamery, které
v sobě mají zabudovaný vhodný snímací prvek. V současnosti jsou nejpoužívanějšími typy
CCD (Charge-Coupled Device) a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semicoductor)
senzory. Oba druhy mají svůj zcela základní princip společný: převádějí světelnou energii na
elektrickou. Velmi zjednodušeně lze tento proces popsat tak, že tisíce až milióny buněk
citlivých na světlo jsou uspořádány do plošné matice. Velikost matice, tedy součin počtu
sloupců a řádků matice, udává rozlišovací schopnost jednotlivých přístrojů. Každá buňka
převádí světelnou informaci ze své malé části obrazu na elektrický signál. Hodnoty náboje
jednotlivých buněk je poté potřeba přečíst.
U systému CCD, používaným v této práci, je nakumulovaný náboj ve formě
analogového signálu přesouván přes matici tvořenou Shottkyho diodami, která se tedy chová
obdobně jako posuvný registr, a jedním rohem matice přechází do vyhodnocovacího zařízení.
Analogově/digitální převodník poté převede každou hodnotu buňky do digitální podoby.
Protože jsou jednotlivé elementy citlivé především na intenzitu světla a méně na barvu, je
takto získaný obrázek černobílý. Barevného obrázku se většinou dosahuje předřazením
příslušného barevného filtru. Pro vytvoření jednoho barevného bodu (pixelu) výsledného
snímku proto potřebujeme nejméně tři buňky matice. V praxi se však na jednom pixelu
barevného obrazu podílí většinou čtyři buňky CCD senzoru. Je zde totiž dvakrát zařazen
zelený filtr, čímž je simulována větší citlivost lidského oka právě na zelenou barvu. Výsledný
barevný bod pak vzniká aditivním smícháním těchto tří barev. Nevýhodou CCD detektorů je
vzájemné ovlivňování nábojů v sousedních buňkách, malý rozsah intenzit a nemožnost
adresovat jednotlivé buňky. Naopak výhodami tohoto detektoru oproti druhému typu je
vysoké rozlišení, vysoká rychlost převodu signálu a nízký šum ve výsledném obraze.
CCD detektory bývají využívány pro práci na vysoce kvalitních snímcích, s mnoha
dokonale zhodnocenými pixely a za vyšší citlivosti ke světlu. Naopak senzory CMOS mívají
obrazovou kvalitu nižší, nižší rozlišovací schopnost a nižší citlivost, ale přístroje s těmito
senzory jsou mnohem levnější a mají nižší spotřebu energie a proto jsou vhodné pro přístroje,
používající jako zdroje energie baterie.
Vlastnosti senzoru, díky kterým je světelný signál převáděn na elektrický, jsou sice
nejdůležitější, ale ne jedinou charakteristikou snímacího zařízení. Při volbě vhodnosti použití
jednotlivých zařízení pro danou aplikaci je nutné brát v úvahu také další schopnosti zařízení.
Jedná se například o charakter připojení přístroje k počítači, formát získaných snímků nebo
schopnost sejmout digitální videozáznam.
Zařízením použitým pro sejmutí obrazu sledovaného vzorku v této laboratorní úloze,
je světelný mikroskop Nikon s kamerou SONY DFW-SX910.
1
2
2.1
Zařízení používaná v této práci
Mikroskop Nikon Eclipse LV100D
Mikroskopy Nikon řady Elipse LV jsou určeny pro celou řadu nejrůznějších oborů,
jako například výroba, výzkum a vývoj polovodičů, elektroniky, léků, dále pak v obecné
metalurgii, krystalografii a ve výzkumu, vývoji a výrobě keramických materiálů.
Mikroskop má zabudovánu nekonečnou optiku CFI60, která koriguje chromatickou
vadu v celém zorném poli. Obraz je tedy extrémně ostrý, s vysokým kontrastem a
minimálním kolísáním jasu. Navíc parfokální vzdálenost 60 mm (tj. vzdálenost v milimetrech
od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla) a větší průměr objektivu
zajišťují jak větší pracovní vzdálenost tak větší numerickou aperturu. Větší pracovní
vzdálenost, je obzvlášť výhodná při pozorování silných preparátů.
Ve stojanu mikroskopu je zabudovaný světelný zdroj pro diaskopické osvětlení a
páčka přepínání osvětlení dia/epi. Dostatečně velký stolek (6" x 4") usnadňuje pozorování ve
všech průmyslových aplikacích. Pohodlí při pozorování preparátů zajišťuje také ergonomické
uspořádání ovládacích prvků stolku a zaostření mikroskopu. Soustředné knoflíky jemného a
hrubého zaostření jsou umístěny pouze několik centimetrů nad úrovní stolu a ovládací prvky
posunu stolku a zaostření jsou v těsné blízkosti. Stolek i zaostření lze tedy ovládat jednou
rukou a druhou rukou je možné například nastavovat osvětlení případně clony a filtry.
Na následujících obrázcích je popis základních prvků tohoto mikroskopu.
Pohled zprava:
2
Pohled zleva (detail ovládacích prvků):
Zacházení s mikroskopem bude před začátkem laboratorní práce demonstrováno
asistentem. Při práci s mikroskopem dbejte na pokyny asistenta, nezacházejte s žádným
ovládacím prvkem hrubě a nezkoušejte nic, co vám asistent neukáže nebo nedovolí. Tento
mikroskop je velmi nákladná součást laboratoře (cca 650 tisíc Kč) a jakákoliv oprava je nejen
finančně, ale také časově náročná a výrazně by narušila chod laboratoří.
2.2
Digitální kamera SONY DFW-SX910
Tato kamera má jako snímací prvek CCD
detektor, jehož rozlišení je 1392×1040 pixelů.
Napájení kamery je zajišťováno pomocí standardního
rozhraní IEEE 1394 (neboli FireWire). Přes toto
rozhraní je také kamera ovládána buď pomocí
software NIS-Elements nebo jiných programů pro
ovládání FireWire kamer (mimo jiné i LabVIEW).
Rychlost snímkování kamery je maximálně 7,5
snímků za sekundu, které je ale možné dosáhnout
pouze při nižším rozlišení. Kamera nemá vestavěný
objektiv, a aby bylo možné získávat snímky, je tedy nutné k ní přes standardní C-závit
připevnit vhodný objektiv v závislosti na velikosti sledovaného materiálu. V této úloze je
objektiv nahrazen mikroskopem Nikon.
3
3
Použitý software
3.1
NIS-Elements AR 2.30
Program NIS-Elements (do srpna 2006 byl původní název LUCIA) je nejpoužívanější
software pro obrazovou analýzu na VŠCHT Praha a jeden z nejpoužívanějších v ČR.
Důvodem této obliby je to, že má českého výrobce Laboratory Imaging, s r.o. a tudíž i českou
jazykovou verzi, což je velmi výhodné především pro výuku.
NIS-Elements je systém obrazové analýzy určený ke sledování, snímání, archivaci a
ručnímu nebo automatizovanému měření preparátů. Používaný snímací systém nejčastěji
tvoří optický přístroj (mikroskop, stereomikroskop resp. makrooptika nebo skener), dále
kamera nebo digitální fotoaparát, nezbytný počítač a softwarové vybavení. Vybavení
programu NIS-Elements je možné rozdělit do několika stupňů rozdělených podle náročnosti
prováděné obrazové analýzy, v této laboratoři je používán III. stupeň nazvaný NIS-Elements
Advanced Research.
NIS-Elements Advanced Research - III. stupeň
Softwarové vybavení určené pro plně automatizované a náročné úlohy, často spojené
s rozhodovacími procesy během měření. Advanced Research obsahuje veškeré možnosti
Measurementu (tj. základní verze programu = I. a II. stupeň); většina funkcí je dále posílena o
doplňky k speciálnímu použití. V základní programové výbavě NIS-Elements Advanced
Research obsahuje následující prvky, z nichž některé budou podrobněji popsány
v následujících odstavcích:

Nastavení a ovládání snímací kamery
Živé zobrazení na monitoru resp. výběr části obrazovky, kde je živý obraz
Snímání jednotlivých snímků, sekvence (sady) snímků, snímání velkých obrázků
Úprava sejmutého obrazu základními nástroji (kontrast, SW doostření, SW vyhlazení)
Rozměrová kalibrace systému pro jednotlivé optické konfigurace (pro více zvětšení)
Ruční proměřování délek, ploch a úhlů pomocí myši s výstupem dat
Prahování - segmentace obrazu na objekty a pozadí
Základní binární operace na segmentovaném obrazu (eroze, dilatace, otevření, zavření,
zaplnění děr, obrysy...)
Ruční editor binárního obrazu
Automatizované měření planimetrických veličin (plocha, max. a min. rozměry,
protažení, cirkularita, délka, šířka.)
Programování - vytváření maker pro opakující se úlohy
Úprava barevných obrazů obsahuje morfologické funkce (erozi, dilataci, morfologický
gradient, detekci hran.)
Úprava binárních obrazů obsahuje rozšířené funkce (separaci binárních objektů,
skeleton, ořezání konců čar, zóny vlivu, jednobodové značení.)
Srovnávací funkce pro dva barevné obrazy (vzájemné posuny, otočení, smrštění nebo
roztažení, diferenční funkce)
Kombinace více binárních obrazů - binární operace (průnik, sjednocení, porovnávání,
odečítání)
4

Měření v masce - lze měřit v libovolně velké ploše různého tvaru, může být složena i s
více vzájemně nepropojených oblastí; masku lze vytvořit prahováním nebo ručním
editorem; lze vzájemně propojit masku a binární obrazy
Měření s omezením veličin (např. jen objekty s plochou větší než 50 µm)
… a řada dalších funkcí
Příklad využití funkcí měření v programu NIS-Elements (zdrojem obrazů je prospekt
k programu NIS-Elements vydaný firmou Laboratory Imaging, s r.o.)
Pro náročnější a speciální operace obrazové analýzy lze k základnímu programu NISElements Advanced Research (příp. NIS-Elements Image resp. Measurement) zakoupit další
přídavné moduly, které nám umožní např. rozšířené ovládání zařízení mikroskopu nebo
náročnější analýzu získaných snímků.
Obecný postup analýzy obrazu programem NIS-Elements Advanced Research je následující:
1. Sejmutí obrazu
Po spuštění programu NIS-Elements se objeví dialogové okno, ve kterém uživatel
volí, zda bude snímat pomocí kamery nebo použije simulátor snímání případně nebude
obrázky vůbec snímat obrázky pomocí programu NIS-Elements, ale pouze analyzovat
již dříve získané snímky.
se v hlavním okně programu
Stisknutím tlačítka Živý obraz na horní liště
zobrazí aktuální obraz, který snímá kamera. Pro korekci světelných a barevných
vlastností obrazu se používá funkce Nastavení kamery v nabídce Snímání resp.
v pravé části obrazovky na záložce Nastavení kamery. Pokud obrázek odpovídá
představám uživatele, stiskne se tlačítko Sejmout na horní liště
a tak se obrázek
převede do počítače. Doporučuje se obraz ihned uložit do počítače pomocí pokynu
Uložit v nabídce Soubor.
5
2. Otevření obrazu
Obraz sejmutý jinak než přímo online kamerou se otevírá jednoduše příkazem
Otevřít v nabídce Soubor.
3. Úprava barevného obrazu – nabídka Obraz

Oříznout – Pokud analyzovaný obraz obsahuje na okrajích zbytečně mnoho
pozadí a rušivých objektů, které mohou rušit analýzu, je možné příkazem
Oříznout upravit velikost obrazu tak, aby obsahoval všechny objekty, které
mají být analyzovány a pokud možno minimum rušivých částí. Oříznout je
možné pouze do tvaru obdélníku a výběr se nastaví táhnutím myši a potvrdí
tlačítkem Enter.
Kontrast – Pokud se sledované detaily v obraze svou světlostí málo liší
od ostatních objektů, pak je možné jejich kontrast zvýšit funkcí Kontrast (pro
šedý obraz) příp. Kontrast složek pro zvýraznění barevných složek obrazu. Při
posouvání hodnot kontrastu na stupnici se v náhledu zobrazuje porovnání
původního a upraveného obrazu.
Upravit obraz – Funkce v nabídce Upravit obraz umožňují další změny
barev a intenzity v obraze, jako jsou například matematické transformace
jednotlivých barev, změna sytosti nebo odstínu apod. .
Vyhladit/Zaostřit – Tyto funkce potlačí resp. zvýrazní detaily v obraze.
Velikost/Otočit/Převrátit/Posunout – Tyto funkce manipulují s obrazem a
upravují jeho rozměry.
Detekce – Funkce v menu Detekce vyhledávají a zvýrazní (zvýšením
světlosti) určité vlastnosti obrazu, jako jsou hrany nebo oblasti, kde hodnoty
světlosti vytvářejí tzv. „údolí“ nebo „vrcholy“,tj. lokální minima nebo maxima.
Morfologie – Morfologické funkce upravují objekty v obraze tak, že je zmenší
nebo odstraní (Eroze), zvětší a příp. spojí (Dilatace), vyhladí kontury, odstraní
malé objekty, rozpojí objekty spojené tenkou šíjí (Otevření) nebo zaplní díry,
vyhladí okrajové trhliny a spojí blízké objekty (Zavření).
4. Transformace obrazu

Konverze – Tato funkce z nabídky Obraz převádí barevný obraz na šedý
(Převést do šedého obrazu), obraz vyjádřený RGB (červená, zelená, modrá)
stupnicí převedou na HSI (odstín, sytost, světlost) stupnici (Převést RGB na
HSI) a naopak (Převést HSI na RGB). Dále je možné z obrazu vybrat jednu
barevnou vrstvu příp. určitou hodnotu světlosti, odstínu a převést ji do šedé
stupnice (Vytáhnout složku - výsledkem je tedy šedý obraz vytvořený na
základě specifických požadavků uživatele).
Prahování – Prahování je jedna z nejdůležitějších funkcí obrazové analýzy,
která převádí barevný nebo šedý obraz na binární (tj. obraz, ve kterém jsou
pouze dvě hodnoty barev – obvykle černá a bílá). Program NIS-Elements
dovoluje prahovat (tedy stanovit práh mezi pozadím a objekty v binárním
obraze) podle jednotlivých barevných složek obrazu (Prahování resp.
Prahování po složkách), podle hodnot HSI (Prahovat podle HSI) a nebo
podle předem stanovené reference (Prahování podle reference).
6
5. Editace binárního obrazu – nabídka Binární

Otevření/Uzavření/Eroze/Dilatace/Vyčištění/Vyhlazení – Tyto funkce jsou
obdobou výše zmíněných funkcí pro barevný obraz, pouze pracují s binárním
obrazem.
Uzavřít díry/Zaplnit díry – Tyto funkce se používají v těch případech, kdy
chceme např. měřit plochu objektů, ve kterých vznikly během prahování a
jiných úprav kvůli odleskům nebo jiným jasovým odchylkám díry. První
funkce uzavře díry, které jsou v úzkém místě otevřeny a druhá funkce pak
takto uzavřené díry vyplní.
Konvexní obálka – Funkce vytvoří konvexní obal kolem objektů (někdy to
může pomoci, např. při pouhém počítání objektů, ale při měření plochy částic
se tato funkce nedoporučuje vzhledem k tomu, že přidává objektům další
pixely navíc, které by mohly rušit přesné měření).
Obrysy - Tato funkce vyhledá a zvýrazní obrysy objektů.
Morfologická separace objektů – Tato funkce umí rozdělit objekty, které se
překrývají nebo dotýkají (oddělit objekty je možné i manuálně, nakreslením
čáry do obrazu – viz Vložit čáru, kruh, elipsu).
Lineární/Pokročilá morfologie – Tyto funkce provádějí jednoduché i velmi
složité morfologické operace s objekty v obraze (pracují tedy s rozměry
a tvarem objektů a mění je podle druhu funkce a požadavků uživatele).
Zpracování po objektech – Tato funkce umožňuje provádět příkazy (funkce)
pro každý objekt zvlášť (příkazy se zadávají textově nebo výběrem
ze seznamu).
Vložit čáru, kruh, elipsu – Pomocí této funkce je možné do obrazu vložit
geometrický tvar v barvě objektů nebo pozadí binárního obrazu. Vkládání
tvarů v barvě objektů se používá např. pro dokreslení objektu, pokud se jeho
část prahováním odstranila a nebo pro přidání objektu, který při prahování
zcela zmizel. Barva pozadí se používá pro již zmíněnou separaci nakreslením
úsečky mezi dvěma dotýkajícími se objekty nebo vymazání nežádoucích
objektů.
6. Výběr objektů v obraze – nabídka Měření –Editace masky

Editor masky – Slouží k úpravě barevného i binárního obrazu tak, aby
neobsahoval nežádoucí objekty, které by mohly rušit analýzu nebo naopak
k výběru požadovaných objektů. Po spuštění editoru se změní levá i horní lišta
programu. V levém rohu se volí, zda budou maskou označeny objekty, které se
mají analyzovat (přepnutím čtvercového políčka na pozici FG -
), nebo
naopak objekty, které se mají přesunout do pozadí (pozice BG – ). Dále se
volí nástroj, kterým se bude maska vytvářet (obdélník, kruh, linie, elipsa či
libovolný jiný i nepravidelný tvar). Pravidelné tvary se vytvoří pouhým
zakreslením tvaru do obrazu potažením myši, nepravidelný tvar se vytvoří
vyznačením několika bodů určujících rozměry a tvar masky a nakonec
potvrzením vykreslení masky pravým tlačítkem myši. Když je maska hotová
(může mít i několik částí), editor se zavře a pokračují další úpravy a analýzy
obrazu.
7
7. Měření – nabídka Měření

Interaktivní měření – Toto měření umožňuje uživateli provádět přímá měření
objektů s okamžitým výstupem naměřených údajů ve zvolených jednotkách.
Můžeme si vybrat z těchto parametrů: Délka, Plocha, Profil intenzity,
Taxonomie, Počet, Poloměr, Poloosy, Úhel.

Měření jednotlivých objektů – Při použití této funkce program změří předem
nastavené parametry všech objektů v binárním obraze. Nejprve je nutné
nastavit Příznaky pro měření objektů, příp. Omezení hodnot příznaků
(tedy nastavení mezí měření), poté Změřit objekty a nakonec je možné přečíst
Výsledky měření objektů.

Měření polí – Obdobně jako jednotlivé objekty je možné měřit pole, kdy jsou
změřeny zvolené parametry objektů (Příznaky pro měření polí)
a zprůměrovány pro všechny objekty dohromady (tj. za celé pole).

Měřicí rámeček – Toto je velmi důležité nastavení rámečku, určujícího které
objekty v obraze budou (uvnitř rámečku) a které nebudou (vně rámečku)
měřeny. Rámeček je možné upravit i po stisknutí klávesy F popotažením jeho
okrajů myší. Rámeček má strany označeny dvojím způsobem, čárkovanou
a plnou čárou. Objekty, které se dotýkají plné čáry (levý a spodní okraj
rámečku) nebudou do měření započítány. Objekty dotýkající se čárkované
linky (pravý a horní okraj rámečku) se do měření započítávat budou.
8. Vytvoření makra – nabídka Makro
Makro slouží k tomu, aby uživatel nemusel při opakovaných analýzách vždy
znovu nastavovat všechny použité funkce, ale mohl celý sled funkcí spustit
pouhým jedním kliknutím.

Nové…, Otevřít… - Zde se vytvoří a uloží nové makro nebo otevře makro již
hotové. Vytvoření a pojmenování nového makra je nutné udělat před začátkem
nahrávání makra, jinak bude sled funkcí zapisován do přednastaveného makra
s názvem pracovní.mac .

Záznam…(F3) - Pokud je zvoleno požadované makro (nové, již dříve
vytvořené nebo pracovní), spustí se klávesou F3 záznam funkcí a dále se
provádí analýza tak, jak si to uživatel předem vyzkoušel. U dříve vytvořeného
nebo pracovního makra budou dříve zaznamenané funkce přepsány příp.
zachovány a k nim budou přidány funkce nové (podle toho, jak si uživatel
vybere v dialogovém okně, které se objeví po stisku klávesy F3). Po provedení
všech úprav a měření v obrazu se nahrávání makra ukončí opět tlačítkem F3 a
nebo v nabídce Makro pokynem Zastavit záznam… .

Editovat…(F8) – Zde je možné editovat makro jako textový program, tedy
textově měnit parametry funkcí, mazat nebo přidávat funkce. Tato funkce je
určena především pro zkušenější uživatele programu NIS-Elements.
8
4
Laboratorní práce 1 (rostlinné buňky)
4.1
Úkoly
1. Sejmout obraz části listu v co největší kvalitě pomocí mikroskopu Nikon, digitální
kamery SONY a softwaru NIS-Elements.
2. Pomocí softwaru NIS-Elements sestavit posloupnost funkcí pro vyhodnocení velikosti
rostlinných buněk.
3. Výsledky analýzy exportovat do programu Excel a vyhodnotit tabulkou i grafem.
4.2
4.2.1
Postup práce
Příprava vzorku
Prvním úkolem je vytvořit z listu pokojové rostliny dva preparáty (tj. vyříznout z něj
dvě vhodně velké části (1x1cm), položit jednu vnější a druhou vnitřní stranou na
podložní sklíčko). Jeden preparát vložte pod objektiv mikroskopu s nejmenším
zvětšením. Zaostřete mikroskop a nastavte zvětšení pootočením karuselem objektivů
tak, abyste v okulárech viděli rostlinné buňky stejně, jako je můžete vidět na
vzorovém snímku (viz příloha zadání). Celkové zvětšení mikroskopu se vypočítá tak,
že hodnotu zvětšení objektivu vynásobíte 10x (neboť samotné okuláry resp. adaptér ke
kameře zvětšují 10x). Zvětšení výsledného obrazu je dáno rozlišením kamery a
softwarovým zvětšením v počítači.
4.2.2
Sejmutí obrazu
Spusťte program NIS-Elements, stiskněte tlačítko Živý obraz na horní liště
.
V hlavním okně programu uvidíte aktuální obraz, který snímá kamera. Podle obrazu
kamery ještě dolaďte zaostření na mikroskopu (případně i umístění preparátu) a poté
stiskněte tlačítko Sejmout na horní liště
. Tak převedete obrázek do počítače.
Obraz ihned uložte do počítače (Soubor – Uložit, na disk D: do adresáře
Laborator OA a vámi vytvořeného adresáře, který bude mít v názvu číslo vašeho
turnusu a skupiny), abyste o něj nepřišli při snímání druhého preparátu a kalibračního
obrazu. Stejným způsobem (i se stejným zvětšením) sejměte obrázek druhé strany
listu.
4.2.3
Sejmutí kalibračního měřítka
Pod mikroskop vložte kalibrační měřítko (linka dlouhá 1mm rozdělená na 100 dílků
uvnitř černého čtverce), obraz zaostřete na linky a sejměte do počítače. V žádném
případě NESMÍTE měnit zvětšení mikroskopu, které jste použili při snímání obrazů
listu.
4.2.4
Analýza obrazu programem NIS-Elements
Prvním krokem je kalibrace obrazu. Otevřete si obraz kalibračního měřítka a v nabídce
Kalibrace zvolte funkci Rychlá kalibrace. Dvěma šikmými úsečkami vyznačte
předem známou vzdálenost na kalibračním měřítku. Při vyznačení vzdálenosti
postupujete tak, že vyberete funkci šikmých rovnoběžek
, potažením myši
vyznačíte úsečkou jednu linku kalibračního měřítka, tuto volbu potvrdíte pravým
tlačítkem myši a pouhým kliknutím na druhou linku (ve známé vzdálenosti od první)
se vykreslí rovnoběžka s předchozí úsečkou. Pokud jsou obě rovnoběžky zakresleny
správně (tj. odpovídají linkám měřítka), potvrďte kalibraci pravým tlačítkem myši.
9
Poté zapište název kalibrace (např. jméno jednoho z pracovníků, číslo turnusu nebo
skupiny) a zadejte skutečnou vzdálenost mezi úsečkami, tak jak je definována
měřítkem. Nyní můžete obraz měřítka zavřít (po uložení) a pokračovat analýzou
obrazu listu.
Úkolem analýzy je určit plochu jednotlivých rostlinných buněk v obou získaných
obrazech a také plochu průduchů v obraze vnitřní části listu. Nejprve si otevřete
snímek horní strany listu (bez průduchů). Aby bylo možné zjistit skutečné rozměry
buněk, musíte obrazu přiřadit kalibraci v nabídce Soubor – Informace o obrazu…,
v poli Kalibrace zvolíte podle názvu tu, kterou jste si vytvořili.
Nyní již pouze změřte plochu buněk. Protože se jedná o složitý systém s velmi
nerovnoměrnou barevností, budete měřit pomocí ručního vyznačení měřené plochy
přímo v původním obraze. To se provádí volbou položky Plocha v nabídce Měření.
V dolní části obrazovky se objeví tabulka pro naměřené hodnoty a tlačítka výběru
nástrojů pro vykreslení měřené plochy. Zvolte si první možnost (Mnohoúhelník) a
postupným kliknutím do rohů rostlinné buňky vyznačte její obvod. Poslední bod
obvodu, kterým se buňka uzavře proveďte pravým tlačítkem myši, tím se vaše volba
tvaru, který bude hodnocen, potvrdí a do tabulky se zapíše hodnota plochy vybraného
tvaru, maximální a minimální rozměr, obvod a řada dalších parametrů. Takto vyznačte
maximum rostlinných buněk, které je možné ve snímku změřit. Naměřená data poté
exportujte do formátu *.xls, aby je bylo možné dále zpracovat v programu Excel.
Export se provádí volbou funkce Export v nabídce Menu, která leží napravo od
tabulky výsledků. Nakonec do snímku vložte měřítko (ikona
v pravém sloupci
obrazovky) a uložte jej pod pozměněným jménem do stejného adresáře jako všechny
původní snímky.
Stejně (včetně přiřazení kalibrace !!) postupujte i při analýze druhého snímku,
předem ale vynulujte tabulku výsledků tlačítkem Vynulovat v nabídce vpravo od
tabulky. V tomto snímku navíc změřte plochu průduchů (pórů) s použitím funkce
4 bodová elipsa v liště nad tabulkou výsledků. Tato funkce se používá tak, že
zakreslíte 4 body elipsy po jejím obvodu (jak je vyznačeno na tlačítku této funkce – tj.
středy os elipsy). Změřte maximum průduchů, které jsou v obraze. Naměřená data
opět exportujte do Excelu a upravený snímek uložte.
4.2.5
Vyhodnocení výsledků
V programu Excel (nebo jiném vhodném programu) vyhodnoťte výsledky měření
a zobrazte je do grafu.
Výsledný protokol by měl obsahovat:
a) Tabulku nastavení parametrů snímání obrazu (zvětšení mikroskopu, formát
ukládaného obrazu (např. JPG), velikost uloženého obrazu (např. 200kB) –
najdete v tabulce Informace o obrazu… v nabídce Soubor programu NISElements)
b) Tabulku funkcí obrazové analýzy (pořadí, název)
c) Tabulku naměřených hodnot plochy (µm2) pro všechny analyzované buňky
v obou obrazech
d) Vypočtenou průměrnou hodnotu plochy rostlinných buněk a průduchů v µm2
e) Graf naměřených hodnot (osa x číslo částice, osa y plocha částice v µm2) spolu
s vyznačením průměrné hodnoty
f) Závěr s vyhodnocením výsledků celého měření
10
Příloha : Vzorové snímky rostlinných buněk získané pomocí mikroskopu Nikon
11
5
Laboratorní práce 2 (PVC)
5.1
Úkoly
4. Sejmout obraz analyzované směsi PVC v co největší kvalitě pomocí mikroskopu
Nikon, digitální kamery SONY a softwaru NIS-Elements.
5. Pomocí software NIS-Elements sestavit posloupnost funkcí pro vyhodnocení plochy
a počtu částic PVC na snímku.
6. Výsledky analýzy exportovat do programu Excel a vyhodnotit tabulkou i grafem.
5.2
5.2.1
Postup práce
Příprava vzorku
Prvním úkolem je rozptýlit analyzovanou směs PVC na podložní sklíčko tak, aby bylo
možné zachytit maximální počet částic v objektivu mikroskopu resp. kamery.
Dále nastavte zaostření a zvětšení mikroskopu opět tak, abyste v objektivu
dostatečně zřetelně viděli optimální počet částic (minimálně 10). Celkové zvětšení
samotného mikroskopu se vypočítá vynásobením hodnoty nastaveného zvětšení 10x
(neboť samotný objektiv zvětšuje 10x). Zvětšení výsledného obrazu je dáno
rozlišením kamery a softwarovým zvětšením v počítači.
5.2.2
Sejmutí obrazu částic PVC
Spusťte program NIS-Elements, stiskněte tlačítko Živý obraz na horní liště
.
V hlavním okně programu uvidíte aktuální obraz, který snímá kamera. Podle obrazu
kamery ještě dolaďte zaostření a zvětšení na mikroskopu (případně i rozptýlení částic
PVC) a poté stiskněte tlačítko Sejmout na horní liště
. Tak převedete obrázek do
počítače. Obraz ihned uložte do počítače (Soubor – Uložit), abyste o něj nepřišli při
snímání kalibračního obrazu.
5.2.3
Sejmutí kalibračního měřítka
Pod mikroskop vložte kalibrační měřítko, obraz zaostřete a sejměte do počítače.
V žádném případě NESMÍTE měnit zvětšení mikroskopu a rozlišení obrazu, které jste
použili při snímání obrazu PVC.
5.2.4
Analýza obrazu programem NIS-Elements
Prvním krokem je kalibrace obrazu. Otevřete si obraz měřítka a v nabídce kalibrace
zvolte funkci Rychlá kalibrace. Dvěma šikmými úsečkami vyznačte předem známou
vzdálenost na kalibračním měřítku. Při vyznačení vzdálenosti postupujete tak, že
vyberete funkci šikmých rovnoběžek
, potažením myši vyznačíte úsečkou jednu
linku kalibračního měřítka, tuto volbu potvrdíte pravým tlačítkem myši a pouhým
kliknutím na druhou linku (ve známé vzdálenosti od první) se vykreslí rovnoběžka
s předchozí úsečkou. Pokud jsou obě rovnoběžky zakresleny správně (tj. odpovídají
linkám měřítka), potvrďte kalibraci pravým tlačítkem myši. Poté zapište název
kalibrace (např. jméno jednoho z pracovníků, číslo turnusu nebo skupiny) a zadejte
skutečnou vzdálenost mezi úsečkami, tak jak je definována měřítkem. Nyní můžete
obraz měřítka zavřít (po uložení) a pokračovat analýzou obrazu PVC.
12
Úkolem analýzy je určit plochu jednotlivých zrníček PVC. Podle výše zmíněného
seznamu si vyberte takové funkce, které jsou pro analýzu vhodné nebo dokonce
nezbytné. Důležitá je nejprve úprava snímku tak, abyste zvýraznili PVC a potlačili
pozadí (viz funkce pro úpravu barevného obrazu), poté je nutné snímek vhodně
naprahovat a převést na binární. Pokud jsou v obraze nějaké binární objekty, které
odpovídají pozadí a ne PVC, pak je odstraňte použitím masky. V editoru masky také
oddělte dotýkající se částice tak, že mezi ně zakreslíte přímku (musíte mít nastaveno,
že zakreslujete pozadí – BG, viz popis Editoru výše). V binárním obraze pak už jen
nastavíte kalibraci a parametry měření tak, aby program změřil plochu vybraných
částic ve výše nadefinovaných jednotkách. Kalibraci obrazu přiřadíte v nabídce
Soubor – Informace o obrazu…, v poli Kalibrace zvolíte podle názvu tu, kterou jste
si vytvořili. Nakonec spustíte měření a zobrazíte si naměřená data.
Doporučený postup je následující:
•
•
5.2.5
Snímek měřítka:
o Kalibrace – rychlá kalibrace
Snímek PVC:
o Obraz - upravit kontrast (zvýraznit PVC, potlačit pozadí)
o Obraz – prahování (převod obrazu na binární)
o Binární – Editor masky (odstranění nežádoucích částic z obrazu, oddělení
dotýkajících se částic)
o Soubor – Informace o obrazu… (přiřazení kalibrace)
o Měření – příznaky pro měření objektů, omezení hodnot příznaků, změřit
objekty
o Měření – výsledky měření objektů (naměřená data exportovat do souboru)
Vyhodnocení výsledků
V programu Excel (nebo jiném vhodném programu) vyhodnoťte výsledky měření
a zobrazte je do grafu.
Výsledný protokol by měl obsahovat:
a) Tabulku nastavení parametrů snímání obrazu (zvětšení mikroskopu, rozlišení
obrazu, formát ukládaného obrazu, velikost uloženého obrazu)
b) Tabulku funkcí obrazové analýzy (pořadí, název, jednoduchá specifikace
a hodnoty nastavovaných parametrů)
c) Tabulku naměřených hodnot plochy (mm2) pro všechny analyzované částice
v obrazu
d) Vypočtenou průměrnou hodnotu plochy vybraných částic v mm2
e) Graf naměřených hodnot (osa x číslo částice, osa y plocha částice v mm2)
spolu s vyznačením průměrné hodnoty
f) Závěr s vyhodnocením výsledků celého měření
13