1. Struktura a replikace DNA

Základy molekulární biologie
KBC/MBIOZ
Čtvrtek 11:30 – 13:00
1.
Struktura a replikace DNA (25.09.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
2.
Metody molekulární biologie I (09.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D)
3.
Metody molekulární biologie II (23.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D)
4.
Transkripce genu a její regulace (06.11.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
5.
Molekulární biotechnologie a transgenní organismy (20.11.2014, Doc. Mgr.
P. Galuszka, Ph.D)
6.
Translace a tvorba proteinů (04.12.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D)
7.
Test (11.12.2014)
Základy molekulární biologie
KBC/MBIOZ
Mária Čudejková
1. Struktura a replikace DNA
Literatura:
Alberts a kol.: Základy buněčné biologie
Espero Publishing, 2000
Garrett & Grisham: Biochemistry 2nd ed.,
Saunders College Publishing, 1999
Nositelem genetické informace je DNA
• Griffith (1928) naočkoval baktérie způsobující
penumónii do myší
• Směs tepelně denaturovaného virulentního typu S a
nevirulentního typu R myši usmrtila
• Vysvětlení: typ R byl transformován typem S!
• Avery (1944) prokázal, že transformaci způsobuje DNA!
Griffithův pokus na myších
Další důkazy
• Lederberg a Tatum (1946) ukázali, že 2 kmeny E. coli lišící
se autotrofií vůči aminokyselinám jsou schopny si
vyměňovat geny
Další důkazy
• Hershey a Chase (1952) při studiu bakteriofágů,
označili jeho DNA s 32P a proteiny s 35S
• Další generace bakteriofága produkovaná po infekci
baktérií obsahovala 32P (tedy DNA z původního
bakteriofága), ale ne 35S (z původních proteinů)!
Základní „dogma“ molekulární biologie
Nukleové kyseliny, DNA a RNA
(primární struktura)
• Polymery spojené 3' - 5' fosfodiesterovou vazbou
• Základní složky nukelových kyselin (monomery) tvoří:
1. fosfát – zbytek kyseliny ortofosforečné
2. ribonukleosid (RNA) / deoxyribonukleozid (DNA):
- ribóza (RNA) / deoxyribóza (DNA)
- dusíkatá báze:
- purínové (A, G)
- pyrimidínové (T, C, U)
AMP - Adenosinmonofosfát
Základní složky nukleových kyselin
RNA vs. DNA
• Sekvence se vždy čte od 5' -konce k 3' –konci
• V sekvenci genu to odpovídá od N-konce k C-konci
proteinu
• DNA – jeden typ, jedna úloha – uložení genetické
informace
• RNA - 3 základní typy a úlohy
- ribosomální RNA (rRNA) – struktura a funkce
ribosomu
- mediátorová RNA (mRNA) – přenáší informace o
genech
- transferová RNA (tRNA) – přenáší aminokyseliny
• Další typy RNA – snRNA, snoRNA, mikro RNA, atd.
Rozdíly mezi DNA a RNA
Proč DNA obsahuje thymin?
• Cytosin samovolně deaminuje a vytváří uracil
• Enzymy opravující chyby v DNA jsou schopny rozpoznat tyto
„mutace“ a nahrazují takovýto uracil cytosinem
• Jak byl ale tyto enzymy rozpoznaly přirozený uracil od
mutantního?
• DNA tedy obsahuje thymin (5-methyl-uracil) namísto uracilu
Proč je DNA 2'-deoxy a RNA není?
• Vicinální -OH skupiny (2' a 3') v RNA způsobují její náchylnost
k hydrolýze
• DNA, která neobsahuje 2'-OH je stabilnější
• Důvod – genetický materiál musí být stabilní
• RNA je použita a poté degradována
Dvoušroubovice DNA
(sekundární struktura)
• Erwin Chargaff měl data o párování bazí, ale nedokázal je
interpretovat (A=T, G=C, zastoupení báz se mezi
různymi organismy liší)
• Rosalinda Franklinová získala difrakční X-ray data
vlákna DNA
• Francis Crick objevil, že je to šroubovice (helix)
• James Watson odvodil princip párování bazí
prostřednictvím vodíkových vazeb
• Objev struktury DNA – 1953
Rentgenový difraktogram svisle orientovaného vlákna DNA.
Antiparalelní dvoušroubovice
• Existuje několik konformací DNA – Watson-Crickovská
pravotočivá B-DNA, pravotočivá A-DNA, pravotočivá
C-DNA, a levotočivá Z-DNA …
http://biostudia.blogspot.cz/20
13/08/konformacni-rodinydna.html
Struktura DNA a párování bazí
• E. coli - průměr vlákna 2 nm, délka 1.6 x 106 nm,
složená struktura (buňka E. coli má délku 2000 nm)
• Lidská DNA ~2 metry, jádro buňky 5 µm, DNA uložena
ve formě chromatinu, histony
Struktura dvoušroubovice DNA
Terciární struktura DNA
• Prostorové uspořádání dvoušroubovice
• Nadšroubovicové vinutí - superhelix DNA
(a nebo např. dvoušroubovice uzavřená do kruhu, nebo
lineární dvoušroubovice připevněná o podklad)
• Terciární strukturu zabezpečují enzymy - topoisomerasy
http://www.cliffsnotes.com/sciences/biology/biochemistryii/dna-structure-replication-and-repair/dna-and-rna-structures
Buňka obsahuje kompletní genetickou
informaci o organismu
Strom života
Bacteria, Archaea ~ 1.000-4.000 genes, Eukaryotes ~ 6.000-30.000 genes
Prokaryota
Struktura eukaryotní buňky
Chromosomy u člověka
Velikost genomů (bp – base pairs)
Amoeba dubia
~ 670.000.000.000
Homo sapiens
~ 3.000.000.000
Paradox hodnoty C
(velikost genomu není v souladu s komplexitou organismu)
Velikost genomu
Velikost genomu
Porovnání velikostí různých genomů
Replikace DNA
Semikonzervativní model
• Prokázali Matthew Meselson a Franklin Stahl (1958) pomocí
izotopového značení
• Replikace DNA vede k vytvoření dvou DNA molekul, ve
kterých je jedno vlákno z původní a druhé zcela nové
Replikace DNA
• Syntéza DNA začína v replikačních počátcích (typická
sekvence, bohatá na AT, bakterie – jeden rep. počátek,
eukaryota – více rep. počátků, iniciační proteiny)
• Syntéza DNA probíhá v tzv. replikačních vidličkách
http://biochemhelp.com/dna-replication-in-prokaryotes.html
Vlastnosti replikace DNA
Nejlépe prozkoumány u E. coli, mnohé vlastnosti obecné
• Replikace je obousměrná - probíhá ve dvou replikačních
vidličkách, které se pohybují v opačných směrech
• Dvoušroubovice musí být rozvinuta - helikasy
• Překroucení (supercoiling) musí být kompenzován
- DNA gyrasa (topoisomerasa typu II)
• SSB proteiny (single strand binding) ochraňují
jednovláknovou DNA před znovuspárováním
• DNA replikace je semidiskontinuální:
Vedoucí vlákno se replikuje průběžně
Druhé vlákno se replikuje v protisměru prostřednictvím
Okazakiho fragmentů, které musí být poté spojeny
(Tuneko and Reiji Okazaki)
Replikační vidlička
• DNA-dependentní DNA-polymerázy syntetizují
komplementární vlákno DNA jen jedním,
a to 5´ - 3´ směrem!
• DNA-polymeráza nedokáže začít syntetizovat nové vlákno
– enzym primáza syntetizuje k DNA komplementární
RNA primer, který pak DNA-polymeráza využije pro
syntézu nového vlákna DNA
• RNA-primery jsou odstraněny a DNA je dosyntetizována
opravnou DNA-polymerázou
• Okazakiho fragmenty jsou spojeny dohromady
DNA-ligázou
Replikační vidlička a replikační aparát
http://bnzm.wordpress.com/what-are-retroviruses/
Důkaz obousměrné replikace DNA
Enzymologie replikace DNA
DNA polymerasa I (opravná DNA polymerasa)
• U baktérie E. coli Arthur Kornberg (1957) prokázal existenci
DNA polymerasy I
• DNA pol I vyžaduje všechny 4 nukleotidy, templát a primer,
který se páruje s templátem a vytváří krátký úsek
dvoušroubovice
• Replikace probíhá od 5' k 3' - konci, nukleotidy jsou
připojovány od 3'-konce vlákna
• DNA pol I katalyzuje kolem 20 cyklů polymerizace než se
nové vlákno oddělí od templátu
• Pol I z E. coli je monomer, 928 aminokyselin (109 kDa)
• Kromě 5'-3' polymerásové aktivity, enzym má také 3'-5'
a 5'-3' exonukleasové aktivity
3´ - 5´ exonukleasová funkce
(odstraňuje chybný/nepárový
nukleotid)
5´ - 3´ exonukleasová funkce
(vyštepuje primery RNA)
E. coli
DNA Polymerasa I
DNA Polymerasa III
„Hlavní" polymerasa u E. coli = DNA-replikasa
• Deset rozdílných podjednotek
• „Jádro" enzymu má 3 podjednotky
–  - polymerasa
–  - 3´ - 5´ exonukleasa
–  - neznámá funkce
• β – podjednotka vytváří prstenec kolem DNA
• Procesivita - 5 millionů bazí!
E. coli
DNA Polymerasa III
DNA replikace u eukaryot
Stejný princip jako u E. coli, ale komplexnější
• Lidská buňka: kopírování 6 miliard bp
• Mnoho počátků replikace: 1 na 3 - 300 kbp
• Známo několik DNA polymeras
• DNA-polymerasa α
- 4 podjednotky
- polymerasová aktivita (procesivita = 200)
- primasová aktivita
- ne 3´ - 5´-exonukleasová aktivita
Buněčný cyklus
Jiný způsob vzniku DNA
RNA-řízená DNA polymerasa
• Howard Temin (1964) pozoroval, že inhibitory DNA
syntézy zabraňují infekci buněk v kultuře RNA viry –
DNA tedy zprostředkovává replikaci viru.
• Temin a Baltimore (1964) nezávisle objevují RNA
řízenou DNA polymerasu – „reverzní transkriptasu“
Opravy poškozené DNA
Základní rozdíl oproti RNA, proteinům, lipidům, atd.
• Všechny ostatní složky mohou být nahrazeny, ale DNA
musí být zachována
• DNA v buňkách podléhá kontinuálnímu poškozování
• Buňky potřebují nástroje pro opravy chybějících,
pozměněných nebo nesprávných bazí, opravy insercí a
delecí, poškození UV zářením – pyrimidinové dimery,
přerušení vlákna, cross-link
• Existují dva základní mechanismy oprav: oprava chyb
v párování bazí (mismatch repair) a opravy chemického
poškození
Mutace odpovědná za vznik genetické choroby
– srpkové anémie
Opravy chyb v párování bazí
(Mismatch repair)
• Opravné enzymové systémy kontrolují dvoušroubovici
DNA a identifikují nesprávně párované báze, poté
vyříznou chybný usek a nahradí jej.
• Příkladem je methylační dráha u E. coli.
• Methylace DNA probíhá po replikaci, takže tento systém
identifikuje methylovaný řetězec jako původní a opraví
nesprávně párovanou bázi na druhém řetězci.
Restrikční endonukleasy
• Baktérie dokážou zabránit ("restrict„) možnosti útoku cizí
DNA pomocí restrikčních enzymů
• Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na
místech specifické sekvence
• Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a
štěpí je.
•
• Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný
kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh
organismu
• Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R
baktérie Escherichia coli.
Opravy chemického poškození DNA
Tvorba pyrimidinových dimerů působením UV záření
Pyrimidinové dimery mohou být přímo opraveny enzymem
fotolyasou
Opravy chemického poškození DNA
• Vystřihnutí a oprava: DNA glykosylasy odstraní
poškozenou bázi a vytvoří AP místo.
• AP (Apurinic/apyrimidinic) endonukleasa rozštěpí
poškozený řetězec, endonukleasa odstraní několik
residuí okolo a mezera je vyplněna pomocí DNA
polymerasy a DNA ligasy.
Oprava poškozené báze v DNA
Mechanismus genové rekombinace
(rekombinační oprava)
• Obecná rekombinace: výměna homologních
segmentů mezi dvěma molekulami DNA
(crossing-over během meiozy)
• Robin Holliday (1964) navrhl model využívající
jednovláknového naštípnutí v homologních
místech.
• Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení
(ligaci) dvou naštípnutých homologních řetězců –
vzniká Hollidayovo spojení (Holliday junction)
Holliday junction
https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva/ruva-020
http://www.learnerstv.com/animation/animat
ion.php?ani=169&cat=Biology