kap. 24

Speciální metody
Příprava materiálu byla podpořena projektem
OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Část 24 – Speciální metody
Mikro HPLC, kapilární HPLC a LC na čipu
Většina v současnosti používaných kolon má vnitřní průměr 4,6 mm, i když mají dvakrát větší
spotřebu solventu a jejich účinnost není lepší než u kolon o průměru 3,2 mm. Je ale řada
dobrých důvodů pro zmenšení jejich průměru:
Spotřeba solventu klesá s druhou mocninou průměru kolony.
Mikrokolony jsou nezbytné pro stopové analýzy a při malých množstvích vzorku.
Některé spřažené techniky LC-MS preferují nízké průtoky eluentu.
K dosažení vyššího počtu teoretických pater jsou třeba kolony s malým, dokonce
velmi malým, vnitřním průměrem.
Kolony se dají rozdělit do tří kategorií:
Otevřené kapiláry (open capillaries). Kapilára s vnitřním průměrem menším nebo
rovným 50 µm, která má chemicky modifikován povrch nebo kapalný film jako
stacionární fázi, ta je normální nebo reverzní.
Plněné kapiláry (packed capillaries). Je možné plnit kapiláry o rozměrech 15 cm ×
75 µm běžnými HPLC fázemi nebo monolity.
Mikrokolony. Ty jsou podobné obvyklým HPLC kolonám, ale mají průměr do 1 mm.
Otevřené kapiláry s průměrem do 5 µm a 106 teoretickými patry jsou poměrně snadno
připravitelné. Teorie ukazuje, že kapiláry s průměrem menším než 10 µm vynikají nad
Speciální metody
plněnými kolonami z hlediska separační kapacity píků, rozlišení a doby analýz. S malým
průměrem kapilár ale souvisí mnohé problémy, které nicméně principiálně jsou technicky
řešitelné (objem nástřiku pouze 50 pl, průtok 2 nl ml-1).
Plněné kolony poskytují vyšší separační kapacitu, tzn. množství nástřiku vzorku může být
větší než u otevřených kapilár. Nevýhodou kolon je nižší permeabilita.
Mikrokolony o vnitřním průměru do 1 mm (ocelové kolony s vnějším průměrem 1/16“) jsou
komerčně dostupné a nabízejí výhody vyšší citlivosti a úspory solventu. Požadavky na
instrumentaci jsou následující:
čerpadlo
25 – 250 µl min-1
objem vzorku
0,2 – 1 µl (maximální zatížení kolony je 10 µl vzorku)
objem detekční cely
0,5 – 1 µl
Navíc jsou používány ještě kolony z taveného křemene (fused-silica) s vnitřním průměrem
kolem 0,2 mm. V obrázku níže je ilustrována účinnost mikro HPLC s použitím této kolony
(tzv. small-bore techniky). V tělních tekutinách bylo touto technikou identifikováno 15
žlučových kyselin, které jsou zásadní pro posouzení onemocnění jater. Tato konkrétní analýza
se vyznačovala nízkou spotřebou solventu pouze 210 µl. V takto malém objemu je
problematická tvorba a reprodukovatelnost gradientu. K detekci byl použit reakční detektor.
V chromatogramu jsou píky popsány používanými zkratkami: UDCL = ursodeoxycholová
kyselina, CL = cholová kyselina, CDCL = chenodeoxycholová kyselina, DCL =
deoxycholová kyselina, LCL = lithocholová kyselina, G (předpona) = konjugát glycinu, T =
kojugát taurinu.
Speciální metody
Jinou oblastí jsou čipy s integrovanou HPLC separační cestou. Jednou možnou variantou je
obdélníkový kanálek (např. 75 µm × 50 µm, dlouhý několik cm), který je plněn klasickou
stacionární 5 µm fází. Obdobný čipový modul velikosti kreditní karty vybavený
odpovídajícím interface může být použit jako vstup do hmotnostního spektrometru s ionizací
elektrosprejem. Nicméně opravdové čipy, které známe z technologie polovodičů, jsou
konstruovány kompletně z křemíku litograficky nebo leptáním. Možné uspořádání je
tvořeno pravidelně uspořádanými válci širokými 5 µm, které jsou umístěny ve směru toku.
Mohou být provozovány v normálním módu (oxidovaný křemík) nebo v reverzním
uspořádání (po derivatizaci). Na takovýchto čipech je možné provádět klasickou
chromatografickou separaci, ale v současnosti jsou spíše ještě v experimentálním vývoji.
Speciální metody
Velmi rychlá a super rychlá HPLC
Rutinní analýza vyžaduje krátké doby analýz obzvláště, pokud není potřeba vzorky složitě
upravovat. Požadavky na instrumentaci jsou velmi vysoké, ale příslušné systémy jsou
komerčně dostupné. Jsou rozlišovány tři kategorie:
Konvenční HPLC
Mrtvý čas t0
≈ 1 min
Velmi rychlá HPLC
≈ 10 s
Super rychlá HPLC
≈1s
Pro velmi a super rychlou HPLC musí být splněny následující podmínky:
Musí být vysoký difúzní koeficient molekul solutu v mobilní fázi, proto musí být
použita mobilní fáze s nízkou viskozitou. Žádoucí mohou být i separace za vyšší
teploty. Metoda je neslučitelná se vzorky o vysoké molekulové hmotnosti.
Rychlá separace je závislá na malém rozměru částic. Teorie říká, že minimální možný
retenční čas je úměrný druhé mocnině průměru částic.
Zajímavou možností je použití vyšších tlaků než je běžné (tedy UHPLC).
Kolona musí být co nejkratší.
Nejvhodnější stacionární fázi tvoří perfůzní částice a monolity.
Mimokolonové objemy chromatografu musí být naprosto minimální. Nejlepším
řešením je uspořádání, kde je kolona připojena k detektoru a injektoru bez dalších
vnějších objemů (obrázek níže).
Čerpadlo musí být schopno zajistit požadovaný průtok a tlak. Lineární tok pro daný
objemový průtok roste se snižováním průměru kolony.
Autosampler musí pracovat s cyklem 10 s a menším.
Časová konstanta i objem cely detektoru musí být dostatečně malé, aby neovlivňovaly
samotnou separaci, tzn. neměly by mít vliv na tvar píků nebo rozlišení.
Zpracování dat musí být velmi rychlé.
Speciální metody
Je zřejmé, že u velmi a super rychlé HPLC pracuje kolona daleko od svého van Deemterova
minima, a tudíž nemůže pracovat s maximální účinností. Ačkoli je super rychlá HPLC spíše
vhodná pro izokratickou eluci, lze ji provádět i se super rychlým gradientem.
Příkladem velmi a super rychlé chromatografie je separace farmaceutických produktů
v obrázku níže. Metoda je výrobcem používána rutinně pro určení rychlosti rozpuštění
a uniformnosti obsahu tablety. Separovány jsou látky na snížení hypertenze, 1-clopamid, 2dihydroergocristin, 3-reserpine, kolona rozměru 100 mm x 2.1 mm, 3 ml min-1.
Speciální metody
Ještě rychlejší je separace zobrazená v níže uvedeném obrázku. Testovaná směs pěti
komponent je rozdělena během 3 s, relativní směrodatná odchylka kvantitativní analýzy je
lepší než 1,5%. Separace proběhla na koloně 25 mm x 2,6 mm, 13 ml min-1, tlak 36 MPa; 1=
p-xylen, 2= anisol, 3= nitrobenzene, 4= acetophenone, 5= dipropyl phthalate.
Speciální metody
Rychlé separace při tlaku 1000 barů: UHPLC
Za zvýšeného pracovního tlaku můžeme docílit většího počtu teoretických pater. Na druhou
stranu je za vyššího tlaku možné provádět i rychlejší separace se stejnou separační účinností.
(Ačkoli pokud je průtok zvýšen bez ohledu na rozměr kolony, bude separace mírně horší
kvůli van Deemterovu vztahu. Zvyšování průtoku není samo o sobě řešením pro optimalizaci
metody.)
Zkonstruovat čerpadla pro tlaky kolem 1000 barů, tak aby splnila základní požadavky na
bezpulzní tok nezávislý na tlakovém spádu, není jednoduché. Nicméně dnes je to
proveditelné. Požadavek vysokých píkových kapacit (např. potřebných v proteomice) vedl k
tomu, že taková čerpadla jsou dnes na trhu dostupná. Technika, která využívá takto vysoké
tlaky je nazývána ultra vysokoúčinná kapalinová chromatografie (ultrahigh performance
liquid chromatography - UHPLC).
Pořídit UHPLC čerpadlo a používat je s běžným HPLC vybavením nemá smysl. V systému
musí všechny komponenty odpovídat zvýšeným tlakovým nárokům. Navíc k uspokojivým
výsledkům je doporučeno použít i speciální UHPLC kolony s UHPLC fází. Obrázek níže
ukazuje profil metabolitů vzorku plazmy, který byl pořízen s UHPLC-MS.
Teoretické základy pro separaci až do 3000 bar byly detailně diskutovány Martinem
a Guiochonem. Zdá se, že při tlacích nad 1000 bar musí být brány v potaz některé další jevy,
jako je stlačitelnost mobilní fáze nebo termální efekty, které znesnadňují vývoj a optimalizaci
technik v této oblasti.
Speciální metody
HPLC s mobilní fází v nadkritickém stavu
Čistá látka může být ve fázi plynné, pevné nebo kapalné (nebo dokonce v kombinaci těchto
fází) v závislosti na tlaku a teplotě, vztahy jsou ukázány v grafu dole. Na konci křivky
vymezující teplotu varu a rozdělující plynnou a kapalnou fázi je vyznačena oblast, kde je
hustota obou fází stejná. Od kritického bodu P (šrafovaná oblast) pokračuje oblast fluidní,
nebo také nadkritická, ve které není látka ani v plynném ani kapalném skupenství. Tato
tekutina/fluidum může být použita/o, jako mobilní fáze pro chromatografii, v modu který je
označen jako chromatografie s tekutinou v nadkritickém stavu (supercritical fluid
chromatography, SFC).
Mobilní fáze v nadkritickém stavu zpřístupňuje kombinaci plynové a kapalinové
chromatografie, má ale i své vlastní zákonitosti. Některé efekty jsou neobvyklé a zajímavé:
Difúzní koeficient analytu leží mezi difúzními koeficienty v kapalině (poměrně nízké,
pro HPLC je potřeba nízký průtok) a plynu (poměrně vysoké, v GC velké rychlosti
průtoku).
Viskozita mobilní fáze je větší než u plynů, ale mnohem nižší než u kapalin.
Speciální metody
Rozpustnost molekul vzorku roste s rostoucím tlakem. Gradient, ovlivňující retenční
časy, může být realizován nejen změnou složení mobilní fáze, ale také změnou tlaku.
Silně zadržované složky jsou rychle eluovány zvýšením tlaku.
Tlak par zplyněných analytů má velký vliv na retenční časy, tato skutečnost je stejná v GC.
Potenciální látky použitelné jako mobilní fáze v SFC jsou uvedeny v tabulce níže. První dvě
nejsou pochopitelně vhodné pro teplotně citlivé analyty. Zatím je nejběžnější využití oxidu
uhličitého jako mobilní fáze v SFC. Jelikož je oxid uhličitý nepolární, je často používán
přídavek solventu, např. methanolu.
Pro chromatografii v nadkritickém stavu je nezbytná instrumentace schopná zajistit přesnou
kontrolu tlaku a teploty. Mobilní fáze je na správnou teplotu vyhřívána ve spirále před
nástřikovým ventilem. Spirála, ventil, kolona i detektor by měly být umístěny v termostatu.
Za detektorem musí být restriktor, který v celém sytému zajistí dostatečný tlak.
K chromatografii mohou být použity jak kolony typu otevřených kapilár, na kterých lze
dosáhnout vysokého počtu teoretických pater, tak plněné kolony, jedna z nich byla použita v
případě obrázku níže pro separaci alkaloidů. Typicky používanými detektory pro SFC jsou
Speciální metody
UV, polarimetr (pro separaci enantiomerů), MS, MS/MS a plamenový ionizační detektor
(jako v GC).
SFC separace alkaloidů na náplňové koloně: 1=narcotine, 2=thebaine, 3=codeine,
4=cryptopine, 5=morphine
Pro SFC jsou méně vhodné polární analyty. Rozpouštědlem vzorku může být methanol, nebo
jakékoli jiné méně polární rozpouštědlo.
Preparativní aplikace SFC jsou možné a to i v průmyslovém měřítku (nenasycené mastné
kyseliny, cyklosporiny, pythol). Předmětem zvláštního zájmu jsou také separace enantiomerů
na chirálních stacionárních fázích, které mohou být provozovaných v normálním módu.
Speciální metody
HPLC s přehřátou vodou
Přehřáté kapaliny se vyznačují zajímavými vlastnostmi i pod svým kritickým bodem. Přehřátá
voda při teplotách nad 100 °C je obzvláště atraktivní médium. Obrázek dole ukazuje vztah
mezi tlakem a bodem varu. Je např. vidět, že při teplotě 200 °C je potřeba udržet tlak téměř 16
bar, aby nedošlo k varu vody. Vyšší teploty jsou používány jen vzácně, ačkoli kritický bod
vody je 374 °C a 220 bar. Chromatografické podmínky mohou být voleny libovolně, ale tlak
musí být minimálně odpovídající hodnotě na křivce bodu varu, rovněž je možné provádět
separace kdekoli v oblasti nad křivkou.
S rostoucí teplotou polarita vody znatelně klesá, při 200 °C je její polarita srovnatelná
s polaritou methanolu. Z tohoto důvodu je možné provádět gradient s reverzní fází prostou
změnou teploty čisté vody (obrázek níže). Cela detektoru musí být tlakově odolná. Jako
restriktor tlaku funguje kapilára odpovídající délky a vnitřního průměru.
Speciální metody
Separace v gradientu teploty vody použité jako mobilní fáze, teplota se měnila lineálně v
rozsahu 130-220C. 1=propazin, 2=atrazin, 3=simazin, 4=ametryn, 5-terbutryn.
Výhody přehřáté vody jsou evidentní: je levná, dostupná, bez negativního vlivu na životní
prostředí, má výbornou transparentnost v UV oblasti a je kompatibilní s univerzálním
plamenovým ionizačním detektorem. Vzrůstající teplota vede k poklesu viskozity, a tím
umožňuje rychlý přenos hmoty. Většina analytů je i při vysokých teplotách stabilní, alespoň
po dobu průběhu separace. Nejsou vhodné tradiční reverzní fáze, ale musí být použity
speciální modifikace. Polystyreny, fáze založené na oxidu zirkoničitém nebo porézní grafit
jsou také vhodné, nicméně je třeba uvažovat individuální tepelnou stabilitu těchto fází.
Separace s přehřátou vodou mohou být prováděny na plněných kapilárách i na HPLC
kolonách klasických průměrů.
Elektrochromatografie
Mobilní fáze nemusí být přes kapiláru nebo kolonu hnána pouze pomocí čerpadla, ale
můžeme použít i elektroosmotický tok. To znamená využít skutečnosti, že elektrická
dvojvrstva se vytvoří na všech vrstvách rozhraní. Křemenné sklo má povrch pokrytý vázaným
negativním nábojem a roztok v kontaktu s povrchem tvoří pozitivní náboj na rozhraní. Jestliže
Speciální metody
je aplikován potenciálový gradient kolem 50 kV m-1, roztok protéká směrem k negativně
nabité elektrodě.
Technika má zřejmé následující výhody:
Rychlostní profil není parabolický, jako při aplikaci čerpadla, ale obdélníkový. Rozšiřování
píků způsobené příspěvkem nerovnoměrné distribuce proudění (A) klesá.
Z tohoto důvodu není třeba používat otevřené kapiláry s velmi malým průměrem. Získaná
účinnost separace je nezávislá na průměru kapilár. Jejich délka může být volena s ohledem na
požadavky a nemusí být brán v úvahu odpor proti proudění. Účinnost separace je stejně
vysoká jako v plynové chromatografii.
Tím, že se nemusí uvažovat odpor, mohou být kapiláry plněny velmi malými částicemi (≤ 1
µm). Redukovaná výška patra h je nižší než 2, to znamená lepší než u klasické HPLC.
Mobilní fáze musí být vodivá. Používají se pufry o koncentracích mezi 0,001 a 0,1 mol l-1.
Lineární rychlost toku je řádově 1 mm s-1. Nevýhodou je silné zahřívání mobilní fáze během
toku. Z tohoto důvodu je nezbytné zajistit efektivní chlazení a plyne z něj i omezení
v průměru kapilár. Přechod ke kapilární elektroforéze, kde musí mít molekuly vzorku náboj
(na rozdíl od kapilární elektrochromatografie) není přesně definován.