Biochemici - USA_Kanada_1

OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Historie biochemie
KBC/HIBC
prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D.
LS 2012/2013
Biochemie v USA a Kanadě
Maud Leonora Menten
(*20. 3. 1879 – †26. 7. 1960)
byla kanadskou vědkyní z oblastí lékařství,
lékařské chemie a biochemie, která je
známa pro svůj příspěvek k formulaci
rovnice Michaelise-Mentenové.
Narodila se v Port Lambdonu v Ontariu a
studovala medicínu na univerzitě v Torontu
(M.D. v r. 1911, byla mezi prvními ženami v
Kanadě). Diplomovou práci zpracovala na
univerzitě v Chicagu. V r. 1912 odešla za
výzkumnou činností do Berlína, kde
spolupracovala s Leonorem Michaelisem
(Biochem. Zeitschrift 1913, 49:333–69).
V r. 1916 získala v Chicagu Ph.D. s disertací
věnovanou zásaditosti krve při chorobách.
V l. 1923-1960 pracovala jako patolog na
Pittsburské univerzitě, v l. 1951-1953 byla
vědeckou
pracovnicí
na
Lékařském
výzkumném ústavu Britské Kolumbie.
http://www.flickr.com
Maminka byla vedoucí pošty. Během studií na univerzitě v Torontu pracovala
M. Mentenová jako demonstrátorka ve fyziologické laboraři (získala
magisterský titul z fyziologie v r. 1907). Získala roční stipendium na
Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum (NYC), kde publikovala první
práci o vlivu bromidu radia na tumory potkanů. Praktikovala v nemocnici pro
ženy a děti v NY.
Z její výzkumné práce je třeba dále zmínit objev spřažené reakce pro
alkalickou fosfatasu s azobarvivem, která se používá v histochemii. Popsala
toxiny z některých baktérií a byla mezi prvními, co separovali proteiny
pomocí elektroforézy (1944). Pracovala na vlastnostech hemoglobinu, regulaci
hladiny krevního cukru a funkci ledvin. Napsala zhruba 100 vědeckých prací.
Měla vztah k umění (hudba, kreslení).
Zabývala se horskou turistikou a
astronomií. Kromě mateřského jazyka
uměla také rusky, německy, francouzsky
a italsky. Jezdila více než 30 let ve
Fordu, model T. Celý život byla
kanadskou občankou, i když pracovala v
USA. V r. 1988 byla uvedena do Síně
slávy kanadských lékařů.
James Batcheller Sumner
(*19. 11. 1887 – †13. 8. 1955)
Sumner byl prvním biochemikem, který
krystaloval enzym (ureasu). Tento jeho
výsledek byl přijat s nedůvěrou či dokonce
s
výsměchem
nicméně
přispěl
ke
konečnému pochopení toho faktu, že
enzymy patří mezi proteiny.
Narodil se v Cantonu u Bostonu, jeho
předkové přišli do Ameriky z Anglie před
pol. 17. stol. Jeho dědeček měl továrnu na
zpracování bavlny a farmu. Už jako dítě
proto mohl pozorovat parní a pletací stroje
a zvířata na farmě. Na střední škole si
oblíbil chemii a fyziku.
Při lovecké výpravě ho postřelil společník
do levé ruky, která musela být
amputována nad loktem. Musel se přeučit
na praváka, ovládal i s postižením sporty
jako tenis, lyžování nebo jízda na kánoi .
Od r. 1906 studoval na Harvardu elektrické inženýrství, ale brzy to změnil za
studium chemie, na škole publikoval jako spoluautor se svým profesorem práci
o syntéze papaverinu.
Po ukončení studia v r. 1910 šel pracovat do přádelny strýce. Po půl roce
dostal nabídku učit jeden semestr chemii a fyziologii na Koleji Mt. Allison v
Sackvillu, Nový Brunšvik (Kanada). Pak ještě krátce působil jako asistent na
Worcesterské polytechnice.
Následně odešel na Lékařskou fakultu Harvardu, kde dostudoval biochemii u
Otto Folina (1867-1934), chemika pocházejícího ze Švédska, který se
zabýval analytickými mikrometodami. Folin spolu s rumunským stážistou
jménem Vintilă Ciocâlteu (1890-1940) vyvinuli činidlo pro stanovení
fenolových látek (Folin-Ciocalteu Reagent, FCR). Absolvoval v r. 1913 a v r.
1914 získal doktorát, disertace se zabývala tvorbou močoviny v těle živočichů,
spolupracoval s Cyrusem H. Fiskem, objevitelem kreatinfosfátu (1927).
Poté nastoupil na Cornellovu univerzitu, kde působil na pobočce Lékařské
fakulty v Ithace, NY. Byl docentem a později profesorem na Katedře
fyziologie a biochemie. V r. 1938 přešel na zoologii na Přírodovědecké fakultě.
V r. 1945 pak zakotvil na Fakultě zemědělství, Katedra biochemie a výživy.
Bylz zde od. 1947 ředitelem Laboratoře chemie enzymů.
Otto Folin v laboratoři McLeanovy nemocnice v Bostonu (rok 1905).
V l. 1920-21 absolvoval postdoktorský pobyt na Lékařské fakultě Bruselské
univerzity v Belgii. V l. 1929 byl u nobelisty Hanse von Eulera (1873-1964)
na Stockholmské univerzitě a konečně v r. 1937 na univerzitě v Uppsale.
Na Cornellu především učil biochemii s velkým úvazkem, ku pomoci měl pouze
jediného asistenta, příležitostí k vědecké práci měl málo. Publikoval na téma
bioanalytických metod, čímž se zabýval už na Harvardu. Šlo o stanovení
amoniaku a močoviny např. ve svalu a moči.
Byl fascinován problémem podstaty enzymů a rozhodl se získat čistý enzym.
Zvolil ureasu z fazole Canavalia ensiformis odkud předtím krystaloval i dva
globuliny. Cesta ke krystalické urease trvala 9 let, zkoušel mnoho metod a
reagencií, nakonec využil relativně jednoduché procedury, získal koncentrát s
malými krystaly. Po centrifugaci a rozpuštění ve vodě šlo naměřit vysokou
aktivitu a test na obsah proteinů byl pozitivní. Výsledky byly publikovány v J.
Biol. Chem. v r. 1926.
Publikace byla přijata s nedůvěrou, zejména Richardem M. Wilstatterem
(1872-1942) a jeho žáky v Německu, kteří předpokládali, že enzymy nejsou
proteinové povahy, s tím, že krystaloval pouhý proteinový nosič enzymu. V
následujících letech Sumner podpořil svoji převratnou práci dalšími
publikovanými daty (10 prací).
V r. 1939 John Howard Northrop (1891-1987) z Rockefellerova ústavu v
Princetonu, NJ, krystaloval pepsin a později s Mosesem Kunitzem (18881978) krystaloval trypsin a chymotrypsin.
Ještě několik let ale trvalo, než se všeobecně akceptovalo, že enzymy jsou
proteiny. V r. 1946 získali Sumner, Northrop a Wendell M. Stanley (19041971) Nobelovu cenu za chemii.
Sumner rovněž krystaloval katalasu, s Alexanderem Douncem (1909-1997),
ten později jako první vyslovil hypotézu, že DNA by mohla být templátem pro
tvorbu RNA a následně proteinů, předpověděl genetický kód (1952), objevil
také skleněný homogenizátor pojmenovaný po něm, umožňující izolaci malých
organel, jako jsou mitochondrie.
Celkem Sumner získal půl tuctu krystalických enzymů. Provedl osobně většinu
laboratorních experimentů. Při přípravě čtyřdílné knihy o enzymech, do které
přispívalo 78 vědců a měla 2800 stran nejen posuzoval všechny příspěvky, ale
i osobně ověřoval v laboratoři některé metodiky.
Frederick Grant Banting
(*14. 11. 1891- †21. 2. 1941)
F. Banting byl kanadský medicínský
výzkumník, lékař a nositel Nobelovy ceny,
který je považován za prvotního objevitele
insulinu. Nobelovu cenu získal spolu se
Skotem Johnem Jamesem Rickardem
Macleodem (1876-1935) a podělil se o
finanční odměnu se svým spolupracovníkem
Charlesem Herbertem Bestem (18991978). Od kanadské vlády dostal za
odměnu celoživotní rentu na výzkum.
Banting se narodil na farmě v Ontariu
(Alliston), byl nejmladší z pěti dětí. V
místě navštěvoval veřejnou základní i
střední školu. Chtěl vstoupit do armády,
ale byl odmítnut kvůli slabému zraku.
Na Torontské univerzitě proto začal se
studiem bohoslovectví a posléze medicíny.
Zdroj: Wiki
V roce 1916 získal bakalářský titul a narukoval do Lékařského sboru Kanadské
armády. Bojoval ve Velké válce ve Francii a byl v r. 1918 raněn v bitvě u
Cambrai (Kamerijk). Za hrdinství získal Válečný kříž (1919). Po návratu do
Kanady měl praxi v Londýně, Ontario. Po návratu do Toronta studoval
ortopedii a pracoval v nemocnici. Učil na univerzitách v Londýně a Torontu a v
r. 1922 získal titul doktor medicíny.
O diabetes se zajímal mj. v souvislosti s jedním článkem o pankreatu. V té
době již díky práci jiných vědců (Naunyn, Minkowski, Opie, Schafer) bylo
známo, že pankreas (Langerhansovy ostrůvky) produkuje hormon, jehož
nedostatek vyvolává symptomy diabetu. Název insulin pochází od Schafera.
Pokusy izolovat insulin z rozdrceného pankreatu do té doby ztroskotaly na
jeho rozkladu působením proteolýzy. Moses Barron uveřejnil článek o
experimentálním podvázání vývodu pankreatu, který poslézle vedl k odumření
buněk vylučujících trypsin, přičemž zůstaly nepoškozeny buňky
Langerhansových ostrůvků. Banting diskutoval záležitost s Macleodem,
profesorem fyziologie na Torontské univerzitě, který mu dal k dispozici
laboratoř a asistenta Besta. Banting a Best pak spolu úspěšně získali insulin.
Banting se v roce 1922 stal starším medicínským demonstrátorem na
Torontské univerzitě a v následujícím roce získal pozici „Banting and Best
Chair“ v medicínském výzkumu financovanou provincií Ontario.
Zdroj: Wiki
Stal se rovněž čestným poradcem v několika nemocnicích v Torontu, Pracoval
dále jako vědec na Katedře medicínského výzkumu Bantinga a Besta.
Věnoval se problematice silikózy, rakoviny, procesu utonutí a jeho obrácení.
V souvislosti s dobou druhé světové války též pracoval na medicínské
problematice v letectví (přechodná ztráta vědomí ve velkých výškách,
synkopa - „blackout“) jako vedoucí výzkumné jednotky v tajném zařízení
Kanadského královského letectva (RCAF).
Zemřel v r. 1941 na následky zranění, které utrpěl při letecké havárii v
Newfoundlandu při cestě do Anglie. Byl totiž spojovacím důstojníkem mezi
britskými a severoamerickými lékařskými službami.
V soukromém životě se věnoval malířství, maloval především kanadskou
krajinu a zúčastnil se i vládou financovaných expedic do Arktidy (Velké
Otročí jezero). Byl dvakrát ženatý, z prvního manželství měl syna.
Byl členem mnoha vědeckých a lékařských společností doma i v Británii a
USA, v r. 1934 se stal rytířem Řádu Britského impéria. V r. 1935 byl zvolen
za člena Královské společnosti. V r. 1989 byl zapálen v Londýně (Ontario)
Plamen naděje, na počest Bantinga a obětí diabetes, má hořet dokud nebude
účinná léčba této nemoci. Je po něm pojmenováno několik škol a institucí.
Charles Herbert Best
(*27. 2. 1899- †31. 3. 1978)
C. H. Best byl americko-kanadský
výzkumník v oboru medicíny, který je
znám jako spoluobjevitel insulinu.
Narodil se v Maine na kanadskoamerické hranici jako syn Kanaďanů.
Jeho otec byl lékař.
V r. 1916 odešel do Toronta kde
studoval na univerzitě humanitní vědy.
V r. 1918 vstoupil do kanadské armády,
ale do války kvůli příměří nezasáhl. Po
návratu z výcviku v Anglii se vzdělával
na Torontské univerzitě v oborech
fyziologie, biochemie a chemická
patologie. Jako student pracoval
experimentálně
na
souvislostech
diabetu u profesora J. J. R.
Macleoda, po promoci od května r.
1921 spolupracoval s F. G. Bantingem.
Biogr. Mems Fell. R. Soc.
Jeho zájem o studium diabetu plynul z tragické zkušenosti z vlastní rodiny,
kdy jeho teta zemřela v diabetickém komatu. Sám Macleod kolem r. 1920
zcela nevěřil, že Langerhansovy ostrůvky produkují antidiabetický hormon.
Nabízela se ještě možnost, že průchod krve pankreatem ovlivňuje její
složení, k čemuž nenastává po odnětí pankreatu u experimentálních zvířat.
Banting v r. 1920 navštívil Macleoda s návrhem na výzkum obsahu buněk
Langerhansových ostrůvků po podvázání vývodu pankreatu a odumření
hroznovitých pankreatických buněk. Macleod byl expert na metabolismus
sacharidů, návrh přijal skepticky (nebyl nový!), ale protože odjížděl na
následující léto do Evropy, rozhodl se umožnit Bantingovi provést
experimenty.
Banting s Bestem podvázali vývod z pankreatu u laboratorních psů, ti pak byli
ponecháni několik týdnů bez dalšího zásahu. Z podvázaných pankreatů byl pak
připraven vodný extrakt a ten injekčně vpraven psům s odstraněným
pankreatem, u kterých byla takto vyvolána silná cukrovka. Injekce způsobila
podstatný pokles krevního cukru. Extrakty jiných orgánů např. sleziny byly
bez účinku. Experiment byl několikrát opakován, opakování si vyžádal i
Macleod po návratu z Evropy (září 1921). Výsledky byly poprvé uveřejněny
na setkání Americké fyziologické společnosti na Yaleově univerzitě v prosinci
1921. Protože Banting a Best nebyli členy společnosti, byl jako hlavní autor
uveden Macleod, což vyvolalo u Bantinga pocit křivdy.
První publikace autorů Banting a Best o insulinu byla v časopise Journal of
Laboratory and Clinical Medicine (únor 1922). Další práce byla později v r.
1922 ve stejném časopise. Extrakt z pankreatu hovězího plodu umožnil při
denní injekční aplikaci žít depankreatizovanému psu po dobu 70 dní. Bylo to
kvůli několikanásobně vyššímu obsahu insulinu v extraktu a kvůli skutečnosti,
že pankreas plodu do 5tého měsíce neobsahuje aktivní trypsin.
Stabilní insulin byl posléze získáván okyseleným ředěným ethanolem. S jeho
přečištěním pomáhal biochemik prof. James Bertram Collip (1892-1965) z
Albertské univerzity v Edmontonu. Od r. 1922 byl insulinový extrakt
testován u pacientů ve Všeobecné nemocnici v Torontu. Za velkou produkci
insulinu byl později odpovědný Best (do r. 1941) jako ředitel Oddělení insulinu
Conaughtových laboratoří na Torontské univerzitě.
Banting, Best, Collip a Macleod se dále věnovali mechanismu působení insulinu.
Přitom se zjistilo u laboratorních králíků, že injekční dávkování insulinu může
vést ke křečím a smrti (v důsledku hypoglykemie). Vzešla potřeba biologicky
standardizovat připravovaný insulin.
Patenty na produkci insulinu byly podány v Kanadě, USA a Velké Británii. Na
Torontské univerzitě vznikl dohlížecí Insulinový výbor. Licence na přípravu
insulinu byla v r. 1922 poskytnuta společnosti Eli Lilly v Indianapolisu.
Působení insulinu (zdroj Wikipedia)
V r. 1923 byla Nobelova cena udělena jen Bantingovi a Macleodovi,
Banting se o finanční prémii podělil s Bestem a Macleod s Collipem.
V r. 1924 se Best oženil, v r. 1925 získal podporu pro vědecký pobyt v Evropě
(Národní ústav pro medicínský výzkum v Londýně). Zde se podílel na studiu
metabolismu glukosy o experimentálních zvířatech s odstraněnými játry, kde
byla hladina glukosy v krvi udržována infuzí. Po přídavku insulinu do infúze
klesala hladina krevní glukosy odbouráním a tvorbou glykogenu.
V Londýně dále studoval histamin v plicní tkáni. V r. 1927 přijal profesuru na
Torontské univerzitě (fyziologická hygiena). V r. 1928 získal na Londýnské
univerzitě titul D.Sc. Po odchodu Macleoda do Aberdeenu (Skotsko) v r. 1929
se Best ve věku 30ti let stal v Torontu vedoucím Katedry fyziologie. Po
Bantingově smrti v r. 1941 se stal ředitelem Katedry medicínského výzkumu
Bantinga a Besta, tuto pozici držel do r. 1967, kdy odešel na odpočinek.
Dalším z Bantingových výzkumů byla role cholinu v potravě laboratorních
zvířat jako prevence proti hepatické cirhóze (tuk v játrech) vyvíjející se v
důsledky chybějícího pankreatu. V r. 1937 vyvinul tým včetně Besta postup,
jak získávat heparin z hovězích plic. Jeho válečný výzkum pro kanadské
námořnictvo spočíval v problematice nočního vidění stimulovaném červeným
světlem. Zabýval se i hyperglykemií vyvolanou glukagonem.
Robert „Jim“ Brainard Corey
(*19. 4. 1897- †23. 4. 1971)
Robert Corey byl dlouholetým spolupracovníkem Linuse Paulinga (19011994) na Caltechu, kde byly na konci 40.
let a začátku 50. let 20. stol.
Formulovány základní principy struktury
proteinů: α-helix a β-skládaný list.
Spolupráce byla založena na Paulingových
představách a nápadech, které pak
Corey ověřoval na základě výsledků
difrakčních experimentů.
Narodil se ve Springfieldu, MA, jeho
rodiče pocházeli z rodu anglických
přistěhovalců, kteří se dostali do
Ameriky v polovině 17. století. Oba byli
vzdělanými
absolventy
Cornellovy
univerzity, otec byl strojním inženýrem.
Zdroj: NAS Biographical
Memoirs
Corey absolvoval univerzitu v Pittsburghu, v r. 1919 se stal bakalářem v oboru
chemie. Od mládí byl chatrného zdraví, neboť prodělal dětskou obrnu, měl
částečně ochrnutou ruku a kulhal. To zřejmě přispělo k jeho povaze, byl velmi
vážný a příliš nevyhledával společnost.
Magisterské studium absolvoval na Cornellově univerzitě v Ithace, NY, kde
studoval anorganickou chemii, spektroskopii a fyzikální chemii. Zde se
spolužákem sestrojili skleněnou vakuovou aparaturu a charakterizovali různé
hydridy germania, které v ní vytvořili.
V r. 1924 získal titul Ph.D. a pokračoval na Cornellu jako instruktor analytické
chemie. Seznámil se s rentgenovým spektrometrem, který byl předtím
používán Ralphem W. G. Wyckoffem (1897-1994), v té době už pracujícím
na Rockefellerově ústavu pro medicínský výzkum (nyní Rockefellerová
univerzita, NYC). V r. 1928 tam Corey odešel jako asistent v oboru biofyzika,
v r. 1930 se tam stal výzkumným pracovníkem, oženil se.
S Wyckoffem se zabýval použitím RTG difrakce pro studium jednoduchých
organických molekul s C-C a C-N vazbami (např. thiomočovina), aby se nakonec
dostali k analýze krystalických a vláknitých proteinů. Laboratoř ale byla v r.
1937 zrušena, Wyckoff odešel na NIH (Washington). Coreymu bylo nabídnuto
roční stipendium pro pokračování jinde, provozní peníze a přesun přístrojů.
Corey napsal Paulingovi, který v té době začinal se strukturní chemií
aplikovanou na biologické systémy. Pauling ho přijal na Caltech, ale s
podmínkou, že nemůže být jeho pobyt delší než roční. Mezi přístroji, které si
s sebou Corey vzal do Pasadeny byl mj. Weissenbergův fotoaparát pro
krystalografii.
V Pasadeně zůstal po zbytek profesní dráhy, úspěšně postupoval v kariéře, v
r. 1938 byl pouhým stipendistou, v r. 1946 se ale stal výzkumným
pracovníkem a v r. 1949 profesorem strukturní chemie. Emeritním
profesorem se stal v r. 1968, pak už kvůli zdraví ovšem nebyl příliš aktivní.
Jeho povaha byla naprostým protikladem Paulinga, možná proto bylo tohle
duo tak efektivní. Pro Coreyho byla typická pečlivost, pozornost k detailům.
S Paulingem nikdy nebyli blízcí přátelé.
Před válkou se Corey v Pasadeně věnoval určování krystalových struktur
malých molekul : glycinu, D,L-alaninu a diketopiperazinu (cyklický anhydrid
glycylglycinu). Byly to první krystalové struktury svého druhu. K výpočtům
přitom tehdy mohl využít pouze logaritmické pravítko (300 intenzit pro
alanin). V té době již byla k dispozici Pattersonova funkce pro řešení
struktur, kterou Arthur Lindo Patterson (1902-1906) zavedl r. 1934.
Struktura diketopiperazinu jako první prokazovala, že peptidová vazba je
planární.
V době války se Pauling zabýval projektem studia stability a výbušnosti
střelného prachu a Corey musel řešit četné administrativní záležitosti s
Ministerstvem války. K vědecké práci se tak vrátil až po válce.
Pauling k řešení biologických problémů chemickými postupy zahrnujícími
termodynamiku, kvantovou mechaniku, elektronovou difrakci v plynné fázi a
krystalografii povolal řadu studentů a postdoků.
Do r. 1955 byly publikovány krystalové struktury šesti aminokyselin a tří
dipeptidů. S teoretickou možností výskytu helikální proteinové struktury
přišel Pauling na konci 40. let. Kombinovala se tak data z teoretických modelů
a experimentální difrakčních dat. Struktura dnes známého α-helixu byla
kompatibilní s daty ze syntetických polypeptidů poly-γ-methyl-L-glutamátu a
poly-γ-fenyl-L-glutamátu. Následovaly publikace v časopisu PNAS popisující
α-helix, další helix – méně kompaktní, paralelní a antiparalelní β-skládaný list
včetně atomových souřadnic (1950-51). Tím byl zahájen věk molekulární
biologie akcelerovaný krátce nato Watson-Crickovou DNA dvoušroubovicí.
Rozsáhle se využívalo modelů struktur. Název CPK modely je odvozen ze
jmen Corey, Pauling, Koltun.
V období 1950-55 studovali Pauling a
Corey struktury řady vláknitých
proteinů z vlasů, hedvábí, vlny, peří a
další včetně kolagenu.
K tomu chybně vyhodnotili strukturní
data pro strukturu deoxyribonukleové
kyseliny,
kde
uvažovali
trojitou
šroubovici. Při hustotě 1.62 nebyli
schopni konstruovat model, kde by
páry bazí byly uvnitř.
Navrhli tak fosfáty uvnitř a spojení řetězců prostřednictvím –OH…..H
vazeb. Pauling se začal věnovat antinukleárním aktivitám a veřejnému
přednášení, proto se Corey stal de facto vedoucím laboratoře struktur.
Na konci 50. let se Corey zaměřil na struktury krystalických proteinů,
zejména lysozymu a dále nukleotidů a nukleosidů. Při tom Karst Hoogesteen
objevil obrácené párování (Hoogsteenovo párování). Projekt struktury
lysozymu s využitím komplexů s těžkými kovy Ta a Nb byl zklamáním,
protože bylo sebráno velké množství dat, získána mapa elektronové hustoty,
ale mezitím byla struktura publikována jinou laboratoří (D. C. Phillips, PNAS
57, 484-95, 1967).
Linus Carl Pauling
(*28. 2. 1901- †19. 8. 1994)
Pauling je považován za největšího
chemika 20. století. Měl široký záběr
působení:
kvantová
mechanika,
krystalografie, mineralogie, strukturní
chemie, imunologie, medicína, evoluce.
Nejvíce je znám pro proniknutí do
podstaty chemické vazby, objev
sekundárních struktur proteinů (helix,
skládaný
list),
objev
podstaty
srpkovité anémie. Byl jedním ze
zakladatelů molekulární biologie. V
roce 1954 získal Nobelovu cenu za
chemii. V r. 1962 získal Nobelovu cenu
míru, byl tak oceněn jeho odmítavý
postoj k testování jaderných zbraní.
Byl velkým propagátorem vitamínu C
jako potravinového doplňku pro
zlepšení
zdraví
a
prevenci
onemocnění.
Narodil se v Portlandu v Oregonu, po otci měl německé a po matce irské
kořeny. Otec byl nějaký čas obchodním cestujícím, později si otevřel vlastní
drogerii. Brzy se naučil číst, v devíti letech měl za sebou četbu Bible či
Darwinovy evoluční teorie. Četl též Encyklopedii Britannicu.
Ve škole byl schopný, získal zájem o chemii a od r. 1917 studoval na
Oregonské zemědělské univerzitě chemické inženýrství. Již v 18ti letech se
stal instruktorem na chemické katedře, četl odborné knihy a časopisy a
začal se zajímat problematikou chemické vazby. V roce 1922 získal
bakalářský titul a přednášel úvodní kurz chemie pro studentky domácnostní
ekonomie, kde se seznámil s budoucí manželkou (Ava Helen Miller).
V témže roce se dostal na Kalifornský technologický ústav (Caltech) v
Pasadeně, kde zůstal více než 40 let. Důvodem bylo tříleté studium k získání
doktorátu a nabídka stipendia od fyzikálního chemika Arthura Amose
Noyese (1866-1936), jednoho ze zakladatelů, spojená s částečným úvazkem
instruktora. Jeho disertace se zabývala rentgenovou difrakční analýzou.
Spolu s R. G. Dickinsonem zjistil např. krystalovou strukturu molybdenitu MoS2. Doktorát získal s 12ti publikacemi mj. s Peterem Debyem (18841966) na téma zředěných roztoků iontů. Od r. 1926 působil díky stipendiu na
Ústavu teoretické fyziky v Mnichově u Arnolda Sommerfelda (1868-1951).
V r. 1927 se vrátil na Caltech jako odborný asistent pro teoretickou
chemii, aplikoval poznatky vlnové mechaniky na atomy s více elektrony. V r.
1929 se stal docentem a v r. 1931 řádným profesorem. Experimentální data
se spolupracovníky získaval rentgenovou krystalografií, elektronovou
difrakcí v plynné fázi, IR, UV a Ramanovou spektroskopií – pro stovky
molekul byly získány meziatomové vzdálenosti a vazebné úhly. Na těchto
podkladech povstaly výsledky jako Paulingovy iontové poloměry (velikosti
iontů v krystal. mřížce) či Paulingova pravidla (5), která definují principy
vzájemné interakce mezi kationty a anionty v reálných strukturách.
V r. 1927 byla vyřešena Schrödingerova rovnice pro molekulový ion H2+ (Ø.
Burrau), Pauling přišel v r. 1928 s koncepcí LCAO („linear combination of
atomic orbitals“) – vlnová funkce H2+ jako lineární kombinace atomových
funkcí dvou atomů v základním stavu, energie interakce má pak minimum.
Tato koncepce byla základem i pro pozdější teorii molekulových orbitalů
(MO; F. Hund, E. Hückel, R. S. Mulliken), i když ve své době Pauling
dával přednost modelu valenční vazby (VB) – elektronové páry kovalentní
vazeb jsou v lokalizovaných orbitalech, každý elektron z páru má opačný
spin. Přišel rovněž s koncepcí hybridizovaných sp orbitalů pro vysvětlení
čtyřvaznosti uhlíku. Dále přišel s koncepty rezonančních struktur a
elektronegativity. Vše shrnul v knize „The Nature of the Chemical
Bond“, vyšla poprvé r. 1939.
Na konci 40. let se Paulingův záměr přesouvá od chemických vazeb ke
struktuře a funkci biologických molekul. Zde již dříve předpokládal velký
význam vodíkových vazeb, svými myšlenkami předběhl prokázání DNA jako
nositelky genetické informace a roli enzymů při snižování aktivační energie
reakcí a zvyšování jejich rychlosti.
Už v době hospodářské krize získal grant od Rockefellerovy nadace, věnoval
se studiu hemoglobinu, měřením magnetické susceptibility prokázal
kovalentní vazbu kyslíku na železo v hemu – žádné nepárové elektrony
(Pauling a Coryell, 1936).
S Alfredem E. Mirskym (1900-1974) popsal denaturaci proteinů jako
proces, který za jemných podmínek může být vratný, jinak je nevratný.
Spolu s Maxem Delbrückem (1906-1981) zmínili pojem komplementarita
(„complementariness“) jako podstatu biologických interakcí, což rozpracoval
na příkladu interakce protilátky s antigenem. Pokud jde o protilátky, chybně
se domníval, že mají stejné polypeptidové řetězce jako jiné globuliny a liší se
pouze v jeho konfiguraci. Neuměl tehdy vysvětlit, jaký mechanismus by na
základě struktury antigenu vedl ke změnám v pořadí aminokyselin.
V r. 1941 se dietou vyléčil z Blightovy choroby (onemocnění ledvin), po
vstupu USA do války se věnoval válečnému výzkumu, např. umělých
protilátek či měření obsahu kyslíku v ponorkách.
V r. 1947 byl hostujícím profesorem v Anglii a přednášel v Oxfordu. Na
základě krystalografické práce Roberta B. Coreyho (1897-1971) s
aminokyselinami a malými peptidy dospěl k modelu sekundární struktury αhelixu proteinů (18 zbytků AK na 5 otoček helixu). V té době se objevila
práce Bragga, Kendrewa a Perutze (1950) o více možných helikálních
strukturách α-keratinu. Pauling spolu s Coreym a Bransonem publikovali
práce o sekundárních strukturách proteinů v l. 1950 a 1951.
V r. 1952 byl proveden experiment A. D. Hersheye a M. Chaseové, který
ukázal, že DNA je nositelkou dědičné informace (fágová infekce vedla k
inkorporaci fágové DNA, fágový protein se nedostal do bakteriální buňky).
V r. 1953 publikoval Pauling s Coreym práci o struktuře DNA, kdy
uvažovali sbalení protonovaných fosfátů (HPO4-) podél osy obalených
pentosovými zbytky a s bázemi trčícími směrem ven. Ještě před publikací
byla kopie textu zaslána do Cambridge tandemu Watson-Crick, kteří byli i
takto stimulovaní k dokončení své struktury s párováním bazí.
Paulingova myšlenka byla chybná, překvapivě v ní opustil svůj princip
komplementarity. Důvodem byla nereprezentativní krystalografická data
získaná z degradované DNA a při výpočtech zanedbal velký obsah vody v
DNA vzorcích. Neměl prostě k dispozici data od Rosalind Franklinové
(1920-1958) a publikování uspěchal.
Jako zakladatel molekulární biologie se Pauling uvádí pro pochopení příčiny
srpkovité anémie na molekulové úrovni. Intuitivně předpokládal chybu v
sekvenci hemoglobinu vedoucí k agregaci molekul. Potvrzení bylo umožněno
příchodem elektroforézy (Pauling et al., 1949). Mnohem později pak bylo
sekvenční analýzou ukázáno, že jde o důsledek záměny Glu za Val v β-řetězci
na pozici 6.
Dalším významným výsledkem v souvislosti s hemoglobinem bylo zjištění, že
odlišnosti v sekvencích řetězců hemoglobinu u člověka, koně, gorily aj. mohou
být využity jako „biologické hodiny“ pro sledování evoluce (Zuckerkandl a
Pauling, 1962). Tak bylo odvozeno, že rozdíl mezi člověkem a gorilou se odvíjí
od společného předka před 10 mil. lety, rozdíl mezi a- a ß-řetězcem je starý
až 600 mil. let (dáno frekvencemi mutací).
Pauling byl v 50. letech 20. stol. veřejně známou osobou. Pro svůj odpor k
vývoji jaderných zbraní byl odstaven od vládních výzkumných peněz a bylo mu
bráněno cestovat mimo USA (McCarthyho éra, válka v Koreji). V r. 1958
organizoval petici pro zákaz jaderných testů předanou generálnímu
tajemníkovi OSN Hammarskjöldovi, další petice se objevila v r. 1961. Po
zákazu testů ve vzduchu, vesmírném a podmořském prostoru v r. 1963 získal
Pauling Nobelovu cenu míru za rok 1962.
V 60. letech měnil působiště: Kalifornská univerzita v San Diegu (1967-69),
Stanfordova univerzita (1969-1972).
Vzhledem k častému nachlazení na doporučení lékaře (Dr. Irwin Stone) začal
užívat denně tři gramy kyseliny askorbové. Stal se pak popularizátorem
tohoto postupu, což se nesetkalo s pochopením lékařské komunity.
Spolupráce se skotským lékařem Ewanem Cameronem vedla k publikaci o
použití vitamínu C jako terapeutika v konečné fázi rakoviny. S Arthurem B.
Robinsonem založil Ústav pro ortomolekulární medicínu (1973), později byl
přejmenován na Ústav přírodních věd a medicíny Linuse Paulinga. Ústav měl
finanční těžkosti, partneři se rozešli se soudní dohrou.
Nynější pohled na pozitivní terapeutický efekt vitamínu C zdůrazňuje jeho
funkci antioxidantu.
Kromě Nobelových cen získal Pauling řadu ocenění a čestných doktorátů: na
Oregonské státní univerzitě, Brooklynském polytechnickém ústavu, Reedově
univerzitě v Portlandu a univerzitách v Chicagu, Princetonu, Yaleově univ.,
Cambridgi, Londýně, Oxfordu, Paříži, Toulouse, Montepellieru, Lyonu,
Lutychu, Berlíně (Humboldtova u.), Melbourne, Yorku (Toronto), Novém
Brunšviku a Varšavě.
Dean Burk
(*21. 3. 1904- †6. 10. 1988)
Dean Burk byl americký biochemik a
vědec v oblasti medicíny, spoluobjevitel
biotinu. Pracoval mj. u Otto Heinricha
Warburga (1883-1970) v berlínském
Ústavu císaře Viléma a také v Národním
ústavu pro výzkum rakoviny. V r. 1934
spolu s Hansem Lineweaverem (19072009) přispěl k enzymologii publikováním
Lineweaver-Burkova grafu pro určení
parametrů enzymové reakce.
Narodil se v Kalifornii (Oakland), jeho
otec
Frederic
byl
zakladatelem
učitelského ústavu, ze které se později
stala Státní univerzita v St. Francisku.
Od 15ti let studoval na Kalifornské
univerzitě v Davisu, po roce pak
přestoupil do Berkeley, kde získal titul
bakaláře (entomologie, 1923) a Ph.D.
(výživa rostlin a chemie, 1927).
Zdroj: Wiki
V l. 1927-1929 byl na stážích na Londýnské univerzitě, Ústavu císaře Viléma a
Harvardově univerzitě. Od r. 1929 pracoval v Laboratoři výzkumu vázaného
dusíku při Ministerstvu zemědělství (USDA). Ve 30. letech byl na stážích v
Rusku (na Akademii u A. N. Bacha and V. I. Engelhardta). V r. 1939 přišel
jako starší výzlumník na Národní ústav pro výzkum rakoviny. Zde pracoval
více jak třicet let; když odcházel do důchodu (1974), byl vedoucím
cytochemické laboratoře. V l. 1939-1941 učil biochemii na Lékařské fakultě
Cornellovy univerzity. Od r. 1947 působil na Univerzitě George Washingtona.
Práce o enzymové kinetice s Hansem Lineweaverem (1934) je nejcitovanějším
příspěvkem v časopise Journal of the American Chemical Society. Mimo to
publikovali spolu články o fixaci dusíku u Azotobacter. Burk byl
spoluobjevitelem biotinu (vitamínu H či B7), stejně jako biochemik Vincent du
Vigneaud (1901-1978), který v r. 1955 získal Nobelovu cenu za chemii (za
izolaci, strukturní identifikaci a totální syntézu cyklického peptidu oxytocinu).
Jako objevitel se uvádí Paul Gyorgy (1893-1976), americký nutricionista
maďarského původu.
Burk napsal několik článků s Otto Heinrichem Warburgem. V r. 1952 získal za
studium fotosyntézy Hildebrandovu cenu. V r. 1965 byl oceněn Cenou
Gerharda Domagka za vývoj postupů pro odlišení normální a rakovinové buňky.
Na konci kariéry publikoval o alternativní léčbě rakoviny (laetril). Byl velkým
odpůrcem fluoridace vody.
Aparatury pro studium fixace dusíku u baktérií;
vlevo Burk, vpravo Lineweaver; zdroj: www.chemheritage.org
Hans Lineweaver
(*25. 12. 1907- †10. 6. 2009)
H. L. byl americký fyzikální chemik, který
je znám pro svůj příspěvek k grafu
Lineweavera a Burka pro určení parametrů
enzymové reakce (1934).
Narodil se v Západní Virginii jako syn
reverenda. Navštěvoval presbyteriánskou
Kolej Davise & Elkinse ve WV odkud přešel
na Univerzitu George Washingtona. V r.
1930 zde získal bakaláře a v r. 1933
magistra (chemie). Ph.D. v oboru fyzikální
chemie dostal na Univerzitě Johnse
Hopkinse (Baltimore) v r. 1936.
Ještě jako student začal v r. 1929
pracovat jako pomocná vědecká síla v
laboratoři při americkém Ministerstvu
zemědělství (USDA).
San Francisco Chronicle
V r. 1930 se stal pomocným chemikem („associate chemist“). Jeho šéfem byl
Dean Burk (1904-1988). Práci o dvojnsobně reciprokém grafu spolu s
Burkem vyhotovil ještě jako doktorand. V časopise JACS byla posuzována
šesti recenzenty, kteří doporučili odmítnutí, editor Arthur B. Lamb však
rozhodl opačně!
V r. 1939 přešel Lineweaver do nově zřízené Výzkumné laboratoře Západní
oblasti (WRRL) USDA v Albany (CA) jako starší biochemik a vedoucí
enzymové sekce biochemického oddělení. Během války spoluopracoval s
armádou na problematice věnované drůbeži a sušeným vejcím. Od r. 1949 byl
vedoucím Laboratoře drůbeže WRRL, na této pozici zůstal až do r. 1973, kdy
odešel na odpočinek.
Během své kariéry publikoval stovku prací věnovaných drůbežářské
technologii, zpracování vajec a biochemii. Byl držitelem 6ti patentů, získal
řau ocenění, byl členem vědeckých společností a národních poradních orgánů.
Z jeho technologických úspěchu lze zmínit proces pasterizace vaječného
bílku a zpracování odpadního peří na krmivo.
Dožil se úctyhodných 101 let, měl syna a dceru a důchod trávil ve Walnnut
Creeku v Kalifornii.
Publikace Lineweavera a Burka z r. 1934 se zabývá tvorbou komplexu enzym –
substrát a úvadí několik možných variant jeho vzniku, včetně možností, kdy se
na enzym současně váže více molekul substrátu nebo se také vážou inhibitory
– kompetivní a nekompetitivní.
Zmiňuje se podobnost závislosti Michaelise-Mentenové a Langmuirovy
adsorpční izotermy q = a.p/(b+p), kde q je množství naadsorbovaného plynu,
p je tlak, a je maximální množství navázaného plynu a b je disociační
konstanta.
Pro případ E+S=ES doporučují autoři vynesení 1/v = KS/Vmax(S) + 1/Vmax oproti
Hanesově vynesení (S)/v = (S)/Vmax + KS/Vmax kvůli lepšímu umístění hodnot při
nižších koncentracích substrátu.
Z vynesení lze pohodlně odečítat hodnotu KS a Vmax. Vysvětluje se rozdíl mezi
kompetitivní a nekompeptitivní inhibicí (sklon závislosti a průsečíky na ose y).
David Ezra Green
(*5. 8. 1910 – 1983)
Green byl americký biochemik, který
významně přispěl k vědomostem o
enzymech
z
oblasti
transportního
řetězce elektronů a oxidační fosforylace.
Narodil se v Brooklynu, NYC. Učil se na
veřejných školách a v r. 1928 se zapsal na
Newyorskou univerzitu. Původně chtěl
být lékařem, ale po dvou letech
přípravného studia přešel k biologii a
absolvoval v r. 1931. Při letní praxi ve
Woods Hole, MA, se inspirativně seznámil
s Leonorem Michaelisem.
Po získání
magisterského titulu v r. 1932 odešel do
Anglie, kde v Cambridge na katedře
biochemie u F. G. Hopkinse potkal
tehdejší osobnosti enzymologie např.
Malcolma Dixona či Robina Hilla.
V Cambridge pokračoval ve studiu k získání titulu Ph.D., jeho školitelem byl
Dixon. Jeho disertační práce měla název “The Application of OxidationReduction Potentials to Biological Systems.” Obhájil ji v r. 1934, ale již rok
předtím publikoval výsledky v časopise Biochemical Journal. Za celých 8
let působení v Cambridge publikoval 32 prací.
Po evakuaci Britů z Dunkirku se vrátil s rodinou do USA a stal se
výzkumníkem na Katedře biochemie Lékařské fakulty Harvardovy
univerzity. Laboratoř však byla špatně vybavena, scházel Warburgův
přístroj pro měření respirace, centrifuga, všechny kofaktory bylo třeba
izolovat z kvasinek či živočišných tkání. Izoloval však kvasinkový
flavoproteinu a fosforylasu škrobu z brambor. V r. 1940 publikoval v
Cambridge knihu o biologických oxidacích.
V r. 1941 se stal odborným asistentem na katedře medicíny Kolumbijské
lékařské a chirurgické fakulty v NYC. Zde pokračoval se svým studentem
z Harvardu Paulem K. Stumpfem. I když byla válka, díky příspěvkům z
různých neveřejných zdrojů mohl tým publikovat 20 článků z oblasti
enzymové oxidace aminokyselin, transaminace a mechanismu oxidace
pyruvátu (multienzymová reakce) a získal vybavení pro studium enzymů
např. spektrofotometr a mixér. Byl aktivním členem diskusního Enzymového
klubu na Kolumbijské univerzitě.
V r. 1948 přešel Green do Madisonu na Wisconsinskou univerzitu, Ústav
výzkumu enzymů. Stumpf zakotvil na Katedře rostlinné výživy Kalifornské
univerzity v Berkeley a stal se rostlinným biochemikem. Od příjezdu do
Madisonu
se
Green
věnoval
oxidaci
mastných
kyselin,
metaloflavoproteinům, syntéze mastných kyselin, mitochondriálnímu
respiračnímu řetězci a oxidační fosforylaci. Díky projektům mohl v
poválečné době podporovat až 10 postdoků. Pro pokračující výzkum oxidace
MK byl zásadní objev, že k stabilnějším enzymovým preparátům vede cesta
přes acetonový prášek nikoli jaterní homogenát. Játra, ledviny a srdce byly
denně dováženy z jatek čerstvé v ledu.
Pro měření celé dráhy oxidace MK vymyslel Green stanovení s tetrazoliovou
solí a spřaženými enzymy. CoASH pro tuto analýzu byl izolován z baktérií
a přečišťován precipitací s glutathionem, posléze získáván z továrny na
kvasinkové extrakty. Díky tomu bylo možné připravovat různé acyl-CoA
jako enzymové substráty a otázka celé dráhy byla vyřešena v průběhu 1
roku. Výsledky byly poprvé prezentovány na setkání Americké biochemické
společnosti v Chicagu v r. 1953 (kontroverze s F. Lynenem).
Butyryl-CoA-dehydrogenasa
byla
prvním
charakterizovaným
flavoproteinem s obsahem mědi. Povrzen tak byl výskyt kovových kofaktorů
jiných než je hemové železo.
Studovány byly vlastnosti flavoproteinů, tvorba volných radikálů a přenos
elektronu. Prokázala se interakce acyl-CoA-dehydrogenasy s ETF. To vedlo
postupně k objevu Fe-S proteinů a jejich charakterizaci EPR spektroskopií.
Na návrh Greena se tým Gibsona a Wakila na Ústavu pro výzkum enzymů
zabýval biosyntézou MK, pracovali s extrakty holubích jater (konec 50. a
začátek 60. let 20. stol.). Sledovali konverzi acetyl-CoA na dlouhořetězcové
MK v přítomnosti esenciálních kofaktorů, přičemž prokázali potřebu ATP a
NADPH v zatím neznámých biosyntetických krocích.
Náhoda pomohla k objevu potřeby HCO3-. Omylem byl použit fosfátový
pufr namísto běžně užívaného bikarbonát-fosfátového pufru, důsledkem byla
ztráta aktivity enzymové směsi. Protože [14C]-HCO3- nebyl inkorporován
přímo do MK, byl hledán intermediát a posléze nalezen malonyl-CoA a
prokázána přítomnost acetyl-CoA-karboxylasy a koenzymu biotinu v určité
frakci extraktu (R1g). Frakce R2g potom obsahovala synthasu MK. Tým z
ústavu také potvrdil, že jako produkt celé dráhy vzniká volná MK, nikoli
derivát CoASH.
Mnohem větší výzvou však byla problematika přenosu elektronu a oxidační
fosforylace. Mitochondrie byly pro tento účel získávány z hovězích a
vepřových srdcí a jater.
Srovnání syntézy a odbourávání mastných kyselin
Klíčovou metodikou byla centrifugace. Zásadní objev spočíval v nalezení
ubichinonu. R. A. Morton v Anglii v 50. letech získal ubichinon z
nezmýdelnitelné frakce tkání jako je trávicí trakt či játra.
Na ústavu u Greena byl nalezen ve vodě nerozpustný avšak lipofilní faktor s
isoprenoidním řetězcem a nazván CoQ. To byl dosud neznámý článek
spojující primární dehydrogenasy (flavoproteiny se železem) s cytochromy.
Postupně byly izolovány komplexy I-IV (Hatefi, Ziegler) pomocí
centrifugace a frakcionací (pH, soli, chaotropy). Z oddělených komplexů
byl pak sestaven funkční dýchací řetězec.
V 60. letech se snaha ubírala k vysvětlení oxidační fosforylace.
Elektronovou mikroskopií byla sledována struktura mitochondrií v
souvislosti s nízkou hladinou vápníku, fosfátu a MK vedoucí k zvýšené
permeabilitě, indukci ATPasy, rozpojení oxidační fosforylace a ztrátě
kontroly respirace. Byly pozorovány konformační změny a předpokládalo
se, že proces uchovávání energie je s nimi spojen.
S pomocí matematiky a teoretické chemie byly hledány modely k vysvětlení
experimentů. Green však nevěřil chemiosmotické teorii a jeho jméno s ní
není spojeno.
Oliver Howe Lowry
(*18. 7. 1910 – †29. 6. 1996)
Lowry byl americký biochemik známý
pro vypracování metody stanovení
koncentrace proteinů.
Jeho otec byl učitelem a později se stal
školským superintendantem. O. Lowry
měl sestru a tři bratry, všichni získali
vysokoškolské vzdělání.
Po střední škole byl rok na brigádě na
obchodní lodi a pracoval na statku v
Nebrasce. Zapsal se na Severozápadní
univerzitu, obor chemické inženýrství.
Pobýval na stáži ve Freiburgu v
Německu a po návratu studoval od r.
1931 na uviverzitě v Chicagu obor
fyziologická chemie. Školitelem jeho
diplomové práce na téma stanovení
ketolátek v krvi byl Frederick Koch.
Foto: Annu. Rev. Biochem.
Současně s Ph.D. získal i titul M.D. Během studií se seznámil s Bairdem
Hastingsem a pracoval s ním v Billingsově nemocnici. Hastings se posléze stal
nástupcem Otto Folina jako vedoucí na Harvardu.
Prvním Lowryho vědeckým tématem na Harvardu bylo měření Cl-, Na+, K+, Ca2+
a Mg2+, v množstvích tkáně v řádu mg, objektem analýzy byl např. srdeční
sval v souvislosti s ischémií. Vypracoval tehdy metodiku pro analýzu kolagenu
a elastinu. Ještě na Harvardu získal prostředky na studijní pobyt v
Carlsberské laboratři v Kodani, kde pracoval s K. Linderstrømem-Langem.
Zde se blíže seznámil s metodami analýzy v mikroměřítku, kterým se pak
věnoval po celý život.
Následovala etapa na Výzkumném ústavu veřejného zdraví v NYC, oddělení
fyziologie a výživy, vzhledem ke vstupu USA do války byl zahájen důležitý
nutriční výzkum s O. Besseym. V malém objemu krve (0.1 ml) se určoval
obsah vitamínů, proteinů a alkalické fosfatasy, jejíž hladina je v souvislosti s
nedostatkem vitamínu D. Dobrovolníci byli krmeni gramovými dávkami vit. C,
zjistilo se, že skladovací kapacita těla jsou 4g, nadbytek je vylučován močí.
V r. 1946 publikoval metodu stanovení alkalické fosfatasy s pnitrofenylfosfátem, r. 1951 pak nejcitovanější práci všech dob – stanovení
proteinů s Folinovým činidlem, i když princip vlastně nebyl originální.
Princip stanovení proteinů s Folinovým činidlem dle Lowryho:
www.labome.com
Byla vypracována metodika stanovení fosfátu za mírných podmínek,
následovala konstrukce mikrocely pro spektrofotometr (30 µl) a vylepšení
spektrofluorimetru přídavkem fotonásobiče.
Od r. 1947 byl vedoucím katedry farmakologie na Washingtonské univerzitě
v St. Louis. Zde se zabýval kvantitativní histochemií mozkové tkáně. Pro
stanovení různých látek a enzymových aktivit se používaly lyofilizované řezy
potkaních mozků skladované při -70 °C ve vakuu.
Z těchto řezů byly dále vysekávány malé kousky a ty váženy na přesných
vahách vlastní konstrukce s rameny z křemenných vláken. Maloobjemové
kapalné vzorky (do 5 µl) byly ve formě kapiček v olejové fázi ve speciálních
destičkách.
Pro stanovení aktivity dehydrogenas či byl-li princip tvorby NADH/NADPH
využíván ve spřažené reakci posloužila fluorescence. Oxidované formy NAD+
a NADP+ nefluoreskují, ale v alkalickém prostředí je možné tyto přeměnit na
fluoreskující deriváty. Ve směsi s redukovanými koenzymy je před
převedením nutné NADH i NADPH rozložit kyselinou.
Pro stanovení velmi nízkých množství těchto koenzymů byly zavedeny
enzymové amplifikační systémy (formálně „analogie“ PCR reakce):
Po uplynutí zvoleného času se zlikviduje koenzym použitý v nadbytku pro
proběhnutí reakce. Následuje amplifikační reakce s vytvořenou formou
koenzymu, výše je to redukovaná forma.
Po proběhnutí zvoleného času (amplifikace třeba v řádu 103 nebo 105) se
reakce zastaví zahřátím a měří se produkt, např. 6-fosfoglukonát, a to v
reakci, kdy opět vzniká redukovaná forma koenzymu jako v počátečním
systému (nahoře).
Lowry takto sledoval glykolytické enzymy, porovnával aktivity u kontrol
a ischemických potkanů se zvýšenou glykolýzou (6x).
Myší hlavičky byly zmrazovány v časové škále, byl prokázán pokles hladiny
Fru-6-Pi a narůst Fru-1,6-bisPi včetně 3C metabolitů. Ukázalo se, že enzym
PFK tvořící Fru-1,6-bisPi je regulačním místem glykolýzy. Pro měření PFK
byl nejlepší fosfátový pufr, snižoval inhibici enzymu působením ATP
(allosterický inhibitor).
Při ischémii roste hladina enzymu PFK, kromě Fru-1,6-bisPi roste i hladina
ADP, AMP, Pi a NH4+, citrát byl potvrzen jako další inhibitor PFK. V
neuronech byl určován obsah ATP , fosfokreatinu a glukosy, detekční limit
byl na úrovni 10-15 mol/l. Lowryho tým rovněž izoloval svalová vlákna a měřil
v nich enzymové aktivity. Vlákna byla dlouhá 10-50 µm, což odpovídalo váze
vzorků 10 až 20 ng.
Metabolity glykolýzy a TCA byly v mikroměřítku analyzovány např. ve
myších i lidských vaječnících. Jako marker (index) intenzity glykolýzy
posloužila 14C-2-deoxyglukosa, která je hexokinasou fosforylována spolu s
glukosou, ovšem není dále přeměňována, což vede k jejímu hromadění (70.
léta 20. stol.). Omezením metody původně byla nemožnost rozlišení 14C-DG
od 14C-DG6P na autoradiofotografii, proto bylo třeba čekat 30-45 min na
distribuci a spotřebování DG v mozku. Odděleným měřením DG a DG6P s
NADP+ byl tento nedostatek překonán (80. léta 20. stol.).
Melvin Ellis Calvin
(*6. 4. 1911 – †8. 1. 1997)
Americký chemik Calvin získal spolu s
kolegy Andrew Bensonem a Jamesem
Basshamem v r. 1961 Nobelovu cenu za
chemii za výzkum asimilace CO2 v
rostlinách. Svou profesionální kariéru v
délce téměř padesáti let strávil na
Kalifornské univerzitě v Berkeley.
Narodil se v Minnesotě rodičům, kteří
byli židovskými imigranty z území
carského Ruska. Rodina se přestěhovala
do Detroitu, kde měl otec obchod s
potravinami.
Zdroj: Wiki
Po střední škole studoval chemii, v r. 1931 získal titul bakaláře na
Michiganské hornické a technické univerzitě (nyní MTU). V r.
1935 dostal Ph.D. titul v oboru Chemie na Minnesotské univerzitě.
Na postdoktoranském pobytu v Manchesteru se začal zajímat o
ftalokyaniny, chlorofyl, fotosyntézu a umělé fotosyntetizující
membránové modely.
V r. 1937 se stal instruktorem na UCA v Berkeley. Pracoval u G. N.
Lewise na Katedře chemie, zabýval se fotochemií barevných
porfyrinů. V r. 1945 byl přesvědčen děkanem Wendellem Latimerem
(Fakulta chemie a chemického inženýrství) a Enestem O. Lawrencem
(1901-1958; ředitel Laboratoře radioisotopů, vynález cyklotronu),
aby použil v biochemickém výzkumu fotosyntézy radioizotopy.
Práci s radioizotopy se tam již předtím zabývali Sam Ruben (19131943) a Martin Kamen (1913-2002). V l. 1938-1942 spolu s E.O.
Lawrencem studovali metabolické procesy fixace CO2 ve fotosyntéze
s pomocí inkorporace izotopu 11C, byli ale neúspěšní kvůli absorpci
produktů na proteiny. Ruben pomocí kyslíku 18O získaného z vody
H218O prokázal, že kyslík uvolněný při fotosyntéze pochází z vody. V
únoru r. 1940 spoluobjevili izotop 14C.
Calvin vytvořil skupinu výborných chemiků s biologickými zájmy. S
izotopem 14C ve formě uhličitanu barnatého, který v r. 1942 získal od
Rubena, začal pracovat mladý Andrew Benson (*1917). Ruben
zemřel na otravu fosgenem při nehodě během válečného výzkumu v r.
1943. Pro separaci produktů se používala extrakce s nemísitelnými
rozpouštědly a papírová chromatografie.
Původní představa (James Franck, Farrington Daniels): CO2 je
absorbován chlorofylem v proteinovém komplexu, vodík z vody se
přenáší k jeho redukci , přičemž vzniká formaldehyd. Při polymeraci
formaldehydu za vzniku cukrů se uvolňuje kyslík. K tomu je třeba
světlo.
Benson izoloval produkty fixace 14CO2 ve tmě, s Edwinem McMillanem
(1907-1991) krystalovali radioaktivní produkt, kyselinu jantarovou.
Experimenty byly prováděny na řasách osvěcovaných v nepřítomnosti
CO2 a pak přenášených do tmavých nádob s 14CO2. Pozorována tvorba
radioaktivní sacharosy, ukázalo se, že musí být k dispozici
redukovadlo a fosforylační činidlo.
Snahou bylo získat produkt z co nejkratší expozice 14CO2, což bylo
problematické vzhledem k malé specifické radioaktivitě izotopu. Po
krátkých expozicích bylo využito chromatografie, nejdříve papírové,
později ionexové, kterou zavedl Calvin. Ukázalo se, že produkt fixace
se drží pevněji než fosfáty sacharidů a potvrzena byla kyselina 3fosfoglycerová (PGA), radioaktivita byla nalezena v –COOH skupině.
Tehdy to byl již známý metabolit odbourání glukosy.
Ostatní cukry z dráhy byly identifikovány podle jejich chemických
vlastností. 14C byl nalezen v obou hexosách v sacharose. K potvrzení
sekvence reakcí bylo využito prvotního značení fruktosy.
Identifikace akceptoru CO2 byla složitější. Na papírovém
chromatogramu byly Bensonem nalezeny ketosy. Experimenty se
prováděly ve spolupráci s Jamesem A. Basshamem (1922-2012).
V jedné ketose bylo nalezeno 14% radioaktivity v karbonylu, z
čehož usoudili, že jde o sedmiuhlíkatý cukr. V menším cukru se
potvrdil pentosadifosfát (radioaktivita 32P a 14C ukázala na poměr
dva atomy fosforu – pět atomů uhlíku). Až na počátku 50. let byl
akceptor ztotožněn s ribulosabisfosfátem. Celá dráha byla
objevena do r. 1958.
Calvin se podílel na činnosti vědeckých společností v USA, byl
prezidentem ACS a ASPP, i na mezinárodní úrovni. Spolupracoval s
NASA: opatření k zamezení biologické kontaminace Měsíce
lunárními sondami ze Země, ochrana před zavlečením patogenů z
Měsíce, plány na hledání života ve vzorcích z Měsíce a planet. Byl
poradcem prezidentů Nixona a Forda,
Konrad Emil Bloch
(*21. 1. 1912 - †15. 10. 2000)
K. E. Bloch byl americký biochemik.
Spolu s Feodorem Lynenem získal v r.
1964 Nobelovu cenu za fyziologii a
medicínu v r. 1964, oceněny byly jeho
objevy v souvislosti s metabolismem
cholesterolu, MK a příslušné regulace.
Narodil se v Nise v pruském Slezsku
(nyní na území Polska) ve středostavovské rodině, jeho otec řídil
rodinnou továrnu. Střední školu ukončil
v r. 1930 (pamětní deska v Nise).
Studoval na Technické univerzitě v
Mnichově, kde ho zaujala chemie díky
přednašejícímu organické chemie Hansi
Fischerovi (1881-1945).
Foto: Wikipedia
Na přednáškách Mnichovské chemické společnosti ho zaujalo např.
vystoupení Heinricha Wielanda (1877-1957) objevitele barviv motýlích
křídel – pteridinů.
Pamětní deska Konradu Blochovi ve slezské Nise (bývalá Brüderstraße)
V r. 1934 musel pro svůj židovský původ studium v Mnichově ukončit, H.
Fischer mu však zajistil asistentské místo v Davosu ve Švýcarsku
(Švýcarský ústav horského výzkumu). Pracoval na analýze lipidů u
mykobaktérií, vyvrátil přítomnost cholesterolu. Při analýze fosfolipidů
korespondenčně spolupracoval s R. J. Andersonem z Yaleovy univerzity.
Připravil např. čistou fosfatidovou kyselinu. Jeho práce byly podkladem
disertace, která byla bohužel v Basileji zamítnuta.
V r. 1936 získal díky Andersonovi nabídku místo asistenta biologické chemie
na Lékařské fakultě Yaleovy univerzity, avšak bez stipendia. Se dvěma
doporučujícími dopisy se dostal na Kolumbijskou univerzitu, kde pracoval u
Hanse Clarka a získal Ph.D. (1938). Ve spolupráci s Rudolfem
Schoenheimmerem se dostal k biochemickým pokusům se značenými
izotopy, kdy s pomocí 15N demonstroval přeměnu svalového kreatinu na
kreatinin v moči. Zabýval se i biosyntézou kreatinu, konkrétně methylačním
krokem při přeměně guanidinoctové kyseliny.
Tehdy neúspěšně studoval původ hydroxylové skupiny v cholesterolu
(pocházející z oxygenasové reakce) a po Schoenheimmerově smrti v r. 1941
se začal zabývat biosyntézou cholesterolu a mastných kyselin např. s
využitím značeného acetátu.
Číslování cholesterolu a steroidů:
21 H3C
20
18 CH3
19 CH3
2
3
HO
1
A
4
10
5
11
9
B
6
12
C
13
14
8
7
17
D 16
15
22
23
24
25
27 CH3
CH3
26
Pomocí značeného cholesterolu připraveného pomocí katalyzované izotopové
výměny prokázal v r. 1945 jeho roli jako prekurzoru při tvorbě. steroidního
hormonu progesteronu. Dobrovolníkem pro klíčový experiment byla jeho žena.
Biosyntézu cholesterolu pak s kolegy potvrdil v novém působišti v Chicagu
pomocí mutantu baktérie Neurospora crassa zavislém na dodání vnějšího
acetátu.
Vedoucím katedry biochemie v Chicagu byl jeho spolužák Earl Evans (19101999). Na počátku 50. let 20. století byl velký zájem rozluštit
proteosyntézu. Bloch se svými studenty sledoval tvorbu peptidových vazeb v
glutathionu nebo biosyntézu aromatických aminokyselin.
Velkým zájmem laboratoře bylo popsat původ všech 27 uhlíkových atomů
cholesterolu, výzkum byl sdílený s laboratoří Cornfortha a Popjaka. Např.
inspirováni pracemi britského nutricionisty H. J. Channona, který prokázal
zvýšený cholesterol u potkanů krmených potravou s obsahem skvalenu ze
žraločích jater. V r. 1952 Bloch uvažoval, že skvalen cyklizuje na na 30tiuhlíkatý lanosterol. Strukturu lanosterolu mezitím popsal tým L. Ruzicky z
Curychu. Po identifikaci kyseliny mevalonové v r. 1956 byl na konci 50 let. 20.
stol. Blochovým týmem a dalšími laboratořemi (mj. F. Lynen) potvrzen
isopentenyldifosfát jako výchozí „biologická isoprenová jednotka“.
Značení uhlíkových atomů cholesterolu
v návaznosti na značení acetylu:
H3C
C
HO
C
C
C
CH3
C
C
C
C
C
C
C
C
C
CH3
C
C
C
C
C
C
CH3
C
CH3
C
C
C
H3C
C
V r. 1954 přešel na Harvard, kde byl až do r. 1982 profesorem biochemie. V
té době se začalo pro studium metabolických drah hojně používat
mikroorganismů. Takto byla prokázána důležitost molekulového kyslíku pro
tvorbu OH- skupiny v poloze 3 u cholesterolu (1956) a to s použitím 18O.
Následovalo studium biosyntézy nenasycených mastných kyselin, pokusným
materiálem byly kvasinkové mikrosomy. Prokázali, že přeměna stearové k. na
olejovou vyžaduje kyslík. U anaerobů byl předpoklad jiného mechanismu,
později se potvrdilo, že jde o dehydrataci hydroxykyselin. Enzym βhydroxydekanoylthioesterdehydrasa z E. coli zároveň fungoval jako
isomerasa (přesun polohy dvojné vazby). Spolu s další laboratoří (Roy
Vagelos) přispěli k objevu ACP proteinu důležitého pro biosyntézu MK.
Kyselina 3-decenová připravená katalyticky z 3-decynové k. přispěla k objevu
fenoménu reakčně závislé inhibice dehydrasy (konec 60. let 20. stol.).
Enzym dehydrasa byl inhibována allenovým isomerem nečistoty v testovaném
substrátu - nezreagované 3-decynové kyseliny (kovalentní modifikace
histidinu). Izomeraci přitom sám katalyzoval. Kyselina 3-decynová inhibuje
růst baktérií, což lze zvrátit přídavkem olejové kyseliny.
Důležitost kyslíku pro biosyntézu cholesterolu a MK je zřejmě dána evolucí.
Christian Boehmer Anfinsen
(*26. 3. 1916 – †14. 5. 1995)
byl americký biochemik, který získal v r.
1972 Nobelovu cenu za chemii, spolu s
Williamem
Howardem
Steinem
a
Stanfordem Moorem za práci věnovanou
enzymu ribonuklease a vztahu mezi
strukturou a aktivitou.
Narodil se v Monessenu, Pensylvánie, do
rodiny norských přistěhovalců. Jeho otec
byl strojní inženýr. Ve 20. letech se
rodina přestěhovala do Filadelfie, v r.
1939 získal magisterský titul v oboru
organická chemie na Pennsylvánské
univerzitě.
Foto: NIH (1969)
Následně využil stipendia Americko-Skandinávské nadace a pobýval do r.
1940 v Carlsberské laboratoři v Kodani, kde se věnoval analýze chemické
struktury proteinů. V r. 1943 získal Ph.D. na lékařské fakultě (Harvard) v
oboru biochemie, kde pak zůstal dalších 7 let (Kat. biologické chemie).
V l. 1947-48 byl na stáži u Hugo Theorella v Nobelově medicínském ústavu
ve Švédsku. V r. 1950 se stal šéfem Laboratoře buněčné fyziologie a
metabolismu v Národním ústavu srdce (NIH) v Bethesdě, Maryland.
Díky stipendiu Rockefellerovy nadace mohl strávit další rok v Carlsberské
laboratoři (1950) a Guggenheimova nadace mu umožnila pobyt v Rehovotu na
Weizmannově vědeckém ústavu (1958-59). V l. 1962-63 se vrátil na Harvard
jako profesor biologické chemie, následně byl ustanoven vedoucím
Laboratoře chemické biologie na Národním ústavu artritidy a
metabolických onemocnění při NIH (do r. 1981). Konečně pracoval jako
profesor biologické chemie na Univerzitě J. Hopkinse (1982-1995).
Byl editorem v časopisech Advances in Protein Chemistry a Journal of
Biological Chemistry, působil v americké i dánské akademii věd.
Zpočátku se zabýval studiem biosyntézy proteinů s využitím radioaktivního
značení (14C). Předpokládalo se, že proteiny se tvoří buď najednou (AK
nasednou na velký templát) nebo postupně v dílčích krocích. První varianta
předpokládala rovnoměrné zabudování značené stavební AK, druhá
nerovnoměrné. Pro ovalbumin bylo analýzou značení, např. pro Asp, po
proteolýze zjištěna druhá varianta. Později bylo tímto způsobem značení
prokázáno, že proteiny se syntetizují z N-konce.
Od pol. 50. let se Anfinsen soustředil na problematiku vztahu mezi
strukturou a funkcí enzymů. Klíčovým enzymem výzkumu jeho týmu byla
ribonukleasa ze slinivky. Spolu s kolegy (M. Sela, F.H. White) rozpoznali,
že informace, která určuje terciární strukturu proteinu, se skrývá v
primární struktuře, tedy v aminokyselinové sekvenci.
Pro potvrzení předpokladu byly prováděny experimenty s reverzibilní
denaturací proteinů. Prokázáno bylo, že mnohé proteiny se mohou
spontánně poskládat („refolding“) do přirozené formy poté, co se redukčně
rozštěpí jejich disulfidové vazby. Tyto výsledky vedly k všeobecnému
přijetí „termodynamické hypotézy“ (Anfinsenovo dogma).
Objevil mikrosomální enzym, který katalyzuje vzájemnou přeměnu –SH
skupin a disulfidů a tím in vitro urychluje skládání reverzibilně
denaturovaných proteinů s disulfidovými vazbami. Rychlost takové
renaturace byla dostatečná k tomu, aby pomohla skládat protein během
biosyntézy.
V posledních etapě vědeckého života se věnoval enzymologii extracelulární
nukleasy ze Staphylococcus aureus. Jeho tým určil jeho aminokyselinovou
sekvenci a biochemické vlastnosti enzymu včetně 3-D struktury.
Anfinsenův experiment
Arthur Kornberg
(*3. 3. 1918 – †26. 10. 2007)
byl americký biochemik, který v roce
1959 získal Nobelovu cenu za fyziologii a
medicínu, a to za objev biosyntézy
DNA, byla to cena sdílená, druhým
laureátem byl Severo Ochoa.
Narodil se v New Yorku židovským
rodičům, imigrantům z Haliče. Jeho otec
pracoval jako technik šicích strojů,
později měl obchod s železářstvím,
hovořil šesti jazyky. A. Kornberg
studoval na střední škole Abrahama
Lincolna v Brooklynu, kterou ukončil v
15ti letech, o tři roky dříve než se
předpokládalo.
Foto: National Library of Medicine
Nastoupil na prestižní Městskou univerzitu (City College) na Manhattanu. V r.
1937 získal bakalářský titul (chemie), v době Velké krize (the Great
Depression) pak pro nedostatek míst pokračoval ve studiu medicíny na
Rochesterské univerzitě, které ukončil v r. 1941.
Biochemie mu při studiu medicíny připadala nudná a nezajímavá zejména pro
popisný charakter přednášky bez témat jako jsou energetický metabolismus
a úloha makromolekul jako jsou např. enzymy. O budoucím zaměstnání ve
výzkumu neuvažoval.
První publikaci měl v r. 1942, kdy se věnoval popisu zvýšeného výskytu
bilirubinu, kterým trpěl, i u ostatních studentů (Gilbertova choroba –
dědičná, nižší aktivita UDP-glukuronyltransferasy). Po počáteční praxi
nastoupil do armády jako lodní lékař, díky zmíněné publikaci získal místo v
NIH, Laboratoř výživy (Nutrition Laboratory). Laboratoř založil Joseph
Goldberger (1874-1929), později se přesunula na předměstí Washingtonu do
Bethesdy, Maryland. Jeho práce v l. 1942-1945 spočívala v hledání příčiny
krvácení a smrti potkanů krmených potravou obsahující sulfonamidy. Po
objevu kyseliny listové se prokázalo, že likvidace střevních baktérií
sulfonamidy vedla k deficitu vitamínu K. V r. 1943 se oženil, jeho žena Sylvy
Kornberg byla biochemička a spolupracovala s ním později v laboratoři.
Povzbuzen literaturou o enzymech, koenzymech a ATP (Warburg,
Meyerhof, Cori, Kalckar, Lipmann) se začal zabývat enzymologií. V r. 1946
pracoval na Lékařské fakultě Newyorské univerzity u Severo Ochoy, kde
se zabýval purifikací akonitasy ze srdečního svalu, spektrofotometrické
stanovení aktivity využívalo spojení s isocitrátdehydrogenasou.
U Ochoy rovněž studoval jablečný enzym, byl i na stáži u Coriových na
Washingtonské univerzitě, kde se zabýval vznikem pyrofosfátu a tvorbou
ATP. Po návratu ze stáží se stal vedoucím oddělení enzymů a metabolismu na
NIH (1947-1953). Ve své laboratoři poskytnuté ředitelem Sebrellem
pokračoval v práci na enzymu štěpícím pyrofosfátovou vazbu NAD, na
kterém už pracoval s Olovem Lindbergem v St. Louis.
Po obtížích s izolací enzymu z králičích ledvin konečně získal
nukleotidpyrofosfatasu z brambor. Následně prokázal umístění extra
fosfátu v NADP a potvrdil, že nikotinamidribosafosfát je možné přeměnit
reakcí s ATP na NAD za vzniku pyrofosfátu. Analogicky spoluobjevil tvorbu
FAD z riboflavinfosfátu a ATP a posléze došel k závěrům, že přenos
nukleotidylu z nukleosidtrifosfátu je důležitý pro biosyntézu koenzymů,
přičemž je reakce posouvána hydrolýzou pyrofosfátu.
V 50. letech se jeho zájem přesouvá k biosyntéze RNA z nukleotidů.
Zabýval se tvorbou fosfodiesterové vazby ve fosfolipidech. V anaerobní
baktérii Zymobacterium oroticum našel metabolity orotové kyseliny –
dihydroorotovou k. a karbamoylaspartát. Později prokázal tvorbu
fosforibosyldifosfátu (PRPP synthetasa), orotidin-5P a konečně UMP s
použitím jaterního a kvasinkového extraktu, orotátu, ATP a ribosa-5P.
Pochopil existenci de novo a recyklačních drah
Clin. Chem. 2004,
50:11 2117-24.
OBJEV DNA-POLYMERASY
V l. 1953-1959 byl profesorem a vedoucím Katedry mikrobiologie na
Washingtonské univerzitě v St. Louis. V Kornbergově laboratoři se od pol.
50. let 20 stol. používala pro studium enzymů baktérie E. coli. Studie
probíhaly s 14C-značenými bázemi a nukleotidy. V té době S. Ochoa a M.
Grunberg-Manago objevili polynukleotidfosforylasu. V l. 1956-1957 začal se
spolupracovníky zkoumat biosyntézu DNA (inkorporace značeného dT, dTMP
a dTTP), přelomové bylo pochopení skutečnosti, že molekula DNA je nutná
pro DNA-polymerasu jako templát (díky znalosti pokusů Coriových s
glykogenfosforylasou).
Od r. 1959 vykonával Kornberg funkci profesora a výkonného vedoucího
Katedry biochemie na Lékařské fakultě Stanfordovy univerzity v Kalifornii
(Palo Alto). DNA-polymerasa (I) bylo purifikována a ukázalo se, že produkt
její reakce odráží složení bazí v templátu (1961). Byla prokázána opačná
polarita řetězců v dvojitém helixu. Když byla objevena ligasa (1967) bylo
možné s DNA-polymerasou I připravit cirkulární jednořetězcovou fágovou
DNA, která měla biologické vlastnosti – byla infekční. To byl převratný
experiment pro vývoj molekulární biologie a genového inženýrství.
DNA-polymerasa I tvoří řetězec DNA ve směru 5’  3’. Brzy však tým
zjistil, že volný 3’ konec je enzymem odbouráván v nepřítomnosti stavebních
kamenů. Syntézou duplexové DNA s chybným párováním na 3’ konci potvrdila
opravnou aktivitu („proofreading“), pravděpodobnost chyby 1:107,
publikováno 1972. Později prokázali nukleasové působení enzymu i na 5’ k.
V l. 1970-1972 byly pak objeveny DNA-polymerasy II a III (Kornbergův syn
Tom), z nichž DNA-polymerasa III byla hledaným replikačním enzymem.
Nedařilo se prokázat, že DNA-polymerasa I je schopná nastartovat syntézu
nového řetězce sama o sobě, potřebovala k tomu povařený extrakt E. coli. V
r. 1968 Okazaki zjistil, že replikace nezačíná na jednom místě chromozomu,
ale opakovaně na více místech.
Otázky průběhu replikace (zahájení – priming) se vyřešily díky fágové DNA
(vláknitý fág M13). Primerem je krátký úsek RNA, který syntetizuje RNApolymerasa. Inhibicí RNA-polymerasy rifampicinem se replikace kruhové
DNA z M13 zastavila. Problém vyvstal u fága φX174, kde replikace nebyla
inhibována rifampicinem. Vodítko přišlo s nalezením enzymu primasy pro
replikaci DNA fága G4. Od poloviny 70. let pak byly vysvětlovány komponenty
tzv. primosomu při replikaci fága φX174, kde helikasa rozevírá replikační
vidličku a umožňuje navázání DNA-polymerasy III-holoenzymu.
Annu. Rev. Biochem. 1989, 58: 1-13.
Při snaze získat bezbuněčný aparát pro iniciaci replikace chromozómu
baktérie E. coli se využilo dvou triků: 1) přídavek PEG vedl k
„zakoncentrování“ proteinů a DNA, 2) frakcionace síranem amonným pak
umožnila získat požadované proteiny oddělením inhibitorů.
Annu. Rev. Biochem. 1989, 58: 1-13.
Arthur Kornberg se rovněž zabýval bakteriálními sporami, zejména s
ohledem na infekční nemoci (anthrax, botulismus, tetanus). Byl k tomu
stimulován případem úmrtí matky v r. 1939 při operaci žlučníku (plynatá
sněť, Clostridium perfringens).
Edwin Gerhard Krebs
(*6. 6. 1918 – †21. 12. 2009)
E. Krebs byl americký biochemik,
nositel Nobelovy ceny za fyziologii
a medicínu v r. 1992 (spolu s
Edmondem H. Fischerem) pro
objasnění reverzibilní fosforylace
proteinů jako regulačního nástroje
buněčných procesů.
Pocházel z Iowy, byl potomkem
německých imigrantů. Jeho otec
byl presbyteriánským pastorem. V
dětství rád četl knihy o občanské
válce, základní školu a část střední
školy navštěvoval v Greenville,
Illinois. Po smrti otce se rodina
přestěhovala do Urbany, kde je
Illinoiská univerzita.
Zdroj: ASBMB
Oba jeho bratři tam studovali chemii. Od r. 1936 se zapsal na
zmíněné univerzitě, kde zpočátku volil předměty s přípravou na další
studium chemie či medicíny. Již na úrovni bakaláře pracoval
experimentálně v organické laboratoři a byl spoluautorem publikací.
Následně započal díky stipendiu se studiem medicíny na Lékařské
fakultě Washingtonovy univerzity v St. Louis, kde se na seminářích
seznámil s Coriovými, Ardou Greenovou a Sidney Collowickem.
Získal zde znalosti z teoretické i praktické medicíny, ale i z oblasti
medicínského výzkumu. Školu ukončil v r. 1943 a byl pak na stáži v
Barnesově nemocnici v St. Louis. Po válce sloužil v námořnictvu, byl
lékařským důstojníkem na lodi.
Po propuštění z armády v r. 1946 se chtěl stát internistou na
univerzitě, nicméně se rozhodl studovat biochemii a byl postdokem u
Coriových. Prováděl kontrolu čistoty krystalických preparátů
glyceraldehyd-3-fosfáttedehydrogenasy a triosafosfátdehydrogenasy (TPD), porovnával vlastnosti svalové a kvasinkové TPD či
sledoval vliv protaminu na aktivitu svalovou fosforylasu a a b.
Laboratoř
byla
kolorimetrem, pH
elektroforézu.
tehdy
metry,
vybavena
spektrofotometrem
Beckman,
centrifugou a Tisseliovým aparátem pro
V r. 1948 získal místo odborného asistenta na Katedře biochemie nově
zřízené Lékařské fakulty Washingtonské univerzity v Seattlu. Od r. 1950
zde byl prvním vedoucím katedry Hans Neurath (1909-2002).
Prvním projektem byla práce na enzymu TPD a inhibici glykolýzy
katalyzované enzymy kvasinkového extraktu protilátkami proti TPD. V r.
1953 přišel na katedru Edmond H. Fischer (nar. 1920). Spolupracovali
poté na enzymologickém výzkumu glykogenfosforylasy, přičemž se zájem
soustředil na konverzi enzymzu mezi formami a/b.
Na základě náhodně zjistěného rozdílu ve staré a nové metodice přípravy
fosforylasy (centrifugace svalového extraktu na rozdíl od dříve používané
filtrace) vedla k objevu fosforylasakinasy, která s využitím ATP
fosforylovala formu b na formu a. Zjistili též, že kinasa potřebuje ke své
aktivitě Ca(II) ionty (byly z filtračního papíru) a aktivaci Ca(II)dependentní proteasou, kalpainem. Dále bylo zjištěno, že defosforylaci
katalyzuje fosfatasa. Revezibilní fosforylace byla tímto prokázána jako
mechanismus regulace funkce proteinů.
http://themedicalbiochemistrypage.org/glycogen.php
Ve stejné době pracoval Earl Wilbur Sutherland Jr. (1915-1974)
na Washingtonově Univerzitě v St.Louis později na univerzitě Case
Western Reserve v Clevelandu, Ohio, na zkoumání vlastností
glykogenfosforylasy z jater. Spolu s ostatními objevil cAMP jako
teplotně stabilní faktor, který slouží jako druhý posel pro adrenalin a
glukagon při aktivaci glykogenfosforylasy.
E. Krebs a E. Fischer ukázali stejné schéma v králičím svalu a
potvrdili, že cAMP učinkuje ve smyslu fosforylační aktivace
fosforylasakinasy. Trvalo několik let, než byl vysvětlen mechanismus
zahrnující další enzym cAMP-dependentní proteinkinasu (PKA).
Ukázalo se, že tento enzym fosforyluje i jiné proteiny, proto je jeho
název obecný. Předpokládalo se sice nejdříve, že regulace
prostřednictvím fosforylace proteinů je omezena na metabolismus
glykogenu, práce z konce 60. let a počátku 70. let 20. století pak
potvrdily obecnou platnost.
V r. 1968 odešel E. Krebs na Kalifornskou univerzitu v Davisu, kde se
stal vedoucím katedry biochemie na lékařské fakultě.
V pokračujícím výzkumu PKA bylo zjištěno, že působí i na lipasu, skládá se z
katalytických (C) a regulačních (R) podjednotek, vlivem cAMP dochází k
jejich disociaci.
Vypracován byl mj. také protokol pro purifikaci
glykogensynthasy.
V r. 1976 se E. Krebs vrátil do Seattlu jako vedoucí tamní katedry
farmakologie.
Spolupráce s Kennethem Walshem a Koiti Titanim z
Katedry biochemie Lékařské fakulty WU se týkala analýzy primární
struktury PKA a dalších kinas. Vazebné studie využívaly afinitního značení
.
Na konci 70. let přišly z jiných laboratoří převratné objevy týkající se
fosforylace a defosforylace proteinů, mj. že fosforylován může být
nejenom serin či threonin, ale i tyrosin.
Potvrzeny byly různé
proteintyrosinkinasy (PTK). Takovou kinasou je i insulinový receptor.
Předmětem zájmu se stalo také propojení tyrosinové fosforylace s
fosforylací serinu a threoninu. Byla objevena MAPK kaskáda. Dalším
studovaným enzymem byla kaseinkinasa 2 (CK2) fosforylující více než 100
substrátů. Bylo zjištěno, že glykogensynthasakinasa 3 může fosforylovat
určitý substrát insulinového receptoru a tím z něj učinit inhibitor.
Jiným předmětem výzkumu byla apoptóza a role fosforylací v jejím
průběhu, např. proteolytická aktivace proteinkinas.
Paul Delos Boyer
(*31.7. 1918)
P. D. Boyer je americký biochemik a
chemik, profesor na Kalifornské universitě
v Los Angeles (UCLA). V r. 1997 získal
Nobelovu cenu za chemii, což přišlo za
výzkum ATP-synthasy, spolu s Angličanem
Johnem Ernestem Walkerem. Dalším
tehdy oceněným byl Dán Jens Christian
Skou za objev Na+/K+-ATPasy.
Narodil se v Utahu, v městě Provo, kde
absolvoval i střední školu. Bakalářského
vzdělání v oboru chemie dosáhl na
mormonské Univerzitě Brighama Younga
tamtéž (1939) a získal stipendium pro
studium biochemie na Wisconsinské
univerzitě v Madisonu.
V té době se tam prováděl špičkový výzkum v oblasti výživy a metabolismu,
byly objevovány a studovány např. vitamíny, jejich příprava a antagonisté.
Pracoval u profesora Paula Phillipse.
Jedním z jeho prvních výsledků bylo zjištění, že enzym pyruvátkinasa je
aktivován K+, bylo sledováno jako ovlivnění přenosu fosfátu z 3fosfoglycerátu do kreatinfosfátu (ATP byl objeven Lohmannem v r. 1927).
Poté co obdržel Ph.D., pobýval na Stanfordově univerzitě, kde v době války
hledali možnost stabilizace sérového albuminu pro zahřívání za účelem
likvidace patogenů. Toho bylo dosaženo přídavkem acetyltryptofanu. Svoji
nezávislou kariéru začal na Minnesotské univerzitě, kde se zabýval především
studiem enzymů (50. léta 20. stol.).
Jedním z témat byla glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasová reakce v
glykolýze. S pomocí izotopu 18O prokázali zabudování kyslíku fosfátu do
karboxylové skupiny fosfoglycerátu. Při studiu oxidační fosforylace
inkubovali mitochondrie s fosfátem značeným 18O a 32P a neznačeným ATP.
Pozorovali rychlou výměnu kyslíků Pi s vodou a fosforu s ATP. Reverzibilita
pokračovala i při inhibici přenašečů elektronů. Předpokládala se existence
energeticky bohaté sloučeniny.
Díky stipendiu byl Boyer v r. 1955 na studijním pobytu u Hugo Theorella ve
Švédsku. Zde např. rozpoznal změnu fluorescence NADH po navázání na
dehydrogenasu. Ve Švédsku také započal experimenty vedoucí k poznání, že
poslední můstkový kyslík v ATP tvořeném oxidační fosforylací nepochází z
ADP, ale z fosfátu.
V následujícím období se využívalo 32P ke studiu intermediátů enzymových
reakcí, např. glutaminsynthetasy. V r. 1961 se již zdálo, že objevili hledanou
energeticky bohatou sloučeninu. Po expozici mitochondrií 32Pi a jejich
solubilizaci byla radioaktivním fosforem značená nedialyzovatelná látka.
Potvrdilo se, že jde o protein s histidinovou fosforylací.
Od r. 1963 byl Boyer profesorem na Katedře chemie a biochemie na
UCLA.
Výzkum
dále
pokračoval
nalezením
modulátorů
tvorby
fosfohistidinového zbytku v daném proteinu, efektivní byl sukcinát a CoA.
Fosforylovaný histidin byl nakonec vysvětlen jako intermediát sukcinylCoA-synthetasové reakce, nikoli oxidační fosforylace.
Na UCLA přijal místo ředitele Ústavu molekulární biologie. Pokračující
experimenty s 32P, ukázaly, že primárním akceptorem fosfátu při oxidační
fosforylaci je ADP. Byly získány důkazy, že domnělý energeticky bohatý
intermediát hraje také roli při transportu aminokyselin či určitých
sacharidů do mitochondrií. Boyer tehdy stále odmítal Mitchellovu teorii
protonmotivní síly, dle jeho slov, kvůli chybějícímu vysvětlení procesu,
kterým migrace protonů může vést k tvorbě ATP. Na poč. 70. let dospěl
Boyer k představě, že energie uložená v ATP může pocházet z
konformační změny proteinu. K tomu svádělo pozorování, že výměna kyslíků
ve fosfátu byla méně náchylná k působení rozpojovačů než celková oxidační
fosforylace (ATP vázáno v aktivním místě enzymu a hydrolyzováno).
en.wikipedia.org
V té době skupina E.C. Slatera prokázala na izolované F1-ATPase a ATPsynthase vazebná místa pro ATP a ADP. Boyerův tým dokumentoval pevnou
vazbu ATP (tvořeného z Pi v médiu) na myosinovou ATPasu. Při hydrolýze
ATP myosinovou ATPasou byla prokázána výměna kyslíků mezi vázaným ATP
a vodou. Kombinace myosinu a aktinu uvolňovala ATP jak bylo předpokládáno
pro ATPasu.
Koncept translokace protonů spojený s uveřejnil Peter D. Mitchell (19201992) v roce 1961.
Robert Bruce Merrifield
(*15. 7. 1921 – †14. 5. 2006)
Merrifield
působil
na
Rockefellerově
univerzitě, v r. 1984 získal Nobelovu cenu
za chemii za vyvinutí metodiky pro chemickou
syntézu na pevné fázi.
Narodil se v Texasu (Fort Worth), jeho otec
byl malířem pokojů a prodavačem nábytku.
Kvůli hospodářské krizi se rodina často
stěhovala. Navštěvoval celkem 11 různých
středních škol, oblíbil si chemii, fyziku a
astronomii, fotografoval.
V r. 1939 nastoupil na Juniorskou kolej v
Pasadeně, pozdějí na Kalifornskou univerzitu v
LA (UCLA), kde v r. 1943 získal bakalářský
titul. Jeho učitel biochemie Max Dunn byl
odborníkem na aminokyseliny, u něj Merrifield
pracoval v magisterském studiu.
zdroj: Wiki
Experimenty, které se prováděly, zahrnovaly především mikrobiologii, např.
sledování látek esenciálních pro růst laktobacilů s cílem vyvinout metody
kvantitativní analýzy látek, např. obsah prolinu v proteinech či obsah
pyrimidinových bazí v DNA.
V r. 1949 získal titul Ph.D., oženil se a přešel na Rockefellerův ústav pro
medicínský výzkum, kde pracoval u D. W. Woolleyho na izolaci nového
bakteriálního růstového faktoru nazvaného strepogenin, což zahrnovalo práci
s proteinovými hydrolyzáty. Osvojil si například aminokyselinovou analýzu
vyvinutou kolegy z univerzity Williamem Howardem Steinem (1911-1980) a
Stanfordem Moorem (1913-1982), kteří spolu s Christianem B. Anfinsenem
(1916-1995) získali v r. 1972 Nobelovu cenu za chemii.
V té době Angličan Fred Sanger (1918-2013) opublikoval sekvenci insulinu,
části inzulinu z B- řetězce byly na RU studovány pro strepogeninovou aktivitu.
Určitý pentapeptid bylo třeba syntetizovat pro ověření výsledků. To se
povedlo tehdy konvenčními technikami, což znamenalo jen minimální změny od
dob Emila Fischera (1852-1919) – chránící skupiny, selektivní reakce,
krystalizace. Tedy pomalý proces s velkými ztátami.Ve 30. letech se objevilo
reduktivní odštěpení chránících skupin sodíkem v kapalném amoniaku. Vincent
du Vigneaud (1901-1978) a kol. zavedli benzyloxykarbonylovou chránící
skupinu (Z), což umožnilo syntetizovat nonapeptidy oxytocin a vasopresin.
Na konci 50. let uvažoval Merrifield o nové strategii, rychlé, kvantitativní a
automatizovatelné, kde by se využilo chromatografické kolony s navázaným
peptidem, kde by k elongaci docházelo přídavkem aktivované kyseliny.
Předpokládal, že vše půjde vyvinout za několik měsíců, fáze proof-of-concept
však trvala 3 roky. Původnějako pevné médium zkoušel celulosový prášek
(uvažoval
esterovou
vazbu
aminokyseliny),
dále
polyvinylalkohol,
polyakrylamid a konečně dospěl k polystyrenu s příčnými vazbami
prostřednictvím divinylbenzenu.
Pokud jde o chránění aminoskupiny, Z skupina nebyla optimální kvůli nutnosti
hydrolyzovat silnou kyselinou, což vede i k odštěpení části startovní
aminokyseliny navázané na polymer ve formě benzylesteru, ale nebylo příliš
na výběr. Po navázání AK na polystyren se skupina Z odštěpila, aminoskupinu
bylo třeba deprotonovat alkalizací s terc. Aminem a následně se navazovala
další Z-chráněná AK s využitím dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI).
K rutinním syntézám pak byla vyvinuta aparatura se sintrovým filtrem a
kohoutem pro promývání. K získání publikovatelných výsledků byl vybrán
tetrapeptid. Další inovace přinesly blokování nezreagovaných aminoskupin
acetylací, odštěpení peptidu proběhlo reakcí zmýdelnění.
Dočištění peptidu bylo provedeno iontoměničovou chromatografií. Celý postup
byl publikován r. 1963 a vznikla syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS). Na
toto téma v průběhu kariéry nakonec Merrifield publikoval více než 300
prací.
Po první publikaci následovala syntéza bradykininu s nově zavedenou chránicí
skupinou Boc (t-butyloxykarbonyl). Postup byl s chráněním postranních
řetězců vypracován tak, že byla rychlost 2 AK za den, celý bradykinin bylo
možné získat za 8 pracovních dnů.
S automatizací na zkonstruovaném aparátu se rychlost zvýšila na 6 AK za
den, ve spolupráci s Johnem Stewartem,
ten pak připravil řadu
bradykininových analogů.
Od r. 1965 pracoval Merrifield v týmu s mladými výzkumníky a studenty, byly
připraveny další peptidy, angiotensin, insulin, oxytocin, antibiotika. S
postdokem Berndem Guttem z Německa v r. 1969 syntetizoval enzym
ribonukleasu A (124 AK). Tento historický úspěch znamenal 369 reakcí a 11
931 kroků bez nutnosti izolace intermediátů. Produkt svými vlastnostmi
odpovídal přirozenému enzymu. Naví šlo o experimentální důkaz k Anfinsenovu
tvrzení o tom, že primární struktura proteinu předurčuje jeho strukturu
prostorovou.
Tento projekt však odhalil některé nedostatky , proto kolem r. 1970
proběhla reexaminace celého postupu, esterové vazby, chránicích skupin,
účinnosti připojování i odštěpení.
Ztráty činily 83%, což znamenalo průměrně 1,4% na krok. Polystyren byl
nahrazen PAM pryskyřicí (oxymethylfenylacetamidomethyl) s řádově
100krát větší stabilitou v kyselém prostředí, k tomu byl překonán i problém s
peptidy, které měly permanentně blokovanou aminoskupinu.
Postup byl dále zdokonalen štěpením v mírně kyselém prostředí a možností
syntézy stavebních bloků pro další spojování. Výtěžek optimalizovaného
postupu se dostal až na 99,9%.
Dalšími syntetizovanými látkami byly peptidy glukagon a jeho analoga,
gastrin, antibiotikum cecropin A a analoga (tvoří iontové kanály v
membránách) mellitin, thymosiny a fragmenty imunoglobulinů.
V současné době se na pevné fázi peptidy syntetizují zcela běžně a
automatizovaně, budují se takto i oligopeptidy a celé knihovny organických
sloučenin.
Kromě Nobelovy ceny a řady dalších cen získal Merrifield i patnáct čestných
doktorátů.
Marshall Warren Nirenberg
(*10.4. 1927 – †15.1. 2010)
byl americký biochemik a genetik židovského
původu. V roce 1968 získal Nobelovu cenu za
fyziologii a medicínu spolu Har Gobindem
Kharanou (chem. syntéza kodonů) a
Robertem W. Holleym (struktura tRNA)
jako ocenění práce na vyluštění genetického
kódu a popisu fungování proteosyntézy.
Narodil se v NYC. Jako chlapec prodělal
revmatickou horečku, proto se s rodiči
přestěhoval na Floridu (Orlando) kvůli
klimatu. Na farmě získal zájem o biologii.
Studoval zoologii na Floridské univerzitě v Gainesvillu (1952), v roce 1957
získal doktorát z biochemie na Michiganské universitě v Ann Arboru. Jako
postdok-stipendista začal pracovat v Národních ústavech zdraví (NIH). Poté
získal místo vědeckého pracovníka (1959) a věnoval se vztahu DNA, RNA a
proteinů. V roce 1962 se stal vedoucím Oddělení biochemické genetiky na
Národním ústavu pro onemocnění srdce, šéfem laboratoří zůstal až do své
smrti. Oženil se v roce 1961 a pak podruhé v roce 2005.
Na konci 50. let 20. století se ukázalo, že DNA je nositelkou genetické
informace (Avery-MacLeod-McCartyův experiment, experiment Hersheye
a Chaseové, Watson-Crickova struktura, Meselson–Stahlův experiment).
Nevědělo se však, jak se přenáší informace do proteinů a jaká je role RNA.
Nirenberg na tom pracoval v týmu s Heinrichem J. Matthaei na NIH. Jejich
klíčový experiment (Nirenberg-Matthaei experiment) ukázal, že poly(U)
RNA (uracil je pouze v RNA) je v systému obsahujícím DNA, RNA, ribosomy a
další buněčný aparát pro proteosyntézu po rozkladu DNA DNasou překládán
do polyPhe proteinu. Tohle bylo ověřeno tak, že přidávali vždy jednu
radioaktivní AK a 19 neradioaktivních, postupně se značení prostřídalo. Do
vzniklého proteinu byl zabudován pouze radioaktivní fenylalanin (!).
Nirenberg zveřejnil výsledky na Biochemickém kongresu v Moskvě v srpnu
1961. Během několika let jeho tým potvrdil, že AAA se překládá jako Lys a
CCC jako Pro. Dalším průlomovým experimentem byla práce postdoktoranda v
Nirenbergově laboratoři Phillipa Ledera, který objevil metodu (NirenbergLederův experiment) pro luštění genetického kódu. Enzymová syntéza
krátkých RNA molekul, vlastně kodonů, to umožnila spolu s radioaktivně
značenou aminoacyl-tRNA a částečně purifikovanými ribosomy. Tyto výsledky
doplnil Gobind Khorana. Nirenberg se na konci kariéry věnoval neurovědě.
Období v l. 1961 a 1962 je často nazýváno „coding race", kvůli soutěži mezi
laboratořemi – Nirenbergovou na NIH a Ochoovou na NYU. Protože tehdy mohl
první vědec z NIH získat Nobelovu cenu, mnoho Nirenbergových kolegů
odložilo svou vlastní práci a přispělo k řešení genetického kódu.
Leder a Nirenberg v experimentu používali velmi krátké umělé RNA sekvence
(tři nukleotidy) v bezbuněčném systému. Tyto krátké fragmenty byly
dostatečně dlouhé, aby se ribosom mohl vázat s molekulou tRNA, která je
komplementární k jednomu kodonu a přitom detekovatelná. Klíčovým krokem
experimentu bylo, že byl vždy označen jeden typ aminokyseliny a směs se
filtrovala. Speciální filtr dovolil průchod nenavázané tRNA, nikoli však
ribosomům s vázaným tripletem. Byla pak sledována radioaktivita vzorku.
Bylo-li radioaktivita ve vzorku, který neprošel přes filtr, znamenalo to
navázání odpovídající aminokyseliny.
Smith, A. (2008) Nucleic acids to amino
acids: DNA specifies protein. Nature
Education 1(1)
•Crick, F. H., et al. General nature of the genetic code for proteins.
Nature 192, 1227–1232 (1961)
•Jones, D. S., Nishimura, S., & Khorana, H. G. Further syntheses, in
vitro, of copolypeptides containing two amino acids in alternating
sequence dependent upon DNA-like polymers containing two
nucleotides in alternating sequence. Journal of Molecular Biology 16,
454–472 (1966)
•Leder, P., et al. Cell-free peptide synthesis dependent upon synthetic
oligodeoxynucleotides. Proceedings of the National Academy of
Sciences 50, 1135–1143 (1963)
•Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H., & Jones, O. W. An intermediate in the
biosynthesis of polyphenylalanine directed by synthetic template RNA.
Proceedings of the National Academy of Sciences 48, 104–109 (1962)
•Nirenberg, M. W., et al. Approximation of genetic code via cell-free
protein synthesis directed by template RNA. Federation Proceedings 22,
55–61 (1963)
•Nishimura, S., Jones, D. S., & Khorana, H. G. The in vitro synthesis of
a co-polypeptide containing two amino acids in alternating sequence
dependent upon a DNA-like polymer containing two nucleotides in
alternating sequence. Journal of Molecular Biology 13, 302–324 (1965)
William Wallace „Mo“ Cleland
(*6. 1. 1930 – †6. 3. 2013)
Narodil
se
v
Baltimoru,
Maryland.
Bakalářské
studium
absolvoval
na
Oberlinské koleji v r. 1950, magisterské a
doktorské na Wisconsinské univerzitě v
Madisonu, a to v l. 1953, resp. 1955.
Postdoktorský pobyt vykonal na Chicagské
univerzitě odkud se vrátil do Wisconsinu
jako odborný asistent. V r. 1962 se stal
docentem a v r. 1966 profesorem. Získal
pak ještě profesury v l. 1978 a 1982.
Jeho hlavním oborem bylo zpočátku studium
lipidů, zabýval se acylací glycerolfosfátu za
vzniku fosfatidových kyselin a sledoval
substrátovou specifičnost enzymu pro různé
acyl-CoA. Substráty připravoval chemickou
acylací CoASH, pro redukci koenzymu
využíval dithiothreitol (Clelandovo činidlo)
jako jistý analog lipoamidu.
zdroj: ASBMB
Pro výuku biochemie se snažil zdokonalit téma enzymové kinetiky.
Kombinace řešení rovnic a experimentů vedla ke třem publikacím v časopisu
Biochimica et Biophysica Acta, ve kterých navrhl nomenklaturu a teorii
enzymových reakcí s více substráty nebo produkty.
Cleland využil svoje poznatky ke studiu rozmanitých enzymů, např.
glycerolkinasy, kde zjistil, že jde o uspořádaný mechanismus, kdy se
nejdříve váže glycerol, pak ATP v komplexu s Mg2+, nejdříve se uvolňuje
MgADP a nakonec glycerol-3-fosfát. Využil přitom inhibičních technik.
Ke studiu enzymových mechanismů využíval kinetických isotopových efektů;
ze stabilních izotopů např. deuteria, 13C, 15N a 18O, z radioaktivních izotopů
14C a 3H. Změnami pH se hledaly podmínky, při kterých chemická reakce
limitovala rychlost, nebo se prováděla místně řízená mutageneze. Sledovalo
se, jak obsah těžkého izotopu (stopové značení) ovlivňoval kcat nebo kcat /Km.
Byl vášnivým filatelistou (prezident US filatelistické společnosti v r. 1992),
měl rád operu a byl členem jachtařského klubu. Na téma známky publikoval
ca. 300 článků.
Cleland zemřel v důsledku nehody, pádu na ledu.
Clelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus
(kreatinkinasa):
ATP Kreatin
Fosfokreatin ADP
Enzyme
Enzyme
E (kreatin)
(ATP)
Kreatin ATP
E (fosfokreatin)
(ADP)
ADP Fosfokreatin
Clelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu
(laktátdehydrogenasa):
NADH Pyruvát
Enzyme
E (NADH) (pyruvát)
Laktát NAD+
E (laktát) (NAD+)
Enzyme
Clelandovo schéma pingpongového mechanismu
(aspartátaminotransferasa):
Aspartát
Enzyme
E
(aspartát)
Oxaloacetát
(E-NH3+ )
(oxaloacetát)
-Oxoglutarát
(E-NH3+ )
(oxaloacetát)
(E-NH+
)
3
(-oxoglutarát)
Glutamát
Enzyme
E
(glutamát)
Bruce Michael Alberts
(*1938)
Alberts je americký biochemik, autor knihy
Molecular Biology of the Cell a veřejný
činitel v oblasti vědy a vzdělávání. Přispěl k
objasnění role proteinových komplexů při
replikaci DNA. Byl editorem časopisu
Science a prezidentem Národní akademie
věd (1993-2005).
Otec byl strojním inženýrem a pracoval na
patentovém úřadě. Studoval střední školu
na předměstí Chicaga (Illinois), je
absolventem
Harvardovy
univerzity
(biochemické vědy), v roce 1965 zde získal
doktorát. Během pregraduálního studia
pracoval v chemické laboratoři a už tehdy
byl spoluautorem vědeckých prací na téma
nukleové kyseliny (PNAS, Nature, r. 1960).
Gitschier J (2012) Scientist Citizen:
An Interview with Bruce Alberts.
PLoS Genet 8(5): e1002743.
doi:10.1371/journal.pgen.1002743
V průběhu Ph.D. studia se pokoušel o experimenty v sousvislosti s
rozluštěním genetického kódu a replikace DNA. Předpokládalo se působení
DNA polymerasy, nevědělo se ale, jak vše probíhá na dvouřetězcové DNA.
Příliš mnoho pokusů bez výsledku nakonec vedlo k studiu příčných vazeb v
DNA zjištěných u E. coli a potvrzených v DNA z telecího brzlíku. O DNA z
E. coli se věřilo, že jde o lineární molekulu, na jejímž konci replikace začíná
vlásenkou spojující oba řetězce.
Ve studiu replikace DNA pokračoval během postdoktorandského pobytu v
Ženevě u Richarda Epsteina. Ten již v roce 1963 publikoval článek o nutné
přítomnosti alespoň sedmi proteinů (včetně DNA polymerasy) pro replikaci
DNA fága T4. V Ženevě se snažil připravit kolonu s DNA pro izolaci
proteinů vázajících se na DNA. Po experimentech s chemickým připojením
přišel náhodou na to, že vysušením vzorku DNA s čistou celulosou dojde k
pevnému navázání.
Od r. 1966 pracoval Alberts jako asistent na Katedře biochemických věd
Princetonské univerzity. E. coli byla infikována různými mutanty fága T4. Při
použití mutanta genu 32 zmizel jeden z proteinů, co se běžně vázal na
jednořetězcovou DNA. Protein byl izolován a zjistilo se, že katalyzuje
denaturaci i renaturaci DNA za fyziologických podmínek (Nature, 1970).
V r. 1972 se stal docentem a v r. 1974 řádným profesorem na Princetonu.
V r. 1975 se podařilo Albertsově týmu rekonstituovat replikační aparát
bakteriofága T4 z purifikovaných proteinových komponent.
V r. 1976 přešel na Kalifornskou univezitu v San Franciscu, kde přijal
místo profesora a zástupce vedoucího Katedry biochemie a biofyziky.
Vedoucím se pak stal v r. 1985. V r. 1980 získal doživotní profesuru od
Americké společnosti pro rakovinu.
Na problematice replikačních proteinů pokračoval Albertsův tým i nadále
až do 90. let 20. století. Popsali např. fungování DNA topoisomerasy,
helikasy, histonacetylasy a jiných enzymů.
Později se začal angažovat v oblasti vzdělávání a školství, působí v Národní
akademii věd, rozmanitých vědeckých komisích a redakčních radách.
Prezidentem Národní akademie věd byl v l. 1993-2005. V l.
V r. 2010 byl vyslancem prezidenta Obamy pro vzdělávací misi v
muslimských zemích.
Kary Banks Mullis
(*28. 12. 1944)
Mullis je americký biochemik, který je znám
za vyvinutí PCR techniky a v roce 1993 byl
laureátem Nobelovy ceny za chemii spolu s
Michaelem Smithem (1932-2000), který
přispěl k vývoji místně řízené mutageneze.
PCR dnes patří k ústředním technikám v
biochemii a molekulární biologii.
Narodil se ve farmářské rodině v Severní
Karolině. V městě Columbia v Jižní Karolině
navštěvoval střední školu. Studoval pak v
Atlantě na Technické univerzitě, kde získal
bakalářský titul v oboru chemie. Ph.D. v
oboru biochemie dosáhl na Kalifornské
univerzitě
v
Berkeley
(1972).
Jako
postdoktorand pracoval na univerzitách v
Kansas City a San Francisku. Několik let
pracoval v biotechnologické společnosti
Cetus Corporation V Kalifornii, kde vyvinul
proces polymerasové reakce.
Zdroj: nobelprize.org
Ve firmě Cetus se zabýval syntézou oligonukleotidů. Amplifikaci DNA s
pomocí DNA-polymerasové reakce, dvou oligonukleotidových primerů a
nukleosidtrifosfátů demonstroval v prosinci 1983. Na projektu vývoje PCR
techniky pracovali i další zaměstnanci firmy Cetus jako Randall Saiki a
Henry Erlich. Vývoj je tedy považován za týmovou záležitost. V r. 1986
Mulis z firmy Cetus odešel a pracoval jako vedoucí molekulární biologie ve
firmě Xytronyx, Inc. v San Diegu. Dále se živil a živí jako konzultant a
podnikatel.
V počátečním uspořádáním experimentu se po každém cyklu musela přidávat
nová DNA polymerasa. V r. 1986 začal Saiki používat termostabilní Taq
polymerasu z Thermus aquaticus, což umožnilo automatizaci.
Princip
samotné PCR ale nebyl novátorský, byl popsán H. G. Khoranou a K. Kleppem
v roce 1971 (Journal of Molecular Biology).
Patent byl firmou Cetus prodán společnosti Roche Molecular Systems za
300 mil. USD, i když byl firmou DuPont zpochybněn.
Mullis přiznal zkušenosti s používáním LSD a na setkání s Albertem
Hofmannem při příležitosti jeho stých narozenin mu sdělil, že to bylo užívání
LSD, které mu dovolilo vyvinout PCR k amplifikaci sekvencí DNA. Má
zajímavé extrémní osobní názory, odmítá nemoc AIDS a globální oteplování.
Kleppe, K.; Ohtsuka, E.; Kleppe, R.; Molineux, I.; Khorana, H. G. (1971). Studies on polynucleotides *1, *2XCVI.
Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. Journal of Molecular Biology 56 (2):
341–361
K.B. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn and H. Erlich, 1986, Specific enzymatic amplification of DNA in
vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, 51:263-273.
Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988) Primer-directed
enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 (4839): 487–491.
K. Mullis, 1990, The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American, April 56-65.