docTECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
download 
Stížnost Transkript
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP) “Koncept párování bazí je striktně konzervativní“ Cytosine Guanine Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární 5 HO konce dsDNA nejsou stejné 3’ end T 4 A 1 3 2 DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena p j G C T A G C OH 3’ end 5’ end Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: ¾ složení bazí ¾ rozpouštědle iontové síle pH ¾ délce DNA DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa p helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny Vlastnosti DNA polymerasy 1. polymerasová aktivita Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový N ý nukleotid kl tid jje přidáván řidá á tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3' 3'--5' exonukle exonukleas asová ová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukle 3 exonukleas asová ová aktivita - odštěpuje RNA primer DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg g dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINů JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Forward primer 5’ dNTPs 3’ TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Reverse primer dNTPs 55’ 33’ GCATATACTCGATTTCT 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea ¾ Ghobind Khorana 1971 ¾ Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty ¾ potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách g y ¾ termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let Jak funguje PCR ¾ Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza PCR komponenty Templátová DNA ¾ vzorek k amplifikaci Primery ¾ krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace dATP, dTTP, dCTP, dGTP ¾ volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2) Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace ¾ Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) ¾ “Hot start” PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu ¾ “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích C C C C C tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = 65.536 krát T T T T T A T stupeň degenerace: ¾ “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měly mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery degenerované primery max. max 20 bp ideální do degenerace 250x Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5 5´ku ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAG AAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’ Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: • Templátová DNA 1-1000ng 1 1000ng • Primery 10 -20 pmols • 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl • MgCl2 0.5 -3.0 mM • 50 ųM každého nukleotidu dATP, dATP dGTP, dGTP dTTP, dTTP dCTP • 2 jednotky Taq polymerasy Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko PCR Optimalizace Složka specifická amplifikace AnnealingTeplota - Tm nespecifická amplifikace nízká vysoká MgCl2 vysoká nízká KCl vysoká nízká Enzym, Primer vysoká nízká pH nespecificky Formamid nízká vysoká látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. pro GC-rich templáty Nespecifická amplifikace Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO) inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR •jednozkumavková reakce •PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) •dideoxyribonukleotidy dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery •velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře •fluorometr s automatickým vyhodnocením multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily – např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent® polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza Taq Pfu Pwo DeepVent® long PCR koktejl 5´-3´exonukleázová 3´-5´exonukleázová aktivita aktivita + + + + + + délka produktu 3 kb 3 kb 3 kb 12 kb 20 kb frekvence chyby 10-4 1.3 x 10-6 3 3 x 10-6 3.3 3.0 x 10-5 2.0 x 10-6 PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 °C Pwo 2 hod při 100 °C DeepVent® 8hod při 100 °C in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorimetr fl i jje součástí čá í termocykleru kl Real-time PCR monitoruje fluorescenci uvolňovanou jako odezvu na každý uskutečněný cyklus v PCR (v reálném čase). + d daleko l k přesnější př ější oproti p ti end-point d p i t barvení b í EtBr EtB při konvenční PCR - náročné na optimalizaci a vybavení aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer srovnání TaqMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) (max 4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká kontaminace • největší problém PCR • aerosol, pipety, staré amplikony • částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsDNA s inkorporovaným deoxyuracilem (dUTP) termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C nereaguje s templátem (dTTP) dUTP v qPCR mixu místo dTTP pracuje během nastavení PCR reakce chyby v pipetování • templát (cDNA) • p premix (p (primery, y, proba, p , polymerasa, p y , dNTP,, pufr, p , srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací AMOUNT OF DNA lineární vynesení 1600000000 1400000000 AMOUNT OF DNA A 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení AMOU N T OF D N A CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 PCR CYCLE NUMBER 30 35 lineární ~20 do ~1500 CT hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu) před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku – absolutní kvantifikace templát: 10x ředění threshold přímo cDNA, nebo p plasmid s buď p naklonovaným genem, který stanovujeme CT koncentrace templátu PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY • směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce • %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu • R2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995) %EFF 100% 90% 80% 70% = 2.00x = 1.90x = 1.80x = 1.70x 10,000,000,000 100% EFF 1,000,000,000 90% EFF 100,000,000 AM MOUNT OF DNA CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 4 3 3 3 8 7 6 5 4 16 13 10 8 5 32 25 19 14 6 64 47 34 24 7 128 89 61 41 8 256 170 110 70 9 512 323 198 119 10 1,024 613 357 202 11 2,048 1,165 643 343 12 4,096 2,213 1,157 583 13 8,192 4,205 2,082 990 14 16,384 7,990 3,748 1,684 15 32,768 15,181 6,747 2,862 16 65,536 28,844 12,144 4,866 17 131,072 54,804 21,859 8,272 18 262,144 104,127 39,346 14,063 19 524,288 197,842 70,824 23,907 20 1,048,576 375,900 127,482 40,642 21 2,097,152 714,209 229,468 69,092 22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456 23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676 24 16 777 216 16,777,216 4 898 763 4,898,763 1 338 259 1,338,259 339 449 339,449 25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466 80% EFF 10,000,000 70% EFF 1,000,000 100,000 10,000 1,000 , 100 10 1 0 10 20 30 PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% ± 3% REFERENČNÍ GEN relativní kvantifikace • musí mít stabilní expresi ve všech studovaných t d ý h vzorcích í h • nejčastěji provozní geny (house-keeping) • actin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA TaqMan Human Endogenous Control Plate ΔCT ΔCT = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cDNA 18S ribosomální RNA • přepisována jinou RNA polymerasou než mRNA • byly popsány výkyvy mezi množstvím rRNA a mRNA • nelze použít pokud se vychází z mRNA vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mRNA) přepis do cDNA navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení č í standardních t d d í h křivek kři k pro oba b geny a stanovení t í efektivity f kti it GAPDH GAPDH GAPDH GOI GOI GOI vyhodnocení kalibrátor sample A sample A sample B kalibrátor sample B GAPDH GOI 1 vyhodnocení metoda „delta delta cé té“ změny exprese pro sample 1 1 určíme CT pro všechny křivky 1. 2. určíme CT 3. 4. GOI určíme CT - CT GOI GAPDH - CT pro kalibrátor ΔCT kalibrátor pro sample 1 ΔCT sample 1 GAPDH ΔCTsample 1 - ΔCTkalibrátor ΔΔCT výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2-ΔΔCT 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cDNA a provedeno qPCR s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cDNA cDNA kalibrator silencing CT 22,48 CT 22,3 cDNA cDNA pkg2 2-ΔΔCT 2 –(5,33-2,43) 0,134 7,5x GAPDH Eff 77% CT 20,05 kalibrator CT 16,97 silencing cDNA cDNA DNA kalibrator cDNA cDNA kalibrator 1,1x104 kopií 1 23 104 kopií 1,23x10 k ií silencing GAPDH (1+0,86)0,18/(1+0,77)3,08 0,192 Gen snížil expresi 5,2x silencing 1,55x104 kopií 8,92x104 kopií 0,194 5,2x navrhování primerů velikost amplikonu 50-150 bp délk primerů délka i ů 20 bp b primery se nesmí překrývat s próbou Tm 58-60◦C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery) navrhování proby délka proby 13-25 bp primery p e y se nesmí es překrývat p e ý at s p próbou óbou Tm 68-70◦C o 10◦C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5´konci zháší fluorescenci FAM barvy navrhování primerů a proby kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon MGB PROBY • minor groove binding • stabilizuje vazbu proby na ssDNA • výrazně zvyšuje Tm • můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm MGB PROBY využití pro alelické diskriminace kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cDNA qPCR 3X 6X kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cDNA qPCR 27X instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System zesilovač halogenová lampa emisní filtry excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku ccd kamera instrumentace http://www.youtube.com/watch?v=k16WgEU1kVM Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika) HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) • detekce SNP bez specifických sond • díky kvalitní instrumentaci Corbett (±0.02◦C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus) HRM ANALYSA pro amplikony do 200bp Aplikace PCR a využití v praxi Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce virových a bakteriálních onemocnění Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator Aplikace PCR a využití v praxi NEZÁVADNOST POTRAVIN Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi j di i v počtu jedinci čt opakování k á í mezi m i 4-40x 4 40 např. ř GTGTGTGT Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN • molekulárně-genetické zhodnocení surovin ži čiš éh živočišného a rostlinného tli éh původu, ů d kt é byly které b l vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství • průkaz falšování potravin druhovou (rostlinného i živočišného původu) záměnou • identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny EVOLUČNÍ BIOLOGIE nebo geneticky změněných mikroorganismů ORNITOLOGIE používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. skot ovce prase koza TEST
Podobné dokumenty
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
Návod k použití - BAG Health Care GmbH
standardu jako pozitivní. Správnou velikost jednotlivých proužků lze nalézt v pracovních listech a
vyhodnocovacích diagramech. Ve všech drahách bez specifických produktů jednotlivých alel musí být ...
Současné trendy v RTG difrakční analýze
RTG difrakční metodiky jsou nedestruktivní a jsou založeny na analýze
difrakčního obrazu: polohách, θhkl (dhkl); intenzitách, Ihkl; šířkách a profilech