Inovace PhD. studia pro biotechnologické aplikace

Inovace PhD. studia pro biotechnologické aplikace

 Inovace PhD. studia pro biotechnologické aplikace Témata stáží reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0272 Obsah Projekt č. 1 - Příprava orientovaných nanovláken z biopolymerů ............................................. 3 Projekt č. 2 - Příprava mikrovláken z biopolymerů jako nosičů biologicky aktivních látek ........ 4 Projekt č. 3 - Fluoreskující nanočástice jako diagnostické prostředky ..................................... 5 Projekt č. 4 - Fluorescenční spektroskopie nanostruktur pro medicínu .................................... 7 Projekt č. 5 - Syntéza hydrogelů z biopolymerů ....................................................................... 9 Projekt č. 6 - Upconversní nanočástice .................................................................................. 11 Projekt č. 7 - Biologie plazmidů u rodu Streptococcus ........................................................... 13 Projekt č. 8 - Moderní postupy u fermentace Basidiomycet ................................................... 15 Projekt č. 9 - Terapeutické užití blokujících RNA ................................................................... 17 2/18
Projekt č. 1 -­‐ Příprava orientovaných nanovláken z biopolymerů Zadání projektu: Během čtyř týdnů se student postupně a prakticky seznámí se všemi kroky při vývoji a výrobě nanovlákenných materiálů metodou elektrostatického zvlákňování. Bude seznámen s postupy k dosažení optimálních fyzikálně chemických vlastností roztoků a základními principy jejich zvláknění. Stěžejním úkolem studenta bude příprava nanovlákenných vrstev s pravidelným uspořádáním (tj. jednoose nebo víceose orientovaným) z optimalizovaného roztoku. Procesní parametry vedoucí k dosažení nejvyššího stupně uspořádanosti budou řešeny v rámci stáže. Připravené materiály budou dále charakterizovány z pohledu morfologie a mechanických, příp. i biologických a chemických vlastností. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group pod odborným vedením výzkumných pracovníků. Student bude absolvovat stáž po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je červenec – září (po domluvě i jindy). Doporučená literatura: 1. Andrady, A.L., Science and Technology of Polymer Nanofibers. Wiley Publication, 2008. ISBN: 978-­‐0-­‐471-­‐79059-­‐4: p. 404 pages. 2. S. Ramakrishna, K.F., W. Teo, T. Lim, Z. Ma, An Introduction to Electrospinning and Nanofibers. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., Singapore, 2005: p. 396 3. [+] odborné články přímo k dané problematice Představa o realizaci: Student bude pracovat ve špičkově vybavených laboratořích, kde jsou dostupné všechny potřebné experimentální přístroje pokrývající celý výzkum a vývoj nanovlákenných materiálů. Přímo pro metodu elektrostatického zvlákňování jsou k dispozici dvě laboratorní zařízení (z nichž jedno velice sofistikované pro přesné řízení a kontrolu procesních parametrů) a jedno provozní umístěné v laboratoři s čistým provozem. Veškerá experimentální činnost bude provedena během prvních tří týdnů, poslední týden bude student zpracovávat výsledky. Výstup: Hlavním cílem stáže z pohledu výstupů je příprava nových nanovlákenných materiálů s precizní strukturou. Student po skončení své stáže zpracuje závěrečnou zprávu v anglickém jazyce, kde shrne a vyhodnotí všechny dosažené výsledky svých experimentů. Kvalitně zpracované výsledky budou podkladem pro společnou publikaci v odborném časopise. 3/18
Projekt č. 2 -­‐ Příprava mikrovláken z biopolymerů jako nosičů biologicky aktivních látek Zadání projektu: Cílem projektu bude příprava nekonečných vláken z biopolymerů, dopovaných biologicky aktivní látkou (např. Ibuprofen). Dále budou studovány difúzní procesy při uvolňování aktivní látky z vlákenné struktury. Detekce bude provedena pomocí UV-­‐VIS spektroskopie. Pro kontrolu chemické stability polymerního systému a stability uvolňované látky budou provedeny NMR analýzy. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři pro vývoj a výzkum mikrovláken po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je červenec – září. Doporučená literatura: 1. Hladík, V.: Textilní vlákna, SNTL 1970 (či jiná literatura popisující tvorbu vláken metodou „mokrého zvlákňování“ – „wet-­‐spinning proces“ ) 2. Hokr, M.: Transportní procesy, TU Liberec, 2005 (či jakákoliv jiná publikace popisující difúzní procesy) 3. Matkovic, S.R., Valle, G.M, Briand, L.E: Quantitative analysis of ibuprofen in pharmaceutical formulations through FTIR spectroscopy, Latin American Applied Research, 2005 URL: http://www.scielo.org.ar/pdf/laar/v35n3/v35n3a04.pdf 4. Chalabala, M.: Liekové formy, Osveta 1985 Představa o realizaci: V rámci odborné stáže se student v prvním týdnu nejprve seznámí s technologií práce s polymerními materiály a jejich zpracování do formy nekonečných vláken. Následně bude vytvořena řada vláken o různé koncentraci aktivní látky. V průběhu 2. a 3. týdne budou prováděny studie relaxace aktivní látky z vlákenné struktury do fyziologického roztoku. Budou sestaveny a matematicky popsány Fickovské relaxační závislosti pro daný systém léčivo-­‐vlákenná matrice pro různé teploty. Sledovanými proměnnými budou koncentrace léčiva v roztoku, teplota, čas a reziduální obsah léčiva ve vlákenné matrici. Pro detekci uvolněného léčiva do fyziologického roztoku bude použito UV-­‐VIS spektroskopie. Chemická stabilita implementovaného léčiva po zvlákňovacích procesech bude sledována pomocí NMR spektroskopie. V průběhu 4. týdne bude sepisována závěrečná zpráva z provedených měření. Výstup: Laboratorní deník, závěrečná zpráva včetně literárně-­‐rešeršní části, celkem min. 10 stran. 4/18
Projekt č. 3 -­‐ Fluoreskující nanočástice jako diagnostické prostředky Zadání projektu: Náplní stáže je příprava fluorescentních nanočástic – kvantových teček oxidu zinečnatého stabilizovaných organickými ligandy. Účastník získá základní přehled v oblasti moderních nanomateriálů pro diagnostiku, vyzkouší si syntézu nanočástic a jejich charakterizaci pomocí analytických přístrojů. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři A214 po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je září. Doporučená literatura: 1.
2.
3.
4.
Coto-­‐García, A. M., Sotelo-­‐González, E., Fernández-­‐Argüelles, M. T., Pereiro, R., Costa-­‐
Fernández, J. M., a Sanz-­‐Medel, A. (2010) Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics, Analytical and Bioanalytical Chemistry 399, 29-­‐42. Delehanty, J. B., Mattoussi, H., a Medintz, I. L. (2008) Delivering quantum dots into cells: strategies, progress and remaining issues, Analytical and Bioanalytical Chemistry 393, 1091-­‐
1105. Jana, N. R., Earhart, C., a Ying, J. Y. (2007) Synthesis of Water-­‐Soluble and Functionalized Nanoparticles by Silica Coating, Chemistry of Materials. 19, 5074-­‐5082. L. Špaňhel, „Colloidal ZnO nanostructures and functional coatings: A survey“, Journal of Sol-­‐Gel Science and Technology, roč. 39, čís. 1, s. 7-­‐24, čvc 2006. Představa o realizaci: Stáž bude rozdělena do tří částí, kde první tvoří teoretický základ a navazující dvě praktické části se zabývají syntézou a charakterizací fluorescenčních nanočástic. Pro vybraná témata praktické části bude připraven pracovní postup s krátkou teorií v úvodu. První část stáže bude uskutečněna formou přednášek, ve kterých se student seznámí s problematikou fluorescenčních nanočástic a jejich využitím v oblasti optického zobrazování in vitro a in vivo. Dále budou shrnuty hlavní analytické metody vhodné pro charakterizaci těchto nanočástic a na závěr bude představena výzkumná činnost školící laboratoře. Předpokládaná časová dotace: 1-­‐2 dny Hlavní náplní praktické části bude příprava koloidních kvantových teček na bázi ZnO a modifikace jejich povrchu za účelem zvýšení biokompatibility. Modifikace fluorescenčních nanokrystalů bude provedena pomocí různě objemných ligandů, s cílem ovlivnit stabilitu částic ve vodném prostředí. Předpokládaná časová dotace: 10-­‐12 dní 5/18
Charakterizace nanočásticových koloidů ZnO bude probíhat mezi jednotlivými syntézami. Student si bude moci vyzkoušet měření absorpčních a fluorescenčních spekter, kvantových výtěžků fluorescence, stanovení velikosti částic pomocí dynamického rozptylu světla či měření jejich zeta-­‐
potenciálu. Rozpouštění částic bude sledováno také pomocí metody ICP-­‐OES umožňující přesné stanovení koncentrace Zn2+. Hlavním úkolem bude vyhodnotit stabilitu kvantových teček ve vodném prostředí v závislosti na použitém ligandu a parametrech syntézy. Předpokládaná časová dotace: 4-­‐5 dní Výstup : Výstupem stáže bude závěrečná zpráva o rozsahu cca 10 stran, která bude celkově shrnovat průběh stáže, získané výsledky a jejich diskusi. 6/18
Projekt č. 4 -­‐ Fluorescenční spektroskopie nanostruktur pro medicínu Zadání projektu: Stáž na téma Fluorescenční spektroskopie nanostruktur pro medicínu přinese účastníkovi širší teoretický i praktický přehled o jevu fluorescence a příbuzných fotoluminiscenční jevech, naučí jej prakticky tyto jevy studovat moderní instrumentací a poskytne komplexní náhled na danou problematiku. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích Centra materiálového výzkumu na Fakultě chemické VUT Brno. Student bude absolvovat stáž v Laboratoři fluorescenční spektroskopie po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je červenec. Doporučená literatura: 1. Valeur, B.: Molecular Fluorescence. Weinheim (Federal Republic of Germany) : WILEY-­‐VCH Verlog GmbH 69469, 2002. 399 s. ISBN 3-­‐527-­‐29919-­‐X. 2. Lakowicz, J. R.: Principles of fluorescence spectroscopy. 2006. 3rd. ISBN 978-­‐0387-­‐31278-­‐1. 3. Radeva, T.: Physical chemistry of polyelectrolytes. Marcel Dekker, Inc. 2001, s. 794-­‐796, ISBN 0-­‐
8247-­‐0463-­‐0 4. Gaucher, G., Dufresne, M., Sant, V., Kang, N., Maysinger, D., Leroux, J.: Block copolymer micelles: preparation, characterization and application in drug delivery. Journal of Controlled Release, 2005, č. 109, s. 69-­‐188 5. Hrubý, M., Kučka, J., Kozempel, J., Lebeda, O.: Cílené polymerní nosiče léčiv v terapii nádorových onemocnění. Chemické listy, 2006, č. 100., s. 10-­‐16 Představa o realizaci: Stáž bude rozdělena do třech etap, jedné teoretické a dvou praktických. Obsahem první etapy stáže bude poskytnutí teoretického základu pro následující praktické etapy. Tato etapa je zařazena z důvodu srovnání informační úrovně účastníků. V rámci této teoretické části bude podrobně představena i instrumentace a základy vyhodnocování získaných luminiscenčních spekter jakož i příprava studovaných nanostruktur, jejich rozdělení a vlastnosti. Předpokládaná časová dotace: 4 dny. Následující etapa bude zaměřena na získávání luminiscenčních charakteristik fluoroforů z typických prostředí. Budou zvoleny zástupci polaritních a viskozitních fluorescenčních sond a bude provedena charakterizace jejich luminiscenčních vlastností, která bude zahrnovat měření emisních spekter, excitačních spekter, anisotropie (viskozitní sondy) a doba života v závislosti na změně polarity resp. 7/18
viskozity. Předpokládaná časová dotace 6 dnů. (přístrojové vybavení viz.: http://www.chempoint.cz/fluorescencni-­‐laborator-­‐na-­‐fakulte-­‐chemicke-­‐vut) Poslední etapa bude zahrnovat laboratorní přípravu nanostruktur na bázi micelární koloidů a polymerních micel. Budou zvoleni zástupci kationaktivních, anionaktivních a neionogenních tenzidů, u nichž bude názorně předvedeno využití fluorescenčních sond ve studiu průběhu jejich agregace. Zároveň bude demonstrován vliv interakce těchto struktur se samotnými sondami, což naznačí kritické omezení této metody. Pomocí tzv. polaritních sond bude stanovena polarita micelárního jádra, jako zásadní řídící prvek využití těchto systémů v nanobiotechnologiích. Vliv teploty a iontové síly na tyto struktury bude studován pomocí vybraných viskozitních sond, kterými bude sledována změna viskozity micelárních jader. Poznatky z klasických tenzidů pak budou následně převedeny na systémy polymerních micel. Na interakci mezi polyaniontem (polystyrensulfonátem sodným) a zvoleným kationaktivním tenzidem bude demonstrován vliv formování nanostruktur typově vhodných pro systémy cílené distribuce léčiv. Tato etapa zahrnuje i základní vyhodnocení a interpretaci naměřených dat. Předpokládaná časová dotace 10-­‐15 dnů. Výstup: Výstupem stáže bude závěrečná zpráva o rozsahu cca 10 stran, která bude celkově shrnovat průběh stáže, získané výsledky a jejich zhodnocení. Výstupem bude také seznam použitých chemikálií a drobného laboratorního zařízení. 8/18
Projekt č. 5 -­‐ Syntéza hydrogelů z biopolymerů Zadání projektu: Náplní stáže je syntéza originálních chemických derivátů kyseliny hyaluronové, které jsou vhodnými prekurzory pro přípravu hydrogelů. Součástí stáže je i optimalizace přípravy hydrogelů a základní studium jejich fyzikálních a chemických vlastností, případně jejich stability ve fyziologických podmínkách. Tyto materiály mají potenciální využití v tkáňovém inženýrství, v kosmetice a v medicíně. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři A-­‐207 po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je srpen – září. Doporučená literatura: 1. Huerta-­‐Angeles G.; Chládková D.; Šmejkalová D.; Buffa R., Velebny V.: Synthesis of highly substituted amide Hyaluronan derivatives with tailored degree of substitution and their crosslinking via click chemistry, Carbohydrate polymers, 84, 1293-­‐1300 (2011). 1. Huerta-­‐Angeles G., Chladkova D., Buffa R., Kettou S., Velebny V.: Amphoteric materials based on crosslinked HA, method of preparation thereof, materials containing entrappted active agents, methods of preparation thereof and use of said materials, CZ PV 2011-­‐241 2. Buffa R., Kettou S., Velebný V. at al.: Oxidized derivatives of hyaluronic acid, their preparation and modification, WO2011/069474 3. Buffa R., Kettou S., Velebný V. at al: New method for preparation of oxidized hyaluronane and its modification. WO2011/069475 4. Buffa R., Jiří Běťák, Sofiane Kettou, Martina Hermannová, Lucie Pospíšilová, Vladimír Velebný: A novel DTPA crosslinking of hyaluronic acid and metal complexation thereof. Carbohydrate Research, 346, 1909-­‐15, 2011. Představa o realizaci: Stáž bude rozdělena do tří částí, kde první tvoří teoretické školení a obeznámení se s metodami a postupy používanými v chemické laboratoři. Navazující praktická část se zabývá přípravou a charakterizací hydrogelů. Poslední část tvoří shrnutí výsledku a sepsání krátké závěrečné zprávy. První část stáže bude uskutečněna formou školení, ve kterém se student seznámí s technickým vybavením laboratoře, bezpečnostními předpisy a s metodami používanými při modifikaci biopolymerů a jejich charakterizací pomocí analytických metod. Předpokládaná časová dotace: 1-­‐2 dny 9/18
Hlavní náplní praktické části bude syntéza originálních chemických derivátů kyseliny hyaluronové, které budou vhodnými prekurzory pro přípravu biokompatibilních hydrogelů. V případě úspěchu se bude pokračovat v optimalizaci přípravy hydrogelů a základnímu studiu jejich fyzikálních a chemických vlastností. Charakterizace meziproduktů pomocí spektroskopických metod jako NMR, IČ, UV-­‐Vis … bude probíhat mezi jednotlivými syntézami. Vlastnosti finálních hydrogelů budou charakterizovány měřením jejich reologických vlastností a případně jejich stability ve fyziologických podmínkách. Předpokládaná časová dotace: 14-­‐15 dní Po kompletizaci výsledků bude následovat sepsání závěrečné zprávy, kde budou popsány všechny modifikační reakce a shrnuté trendy pozorované při optimalizaci přípravy hydrogelů v souvislosti s jejich stabilitou a reologickými vlastnostmi. Předpokládaná časová dotace: 3-­‐4 dní Výstup: Výstupem stáže bude závěrečná zpráva o rozsahu cca 10 stran, která bude celkově shrnovat průběh stáže, získané výsledky a jejich diskusi. Výstupem bude také seznam použitých chemikálií a drobného laboratorního zařízení. 10/18
Projekt č. 6 -­‐ Upconversní nanočástice Zadání projektu: Náplní stáže je příprava upkonverzních nanočástic materiálu NaREF4 (RE = Y, Gd, Yb, Er). Účastník získá základní přehled v oblasti moderních nanomateriálů pro diagnostiku, vyzkouší si syntézu nanočástic a jejich charakterizaci pomocí analytických přístrojů. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři A214 po dobu 1 měsíce v celku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je září. Doporučená literatura: 1. M. Haase a H. Schäfer, „Upconverting Nanoparticles“, Angewandte Chemie International Edition, roč. 50, čís. 26, s. 5808-­‐5829, čer 2011. 2. F. Wang et al., „Upconversion nanoparticles in biological labeling, imaging, and therapy“, The Analyst, roč. 135, čís. 8, s. 1839, 2010. 3. N. J. J. Johnson et al., „Size-­‐Tunable, Ultrasmall NaGdF4 Nanoparticles: Insights into Their T1 MRI Contrast Enhancement“, Chem. Mater., roč. 23, čís. 16, s. 3714-­‐3722, 2011. 4. G. Jiang et al., „An Effective Polymer Crosslinking Strategy to Obtain Stable Dispersions of Upconverting NaYF4 Nanoparticles in Buffers and Biological Growth Media for Biolabeling Applications“, Langmuir, 2012. 5. F. Wang et al., „Tuning upconversion through energy migration in core–shell nanoparticles“, Nat Mater, roč. 10, čís. 12, s. 968-­‐973, pro 2011. Představa o realizaci: V první části stáže bude probrán teoretický základ fungování a přípravy upkonverzních nanočástic. Praktická část bude spočívat v přípravě a charakterizaci nanočástic. Pro vybraná témata praktické části bude připraven pracovní postup s krátkou teorií v úvodu. První část stáže bude uskutečněna formou přednášek, ve kterých se student seznámí s problematikou upkonverzních nanočástic a jejich využitím v oblasti optického zobrazování in vitro a in vivo. Dále budou shrnuty hlavní analytické metody vhodné pro charakterizaci těchto nanočástic a na závěr bude představena výzkumná činnost školící laboratoře. Předpokládaná časová dotace: 1-­‐2 dny 11/18
Náplní praktické části bude příprava upkonverzních nanočástic NaREF4 (RE = Y, Gd, Yb, Er) metodou tepelné dekompozice a modifikace povrchu nanočástic s cílem připravit koloid stabilní za fyziologických podmínek. Předpokládaná časová dotace: 10-­‐12 dní Charakterizace nanočástic bude probíhat mezi jednotlivými syntézami. Student si bude moci vyzkoušet měření upkonverzních spekter, stanovení velikosti částic pomocí dynamického rozptylu světla a přípravu vzorků pro stanovení koncentrace částic metodou ICP-­‐OES. Předpokládaná časová dotace: 4-­‐5 dní Výstup : Výstupem stáže bude závěrečná zpráva o rozsahu cca 10 stran, která bude celkově shrnovat průběh stáže, získané výsledky a jejich diskusi.
12/18
Projekt č. 7 -­‐ Biologie plazmidů u rodu Streptococcus Zadání projektu: Vnášení cizorodé DNA do bakteriální buňky se zpravidla začíná enzymatickým vyštěpením genu zájmu a jeho následným vložením do vektoru, nejčastěji do plazmidu. Pro štěpení DNA se využívají enzymy restriktázy, pro následné spojení fragmentů pak ligázy, nejčastěji T4 DNA ligáza. Během procesu spojeni DNA fragmentu s plazmidem dochází ke vzniku směsi produktů, ve které jen malá část představuje vektor se správně orientovaným a vloženým fragmentem. Pro selekci transformantů se používají rozmanité genetické markery, obvykle geny rezistence k antibiotikům. Avšak přítomnost rezistence ještě neznamená, že ligace proběhla úspěšně, protože mohlo dojít k ligaci prázdného vektoru. Pro zjednodušení vytipování správných klonů se často používá systém modro-­‐bílé selekce. Tento systém je založen na plazmidu, nesoucím LacZ gen, který propůjčuje buňce schopnost štěpit chromogenní substrát X-­‐gal (5-­‐bromo-­‐4-­‐chloro-­‐indolyl-­‐β-­‐D-­‐galactopyranoside). Tímto dochází k modrému zabarvení kolonií. Uprostřed sekvence LacZ genu se nachází MCS (angl. multiple cloning site, tedy mnohočetné klonovací místo). Při vložení DNA fragmentu do MCS se sekvence LacZ genu přeruší, buňka již nemůže štěpit X-­‐gal a vytváří bílou kolonii. Takovéto bílé kolonie jsou vybrány pro další práci. Nedostatkem systému modro-­‐bílé selekce je nutnost používat chromogenní substrát X-­‐gal a látku-­‐
induktor IPTG. To vše zvyšuje cenu práce, navíc IPTG je toxická pro bakteriální buňky. Proto navrhujeme systém barevné detekce správných transformantů, který nemá uvedené nedostatky. Místo LacZ genu by byl použít gen vhb (Vitreoscilla hemoglobin). Z tohoto genu se exprimuje bakteriální hemoglobin, který přidává buňkám červeno-­‐oranžovou barvu. Při přerušení sekvence vhb genu, stejně jako pří modro-­‐bíle selekci, se vytváří bílé kolonie. Restrikční místa pro nejčastěji používané endonukleázy budou vytvořena pomocí tichých mutací, to znamená takových, při kterých dojde k substituci báze v tripletu, která nemění aminokyselinu v budoucím bílkovinném řetězci. Cíle projektu jsou: -­‐ vytvořit klonovací vektor s barevným rozlišením transformantů, vhodný pro množení požadovaných fragmentů DNA; -­‐ vytvořit shuttle-­‐vektor s barevným rozlišením transformantů, který je schopen replikace v Escherichia coli a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v laboratoři po dobu 1 měsíce vcelku. Možný termín realizace stáže pro rok 2012 je červenec – září. Doporučená literatura: 1. Suwanwong Y., Kvist M, Isarankura-­‐Na-­‐Ayudhya C., Tansila N., Bulow L., Prachayasittikul V. (2006) Chimeric antibody-­‐binding Vitreoscilla hemoglobin (VHb) mediates redox-­‐catalysis reaction: new insight into the functional role of VHb. Int. J. Biol. Sci., 2. 13/18
2. Isarankura-­‐Na-­‐Ayudhya C., Panpumthong P., Tangkosaku T., Boonpangrak S., Prachayasittiku V. (2008) Shedding light on the role of Vitreoscilla hemoglobin on cellular catabolic regulation by proteomic analysis. Int. J. Biol. Sci. 4. 3. Joshi M., Mande S., Dikshit K.L. (1998) Hemoglobin Biosynthesis in Vitreoscilla stercoraria DW: Cloning, Expression, and Characterization of a New Homolog of a Bacterial Globin Gene. Appl. Environ. Microbiol., 64(6): 2220-­‐2228. Představa o realizaci: In silico silent mutagenesis. PCR. Elektroforéza v agarózovém gelu. Elektroporace. Restrikční štěpení. Ligace. Kultivace mikroorganismů na pevných a tekutých mediích. Výstup: Závěrečná zpráva (doporučeno min. 10 stran), seznam použitých chemikálií a drobného laboratorního zařízení. 14/18
Projekt č. 8 -­‐ Moderní postupy u fermentace Basidiomycet Zadání projektu: Cílem stáže „Moderní postupy fermentace Basidiomycet“ je naučit studenta teoretické i praktické aspekty submersní kultivace Basidiomycet a rozšířit přehled možností využití vyšších hub (Macrofungi) v biotechnologii. Student bude mít možnost seznámit se s moderním fermentačním zařízením, nastudovat postupy práce s vyššími houbami a vyzkoušet si různé strategie submersních kultivací. Termín realizace stáže: Stáž bude realizovaná v laboratořích společnosti Contipro Group. Student bude absolvovat stáž v biotechnologické laboratoři po dobu 1 měsíce. Termín realizace stáže pro rok 2012 je plánován na období červenec – srpen. Doporučená literatura: 1. Fazenda M.L., Seviour R., McNeil B., Harvey L.M. 2008. Submerged Culture. Fermentation of ‘‘Higher Fungi’’: The Macrofungi. Advances in Applied Microbiology, V. 63. P. 33-­‐103. 2. Kim H.M., Paik S.Y., Ra K.S., Koo K.B., Yun J.W., Choi J.W. 2006. Enhanced production of exopolysacharides by fed-­‐batch culture of Ganoderma resinaceum DG-­‐6556. The Journal of Microbiology. P.233-­‐242. 3. Lee K.M., Lee S.Y., Lee H.Y. 1999. Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-­‐lift fermentor. Journal of bioscience and bioengineering. V. 88 (6). P.646-­‐650. 4. Tang Y.J., Zhong J.J.. 2002. Fed-­‐batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid, Enzyme Microb. Technol. V.31. P. 20–
28. 5. Tang Y.J., Zhu L.W., Li H.M., Li D.S. 2007. Submerged Culture of Mushrooms in Bioreactors – Challenges, Current State-­‐of-­‐the-­‐Art, and Future Prospects. Food Technol. Biotechnol. V.45 (3). P. 221–229. 6. Xiang Zou. 2006. Fed-­‐batch fermentation for hyperproduction of polysaccharide and ergosterol by medicinal mushroom Agaricus brasiliensis. Process Biochemistry. V.41. P. 970–
974. Představa o realizaci: Praktická část stáže bude realizovaná na fermentačním zařízení INFORS AG (Švýcarsko). Jako testovací kultura bude používána vyšší houba Schizophyllum commune. Z důvodu časové náročnosti práce s basidiomycetami bude stáž rozdělena do čtyř etap a naplánována následujícím způsobem: 15/18
•
Obsahem první etapy stáže bude poskytnutí teoretického a praktického základu uchovávání kmenů a přípravy inokul pro zahájení submersní kultivace. Student se naučí principům manipulace se zařízením a přípravě fermentoru (kalibrace sond, čerpadel, sterilizace „in situ“, apod.). Předpokládaná časová dotace: 2-­‐3 dny. •
V rámci následující etapy bude provedena „batch“ kultivace S. commune, během které budou monitorovány charakteristické parametry procesu: změna pH, pO2, narůst mycelia, morfologie pelet, produkce metabolitů, spotřeba zdroje uhlíku, apod. Předpokládaná časová dotace: 4-­‐5 dnů. •
Třetí etapa bude věnována kultivační strategii – „two-­‐stage“ kultivaci. Na základě výsledků, získaných v „batch“ kultivaci bude vybrán klíčový parametr a naplánován design fermentací. Předpokládaná časová dotace: 4-­‐5 dnů. •
V poslední etapě bude zahájena „fed-­‐batch“ fermentace, budou analyzovány a zhodnoceny získané výsledky, porovnány mezi sebou a otestovány fermentační strategie a připravena závěrečná zpráva. Předpokládaná časová dotace: 7-­‐10 dnů. Výstup : Výstupem stáže bude závěrečná zpráva o rozsahu cca 10 stran, která bude celkově shrnovat průběh stáže, získané výsledky a jejich zhodnocení. Výstupem bude také seznam použitých chemikálií a drobného laboratorního zařízení. 16/18
Projekt č. 9 -­‐ Terapeutické užití blokujících RNA Zadání projektu: Anotace projektu Kyselina hyaluronová (dále jen HA) v organismu uplatňuje nejen svoje fyzikální vlastnosti tím, že slouží jako hydratační složka tkáně, lubrikant a podporuje viskoelasticitu tkáně, ale je také velmi často spojována s regulací významných buněčných procesů jako je embryogeneze, diferenciace či migrace buněk. HA je významnou komponentou extracelulární matrix (dále jen ECM). Buňky epitelu a pojivové tkáně ji používají jako kostru pro umístění a uchycení v tkáni a zároveň jako oporu při migraci tkání. HA je těmito buňkami rozpoznávána specificky pomocí receptorů. Majoritním a nejvíce prozkoumaným receptorem buněk pro HA je CD44. Receptor CD44 je napojen na několik signálních drah, což podporuje roli HA jako signální molekuly. Jedním z buněčných procesů, který HA může ovlivňovat, je migrace buněk. Migrace buněk je nezbytná během jak fyziologických pochodů (embryogeneze, vývoj tkání), tak během patologických stavů jako je hojení rány. Během hojení rány je migrace dermálních fibroblastů z neporušené tkáně do místa defektu nutná pro reparaci poškozené tkáně. Migrace fibroblastů je stimulována prvotně cytokiny a růstovými faktory, avšak podpora migrace vlivem interakce s ECM, konkrétně s HA, je také předpokládána. Cíl projektu Cílem stáže bude připravit primokultury kožních fibroblastů (dále jen NHDF) s dočasně blokovanou expresí receptoru CD44. Takto upravené buňky budou použity jako kontrola v pokusech studující vliv HA na migraci fibroblastů in vitro (scratch assay). Termín realizace stáže: Stáž bude realizována v září 2012. Doporučená literatura: 1. Turley EA, Noble PWBourguignon LY (2002). Signaling properties of hyaluronan receptors. J Biol Chem. 277: 4589-­‐4592. 2. Singer AJ and Clark RA (1999). Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341: 738-­‐746. 3. Chen WY and Abatangelo G (1999). Functions of hyaluronan in wound repair. Wound Repair Regen. 7: 79-­‐89. 4. Naor D, Nedvetzki S, Golan I, et al (2002). CD44 in cancer. Crit Rev Clin Lab Sci. 39: 527-­‐579. 5. Lauffenburger DA and Horwitz AF (1996). Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84: 359-­‐369. 6. Bustin SA (2004). A-­‐Z Quantitative PCR. International University Line, La Jolla CA 92038-­‐2525, USA. 17/18
7. Paddison PJ, et al (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-­‐specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16: 948-­‐958. 8. Ui-­‐Tei K, et al (2004). Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 32: 936-­‐948. Představa o realizaci: 3. -­‐ 7. 9. 2012: první dva dny – seznámení se s laboratorním prostředím a vybavením, bezpečností práce a zásadami laboratorní práce v holdingu Contipro; čtení literatury další tři dny – detailní naplánování pokusu, zahájení práce v laboratoři, příprava buněk • Okamžité zahájení pokusu vyžaduje objednání všech potřebných chemikálií a materiálu v předstihu, aby byly k dispozici. Pokud by byl zájem ze strany stážisty, může si problematiku nastudovat předem a může pomáhat s výběrem a koupí chemikálií a materiálu. 10. – 27. 9. 2012: transfekce buněk • příprava buněk podle standardních postupů zavedených v holdingu Contipro • transfekce buněk podle návodu od výrobce transfekčního činidla ověření úspěšnosti blokace exprese CD44 • pomocí metody qPCR – změna v expresi mRNA pro CD44 • pomocí metody flow cytometry – změna v produkci proteinu CD44 vyhodnocování dat • pomocí softwarů příslušných přístrojů • statistické vyhodnocení pomocí programu Statistika 10 (předpokládá se alespoň 5 biologických opakování) sepisování výsledků do závěrečné zprávy Výstup: Výstupem bude závěrečná zpráva z pokusu psaná v anglickém jazyce a skládající se z kapitol: 1) Literární úvod; 2) Metody a materiály; 3) Výsledky; 4) Diskuse; 5) Závěr; 6) Seznam zkratek; 7) Seznam použité literatury. 18/18