detekce a kvantifikace gm potravin

DETEKCE A KVANTIFIKACE GM POTRAVIN
Eva Bergerová 1, Zuzana Godálová 2, Peter Siekel 1
1 Výskumný
2
Abstrakt :
ústav potravinársky, Priemyselná 4, 820 06 Bratislava 2
Prírodovedecká fakulta UK, Mlynská dolina 4, 842 15 Bratislava 4
[email protected]
Produkce a studium GM organismů je intenzivně se vyvíjející oblastí, přičemž jejich zavádění do životního prostředí, pěstování,
distribuce a vlastní využití nejen v potravinářské výrobě podléhá řadě omezení a vládních nařízení. Proto je nezbytný a i legislativně
požadovaný, spolehlivý systém detekce a kvantifikace GMO v potravinách, potravinářských surovinách, krmivech a rovněž je kladen
velký důraz značit GM produkty (Regulation (EC) N° 1830/2003). Na určení relativní kvantifikace jsme použili jako modelový
organismus modifikované vzorky kukuřice NK 603, MON810 a RoundupReady sóje (RRsója). Kvantifikaci jsme uskutečnili pomocí
metody Real-time PCR (obr.2). Při zavádění metod pro relativní kvantifikaci GMO jsme optimalizovali vhodné podmínky pro jednotlivé
vzorky. Připravené vzorky s různým obsahem transgenu jsme použili v dalších experimentech založených na sledování degradačních
účinků DNA.
Metody a
Obr. 1 Konstrukt genu epsps RRsóje (Holst - Jensen, 2001).
• referenční materiál x analyzovaná vzorek
Výstup Real.time PCR záznamu
Kinetiku tepelné degradace DNA jednotlivých vzorků a stupeň degradace
Výsledky :
DNA v závislosti od tepelné úpravy jsme sledovali pomocí amplifikace
TRESHOLD CYKLUS
FLUORESCENCE
PCR produktů různých velikostí a následně vzorky analyzovali v 1,5 – 2%
agarózovém gelu. Detekovali jsme jednoltivé fragmenty DNA genu RR
sóje i GM kukuřic. Jako kontrolu degradace DNA jsme použili endodgen
(lektin, ADH2 HMG gen)., obr. 3,4,5.
Počet cyklů
Obr.5 Detekce PCR fragmentů transgenu epsps RR sóje (14%) po tepelné degradaci
při teplotě 200 ºC
Dráha č. 1. standard mol. hmotnosti 50 bp, 2. DNA fragment transgenu (620 bp) –
nepečená mouka, 3. DNA fragment transgenu (620 bp) – pečený chleba, 4. DNA fragment
transgenu (620 bp) – horní část chleba, 5. DNA fragment transgenu (620 bp) – střední část
chleba, 6. DNA fragment transgenu (620 bp) – spodní část chleba, 7. negativní kontrola
pro transgen 96% RR sóje (620 bp), 8. DNA fragment transgenu (1101 bp) – nepečená
mouka, 9. DNA fragment transgenu (1101 bp) – pečený chleba, 10. DNA fragment
transgenu (1101 bp) – horní část chleba, 11. DNA fragment transgenu (1101 bp) – střední
část chleba, 12. DNA fragment transgenu (1101 bp) – spodní část chleba, 13. neg.
kontrola pro transgen RR sóje (1101bp), 14. standard mol. hmotnosti 100 bp
Počet kopií
Obr2. A.Výstup Real-Time PCR záznamu pro kvantifikaci RR sóje (23%) pro epsps gen .
B. Kalibrační křivka kvantifikace RR sóje (23%) pro epsps gen.
Tab.1 Vyhodnocení max. času amplifikace DNA fragmentů lektinového genu sóje
Detekovali jsme fragment DNA genu epsps RR sóje (obr.1)
s velikostí 286 bp do 225 min po sušení při 100 ºC. Jako kontrolu
degradace DNA jsme použili druhově specifický referenční gen
(např. lektinový gen). Teplota 200 °C při delším časovém působení
redukovala velikost větších fragmentů DNA (tab.1).
Obr. 3 a 4 Degradace DNA sóje vařené při 100°C (vlevo), 200°C (vpravo) v závislosti na čase. 1. dráha
standard mol. hmotnosti 250 bp, 2. 0 min, 3. 7 min, 4. 15 min, 5. 30 min, 6. 45 min, 7. 60 min, 8. 90 min, 9. 120
min, 10. 150 min, 11. 225 min
V případě tepelně zpracovaných vzorků: var a pečení při různých
teplotách jsme zjistili, že teplota 200ºC významně redukovala DNA (obr.
4, tab 1), na rozdíl od teploty 100 ºC, kde se DNA ještě nedegradovala
(obr. 3) nebo degradovala až po delším časovém působení. Podobné
výsledky jsme získali i u vzorků kukuřic. Prokazatelná degradace nastala
u velkého DNA fragmentu (1101 bp) transgenu v pečené mouce a ve
vrchní části sojového bochníku, kvůli největšímu vlivu tepla, podobně
jako v případě kukuřice MON810 a NK603, obr. 5.
Jako referenční geny jsme využili geny, které se přirozeně vyskytují v
rostlinném genomu (lektinový pro sóju, ADH2-alkoholdehydrogenázový a
HMG-highmobilitygroup gen pro kukuřice). Jako specifické geny jsme
použili geny s cílenou genetickou modifikací (CP4 epsps pro sóju a pro
NK603 kukuřici a cry1A(b) pro MON810. Na základě počtu kopií
referenčního a specifického genu jsme určili procento GM složky
v potravině. Dále jsme sledovali vliv teploty na kvantitu transgenní složky
v laboratorně připravených vzorcích obsahující určitý
hmotnostní podíl
modifikované mouky. Degradaci transgenní DNA jsme zaznamenali v
pečeném vzorku v horní a spodní části. Vzorky s nižší modifikací 14 %
a 0,8 % GM byly fragmentované ve vzorcích mouky pečené 45 minut
a převážně ve spodní a vrchní časti sojového chleba, podobně jako
v případě kukuřice MON810 (tab. 2,3).
Závěr :
Tab. 2, 3 Přehled kvantifikace sojových vzorků (vlevo) a vzorků kukřice MON810 (vpravo)
• Na detekci a kvantifikaci GMO v potravinách jsme vypracovali metody PCR využívající analýzu izolované DNA. Vybrali jsme certifikované standardní materiály: Roundup ready™ sóje a kukuřice NK603 a MON810, ze kterých se izolovala DNA a
navrhly se vhodné Real-time PCR postupy na identifikaci referenčních materiálů stejně jako pro specifický vzorek RR sóje a kukuřice NK603 a MON810. Pomocí Real – time PCR jsme určili a ověřili daná procenta modifikací jak pro RR sóju, tak i
pro kukuřici NK603 a MON810. Vysoká citlivost RT- PCR umožňuje detekci DNA o velmi nízké koncentraci a malém počtu kopií cílové DNA. PCR produkt nemusí byt následně analyzován, čímž se předejde možné kontaminaci (Miraglia a kol.2004).
• V případě sledování vlivu tepla na kvantifikaci a degradaci GMO jsme zjistili, že degradace nastala u velkého DNA fragmentu (1101 bp) transgenu sóje v pečené mouce a ve vrchní části sojového bochníku, kvůli největšímu vlivu tepla, podobně jako
v případě kukuřice MON810 a NK603. Vyšší teploty (200°C) významě redukují DNA. Domníváme se proto, že tepelně indukovaná fragmentace se projevuje stejně v transgenní i v kterékoliv jiné oblasti DNA, což redukuje možnost přenosu
genetické informace z potravin na jiné organizmy v prostředí.
REFERENCE : Regulation (EC) No 1830/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified organisms and the traceability of food and feed products produced from genetically modified organisms and amending Directive 2001/18/EC. Official Journal L, 2003, 268 P, 24–28. HOLST-JENSEN, A.
2001. GMO detection using PCR. National Veterinary Institute, Section of Food and Feed Microbilogy. MIRAGLIAA, M., BERDALB, K.G., BRERAA, C., CORBISIERC, P., HOLST-JENSEN, A., KOKD, E.J., MARVIND H.J.P., SCHIMMELC, H., RENTSCHE J., VAN RIED J.P.P.F., ZAGONF, J, 2004. Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production
chain. Food and Chemical Toxicology 42: 1157–1180.