Bakterie 1

Barvení mikroorganismů; imerzní mikroskopie
(teoretický úvod)
Barvení mikroorganismů
Pro barvení mikroorganismů se použivají zředěné vodné roztoky organických barviv :
1. Bazická barviva (soli, v nichž je barevnou složkou kationt) - např. krystalová violeť, genciánová
violeť, methylénová modř, safranin, zásaditý fuchsin, vesuvin, malachitová zeleň. Používají se
pro barvení bakterií nebo jader eukaryotických buněk.
2. Kyselá barviva (soli, v nichž je barevnou složkou aniont) - např. kyselina pikrová, eosin.
Používají se pouze pro vybarvení cytoplazmy eukaryotních organismů.
Intenzitu vybarvení bazickými barvivy zvyšuje zásaditá reakce prostředí, u kyselých barviv pak kyselá
reakce prostředí.
Některé chemické sloučeniny (např. fenol, anilin, kyselina chromová, tanin, Lugolův roztok)
způsobují sytější a lepší vybarvení objektů - při používání těchto sloučenin hovoříme o moření.
Barvící metody podle účelu :
Jednoduché barvení - používáme jej, pokud potřebujeme rozlišit tvar buněk (např. cvičení Bakterie mléčného kvašení)
Diferenciační barvení - slouží k rozlišení jednotlivých morfologických útvarů buňky
prokaryotické i eukaryotické (př. jádro, spóry, vakuoly apod.) nebo chemických složek buňky
(škrob, glykogen, tukové kapénky apod.)
Diagnostické barvení - slouží jako jedna z metod při klasifikaci mikroorganismů. Nejpoužívanější
je Gramovo barvení bakterií.
Negativní barvení - používáme v případě, kdy potřebujeme zjistit nejen tvar ale i velikost buněk.
Při běžných metodách barvení jednotlivé kroky postupu mohou velikost buněk výrazně měnit
(např. fixace, působení chemikálií barviv). Při negativním barvení je barveno pouze pozadí, nikoli
buňky. Buňky pak pozorujeme jako světlé útvary, které jsou patrné na barevně odlišeném pozadí.
Pozn. Pro přípravu preparátů se používají čistá, odmaštěná podložní sklíčka (tuk odstraníme xylenem
nebo benzenem nebo chromsírovou směsí; po řádném opláchnutí je vkládáme do odmašťovacích
roztoků na několik hodin, potom ponoříme do ethanolu a následně opláchneme destilovanou vodou,
usušíme a vyleštíme hadříkem) před použitím se sklíčko vždy ožehne z obou stran v plameni kahanu.
Pro přípravu většiny barvených preparátů (zvláště barvení bakterií) je třeba objekty fixovat.
Účelem fixace je usmrcení buněk (mrtvé buňky snáze přijímají barvivo) a lepší přilnutí buněk
k podkladu, aby nebyly při barvení či oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji
plamenem, kvasinky a plísně většinou chemikáliemi (aceton, ethanol) neboť plamen výrazně
mění jejich tvar. Fixace kvasinek a plísní se používá jen při některých speciálních barvících
technikách. Není-li v návodu uvedeno, neprovádí se.
Fixace plamenem - na plamenem protažené sklíčko přeneseme bakteriologickým očkem
kulturu a provedeme nátěr (rezetřeme na plochu cca 2 cm2. Necháme na vzduchu oschnout.
Pak sklíčko (nátěrem vzhůru) několikrát protáhneme plamenem kahanu a po vychladnutí
barvíme.
Imerzní mikroskopie
Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají
velmi malé rozměry. Užívá se pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný
objekt se dává imerzní olej (oleum cedri = cedrový olej) - kapalina, jejíž index lomu je stejný jako
index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných objektů získáme věrný obraz.
U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku
kondenzoru a sklíčko).
Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem
(označen jedním, častěji dvěmi černými proužky).
Postup :
1. Na obarvený suchý preparát bez krycího sklíčka kápneme kapku cedrového oleje
2. Preparát umístíme na stolek mikroskopu, zvolíme imerzní objektiv
3. Opatrně přibližejeme objektiv, až čočku namočíme do kapky oleje (sledujeme ze strany, pozor na
proražení sklíčka)
4. Za pohlížení do okuláru velmi pomalu mikrošroubem oddalujeme objektiv. Sloupec kapaliny oleje
mezi sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jsme objektiv příliš oddálili, postup opakujeme
(nikdy nepřibližujeme objektiv při pohlížení do okuláru, vždy kontrolujeme pohledem z boku).
5. Po skončení pozorování omyjeme objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem
ethanolu. Stejně tak i sklíčko.
Pokud prohlížíme s imerzí trvalé preparáty, dáváme imerzní olej na krycí sklo trvalého preparátu. Při
omývání oleje z preparátu postupujeme opatrně, abychom trvalý preparát neznehodnotili.
Nejčastější chyby :
Nedostatečné osvětlení zorného pole (pracujeme s velkým zvětšením, kondenzor musí být v
maximální horní poloze)
Příliš „hrubé“ zaostřování - zaostřování makrošroubem, či příliš rychle mikrošroubem, zaostření
objektu naše oko nepostřehne. Postup je třeba trpělivě opakovat.
Pozor ! ! ! Nezapomínejte zvolit správnýobjektiv - černými proužky označený imerzní objektiv
Literatura :
Šilhánková, L. a kol : Návody pro laboratoře z mikrobiologie; SNTL Praha 1985
Praktické cvičení – Bakterie 1
Náležitosti protokolu z praktického cvičení:
1. Číslo protokolu, jméno zpracovatele, datum
2. Téma
3. Materiál a pomůcky (vč. literatury nebo internetových zdrojů, které užíváte)
4. Vypracování: popis postupu, obrázky (kreslíme tužkou) s popisem (pokud jde o
mikroskopické preparáty nezapomeňte psát zvětšení, při kterém pozorujete), zjištění.
Pokud je v protokolu víc dílčích úkolů, část vypracování se provádí u každého zvlášť
5. Závěr: shrnutí, zhodnocení výsledků, příp. odpovědi na otázky pokud jsou v zadání
nějaké položeny.
Pozn. z tématu bakterie odevzdá každý student jeden souborný protokol. K jednotlivým úkolům
píše data pozorování.
Úkol č. 1 - Pohyblivé bakterie z močůvky
K přípravě preparátu
použijte vzorek z jemné blanky, která se vytvoří na povrchu zředěné
močůvky; odeberte kapátkem, přikryjte krycím sklíčkem.
Povrchovou blanku tvoří vesměs jen šroubovitě vinuté baktérie spirily. Preparát mikroskopujte při
velkém zvětšení a zaostřujte hlavně na okraj kapky, kam se baktérie stahují.
Z j i š t ě n í: V preparátu je možno pozorovat aktivní pohyb baktérií Spirillum volutans; běžná
baktérie odpadových vod znečištěných organickými zbytky se
pohybuje v kapce pomocí bičíků - viz obrázek.
Jaký význam mají bakterie v močůvce?
Vyhledej na internetu název některé z dalších bakterií,
které mají v přírodě podobný význam jako Spirillum
volutans.
Je tato bakterie nějak prospěšná i člověku?
Úkol č. 2 Negativní barvení bakterií z močůvky
Provedení :
Na odmaštěné podložní sklo kápneme malé množství tuše
zředěné destilovanou vodou 1:2. V této kapce dobře rozmícháme
malé množství bakterií. Hranou dalšího podložního skla
rozetřeme suspenzi po celé ploše a necháme volně na vzduchu
zaschnout.NEFIXUJEME!
Pozorujeme pod imerzí při zvětšení 1000x
Výsledek: zapíšeme a zakreslíme do protokolu