AAA400 chemická část

Transkript

INGOS s.r.o
AUTOMATICKÝ ANALYZÁTOR
AMINOKYSELIN
AAA 400
Návod k obsluze chemická èást
PRAHA
11. dubna 2006
Výrobce
:
INGOS s.r.o divize laboratorních přístrojů
Vývoj a konstrukce
Chemický systém
:
:
PiKRON s.r.o
V. Havlíček - ZMBD chemik
Dodavatel a servis
:
INGOS s.r.o
K Nouzovu 2090
14316 PRAHA 4
(c) INGOS 2006
Tel: +420 296 781 683
+420 296 781 692
Fax: +420 244 403 051
e-mail:[email protected]
ÚVOD
CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA
PØÍPRAVA VZORKÙ
BIOGENNÍ AMINY
VZOROVÉ ANALÝZY
OBSAH
1
2
3
4
5
6
1
1. ÚVOD
1.1 Úèel publikace
Tato příručka je určena pracovníkům, kteří se zabývají obsluhou automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400. Byla vypracována jako pomůcka začínajícím obsluhám a
začátečníkům v oboru ionexové chromatografie. Usnadňuje pochopit princip přístroje jako
celku i jeho jednotlivých částí. Pochopení a osvojení všech činností, spojených s provozem přístroje,je základním předpokladem jeho správného využití a jeho bezporuchového
chodu. Úvodní kapitoly poslouží jako pomůcka.
1.2 Základní chemická problematika aminokyselin.
1.2.1 Aminokyseliny
Aminokyseliny jsou organické sloučeniny obsahující jak aminovou skupinu, tak i skupinu karboxylovou. Většina aminokyselin má obecnou strukturu, ve které primární aminy
a skupina karboxylové kyseliny jsou připojeny k jednomu atomu uhlíku.
Další vazba tohoto uhlíku váže atom vodíku a čtvrtá vazba s připojenou skupinou
určuje vlastnosti každé aminokyseliny. Tento postraní řetězec také přispívá ke specifickému rozdělení nábojů jednotlivých aminokyselin. Struktury vedlejších řetězců a běžné
názvosloví nejdůležitějších aminokyselin a ninhydrin pozitivních látek jsou uvedeny v
následující tabulce.
název
()2,6-amino
pimelová kyselina
zkr.
MW
Dpm
190.20
strukturní vzorec
O
O
OH
HO
NH2
NH2
alanin
2-amino propionová
kyselina
Ala
89,09
O
OH
NH2
Tab.1 Přehled aminokyselin
INGOS s.r.o.
Strana 4
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
název
zkr.
MW
alfa amino adipová
kyselina
Aad
161,16
O
HO
OH
O
alfa amino-n-máselná
kyselina
1
strukturní vzorec
Abu
NH2
103,12
O
OH
NH2
gama amino-n-máselná
kyselina
gAbu 103,12
O
H2N
beta amino isomáselná kyselina
OH
BAIBA 103,12
O
H2N
asparagová kyselina
2-amino jantarová
kyselina
Asp
OH
133,10
O
HO
OH
O
asparagin
2- amino 3-karbamylpropionová kyselina
Asn
132,12
O
H2N
OH
O
arginin
2-amino 5-guanidinovalerová kyselina
NH2
Arg
174,20
NH
H2N
N
H
NH2
O
OH
NH2
INGOS s.r.o.
Strana 5
AAA400
název
alfa amino-beta guanidino propionová
kyselina
citrullin
2-amino -5-ureidovalerová kyselina
cystathionin
3 thio di 2 amino
propionová kyselina
Kapitola 1: ÚVOD
zkr.
MW
AGPA 146,15
O
NH
175,19
O
H2N
Cysta 208,24
Cys
NH2
O
N
H
HO
OH
NH2
O
O
OH
S
H2N
cystein
2-amino -3-merkapto
OH
N
H
H2N
Cit
1
strukturní vzorec
121,16
NH2
O
HS
OH
NH2
cysteová kyselina
2-amino-3-sulfopropionová kyselina
Cya
169,16
O
O
HO
cystin
2-amino-3-merkaptopropionová kyselina
240,30
OH
S
O
NH2
HO
OH
O O
H2N
NH2
S S
ethanolamin
2-amino ethanol
EA
61,08
H2N
OH
INGOS s.r.o.
Strana 6
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
název
zkr.
MW
fenylalanin
2-amino-3-fenylpropionová kyselina
Phe
165,19
1
strukturní vzorec
O
OH
NH2
glutamová kyselina
2-aminoglutarová
kyselina
Glu
147,13
O
O
HO
OH
NH2
glutamin
2-amino-4-karbamoylmáselná kyselina
Gln
146,15
O
O
H2N
OH
NH2
glycin
glykol,aminooctová
kyselina
Gly
75.07
O
H2N
histidin
2-amino-3-(4-imidazolyl)propionová
kyselina
His
homoserin
2-amino-4-hydroxy
máselná kyselina
Hse
OH
155,16
O
OH
HN
N
119,12
NH2
O
HO
OH
NH2
homocystein
2amino-4 mercapto
máselná kyselina
Hcy
135,19
O
HS
OH
NH2
INGOS s.r.o.
Strana 7
AAA400
název
hydroxy prolin
4-hydroxypyrolidin2-karboxylová kys.
Kapitola 1: ÚVOD
zkr.
MW
HO
4Hyp 131,13
N
H
isoleucin
2-amino 3-methylvalerová kyselina
Ile
1
strukturní vzorec
131,18
OH
O
O
OH
NH2
leucin
2-amino-5-methylvalerová kyselina
Leu
131,18
O
OH
NH2
lysin
(2,6-diaminokapronová kyselina)
Lys
146,19
O
H2N
OH
NH2
methionin
2-amino-4-methylthio máselná kys.
Met
149,21
O
S
OH
NH2
1 methyl histidin
2-amino 3-(imidazol)1-methyl di azol
octová kyselina
1mHis 169,18
3 methyl histidin
2-amino 3-(imidazol)3-methyl di azol
octová kyselina
3mHis 169,18
O
OH
N
N
NH2
O
OH
N
N
NH2
INGOS s.r.o.
Strana 8
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
název
zkr.
MW
norleucin
2-amino kapronová
kyselina
Ahx
131,18
1
strukturní vzorec
O
OH
NH2
norvalin
2 amino valerová
kyselina
Ape
117,15
O
OH
NH2
ornithin
2,5 diaminovalerová
kyselina
Orn
132,16
O
H2N
OH
NH2
prolin
pyrolidin -alfa
karbonová kyselina
serin
2-amino-3-hydroxypropionová kyselina
Pro
115,13
OH
N
H
Ser
O
105,09
O
HO
OH
NH2
taurin
2-aminoethansulfonová kyselina
threonin
2-amino-3-hydroxymáselná kyselina
Tau
125,14
O
S
H2N
Thr
119,12
OH
O
OH
O
OH
NH2
INGOS s.r.o.
Strana 9
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
název
zkr.
MW
strukturní vzorec
tryptofan
2-amino-3-(3-indolyl)
Trp
204,23
O
OH
NH2
N
H
tyrosin
2-amino-3-(4hydroxyfenyl propionová
kyselina
Tyr
valin
(2-aminoisovalerová
kyselina)
Val
181,19
O
OH
NH2
HO
117,15
O
OH
NH2
1.2.2 Výskyt aminokyselin
Aminokyseliny se vyskytují v přírodě bud ve volném stavu nebo jako polymerované
řetězce nazývané peptidy nebo proteiny, které mohou být spojeny s nejrůznějšími substráty jako např. uhlohydráty, lipidy a.p. Všechny tyto aminokyseliny, po vhodné úpravě
vzorku, je možno analyzovat chromatografickými metodami. Peptidy jsou polymerické
řetězce aminokyselin.Peptidické vazby se vytvářejí kondenzací alfa aminoskupiny jedné
aminokyseliny a alfa karboxylové skupiny druhé aminokyseliny.
!"
Vazba dvou aminokyselin tvoří dipeptidy, tří aminokyselin tripeptidy a více aminokyselin polypeptidy. Protein je dlouhý polypeptid, obsahující přibližně 20 zbytků aminokyselin, má obvykle specifickou biologickou funkci (na př. enzym). Analýza složení aminokyselin v peptidu nebo proteinu se provádí po hydrolýze peptidických vazeb. Spojením
aminokyselin s jinými substráty je možno vytvořit mnoho derivátů. Tyto dvě skupiny,
t.j. aminokyseliny a substráty, se často analyzují odděleně po hydrolýze konjugátu.
INGOS s.r.o.
Strana 10
1
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
1.2.3 Historie analýzy aminokyselin
Stanford Moore a William Stein věnovali mnoho času separaci aminokyselin. Když
v roce 1958 publikovali, společně se Spackmanem, popis prvého automatického analyzátoru pro kvantitativní i kvalitativní stanovení ninhydrin pozitivních látek, uzavřeli tím
jednu dlouhou etapu v biochemické analýze.V roce 1972 obdrželi Nobelovu cenu. Od roku
1958 se mnoho autorů zabývalo zdokonalením analýzy aminokyselin, byla provedena řada
zlepšení, avšak žádné z nich nebylo zásadní. Náš přístroj pracuje na tradičním principu
Moora a Steina s ninhydrinovou detekcí.
V poslední době je ve značné oblibě HPLC. U těch pracovníků, kteří nejsou dobře
obeznámeni s posledními trendy vývoje stanovení aminokyselin mohou, proto některé
nově používané metody vyvolat zmatek. Stanovení aminokyselin pomocí HPLC přináší
řadu problémů a nedostatků proti dnes již klasickému stanovení podle Moora a Steina.
Tím je možno vysvětlit pomalé pronikání HPLC do běžných provozních aplikací.
Pro HPLC se vyžadují většinou naprosto čisté vzorky bez zákalů a p.,jinak se zničí
drahá náplň analytické kolony, problémová bývá i derivatizace aminokyselin, odstraňování
přebytečného činidla, nutnost používat velice čistých elučních roztoků atd. Nesnadné
bývá i rozdělení složitých směsí. Tyto problémy u klasické ionexové chromatografie s
ninhydrinovou detekcí odpadají.
Vzhledem k tomu, že celý proces stanovení aminokyselin je zcela automatizován,
předčí svými parametry HPLC co do spolehlivosti i přesnosti stanovení.
1.2.4 Reakce ninhydrinu s aminokyselinami
Reakci ninhydrinu (indantrionového hydrátu) s aminokyselinami a iminokyselinami
lze znázornit takto:
Reakce NHD s primárními aminokyselinami
!#" $
%
& '%
(
Reakce NHD se sekundárními aminokyselinami (iminokyselinami)
!
Ninhydrin je silné oxidační činidlo, které reaguje s alfa aminoskupinami, uvolňuje
amoniak, oxid uhličitý, aldehyd a redukovanou formu ninhydrinu hydrindantin. Uvolněný
amoniak pak reaguje s hydrindantinem a další molekulou ninhydrinu a dává purpurovou
INGOS s.r.o.
Strana 11
1
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
substanci (Ruhemanova červeň). Hydrindantin přítomný v detekčním činidle zabraňuje
vedlejší reakci, která by redukovala vznikající Ruhemanovu červeň. Sekundární aminokyseliny vytvářejí různé chromofory.
1.2.5 Detekce
Ruhemanova červeň má absorbční maximum při 570 nm.Tato absorbance je lineární funkcí množství přítomných alfa aminoskupin. Reakce je vhodným základem pro
stanovení všech organických sloučenin obsahujících aminokyseliny. Reakce nihydrinu se
sekundárními aminokyselinami má absorbční maximum při 440 nm. Měření při vlnových
délkách pod 440 nm dává příliš velkou doplňkovou absorbanci z nezreagovaného ninhydrinu.
1.3 Iontomìnièová chromatograe aminokyselin
1.3.1 Struèná teorie iontomìnièové chromatograe.
Aminokyseliny je možno oddělovat chromatografií založenou na výměně iontů. Chromatografická kolona je naplněna pryskyřicí s negativním nábojem a aminokyseliny jsou
na kolonu zaváděny při nízkém pH. Tím jsou všechny kladně nabity. Za těchto podmínek
nenastane chromatografické dělení. Aminokyseliny čekají na počátku kolony na změnu
podmínek. Při zvýšeném pH, zvýšené teplotě nebo vyšší iontové síle elučního roztoku
dojde k dosažení izoelektrického bodu aminokyseliny.
Tehdy ztrácí přitažlivost svých iontů k pryskyřici a aminokyselina je eluována z kolony. Izoelektrický bod molekuly je definován jako pH, při kterém molekuly v roztoku
nenesou žádný náboj. Izoelektrický bod aminokyselin je funkcí pK hodnot ionizovatelných skupin v molekule. Podmínky jsou upraveny tak, že izoelektrické body, pro všechny
aminokyseliny, se dosahují v různých časech. To umožňuje provést chromatografické dělení. Jako příklad uvedeme kyselinu asparagovou.
Podíváme-li se na výše uvedenou rovnici kyseliny asparagové, vidíme, že při pH 1
mají v zásadě všechny molekuly jeden kladný náboj. Při vzrůstajícím pH, bude mít stále
větší počet molekul na alfa karboxylové skupině negativní náboj, až při pH 2,8 jej budou
mít všechny. To je izoelektrický bod. Karboxylová skupina v postranním řetězci je méně
kyselá než alfa karboxylová skupina a koncentrace iontů vodíku je stále dostatečná, aby se
zabránilo její ionizaci. Když pH stoupne na 6,6, budou mít všechny molekuly ionizovány
karboxylové skupiny postranního řetězce a budou mít dva záporné a jeden kladný náboj.
Při pH 11 mají všechny molekuly pouze dva záporné náboje.
Podíváme-li se nyní, na př. na molekulu lysinu, který má aminoskupinu i na postranním řetězci, zjistíme, že jeho izoelektrický bod je při pH 9,7, a je to právě aminokyselina
INGOS s.r.o.
Strana 12
1
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
na postranním řetězci, která je při izoelektrickém bodu nabita. Má tedy větší váhu, než
alfa aminoskupina.
!
#"%$
Proces výměny iontů je možno znázornit jednoduše takto:
Separace je ovlivňována změnou pH,teploty nebo koncentrace opačně nabitých iontů.
Tím se posunuje rovnováha jedním nebo druhým směrem.
1.4 Iontomìnièe
Iontoměničové náplně dnešních klasických analyzátorů aminokyselin mají sférický kulový tvar. Jejich syntéza se provádí kopolymerací styrenu a divinylbenzenu. Divinylbenzenu bývá při syntéze použito přibližně 8%. Procenta divinylbenzenu jsou velice důležitá
nejen proto, že tvoří v řetězcích styrenu příčné vazby, čímž vzniká kulovitý tvar, ale ionex
podle množství příčných vazeb má řadu vlastností příznivých i méně příznivých, na př.
rigiditu, botnavost, pórovitost a.p. Množství příčných vazeb se u ionexů označuje písmenem X (crosslinking). Strukturu pryskyřice je možné znázornit na následujícím obrázku.
Příčně svázaná pryskyřičná struktura se nazývá pryskyřičná matrice. Je-li tato matrice nasulfonována, potom získáme silně kyselý katex. Také písmena v označení českých
ionexů ve znaku KS značí silně kyselý. Úseky uvnitř skeletu se nazývají póry a pro nabité
ionty SO3- se užívá termínu vázané ionty. Opačně nabité ionty jsou vyměnitelné ionty,
které jsou přiřazeny k matrici heteropolárními vazbami (kladně nabité skupiny v pufrech
nebo aminokyselinách). Při iontové výměně pronikají opačně nabité ionty v pufru do pórů
matrice a vyměňují si místa s opačně nabitými ionty, které jsou tam vázané.
INGOS s.r.o.
Strana 13
1
AAA400
Kapitola 1: ÚVOD
U pryskyřic (ionexů) používaných pro analýzu aminokyselin, jsou proměnnými parametry rozměry částic, stupeň sulfonace a stupeň zesítění /crosslinking). Chromatografickou činnost analyzátorů aminokselin ovlivňují ještě jiné parametry, jako rozměry kolony,
rychlost toku eluentu, teplota a přítomnost organických rozpouštědel a.p. O těchto parametrech bude pojednáno v dalších kapitolách - příprava elučních roztoků.
INGOS s.r.o.
Strana 14
1
2. CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA
2.1 Ionexy
Pro analyzátory aminokyselin se používají tři druhy ionexů. Všechny jsou od firmy
Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí nad Labem. Jsou prodávány pod ochrannou
značkou OSTION. Označení LG znamená určení ionexu pro analytické účely. Prvé dvojčíslí značí stupeň zesítění, druhé dvojčíslí velikost zrna. Toto je běžné u analytických
ionexů u nás toto značení používáme pouze pro ionex předkolony. Ionexy určené pro
analytické kolony našich analyzátorů aminokyselin mají poněkud odlišné značení. Pro
náplň analytické kolony určené pro stanovení hydrolyzátů bílkovin se používá Ostion LG
ANB, dodávaný v Na cyklu. Pro analýzu volných aminokyselin se dodává Ostion LG FA,
dodávaný v Li cyklu. Ionexy mají odlišné značení od běžných analytických ionexů proto,
že jsou testovány podle jiných kriterií, než běžné ionexy.
2.1.1 Ionex pro pøedkolonu.
Ionex pro předkolonu je dodáván pod označením Ostion LG KS 0804, v Na cyklu. Pro
použití v Li provoze je nutné jej přecyklovat podle kapitoly 2.1.5. Skladování se provádí
v chladničce ve vlhkém stavu.
2.1.2 Ostion LG ANB pro stanovení hydrolyzátù.
Ostion LG ANB je silně kyselý katex s průměrnou velikostí zrna asi 12 um. Je dodáván
zásadně v Na formě v balení po 20 ml. Skladování se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.
2.1.3 Ostion LG FA pro stanovení volných aminokyselin.
Speciálně vyvinutý ionex pro náš přístroj. Dodává se zásadně v Li formě. Skladování
se provádí v chladničce ve vlhkém stavu.Pro stanovení volných aminokyselin lze také
použít Ostion LG ANB. Je však nutné jej převést do Li cyklu.
2.1.4 Práce s ionexy.
Před plněním kolony, nebo po delší době stání ionexu (několik měsíců) jej doporučujeme přecyklovat, protože se během skladování uvolňují zbytky látek po syntéze, které
zhoršují dělící schopnosti ionexu a kvalitu nulové linie. Během provozu jsou na ionex
vázány nečistoty ze vzorků a většinou se neúnosně zvětší tlaky, nebo podstatně zhorší
dělení obtížně dělitelných dvojic. Takto znečištěný ionex nic neztrácí na své kvalitě, je
však nutné jej vyčistit. Toto provedeme opakovaným převedením do H cyklu a zpět do
Na nebo Li cyklu. Při práci s analytickými ionexy musíme zachovávat určitá pravidla, na
která upozorňujeme.
1.Ionex nesmíme nikdy nechat vyschnout. Když už se tak stane, je nutné jej přecyklovat, silně naředit - 20 ml ionexu smíchat v odměrném válci přibližně s 250 ml destilované
vody. Počkat asi 20 až 30 min, až se ionex usadí a vrchní zakalenou část H2O odsát
(dekantovat).Toto lze zopakovat podle potřeby 2 až 3 krát. Touto manipulací se zbavíme
drtě, která vznikla uschnutím ionexu. Zmenší se nám sice množství , avšak vzroste kvalita
a sníží se tlaky v systému.
INGOS s.r.o.
Strana 15
2
AAA400
Kapitola 2: CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA
2.Ionex uchováváme vždy vlhký, to znamená, že po přecyklováni nebo jiné manipulaci
(plnění kolony a.p.) jej kvantitativně spláchneme do skladovací nádobky destilovanou
vodou. Po usazení dekantujeme. Nad ionexem ponecháme stát malé množství vody (l až
2 mm).
3. Skladováni provádíme pokud možno v chladničce, abychom zabránili případné kontaminaci (bakterie,plísně).
4. Při manipulaci s ionexem musíme míchat skleněnou tyčinkou, nepřípustné je míchání protřepáváním. Při protřepávání se naváže na jednotlivá zrnka ionexu vzduch, což
má za následek vysoké tlaky a zhoršené dělení čerstvé kolony.
5.Při cyklování nesmí dojít nikdy k prosátí vzduchu přes vrstvu ionexu na fritě. Staneli se, že se nám přes všechnu opatrnost navázal do ionexu vzduch je nutné opakovat
minimálně jednou cyklování.
2.1.5 Cyklování ionexu - èi¹tìní.
Když je ionex znečištěný balastními látkami a zhorší se jeho vlastnosti, je nutné
jej přecyklovat.Nyní bude popsán praktický postup cyklování ionexů. Před započetím je
nutné přečíst kapitolu 2.1.4.
1.Převedení do H formy. Jeden objemový díl ionexu smícháme s 5 až 6 objemovými díly 15 % HCl (1:1). Za občasného míchání zahříváme na teplotu 80C po dobu 6O
min.Potom promyjeme na fritě S4 (nebo takové, která nemá větší velikost pórů než 4 um)
destilovanou vodou do neutrální reakce. Takto zpracovaný ionex je v H formě.
2. Převedení do Na formy. Ionex v H formě smícháme s 16 % NaOH v poměru 1
objemový díl ionexu + 5 až 6 objemových dílů NaOH. Ponecháme asi 30 min stát při pokojové teplotě. Občas zamícháme celý obsah skleněnou tyčinkou. Potom opět sfiltrujeme
přes fritu S 4, promyjeme destilovanou vodou do neutrální reakce.
3. Převedení do Li formy. Ionex v H formě smícháme s pětinásobným množstvím
nasyceného roztoku LiOH. Za občasného míchání skleněnou tyčinkou ponecháme stát
asi 1 hod. Potom sfiltrujeme přes fritu S 4 a promyjeme destilovanou vodou do neutrální
reakce. Pro plnění analytické kolony nebo předkolony ředíme prvním analytickým pufrem
0,18 N Li pH 2,9. Pro uskladnění převedeme do PE lahvičky a skladujeme ve vlhkém stavu
v chladničce.
4. Skladování ionexu. Po převedení ionexu do Na nebo Li formy tento promyjeme
na fritě prvním pufrem a v tomto stavu jej uchováváme v PE lahvičce v lednici. Nikdy
neskladujeme ionex po převedení do Na nebo Li formy po promytí louhem.
Louh se z pórů ionexu uvolňuje a ionex je potom skladován prakticky v louhu, což
způsobuje jeho naboptnání a ztrátu tvrdosti. Skladuje se proto v kyselém prostředí prvního pufru. K udržení vlkosti postačí doplňovat H2O.
2.1.6 Plnìní analytických kolon pro hydrolyzáty Na cyklus.
Kolona se plní ionexem OSTION ANB. Kolonu nejprve chemicky vymyjeme,přišroubujeme
k ní spodní uzávěr, jehož kapiláru odpojíme od směšovače a vložíme do malé kádinky.
Kolonu zasadíme do držáku kolony v analyzátoru a necháme povytaženou z lůžka topení ven. Připravíme si asi 5ml injekční stříkačku opatřenou PE hadičkou s vnitřním
INGOS s.r.o.
Strana 16
2
AAA400
průměrem asi 1 mm a délce 500 mm. Do této stříkačky nasajeme destilovanou vodu a
vpravíme ji na dno do výše 10-20 mm. Potom do této stříkačky nasajeme ionex, který
jsme předtím zředili prvním pufrem v poměru 1 díl ionexu a 2-3 díly pufru. Při rozmíchávání ionexu používáme vždy skleněnou tyčinku, míchání provádíme pomalu. Nikdy
nerozmícháváme ionex protřepáváním! Zasuneme PE hadičku na dno kolony, pomalu
vytlačujeme ionex ze stříkačky do kolony a současně vytahujeme hadičku tak,aby byla
stále 5-10 mm pod hladinou suspenze, až naplníme kolonu po okraj. Potom na kolonu
našroubujeme plnící uzávěr (shodný s uzávěrem předkolony) a běžným průtokem plníme.
Když je suspenze ionexu nad sedimentem ionexu asi 20mm, vypneme čerpadlo. Počkáme
na pokles tlaku, odšroubujeme horní plnící uzávěr,odsajeme čirou kapalinu až k suspenzi
a opět naplníme suspenzí ionexu. Takto pokračujeme až docílíme požadovanou výšku
ionexu v koloně. Výška ionexu v koloně má být pro stanovení hydrolyzátů 350-370mm,
což odpovídá počtu asi 23-25 000 teoretických pater. Počáteční plnění kolony necháváme
na 370mm, protože během prvních analýz ionex asi o 20mm klesne. Přeplníme-li kolonu,
postačí přebytečné množství odsát. Po naplnění kolony neodsáváme přebytečný pufr nad
ionexem, ale vložíme do kolony analytický uzávěr, který dotáhneme těsně na ionex. Během prvních analýz kontrolujene dotažení horního uzávěru na ionex a v případě potřeby
jej opět dotáhneme, nelze-li uzávěr již dotáhnout na ionex pomocí šroubu, vložíme na
uzávěr další distanční trubičku.
Upozornění: V případě, že při plnění dojde ke spojení suspenze se sedimentem, neodsajeme všechen přebytečný pufr, ale ponecháme nad sedimentem asi 10-20mm pufru
a hadičkou krouživým pohybem rozhrábneme horní vrstvu ionexu a dále plníme běžným
způsobem. Neprovedeme-li toto rozhrábnutí je vážné nebezpečí, že kolona nebude dobře
dělit.
2.1.7 Plnìní analytických kolon pro volné aminokyseliny Li cyklus.
Kolona se plní ionexem OSTION LG FA, ředění ionexu opět provedeme prvním
pufrem ve stejném poměru jako při plnění hydrolyzátové kolony. Plnění provádíme postupem v kapitole 2.1.6. Kolona se plní do výše 200-220mm.
2.1.8 Plnìní pøedkolony.
Předkolona se plní ionexem OSTION 0804 stejným způsobem jako analytická kolona.
Pro plnění kolony do Li cyklu (stanovení volných aminokyselin) se má teoreticky ionex
přecyklovat do Li cyklu. Z praxe však víme, že to není nutné, protože během plnění se ionex přecykluje sám. Je ale nutné alespoň 2x vystřídat po 10 min. průchod kolonou LiOH a
první pufr, na hořejší části se objeví malá prohlubeň. Postačí otevřít horní uzávěr a kolonu
doplnit čerstvým ionexem, nejlépe je slít z uskladněného ionexu pufr a hustým sedimentem pomocí špachtle (kopistě, navažovací lžičky) doplnit ionex (dokytovat).Projeví-li se
nám časem zhoršené doběhnutí arg na základní linii a kolona je řádně naplněna, bývá
většinou horní vrstva ionexu znečištěná. Poznáse to po sejmutí horního uzávěru. Na povrchu je ionex tmavé barvy. Tento ionex odstraníme až na čistý ionex a doplníme čerstvý
ionex. Při zavírání předkolony musí být její okraj vždy řádně očištěn, jinak by mohla
kolona špatně těsnit, což je hrubá závada.
INGOS s.r.o.
Strana 17
2
AAA400
2.1.9 Vyprazdòování kolon
Z kolony odšroubujeme spodní uzávěr, podsuneme pod ní kádinku a spustíme pufrové
čerpadlo. Počkáme, až mám všechen ionex vyteče z kolony. Tento ionex uskladňujeme
samostatně a až je ho větší množství, tak jej přecyklujeme a vrátíme k původnímu ionexu.
2.2 Ninhydrinové èinidlo.
2.2.1 Chemikálie potøebné pro pøípravu ninhydrinového èinidla:
2.2.2 Ninhydrin
Ninhydrin - 1,2,3 - triketohydrinden monohydrát C9H6O4, MW 178,14.
Kvalitní ninhydrin (dále jen NHD) tvoří světle žluté krystalky. Červenofialové krystalky v NHD jsou známkou jeho znehodnocení. NHD uskladňujeme při normální teplotě
v tmavých láhvích za nepřístupu světla.
2.2.3 2-methoxyethanol
2-methoxyethanol (ethylenglykolmonomethylether, methylcellosolv) MW 76,10 C3H8O2
CH3-O-(CH2)2-OH Methylcellosolv (dále jen MCV) musí být prostý peroxydů. V případě, že je obsahuje projeví se to na rychlém zhoršování ploch píků a jejich výšek.(pokud
není jiný důvod k jejich snižování). V takovém případě je nutné MCV předestilovat a to
pouze potřebné množství pro přípravu NHD činidla. Destilace se provádí s přídavkem 10
ml roztoku FeSO4 na 1000 ml MCV. Roztok síranu železnatého připravíme rozpuštěním
6 g FeSO4 ve 100 ml destilované vody okyselené 6 ml koncentrované H2SO4.
2.2.4 4 M acetátový tlumiè.
se připraví takto: V 600 ml horké destilované vody rozpustíme 544 g octanu sodného
(CH3COONa.3H2O). Po zchladnutí přidáme 100 ml ledové kyseliny octové a doplníme
na 1000ml destilovanou vodou. Tento acetátový tlumič bývá výrobcem většinou dodáván
hotový.
2.2.5 Hydrindantin dihydrát MW 358,31.
Bílá jemně krystalická látka. Skladuje se v tmavé láhvi pokud možno za nepřístupnosti
světla (ve skříni) při pokojové teplotě. Navažuje se s přesností 0,02 g.
2.2.6 Pøíprava ninhydrinového èinidla.
Chemikálie rozpouštíme v uvedeném pořadí za stálého probublávání dusíkem přímo v
reagenční láhvi.Množství, pořadí a nezbytná doba pro probublávání dusíkem jsou uvedeny
v následující tabulce.
poř.čís.
název
množství
l.
2.
3.
4.
ninhydrin (NHD)
methoxyethanol (MCV)
4 M Na acetátový pufr
hydrindantin dihydrát
40 g
1 500 ml
500 ml
2,00 g
INGOS s.r.o.
dusík min.
promývání
do rozp.NHD
5 min
do rozpušt.
Strana 18
2
AAA400
Tab.2 Příprava ninhydrinu
Hydrindantin se ve směsi acetátový pufr methoxyethanol velmi špatně rozpouští,
proto při přípravě činidla odlijeme asi 200ml MCV do kádinky, jinak postup zachováme
stejný. Když máme přidat hydrindantin, rozpustíme ho v připravované MCV. Ihned po
vložení hydrindantinu do MCV intenzivně mícháme, aby se rozpustil v co nejkratší době
(do 1 min.). Rozpuštění poznáme tak, že se roztok zcela vyjasní. Potom ihned nalijeme
do láhve s připraveným činidlem NHD, kádinku nevyplachujeme a krátce probubláme
dusíkem (1-2 min.).
Poznámka: 1. Všechny použité chemikálie musí být čistoty pro analýzy, nebo pro
analyzátory aminokyselin.
2. Methoxyethanol je možné nahradit dimethylsulfoxidem, je však nutné použít 4 N
Li acetátový pufr pH 5,2.
3. Místo hydrindantinu je možné použít jiné redukční činidlo na př SnCl2 (O,8 g pro
4O g NHD) nebo 7,5 ml 15% roztoku TiCl3.
4. Dusík který používáme jako inertní plyn musí být zcela prostý kyslíku (žárovkový).
Lze použít i argon. Nedoporučujeme použití helia (má malou molekulu).
2.2.7 Bezpeènostní pøedpisy pøi práci s NHD èinidlem
Při přípravě činidla vždy používáme gumové rukavice. Dojde-li k potřísnění pokožky
omyjeme zasažené místo vodou a posypeme pyrosiřičitanem sodným (dvojsiřičitan sodný).
Při zjištění modrých skvrn na pokožce tyto též posypeme pyrosiřičitanem sodným a
omyjeme vlažnou vodou. Při požití vyvoláme zvracení a ihned lékařskou pomoc.
2.3 Pøíprava sodno citrátových eluèních roztokù.
Sodno citrátové pufry jsou používány převážně pro stanovení aminokyselin v hydrolyzátech bílkovin.
2.3.1 Seznam potøebných chemikálií:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Kyselina citrónová p.a.
Citronan sodný p.a.
Chlorid sodný p.a.
Hydroxid sodný p.a. - pecičky a roztok obsahující v 1 ml 0,5 g NaOH
Kyselina boritá p.a.
Thiodiglycol pro analyzátory aminokyselin
Azid sodný
Poznámka:
1.Používáme chemikálie pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin,
případně chromatograficky čisté.
2. Roztok NaOH připravujeme v minimálním množství 500 ml a uchováváme v PE
láhvi. Pipetujeme vždy ze středu láhve pod vrstvou uhličitanů. Výsledná koncentrace
NaOH má být 0,5 g v 1 ml. Př. 500 g NaOH rozpustíme za stálého míchání a chlazení
asi ve 300 ml destilované vody. Po zchladnutí doplníme na 1000 ml destilovanou vodou.
3. Azid sodný můžeme nahradit fenolem, pentachlorfenolem, nebo kyselinou kaprylovou v množství 0,1 g na 1000 ml elučního roztoku.
INGOS s.r.o.
Strana 19
2
AAA400
Tabulka výpočtu množství jednotlivých chemikálií pro zhotovení sodno citrátových
elučních roztoků.
Na pufry
1
2
3
4
M Na
M citr.
0.2
0.066
0.2
0.066
0.4
0.066
1.12
0.066
pH
H
Z
F
2.6
30
19.6
11.7
3.0
30
19.6
11.7
4.25
32
19.6
23.4
viz dole∗
viz dole∗
přísady
TDG ml/l
NaOH roz.
H3BO3
N3Na
2.5
0.1
2.5
0.1
2.5
0.1
–
0.5-3ml
2.05 g
0.1
Tab.3 Na Pufry
Výpočet:
kyselina citrónová [g/l] =
citronan sodný
[g/l] =
chlorid sodný
[g/l] =
H : pH
Z - (A x 1.4)
F - (B x 0.596)
=A
=B
MW
210.14
294.11
58.44
∗
Pufr 4 se připraví navážením 19.6 g citronanu sodného a 52.6g chloridu sodného +
přísady podle tabulky.Navážky jsou konstantní není třeba je vypočítávat, proměnné je
pouze množství NaOH.
2.3.2 Postup pøi pøípravì eluèních roztokù (dále jen pufrù)
Postupně rozpouštíme za stálého míchání jednotlivé složky pufru v teplé destilované
vodě (40 až 60O C). Po rozpuštění doplníme na žádaný objem. Takto připravené pufry
”nezrají”, je možno je okamžitě používat.
Několik praktických poznatků při přípravě pufrů.
Při zavádění nového systému, na př. při výměně ionexu nejprve připravíme 1000 ml
pufru , nevyhovuje-li tento pufr, (je rychlý, nebo pomalý), nezdržujeme se jeho opravou, ale připravíme nový pufr se změněnými parametry podle nového výpočtu.Změnu u
prvního pufru neprovádíme zpravidla větší než o 0,1 pH.
Známe-li parametry vyhovujícího pufru, není nutné jej podruhé vypočítávat, postačí
si zapsat jeho pH a navážky, které se potom v praxi opakují. Doporučujeme připravovat
z vyhovujících pufrů koncentráty v množství asi 5000 ml, pětinásobný koncentrát. Potom celá příprava pufru spočívá v odměření 200 ml koncentrátu a doplnění na 1000 ml
destilovanou vodou.
INGOS s.r.o.
Strana 20
2
AAA400
Příklad přípravy koncentrátu: Koncentrát vyrobíme tak, že v přibližně 2500 ml destilované vody rozpustíme postupně 25ti násobek jednotlivých složek pufru. Po rozpuštění
doplníme destilovanou vodou na 5000 ml.
2.3.3 Vlastnosti Na pufrù
Systém pufrů ”INGOS” má celou řadu výhod, je velice jednoduchý, pufry nevyžadují
použití pomocných zařízení (pH metry). Jsou vyrobeny z pevných chemikálií a pouhým
navážením na technických váhách se dociluje maximální reprodukovatelnosti.Celý systém
výpočtu jednotlivých složek pufrů byl zjednodušen avšak variabilita pH byla zachována.
Všechny zde popsané pufry budou prokazovat uvedené parametry při konstantním
průtoku pufru 0,3 ml/min, dále při rozměrech kolony 0.37 x 45 cm, při náplni OSTION
LG ANB (výrobce Spolek pro chemickou a hutní výrobu Ústí n/Labem.) a výšce sloupce
ionexu l = 35 až 37 cm.
Pufr 1 0.2 M Na, pH 2.7 Při použití tohoto pufru je poředí aminokyselin toto: Kyselina
cysteová, kyselina asparagová, methionin sulfon, threonin, serin. Při správném nastavení
času stabilizace kolony je rozdělení všech píku na 100%. Problém může činit jedině metS,
který je při dlouhé stabilizaci kolony blíže k asp a naopak. Postačí proto upravit délku
stabilizace tímto pufrem na konci analýzy. Upozorňujeme také na nebezpečí přidavku
thiodiglykolum, který musí být přesný a je potřeba ho odměřovet, ovlivňuje též ruclost
eluce metS.
Pufr 2 0.2 M Na, pH 3.0
Tento pufr slouži k dokončení eluce kyselých aminokyselin, protože použitím pufru
pH 2.8 by bylo zbytečně dlouhé. Eluují se jím tyto aminokyseliny: Kyselina glutámová,
prolin, glycin, alanin, cystin a valin. Při správném přepnutí ihned na začátku analýzy
nejsou žádné problémy a všechny píky jsou dodělěny na 100%. Přepnutí z pufru pH 2.7
na tento pufr provádíme zpravidla již v 1 min.
Pufr 3 - 0,4 M Na, pH 4,25 Tímto pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: met,
ile, leu. Tento pufr není problematický,všechny dvojice jsou velice dobře rozděleny. Čím
je pufr kyselejší, tím je pomalejší eluce a naopak. Totéž platí o teplotě. Čím vyšší teplota
kolony, tím rychlejší eluce a naopak.
Pufr 4 - 1.12 M Na, pH 7,9 Moderní pufr, který na počátku stlačí během prvních
tří analýz ionexový sloupec v koloně o max. 1 cm a zvýší tlak na koloně přibližně o 0,2
až 0,5 MPa. Toto se v průběhu dalších analýz však vůbec nemění. Jeho veliká přednost
spočívá v tom, že své analytické vlastnosti po celou dobu své životnosti nemění. Retenční
doby se prakticky vůbec nemění a reprodukovatelnost je také výborná.Toto vše nám
plně vynahradí malé sesednutí kolony a nepatrné zvýšení tlaků. Jeho příprava je velice
jednoduchá a naprosto nenáročná. Eluční vlastnosti se určují pouze množstvím přidaného
NaOH.
2.3.4 Pøíprava øedícího roztoku pufru O.2 M Na, pH 2.2
Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné
měřit pH. Postačí jej připravit podle následující receptury.
kyselina citronová
14.0 g/l
INGOS s.r.o.
Strana 21
2
AAA400
chlorid sodný
thiodiglycol
azid sodný
11.5 g/l
5.0 ml/l
0.1 g/l
2.3.5 Pøíprava regeneraèního roztoku NaOH 0,2 M Na
Tento roztok připravíme rozpuštěním 8.0g NaOH (MW 40,01) v 1000 ml destilované
vody.
2.3.6 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Na pufry.
Vzhledem k tomu že se jedná o sloučeniny kyseliny citrónové a chloridu sodného,
což jsou suroviny běžně obsažené v potravě, není nutné dbát zvláštních bezpečnostních
předpisů.
2.4 Pøíprava lithno citrátových eluèních roztokù.
Lithno citrátové eluční roztoky (dále jen pufry) jsou používány převážně pro stanovení
volných aminokyselin ve fyziologických roztocích.
2.4.1 Seznam potøebných chemikálií
1.
2.
3.
4.
5.
6.
kyselina citronová
citronan lithný
chlorid lithný
hydroxid lithný
thiodiglykol pro analyzátory aminokyselin
azid sodný
Poznámka:
1.Používáme chemikálií pro analýzy, nebo chemikálie pro analyzátory aminokyselin,
případně chromatograficky čisté.
2. Chlorid litný je značně hydroskopický. Starší může obsahovat značné množství
vody. Lépe něž jej sušit je rozpustit ho v destilované vodě, stanovit jednoduchým způsobem chloridy (např. titračně-argentometricky) a potom vypočítat množství LiCl v 1ml
rozroku a odměřit potřebný počet g.
3.Azid sodný můžeme nahradit kyselinou kaprylovou, fenolem nebo pentachlorfenolem v množství 0,1 g na 1000 ml pufru. Při větším přidaném množství azidu sodného do
Li pufrů může dojít ke koincidenci (splynutí) píku kyseliny asparagové a hydroxyprolinu.
V sodných pufrech jsou jejich polohy opačné.
4.Pro přípravu pufrů používáme zásadně kvalitní čerstvou destilovanou vodu, která
není kontaminována amoniakem. Navážky jednotlivých komponent pro 1000 ml provádíme s přesností 0,05 g.
5. Při rozpouštění je přípustné zahřát roztok na teplotu přibližně 60O C a mícháním
napomáhat rychlejšímu rozpouštění.
2.4.2 Pøíprava øedícího pufru 0,1 M Li, pH 2,2
Tímto pufrem ředíme na žádanou koncentraci vzorky i standardy. U pufru není nutné
měřit pH. Postačí jej připravit podle následující receptury.
INGOS s.r.o.
Strana 22
2
AAA400
9.5g
8.5 g
5,0 ml
0,1 g
citronan lithný
kyselina chlorovodíková p.a. (33 - 35 %)
thiodiglykolu
azid sodný
destilovaná voda - doplníme na konečný objem 1000 ml.
2.4.3 Pøíprava regeneraèního roztoku LiOH 0,3 M Li
Tento roztok připravíme rozpuštěním 12.59 g LiOH (MW 41,96) v 1000 ml destilované
vody. Máme-li LiOH s jinou MW, musíme provést přepočet.
2.4.4 Pøíprava eluèních roztokù a jejich výpoèet podle tabulky.
Li pufry
1
2
3
4
5
M Li
M citr.
0,18
0,053
0,20
0,06
0,35
0,07
0,33
0,10
1,20
0,22
pH
H
Z
F
2,90
27,26
14,92
7,62
3,10
3O,O7
16,92
8,47
3,35
35,17
19,74
14,83
4,O5
38,48
28,20
13,98
4,65
41,65
62,04
50,87
přísady
TDG
N3Na
2,5
0,1
2,5
0,1
2,5
0,1
0,1
0,1
Tab.4 Li pufry
Výpočet:
kyselina citrónová [g/l] =
citronan lithný
[g/l] =
chlorid lithný
[g/l] =
H : pH
Z - (A x 1.342)
F - (B x 0.4509)
=A
=B
MW
210.14
281.93
42.43
2.4.5 Vlastnosti Li pufrù
Při hledání vhodného pH a ostatních partametrů pufrů je vždy nejdůležitější si uvědomit, které aminokyseliny (skupinu aminokyselin) nám bude pufr eluovat. pH pufrů
neměříme. Posoudíme dělící vlastností pufru, jsou-li nevyhovující, připravíme nový pufr.
Navážky vyhovujících pufrů si zapíšeme. Bývají neměnné, pokud neměníme analytické
podmínky. Toto je veliká přednost systému pufrů INGOS. V popise jsou uvedeny aminokyseliny a NHD pozitivní látky v pořadí ve kterém jsou eluovány z kolony.
Pufr 1 - 0.18 M Li, pH 2,80 První Li pufr eluuje tyto aminokyseliny (NHD pozitivní
látky): kyselinu cysteovou, taurin, fosfoethanolamin, močovinu, asparagovou kyselinu,
hydroxyprolin, threonin, serin, asparagin, glutamovou kyselinu, glutamin. Eluce se provádí při základní teplotě 37 až 40C. Nejcitlivější na pH a teplotu je trojice asn, glu, gln. Z
těchto tří je nejcitlivější a nejpohyblivější, při změnách pH a teploty, kyselina glutamová.
INGOS s.r.o.
Strana 23
2
AAA400
Tím je určena taktika přípravy purfu. pH a teplotu musíme upravit tak, aby kyselina
glutamová byla přesně uprostřed mezi asn a gln. Zvýšením teploty a zvětšením pH se
eluční čas kyseliny glutamové zkrátí a tato se přiblíží k asn a naopak.U tohoto pufru
můžeme také provést posun kyseliny glutamové zkrácením doby stabilizace.Čím kratší je
doba stabilizace, tím je alkaličtější (rychlejší) první pufr a opačně. Jedná se o zkrácení o
několik minut, max 15.
Pufr 2 - 0,20 M Li, pH 3,05 Druhý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: kyselinu alfa
amino adipovou, prolin, glycin, alanin, citrullin, kyselinu alfa amino máselnou a valin.
Problém při dělení je pouze s citrullinem, který je velice citlivý na teplotu a pH. Jeho
polohu je možné nastavit pomocí pH pufru (nový pufr). Většinou postačí upravit dobu
přepnutí druhého pufru. Je-li citrullin eluován blízko alaninu, je druhý pufr méně kyselý
(rychlejší), postačí posunout dobu jeho přepnutí o 2 až 3 min. Příklad: druhý pufr přepínáme v 16 min. provedeme tedy změnu přepnutí na 19 min. Totéž platí opačně, dělí-li se
citrullin špatně od kyseliny alfa amino máselné. Někdy bývají drobné problémy s dělením
prolinu. Zde musíme provést úpravu prvního pufru, aby ještě uspokojivě dělil trojici asn,
glu, gln a současně se dělil dobře i pro ve druhém pufru.
Pufr 3 - 0,36 M Li, pH 3,35 Třetí Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: cystin, methionin,
cystathionin, isoleucin, leucin. Tento pufr není náročný na pH. Z eluovaných aminokyselin
je problematický jen cystathionin, který je citlivý na pH i na teplotu. Volíme proto
přepnutí na vyšší teplotu 60O C tak, aby byl cystathionin uprostřed mezi methioninem
a isoleucinem. V případě pozdějšího přepnutí teploty je cystathionin eluován později
a je nedostatečně oddělen od isoleucinu, v opačném případě je eluován v methioninu.
Zpravidla nebývá rozdíl od základního času větší než o 5 min. Také je důležité, aby změna
pufru proběhla za valinem a aby cystin byl eluován již v tomto pufru. Toto poznáme na
grafu standardu tak, že cystin je štíhlejší a vyšší pík než valin.
Pufr 4 - 0,33 M Li, pH 4,05 Čtvrtý Li pufr eluuje tyto aminokyseliny: tyrosin, fenylalanin, beta alanin a beta aminomáselnou kyselinu. U tohoto pufru nejsou žádné problémy,
je-li pufrová změna provedena na správném místě. Změnu pufru poznáme snadno, za leucinem se objeví při analýze standardu typické zvlnění pufrové změny. V případě, že je
provedena brzy je eluován leucin již ve 4 pufru je užší vyšší než ile. (leu je ve standardu
ze čtveřice met,cystathionin,ile,leu nejnižší). Když je eluován pouze částečně 4 pufrem,
projeví se to jeho nesymetričností. V tomto případě také neuvidíme typické zvlnění nulové linie zaviněné změnou pufru. Pozdní změna pufru se projeví velkou mezerou mezi
leucinem a tyrosinem. Toho se využívá při použití vnitřního standardu norleucinu (nle),
který je právě eluován za leucinem v tomto místě.
Pufr 5 - 1.20 M Li, pH 4.65 Pátým pufrem jsou eluovány tyto aminokyseliny: gama
amino máselná kyselina, ethanolamin, amoniak, ornithin, lysin, histidin, 1-methyl histidin, 3-methyl histidin a arginin.Tento pufr je bezproblémový. Pufrovou změnu musíme
provést za kyselinou beta aminomáselnou, aby tato byla eluována ve 4 pufru. (má pík
řádově stejně vysoký jako beta alanin.) V případě, že byl pufr přepnut brzy, je beta aminomáselná kyselina podstatně vyšší než beta alanin. Také zde je dobře patrná pufrová
změna.
INGOS s.r.o.
Strana 24
2
AAA400
Další pozornost musíme věnovat zařazení regenerace. Předčasné zařazení regenerace
vede k deformaci píku argininu, nebo k jeho splynutí s regenerací. Pozdější zařazení
regenerace se projeví podstatně pomalejším nárůstem nulové linie a v okamžiku, kdy
přichází regenerace tento nárůst prudce stoupá.
2.4.6 Poznámky k Li provozu z praxe
1. Li pufry jsou mnohem agresivnější než Na, proto je vhodné přibližně jedenkrát měsíčně propláchnout, při maximálním průtoku, čerpadla teplou destilovanou vodou.
Tuto nepouštíme do hydraulického systému.
2. Pro korekce časových změn přepínání pufrů použijeme kurzor, kterým odečteme časové hodnoty vzdáleností jednotlivých píků z grafu (ve výpočtové obrazovce).
3. Je nutné mít na paměti, že posuny časů přepnutí nižších pufrů se musí provést i u
pufrů s vyššími čísly. Na př. pufr č 3 posuneme o 5 min, musíme tím samým směrem
posunout přepnutí 4 a 5 pufru a regenerace též o 5 min.
4. V případě nouze lze provést analýzu volných aminokyselin též na ionexu OSTION
LG ANB, který převedeme do Li cyklu.
5. V případě značné kontaminace pufrů amoniakem nebo v případě práce se značně
znečištěnými vzorky, se může stát, že nulová linie se obtížně ustaluje. Projeví se to
pomalým sestupem na základní čáru. Start analýzy proběhne a nulová linie není ještě
ustálena. V tomto případě nepostačí pouhá jednoduchá regenerace. Je nutné provést
dvě regenerace. Dosáhneme tím dokonalou reprodukovatelnost. Doporučujeme tento
postup:
a. regenerace 0,3 M LiOH po dobu 10 min, při teplotě 60o C.
b. stabilizace pufrem č. 1 po dobu 20 min, teplota 60o C.
c. regenerace 0,3 M LiOH po dobu 15 mi při teplotě 60o C.
d. Stabilizace pufrem č.1 po dobu 50 min při teplotě 38o C.
e. Pro zlepšení reprodukovatelnosti doporučujeme nepřetržitý provoz.
6. Všechny úpravy a ladění pufrů se provádí pouze na počátku při zavádění programu,
nebo při změně analytických podmínek. Podrobně jsou zde popsány proto, aby obsluhu nezdržovaly. V praxi se již úpravy pufrů neprovádí, pouze se navažují, nebo se
vyrábí koncentráty, tak jak to bylo popsáno v kapitole přípravy Na pufrů.
2.4.7 Bezpeènostní pøedpisy pro práci s Li pufry
Tyto předpisy jsou shodné s Na pufry, pouze jsou agresivnější vůči všem kovům, není
vhodné je nechávat delší dobu ve styku s povrchy laků a kovů.
2.5 Pøíprava eluèních roztokù pufrù
Celá tato problematika je součástí programu počítače, který obsluhuje analyzátor.
Tento program nám po zadání pH vypočítá optimální složení pufru. V instrukci jsou
potom vlastnosti jednotlivých pufrů i jejich úprava. Celá problematika elučních roztoků
je též popsána ve stati 2.3. a 2.4. .
INGOS s.r.o.
Strana 25
2
3. PØÍPRAVA VZORKÙ
3.1 Úvod
Správně zvolený způsob přípravy vzorku je prvotním předpokladem správných a reprodukovatelných výsledků v automatické analýze aminokyselin. Chybný způsob přípravy
vzorku může nejen vést k omylům v kvalitativní analýze a chybám při kvantitativním
stanovení, ale může ohrozit i chod analyzátoru.
Pro úspěšnou přípravu vzorku je žádoucí se nejprve seznámit s dostupnými literárními údaji o jeho spektru aminokyselin a jiných látek, jež mohou hrát roli při zpracování
vzorků a interpretaci chromatogramu. Předběžná znalost přibližného obsahu aminokyselin je výhodná pro zvolení optimální navážky. K dávkování do automatického analyzátoru
používáme zásadně pouze čiré roztoky, zbavené pevné fáze a koloidních příměsí.
Přípravu vzorků lze rozdělit na uvolňování aminokyselin vázaných v bílkovinách,
peptidech apod. hydrolýzou a na přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny (biologické tekutiny, tkáňové extrakty), z nichž odstraňujeme bílkoviny a jiné rušivé látky. V
komplexních biologických materiálech často stanovujeme vázané i volné aminokyseliny.
Vzhledem k neobyčejné rozmanitosti přírodního materiálu a k rozsáhlému použití automatické analýzy aminokyselin v řadě oborů, lze v této stati podat pouze orientační údaje
o přípravě vzorků, jež doporučujeme konfrontovat se speciální literaturou v daném oboru.
Při výběru metod přípravy vzorků byla v této stati dána přednost jednoduchým, v praxi
prověřeným postupům, jež nejsou náročné na přístrojové vybavení. Máme-li však možnost, provádíme zejména přípravu vzorků obsahujících volné aminokyseliny za nízkých
teplot (používáme chlazených odstředivek, vakuové odpařování nahrazujeme lyofilizací
apod.).
3.2 Bílkoviny a peptidy
3.2.1 Charakteristika materiálu
Odolnost peptidických vazeb vůči hydrolýze se liší v závislosti na druhu aminokyseliny a struktuře bílkoviny. Aminokyseliny uvolněné z peptidické vazby mohou podléhat
různým rozkladným změnám účinkem hydrolyzačního činidla nebo jiných složek reakční
směsi. Není proto možné získat absolutní údaje o obsazích aminokyselin při jediných
podmínkách hydrolýzy.
3.2.2 Hydrolýza kyselinou chlorovodíkovou [1]
Pro tuto nejběžnější metodu hydrolýzy 6N HCl, kterou získáme buď zředěním koncentrované kyseliny v poměru 1:1 destilovanou vodou, nebo destilací azeotropní směsi
HCl s vodou (1:1) ve skleněné aparatuře s přídavkem malého množství SnCl2.
Hydrolýzu provádíme ve zkumavce ze Sialu nebo Pyrexu, postupně vypláchnuté
chromsírovou směsí (40g CrO3 do 600ml H2O,po rozpuštění + 400ml H2SO4),destilovanou
vodou a 1N HCl. Zbytky HCl se odstraní v sušárně při 100o C. Zkumavky pak uchováme
v polyetylenových sáčcích, aby na nich nevznikly nálety NH4Cl.
INGOS s.r.o.
Strana 26
3
AAA400
Kapitola 3: PŘÍPRAVA VZORKŮ
Vzorek diferenčně navážíme na dno zkumavky tak, aby materiál neulpěl na stěnách.
Potom připipetujeme 6N HCl ve dvěstěnásobném přebytku. Ke kapalným vzorkům přidáme 12N HCl v objemu vzorku.
Při stanovení navážek vycházíme z orientačního údaje, že 1mg bílkoviny obsahuje
0,3 - 1 mol jednotlivých aminokyselin. Na kyslíkovém plameni zúžíme vrch zkumavky
na vnitřní průměr asi 2mm tak, aby nedošlo k zeslabení stěn. Roztok pak zmrazíme v
mrazící lázni (aceton a suchý led) nebo v podchlazeném alkoholu. Pak vzorek evakuujeme
přes kohout, uzavřeme a zkumavku v krčku zatavíme.
Zkumavku vložíme do hydrolyzačního bloku nebo do vzdušného termostatu a ponecháme po dobu 20 hodin při teplotě 110 1o C. Další stejně připravený podíl vzorku
hydrolyzujeme 70 hodin. Po hydrolýze zkumavky ochladíme, nařízneme a odpukneme přiložením na konci rozžhavené tyčinky. Kyselinu odpaříme ve vakuovém rotačním odpařováku. Vzorky, jež nemohou být ihned po hydrolýze analyzovány neotvíráme a uskladníme
je v lednici nebo mraznici. Pokud je ve vzorku přítomen cystein, je nutno odparek rozpustit v destilované vodě a po úpravě fosforečnanovým pufrem na pH 6,5 jej ponecháme
4 hodiny při laboratorní teplotě. Po této oxidaci cysteinu na cystin se vzorek okyselí
1N HCl a doplní na potřebný objem pufrem o pH 2,2. Neprovádíme-li oxidaci cysteinu,
rozpouštíme odparek přímo v tomto pufru.
3.2.3 Zdroje chyb
Přítomnost těžkých kovů v hydrolyzačním médiu, kam mohou být vneseny např. s
HCl, zvyšuje ztráty threoninu, serinu, sirných aminokyselin a tyrosinu. Ke ztrátám sirných
aminokyselin a chloraci tyrosinu přispívá rovněž nedokonalá evakuace vzorku a zejména
přítomnost oxidačních činidel (např. methionin - sulfoxidu, dimetylsulfoxidu, iontu NO3
- apod.). V přítomnosti nitroargininu se chloruje i fenylalanin. Ke ztrátám threoninu a
serinu esterifikací přispívá přítomnost síranového iontu a starší způsob odstraňování HCl
odpařením v exikátoru nad louhem, jež se projeví výskytem malých vrcholů v různých
částech chromatogramu. Kyselina glutamová se za těchto podmínek částečně cyklizuje.
Neúplné výtěžky některých aminokyselin jsou dány použitou metodou hydrolýzy HCl
a nejsou prakticky odstranitelné. Cystin při hydrolýze recemizuje a poskytuje na chromatogramu plochý, asimetrický, obtížně integrovatelný pík. Přesnějších výsledků při stanovení sirných aminokyselin i s ohledem na možnou oxidaci při hydrolýze HCl lze dosáhnout
oxidací vzorku před hydrolýzou (viz odst. 3.2.4 str. 28).
Pro stanovení přesných obsahů isoleucinu a valinu, jež jsou obtížně uvolňovány z
peptidických vazeb, používáme 70 hod. hydrolýzy.
U threoninu a serinu dochází podle různých autorů při 20 - 24 hodinách hydrolýzy
ke ztrátám ve výši 3 - 15%, přičemž je serin podle většiny údajů labilnější než threonin.
Ztráty tyrosinu uváděné v literatuře pro tytéž časy hydrolýzy se pohybují v rozmezí 1 14%. Tryptofan je během kyselé hydrolýzy HCl ničen téměř úplně, píky jeho oxidačních
produktů se však mohou objevit na chromatogramu před pozicí tryptofanu. Ostatní aminokyseliny jsou podle většiny literárních údajů při 20 - 24 hodinové hydrolýze považovány
za stabilní, resp. jejich ztráty lze s ohledem na přesnost stanovení zanedbat.
INGOS s.r.o.
Strana 27
3
AAA400
Pro získání údajů o skutečném obsahu labilních aminokyselin v intaktním vzorku z
výsledků rozborů hydrolyzátů byla navržena řada metod, jejichž přehled podává Robel
[3]. Nejjednodušší postup předpokládá reakční kinetiku I.řádu, provedení dvou hydrolýz
při čase t1 =20 hod. a t2 =70 hod. a výpočet původního obsahu A0 podle vzorce:
t2
logA1
t1
logA2
t2 t1
t2 t1
kde A1 ,A2 jsou zjištěné obsahy aminokyseliny A v časech t1 , t2 .
Korekce na základě grafické interpolace [2], nebo obecně použitelná řešení metodou
nelineárních nejmenších čtverců [3] vyžadují 4 - 5 dob hydrolýzy.
logA0 =
3.2.4 Pøíprava vzorku pro stanovení sirných aminokyselin [4]
Nespecifickým redox reakcím sirných aminokyselin během hydrolýzy HCl zabráníme
převedením cystinu a methioninu pomocí kyseliny permravenčí na stabilní oxidované
deriváty - kyselinu cysteovou a methioninsulfon.
Příprava oxidační směsi: 1 díl 30% H2O2 smísíme s 9 díly 88% kyseliny mravenčí,
ponecháme stát 30 minut při laboratorní teplotě a vychladíme na 0o C. Směs pak přidáme
ke vzorku v poměru 1ml na 0,04 až 0,08mg cystinu (tj. asi 2mg bílkoviny) a ponecháme
stát při 0o C 4 hodiny. Vzorky, jež se v té době nerozpustí, ponecháme při této teplotě přes
noc. Oxidační směs odpaříme na rotačním vakuovém odpařováku při 40o C do sirupovité
konsistence - úplné odpaření vzorku způsobuje ztráty cystinu. Po přidání 200násobného
přebytku HCl pak vzorek podrobíme normální kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). Oxidovaný hydrolyzát zpravidla nepoužíváme ke stanovení ostatních aminokyselin, i když
jsou kromě tyrosinu a tryptofanu vůči oxidaci stabilní. Výtěžek kyseliny cysteové lze poněkud zvýšit redukcí zbytků oxidační směsi před vakuovým odpařením pomocí HBr podrobnosti viz [5].
3.2.5 Urychlené odpaøování vzorkù po hydrolýze oxidaèní i bì¾né
Po hydrolýze vzorek sfiltrujeme přes černou pásku do odměrné baňky 200 nebo 250
ml. Filtr promyjeme teplou vodou a doplníme po vychladnutí. K odpařování požíváme
alikvot (20 nebo 25 ml), který spláchneme do 10 ml odměrné baňky a doplníme ředícím,
pufrem pH 2.2. Tímto postupem si značně zrychlíme odpařování vzorku, jelikož odpařování objemu cca 150ml vzorku je značně zdlouhavé. Odpaření 20ml trvá několik minut.
3.2.6 Pøíprava vzorkù pro stanovení aminocukrù
Aminocukry vázané v glykoproteinech lze jako látky reagující s ninhydrinem dobře
stanovit analyzátorem aminokyselin. Při běžných způsobech hydrolýzy jsou však větší
části ničeny a tvoří součást tzv. huminů, jež se z hydrolyzátů odstraňují odstřeďováním
či filtrací. Pro stanovení aminocukrů se používá hydrolýzy 4N HCl po dobu 1 - 4 hod.
nebo 2N HCl po dobu 12 hod. při 100o C. Postupuje se podle metody v části 3.2.2 str. 26,
vyloučení kyslíku a těžkých kovů je zcela nezbytné.
3.2.7 Pøíprava hydrolyzátù pro stanovení tryptofanu
Příprava vzorku pro stanovení tryptofanu vázaného v bílkovině je obtížná vzhledem k
nízké stabilitě této aminokyseliny v obvyklých hydrolyzačních médiích, zvláště v přítomINGOS s.r.o.
Strana 28
3
AAA400
nosti nebílkovinných složek. U čistých bílkovin neobsahujících cukry lze částečně zabránit
rozkladu tryptofanu (dále jen trp) při kyselé hydrolýze přídavkem merkaptosloučenin k
HCl nebo použitím aryl- a alkylsulfonových kyselin k hydrolýze.
Pro vzorky obsahující cukry se užívá bazické hydrolýzy, při níž se výsledek tryptofanu snižuje oxidací vzdušným kyslíkem, uvolňováním křemičitanů ze stěn skleněných
hydrolyzačních nádob (zvláště při použití NaOH) a absorbcí tryptofanu na případných
sraženinách a nerozpustných podílech reakční směsi. Podle většiny prací poskytuje nejvyšší výtěžky trp hydrolýza hydroxidem barnatým, odstraňování Ba(OH)2 před ionexovou chromatografií je však pracné a může být zdrojem dalších ztrát. Dále jsou uvedeny
dva příklady seriózně ověřených metod hydrolýzy pro stanovení tryptofanu.
3.2.8 Kyselá hydrolýza [6]
K HCl přidáme 4% kyseliny thioglykolové p.a. a postupujeme jako při standardní
kyselé hydrolýze (část 3.2.2 str. 26). Výtěžěk tryptofanu činí 90%, vzorek však nesmí obsahovat cukry. Cystein vznikající při tomto způsobu hydrolýzy interferuje se stanovením
prolinu. Kyselina thioglykolová poskytuje dva píky na chromatogramu, jeden v oblasti
mezi píky kyseliny cysteové a asparagové, druhý na místě karboxymetylcysteinu.
3.2.9 Bazická hydrolýza [7]
Tryptofan je uvolňován působením 4,2N NaOH na vzorek umístěný v evakuované
propylenové kyvetě za přídavku částečně hydrolyzovaného škrobu.
Příprava částečně hydrolyzovaného škrobu: 50g bramborového škrobu se přidá ke
směsi 99ml acetonu a 1ml koncentrované HCl. Směs se zahřívá 2 hodiny na 50o C. Po
přidání 25ml 1M octanu sodného se směs převede na fritu a promyje postupně 2l destilované vody a 2l acetonu. Produkt se vysuší v exikátoru. Lze použít i obchodního preparátu
škrobu pro gelovou elektroforézu.
Pro hydrolýzy nejprve připravíme roztok bílkoviny v 0,005N HCl nebo NaOH, obsahující 0,1 - 0,5 mol trp na 1ml, 0,1ml tohoto roztoku se pipetuje do polypropylenové odstředivkové kyvety (11 x 50mm), přidá se 25mg částečně hydrolyzovaného škrobu a 0,5ml
5n NaOH, čerstvě připraveného z 50% NaOH . Kyveta se pak umístí do tenkostěnné
zkumavky (16 x 150mm) a přidá se 5µl 1% roztoku oktanolu v toluenu pro zamezení
pěnění.
Zkumavka se přibližně v polovině vytáhne nad kyslíkovým plamenem do průměru
asi 2mm. U tenkostěnné zkumavky to lze provést bez poškození plastické vložky. Pak se
spodek zkumavky vychladí ve směsi acetonu a suchého ledu po 90s tak, aby nezmrzl obsah.
Poté se evakuuje olejovou vývěvou, přičemž se spojením se zdrojem vakua několikrát
přeruší a v případě, že vzorek příliš pění, se zkumavka opět ponoří do chladící lázně. Po
dosažení evakuace po 50 m Hg se zkumavka zataví. Zatavená zkumavka se hydrolyzuje
při 110 1o C. Po dokonalém ochlazení se pak zkumavka otevře naříznutím a přiložením
horké skleněné tyčinky.
Ke vzorku se přidá 0,5ml sodnocitrátového pufru o pH 4,25 (nemá obsahovat BRIJ
- 35) a směs se promíchá. Pak se roztok kvantitativně převede tímto pufrem do 5ml
INGOS s.r.o.
Strana 29
3
AAA400
odměrky, obsahující 420µl 6N HCl a umístěné v suchém ledu. Pak se obsah baňky doplní
po značku. Případný zákal odstraníme odstředěním po dobu 30 minut při 40,000 g.
3.2.10 Zdroje chyb
Výtěžky tryptofanu touto metodou dosahují 100 2% za předpokladu, dostatečné
doby hydrolýzy. Pro většinu bílkovin postačuje 16 hodin, avšak vazba Val - Trp nebo Ile Trp vyžaduje až 98 hodin nebo 48 hodin při 135o C. Pro stanovení jiných aminokyselin se
bazické hydrolýzy nepoužívá (s vyjímkou metioninsulfoxidu), neboť u řady z nich dochází
ke značným změnám. Arginin přechází částečně na ornitin, cystin na lanthionin, reakcí
rozkladných produktů cystinu a serinu s lysinem vzniká lysinoalanin atd. Pro oddělení
tryptofanu od lysinoalaninu při automatické analýze doporučujeme metodu Hugliho a
Moora [7].
3.3 Krevní plazma
Krevní plasma či serum obsahující volné aminokyseliny, bílkoviny odstraňované deproteinací a vázané aminokyseliny v ninhydrinnegativních formách, neodstranitelné deproteinací. K odbílkovinování byla navržena ultrafiltrace, gelová filtrace, ultracentrifugace
po okyselení apod., nejběžnější jsou však metody chemické deproteinace, zejména pomocí
kyseliny sulfosalicylové a pikrové.
3.3.2 Odbìr a pøíprava plasmy pro deproteinaci
Odebraná krev se převede do centrifugační zkumavky, obsahující 5mg heparinu/25ml
krve, odstředí se 10 minut při 21 000 g a supernatan se odebere pro analýzu tak, aby
se zamezilo jaho kontaminaci sedlinou. Všechny operace včetně deproteinace mají být
provedeny ihned po odběru.
3.3.3 Deproteinace kyselinou sulfosalicylovou
K plasmě přidáme pevnou kyselinu sulfosalicylovou v poměru 3Omg na 1ml plasmy,
protřepeme a odstředíme 1O minut při 21 000 g. Pro eliminaci chyb, vzniklých změnami
objemu kapalné fáze lze při deproteinaci přidat vnitřní standard norleucinu (10µmol) ml
v 0,02N HCl/ v poměru 0,2ml na 4 ml plasmy.
Tento postup poskytuje roztok, jehož koncentrace aminokyselin (0,05-0,6µmol/ml)
je postačující pro přímé dávkování do analyzátoru. Použití kyseliny sulfosalicylové však
může v některých případech poněkud zhoršit dělení kyselých a neutrálních aminokyselin
v oblasti od startu po pík serinu.
3.3.4 Deproteinace kyselinou pikrovou [10]
Ke 4ml plazmy 20 ml 1% roztoku kyseliny pikrové. Po pečlivém protřepání se odstředí
a 20ml supernatantu se nanese na kolonku průměru 2 cm, plněnou 6ml středně bazického
anexu (Ionex Bio Rad AG 2 - X 10 použitý v původní práci lze nahradit Dowexwm 2,
Amberlitem IRA - 410 nebo Ostionem AD. Vhodné zrnění je 200 - 4OO event. 100 - 200
mesh.).Ionex slouží k odstranění kyseliny pikrové.
INGOS s.r.o.
Strana 30
3
AAA400
Příprava ionexového sloupce: ionex několikrát rozmícháme v cca 10násobném množství destilované vody a opakovanou dekantací odstraníme prachové částice. Poté ionex
promyjeme na fritě 10násobným objemem 1N HCl, destilovanou vodou do neutrální reakce efluentu a ve vodní suspenzi /2 díly vody na 1 díl ionexu) jej plníme do kolony.
Uvedené množství ionexu vytvoří asi 2cm vysoký sloupec, jehož povrch chráníme přiložením kolečka filtračního papíru. Kolonu promyjeme 15ml 1N HCl a po opětném promytí
vodou do neutrální reakce je kolona připravena. Nad povrchem ionexu ponecháme 2 5mm kapaliny - povrch nesmí vyschnout!! Při průchodu vzorku kolonou jímáme veškerý
eluent. Po úplném vsáknutí vzorku (musíme však zabránit vniknutí vzduchu do ionexového sloupce) opláchneme stěny 3ml 0,02N HCl. Po vsáknutí kyseliny postup ještě
dvakrát opakujeme se stejnou dávkou HCl a nakonec s 1ml dávkou 0,02N HCl. Nemámeli k dispozici lyofilizaci, postupujeme podle Steina a Moora [12] tak, že vzorek odpaříme
ve vakuu a po rozpuštění vzorku ve vodě a přibližné neutralizaci na pH 7 - 8 oxidujeme
cystein na cystin stáním při laboratorní teplotě po dobu 4 hod. Pak vzorek okyselíme
(pH 2,2).
3.3.5 Pøíprava vzorku plazmy pro stanovení tryptofanu
Chceme-li určit veškerý volný tryptofan v plazmě včetně podílu reversibilně vázaného
na bílkoviny, použijeme deproteinace kyselinou trichloroctovou [10].
3.3.6 Stanovení ve¹kerých nebílkoviných aminokyselin v plasmì
Pro stanovení veškerých aminokyselin včetně konjugovaných použijeme 1ml alikvot.
roztoku, získaného po deproteinaci kyselinou pikrovou a přečištěním na anexu. Postupujeme podle části 3.2.2 str. 26, odparek po hydrolýze rozpustíme ve 2ml pufru pH 2,2.
3.3.7 Zdroje chyb
Při opakované venipunktuře klesá v odebrané plasmě obsah taurinu a kyseliny glutamové. Opožděná deproteinace způsobuje zrtáty cystinu, homocystinu a směsných disulfidů sirných aminokyselin. Při kontaminaci odebrané plasmy krevními destičkami a
leukocyty vzrůstá obsah taurinu, kyseliny asparagové a glutámové. Hemolýza se projevuje nálezem glutathionu a vzrůstem obsahu ornitinu, zatím co obsah kyseliny asparagové
a cystinu klesá.
Skladování plazmy při teplotách nad -68o C vede ke zvýšení obsahu kyseliny asparágové a glutámové na úkor příslušných amidů. Snižuje se rovněž obsah tryptofanu. Obsah
amidů se snižuje rovněž zpracováním vzorku nad 40o C a stáním okyseleného vzorku při
nízkém pH (glutamin je podstatně labilnější než asparagin). Použitím kyseliny etylendiamintetraoctové jako antikoagulantu mohou být do vzorku zaneseny ninhydrinpositivní
nečistoty.
Pokud jde o volbu optimálního deproteinačního činidla z hlediska výtěžků volných
aminokyselin a jejich reprodukovatelnosti, literární výsledky nejsou jednoznačné.
3.4 Tkáòové extrakty
INGOS s.r.o.
Strana 31
3
AAA400
V živočišných tkáních nacházíme kromě volných aminokyselin rovněž některé typické
peptidy. Výskyt některých z nich (karnosin, anserin, homokarnosin apod.) je vázán pouze
na některé tkáně, zatím co peptid glutation nacházíme v oxidované i redukované formě
ve všech tkáňových vzorcích. Ve vysoké koncentraci je glutathion přítomen v játrech.
Redukovaný glutathion se eluuje v oblasti píku kyseliny asparágové, oxidovaný se vymývá
jako velmi široký pík za glutaminem. Příprava vzorku tkáně zahrnuje extrakci spojenou
s deproteinací a odstranění glutathionu.
3.4.2 Pøíprava vzorku s pou¾itím kyseliny pikrové [13]
Tkáně určené k analýze mají být pokud možno co nejrychleji vyjmuty z vykrváceného
živočicha a zpracovány. Mají-li být převáženy nebo uchovány, musí být zmrazeny suchým
ledem a přechovávány při -45o C. Tkáň zbavenou tuku a spojovacího vaziva odvážíme
a rozřežeme na dávky, které přelijeme v mixéru desetinásobkem váhového množství 1%
vodného roztoku kyseliny pikrové. Pro mozkové tkáně použijeme pětinásobného přebytku.
Po homogenizaci v mixéru rychle odstředíme vyloučené bílkoviny a kapalný podíl
naneseme na kolonu, plněnou středně bazickým anexem (viz část 3.3.4 str. 30). Pro méně
než 80ml extraktu použijeme kolonu, která má vnitřní průměr 2cm, plněnou 6ml ionexem.
Stěny kolony se vymyjí 3 x 5ml 0,02N HCl, veškerá kapalina vycházející z kolony při
nanášení vzorku a vyplachování kolony se jímá. Pro větší množství extraktu použijeme
dvojnásobného množství měniče iontů a pro mozkové extrakty používáme kolonu průměru
7,5cm, plněnou ionexem do výše 2cm. Pro změněné množství ionexu přiměřeně upravíme
i množství HCl pro výplach kolony. Eluát z kolony lyofilizujeme nebo vakuově odpaříme
na objem asi 1ml. Objeví-li se sraženina, přidáme asi 4ml vody a několik mg Cellitu
a suspenzi přefiltrujeme na filtru, promytém 1N HCl a vodou. Filtrát opět odpaříme.
Koncentrát vymyjeme do 5ml odměrky tak aby objem nepřekročil 3ml. V této fázi lze
vzorek uskladnit ve zmrazeném stavu přes noc. Následující den upravíme pH roztoku na 7
- 8 pomocí 1N NaOH (kontrola indikátorovým papírkem) a objemem destilovanou vodou
na 5ml.
Ze vzorku odebereme alikvot pro stanovení celkového obsahu volných a vázaných
aminokyselin po hydrolýze (viz část 3.2.2 str. 26) a další 2ml alikvot smísíme s 0,5N
siřičitanem sodným, který přidáme v poměru 0,2ml na každých 2,5g tkáně v alikvotu extraktu. Oba podíly vzorku nepodrobeného hydrolýze (s přidáním a bez přidání Na2SO3)
ponecháme 4 hodiny při laboratorní teplotě. V podílu neobsahujícím siřičitan dojde k
oxidaci cysteinu na cystin, zatím co v alikvotu s přídavkem siřičitanu přejdou obě formy
glutathioninu na glutathion - S - sulfonát, eluovaný při automatické analýze před kyselinou asparágovou. Rovněž cystein na cystin v tomto podílu vzorku přejdou na příslušný
- S - sulfonát, vycházející na počátku analýzy s mrtvým objemem kolony. Pro stanovení
cystinu proto použijeme podíl bez přídavku Na2SO3. Konečnou fází přípravy vzorku je
úprava pH 1M HCl na 2,2 tak, aby konečná koncentrace vzorku odpovídala (přibližně)
0,5g původní tkáně na 1ml.
INGOS s.r.o.
Strana 32
3
AAA400
3.4.3 Zdroje chyb
Popsaný postup poskytuje snížené výtěžky citrulinu, homocitrulinu a tryptofanu a
podle Saifera [15] rovněž bazických a sirných aminokyselin. K deproteinaci lze použít i
jiných činidel, z nichž se pro mozkové extrakty nejlépe osvědčila kyselina chloristá, kterou
lze jednoduše odstranit přidáním KOH a ochlazením roztoku [15]. Tkáňové extrakty někdy čistíme rovněž na katexu (viz část 3.6.2 str. 33), chceme-li získat čisté aminokyseliny.
3.5 Moè
Moč je z hlediska automatické analýzy aminokyselin velmi složitým materiálem. Převažujícími ninhydrinpozitivními složkami jsou močovina a čpavek, více než 50% aminokyselin v moči je přítomno v různých konjugovaných formách. Bílkoviny nejsou v normální
moči přítomny.
3.5.2 Odbìr a zpracování vzorku moèi
Vzorek předkládaný k analýze zpravidla představuje 24 hodinový sběr, který má být
konzervován přídavkem několika ml toluenu a uchovávám v chladnici. Vícedenní skladování vzorku vyžaduje uložení v polyetylénové lahvi v mraznici. Před analýzou ohřejeme
vzorek na laboratorní teplotu a zjistíme jeho celkový objem a specifickou hmotnost. Pokud z moči neodstraňujeme čpavek, je jedinou úpravou pro analýzu okyselení vzorku na
pH 2 6M HCl. Jestliže rozlehlý pík čpavku znemožňuje stanovení sousedních látek, přidáme k 10ml moči v kádince po kapkách 2 - 4M NaOH až do dosažení pH 11,5 - 12.
Reakci kontrolujeme indikátorovým papírkem. Kádinku s močí pak vložíme do exikátoru
a evekuujeme vodní vývěvou 6 hodin. Poté moč z exikátoru vyjmeme, upravíme pH na
2,2 pomocí 6M HCl a objem adjustujeme pufrem o pH 2,2 [8].
Pro stanovení veškerých aminokyselin v moči včetně konjugovaných hydrolyzujeme
1ml alikvot moči se stejným objemem 12N HCl podle části 3.2.2 str. 26. Residuum po
vakuovém odpaření rozpustíme ve 3ml pufru o pH 2,2, převedeme do 5ml odměrky a
doplníme pufrem po značku.
3.6 Rostlinné extrakty
Rostlinné extrakty jsou z hlediska analýzy aminokyselin rovněž velmi složitým materiálem, neboť jsou výhradním zdrojem většiny z dosud známých několika set volných
aminokyselin [16],[17]. Většina z těchto aminokyselin je však svým výskytem omezena na
několik příbuzných rostlin a většina hospodářsky významných rostlin tyto vzácné aminokyseliny neobsahuje. Kromě aminokyselin však rostlinné extrakty mohou obsahovat i
další ninhydrinpozitivní látky jako aminy, kyselé - glutamylové peptidy, rostlinná barviva
a dusíkaté látky, reagující s ninhydrinem (např. redukující cukry). Příprava rostliných
vzorků pro stanovení volných aminokyselin vyžaduje desintegraci rostlinných buněk, extrakci aminokyselin a případně odstranění rušivých složek extraktů.
3.6.2 Extrakce rostlinných vzorkù a úpravy extraktù
INGOS s.r.o.
Strana 33
3
AAA400
Nejběžnějším extrakčním činidlem je etanol, který na aminokyseliny nepůsobí chemicky agresivně, lze jej snadno odpařit a za varu zároveň deproteinuje extrakt.
50g jemně pokrájeného vzorku či rozemletého suchého vzorku (rostlinných materiálů
s nízkým obsahem vody a pevnými buněčnými stěnami rozetřeme vzorek v třecí misce s
abrasivním materiálem, např. skleněnou drtí), doplníme 200ml vroucího alkoholu, jehož
koncentrací upravíme horkou vodou podle obsahu vody ve vzorku tak, aby konečná koncentrace po smíšení se vzorkem byla 80% objemových. Směs vaříme 5 minut pod zpětným
chladičem a necháváme vychladnout na laboratorní teplotu. Pak směs převedeme 80%
alkoholu a směs homogenizujeme po dobu 20 minut. Poté necháme usadit pevnou fázi a
kapalný podíl přidáme k supernatantu po odstředění.
Extrakci v mixéru opakujeme ještě 3x s novými 100ml dávkami 80% alkoholu. Kombinované kapalné podíly necháme přes noc stát v lednici, druhý den je zfiltrujeme, filtr
propláchneme 80% alkoholem a další zpracování volíme podle povahy vzorku. Materiály s
vysokým obsahem volných aminokyselin, nebo s nízkým obsahem barviv (např. podzemní
části) a vzorky, u nichž je nutno přesně stanovit obsah glutaminu a kyseliny glutamové,
zpracováváme takto:
Filtrovaný extrakt odpaříme při 50o C na rotačním vakuovém odpařováku na koncentraci asi 2,5 - 25g vzorku na ml roztoku (podle očekávaného obsahu aminokyselin). Koncentrát lze skladovat v lednici. Před analýzou odebereme z koncentrátu temperovaného na
laboratorní teplotu 1 - 2ml, k nimž po převedení do odměrné baňky přidáme 0,5ml vnitřního standardu (norleucin v 10% isopropanolu, 10mol/ml) a 1ml 1,5M litno Citrátového
pufru. Tento pufr připravíme podle návodu pro přípravu 0,3M litnocitrátového pufru o
pH 2,2 použijeme však pětinásobné navážky . Roztok doplníme po značku destilovanou
vodou a ponecháme stát 1 hodinu v chladnici. Pak roztok, je-li třeba, odstředíme a ihned
použijeme k analýze. Vzorek po přidání pufru je nestálý - dochází k hydrolýze glutaminu
vlivem nízkého pH.
V takto připraveném vzorku se mohou při chromatografii kromě aminokyselin objevit
i píky jiných látek, zmíněných v části 3.6.1 str. 33. Píky cukrů a rostlinných barviv jsou
lokalizovány na chromatogramu v oblasti píku kyseliny cysteové.
Vzorky obsahující zvýšené množství pigmentů nelze úspěšně koncentrovat ve vakuu
bez vypadnutí pevné fáze. Kromě toho mohou tyto látky koagulovat v kapilárním reaktoru a způsobit nekvalitní zápis, případně ucpat reaktor. Téměř čisté směsi aminokyselin
lze získat čištěním extraktu na měniči kationtů v H+ formě. Lze použít jakéhokoliv silně
kyselého sulfonovaného polystyrenového katexu (Dowex 50W, Amberlite IT - 120, Kationit KV - 2, Bio Rad AG - 50W atp.).
100ml extraktu prolijeme kolonkou, obsahující 16ml ionexu ve formě H+ (na tuto
formu ionex převedeme 2N HCl a propláchneme vodou do neutrální reakce). Po vsáknutí
vzorku kolonku promyjeme 300ml destilované vody, kterou vymyjeme část rostlinných
barviv, cukry a anorganické i organické kationty. Pak vymyjeme aminokyseliny (18) postupnou elucí 100ml 2M NH4OH a 100ml 4M NH4OH při průtokové rychlosti asi 5ml/min.
Čpavek odstraníme odpařením na vakuovém rotačním odpařováku při 40o C. Suchý
odparek rozpustíme ve 2,5ml 10% isopropanolu (je výhodné, obsahuje-li roztok vnitřní
standard norleucin v koncentraci 1µmol/ml). Rozpuštěný odparek skladujeme v chladINGOS s.r.o.
Strana 34
3
AAA400
ničce. Hodinu před analýzou odebereme z roztoku vytemperovaného na laboratorní teplotu 2ml, přidáme 1ml 1,5M litnocitrátového pufru a doplníme destilovanou vodou po
značku. Ponecháme vzorek 1 hodinu v chladničce. Před dávkováním do analyzátoru odstředíme případnou sraženinu.
3.6.3 Pøíprava vzorkù pro stanovení aminokyselin rostliny
Při použití jiných extrakčních činidel než vroucího alkoholu přecházejí spolu s volnými
aminokyselinami do roztoku ve větší či menší míře i rostlinné bílkoviny [18][19]. Pro správnou interpretaci výsledků je proto nutno dbát na oddělení nízko- a vysokomolekulárního
podílu.
Z extraktu se bílkoviny sráží sedminásobným přebytkem acetonu při stání při -200 C,
nebo smíšením s 10% roztokem kyseliny trichloroctové v poměru 1:1. Sraženiny se po
důkladném promytí suší a navažují k hydrolýze, při níž ke ztrátám přispívá přítomnost
síranu, těžkých kovů a zbytku organických činidel.
3.6.4 Zdroje chyb
Extrakce: Žádné extrakční činidlo neposkytuje zcela kvantitativní výtěžky. Pro zvýšení výtěžku je účinnější zvětšit počet opakování než zvětšit objem extraktantu. Použití
kyselých extrakčních činidel obsahujících alkohol může vést za vyšších teplot k esterifikaci některých aminokyselin, nízké pH způsobuje hydrolýzu glutaminu. Dlouhodobé
zahřívání vzorku při neutrální reakci (zejména přítomnosti fosfátu) působí cyklaci glutaminu na ninhydrinem nedetekovatelnou kyselinu pyrolidonkarbonovou. V přítomnosti
bílkovin může dojít k vazbě sirných aminokyselin na bílkovinu nebo k proteolýze.
Dělení na katexu: Působí 16 - 50% ztráty kyseliny glutámové cyklací. Může dojít
i ke ztrátám jiných aminokyselin hydrolýzou, neúplným zadržením na koloně (kyselina
asparágová), neúplnou elucí či vlivem bazické reakce. Ztráty si můžeme ověřit modelovým
pokusem se standardní směsí aminokyselin a standardizujeme je pečlivým dodržováním
konstantních časů jednotlivých operací. Místo čpavku, jehož přítomnost v odparku může
rušit sousední píky, lze použít trimetylaminu [20]. Z katexu se mohou rovněž vymývat v
něm obsažené ninhydrinpozitivní látky, vymývané při automatické analýze přibližně na
místě čpavku.
3.7 Potraviny a krmiva
Jedná se o velmi různorodou skupinu vzorků rostlinného, živočišného event. mikrobielního původu. Pro stanovení nutriční hodnoty zpravidla stanovujeme celkový obsah
volných i vázaných aminokyselin po hydrolýze vzorku. Pro posouzení vlivu technologie
výroby a skladování je často účelné sledovat i obsah volných aminokyselin. Při technologickém zpracování se mohou ve vzorcích vytvářet ninhydrinpozitivní látky, jež se ve
výchozím přírodním materiálu nevyskytují.
INGOS s.r.o.
Strana 35
3
AAA400
3.7.2 Pøíprava vzorkù pro stanovení volných aminokyselin
Příprava vzorků je určována jeho původem. U vzorků živočišného původu postupujeme jako při přípravě vzorků pro stanovení volných aminokyselin v tkáňových extraktech
(část 3.4 str. 31), u vzorků rostlinného původu postupujeme jako při přípravě rostliných
extraktů (3.6 str. 33). Jsou-li vzorky v tekuté formě či ve formě zcela rozpustné ve vodě,
deproteinujeme roztok kyselinou trichloroctovou (3.6.3 str. 35), vysrážené bílkoviny dokonale promyjeme vodou, vysušíme a použijeme pro přípravu hydrolyzátu (část 3.2 str.
26 a další 3.7.3 str. 36).
Bylo-li do vzorku při technologickém zpracování vneseno větší množství cizorodých
látek, můžeme vzorek přečistit na katexu (3.6.2 str. 33).
3.7.3 Hydrolýzy potravin a krmiv
Metodika přípravy hydrolyzátů potravin a krmiv se liší od práce s čistými bílkovinami, neboť vzhledem k heterogenitě materiálu zpravidla pracujeme s velkými navážkami
a upouštíme od evakuace vzorku, kterou nahražujeme dusíkovou atmosférou. Vzorky s
vysokým obsahem tuků (olejniny) před hydrolýzou navažujeme zásadně suché, jemně
mleté vzorky se známým obsahem dusíku.
Postup při hydrolýze 6M HCl: 0,5 - 2,5g jemně mletého suchého vzorku odpovídající 0,04g N/0,25g dusíkatých látek (navážíme do 500ml trojhrdlé varné baňky, zalijeme
250ml 6M HCl, jedním z postraních ramen zavedeme kapilárou proud dusíku a hydrolyzujeme 24 hodin pod zpětným chladičem. Ochlazený hydrolyzát přefiltrujeme přes fritu
S2. Hydrolyzační baňku a fritu promyjeme 0,1M HCl. Spojené filtráty a promývací vody
kvantitativně převedeme do odměrky o objemu 500ml a doplníme destilovanou vodou po
značku. Z roztoku odebereme 50ml alikvot, odpovídající 0,004g N, který odpaříme při
50o C ve vakuovém rotačním odpařováku do sirupovité konsistence. Odparek převedeme
0,2M sodnocitrátovým pufrem pH 2,2 do 50ml odměrky a doplníme.
Alternativní provedení hydrolýzy: Pohodlnější než hydrolýza pod zpětným chladičem
je použití speciálních ampulí . Navažujeme stejné množství vzorku, přidáme 150ml 6M
HCl a obsah ampule probubláme pomocí kapiláry analyticky čistým N2 po dobu 10 minut
(pěnění potlačuje 0,2ml kyseliny kaprylové) a zatavíme. Zatavené ampule stavíme ve vertikální poloze do termostatu vytemperovaného na 100 1o C na 22 hodin. Po dokonalém
ochlazení nařízneme zúženou část ampule těsně pod zatavením, špičku odlomíme a obsah
převedeme na fritu S2. Ampuli a fritu proplachujeme 0,1M HCl a dále postupujeme jako
v předchozí metodě. Ampuli lze několikanásobně použít, pokud je její stopka alespoň
2cm dlouhá. Hydrolýzu lze značně urychlit vyšší teplotou a tlakem (použitím autoklávu).
Podle literatury [2] jsou 4 hodiny při 145o C ekvivalentní 26 hodinám při 110o C.
3.7.4 Zdroje chyb
Z literatury lze soudit, že u vzorků s vysokým obsahem nebílkovinných látek způsob
hydrolýzy (reflux, hydrolýza v zatavené nádobě pod vakuem či pod dusíkem) významně
neovlivňuje výsledky. Ztráty aminokyselin však mohou být významně ovlivňovány složením vzorku.
INGOS s.r.o.
Strana 36
3
AAA400
Analyzujeme-li sériově vzorky o podobném složení (např. obilniny), je vhodné u reprezentativního vzorku na základě několika časů hydrolýzy (viz. část 3.2.3 str. 27) zjistit
ztráty labilních aminokyselin, stanovitelných po hydrolýze HCl (threoninu, serinu, tyrosinu). Pro ostatní sériové rozbory pak používáme jen jediného času hydrolýzy (obvykle
20 až 24 hodin) a ztráty korigujeme pomocí vypočtených korekčních faktorů [23].
Při interpretaci chromatogramu hydrolyzátu může činit obtíže přítomnost volných
aminokyselin ve vzorku před hydrolýzou. Některé z těchto látek jsou při hydrolýze stabilní (kyselina -aminoadipová, kyselina -aminomáselná, ornithin a řada méně běžných
rostlinných aminokyselin, labilní látky se mohou rozpadat na ninhydrinpozitivní rozkladné produkty.
U vzorků s významným zastoupením volných aminokyselin lze proto doporučit nejprve provést analýzu hydrogenizovaného vzorku metodou pro volné aminokyseliny a teprve po zjištění spektra ninhydrinpozitivních látek použít pro seriové rozbory hydrolyzátové metodiky.
Působení alkálií na vzorek před hydrolýzou se může projevit částečným přechodem
argininu na ornithin a tvorbu lanthioninu z cystinu.
Přítomnost cukrů podle většiny autorů nezvyšuje ztráty aminokyselin při hydrolýze.
Některé rozkladné produkty cukrů se při automatické analýze eluují v oblasti za kyselinou cysteovou, další podíl sacharidů přechází do tzv. huminů, jež částečně odstraňujeme
filtrací na fritě. Použití odbarvovacích prostředků pro odstranění tmavě zbarvených huminových látek nelze doporučit vzhledem k možnosti absorbce některých aminokyselin.
3.7.5 Pøíprava vzorkù pro stanovení sirných aminokyselin
Pro stanovení sirných aminokyselin v krmivech a potravinách používáme zásadně
oxidační metodiky (viz. část 3.2.4 str. 28), neboť zejména u vzorků rostlinného původu
při hydrolýze HCl nelze zabránit ztrátám.
Poznámky k metodice: Na navážku vzorku odpovídající 0,04g N použijeme 100ml
oxidační směsi. Pěnění vzorku při odpařování potlačujeme přídavkem 0,2ml kyseliny kaprylové. Po odpaření kyseliny permravenčí hydrolyzujeme vzorky přímo v baňce, v níž byl
vzorek oxidován, pod zpětným chladičem. Přívod dusíku není nutný. Hydrolýza v uzavřených ampulích se nedoporučuje, při nedokonalém odpaření oxidační směsi by mohlo
dojít k explozi.
Chybu při stanovení kyseliny cysteové může způsobit přítomnost železitého iontu, jež
se eluuje na stejném místě chromatogramu. Lze jej však odstranit na katexu v H+ formě
(3.6.2 str. 33).
S kyselinou cysteovou se mohou rovněž smývat oxidační produkty jiných sirných
aminokyselin, vyskytující se např. ve volné formě v některých rostlinách.
3.7.6 Pøíprava vzorkù potravin pro stanovení tryptofanu
Vzhledem k přítomnosti cukrů používáme při stanovení vázaného tryptofanu v krmivech a potravinách zásadně bazické hydrolýzy (část 3.2.9 str. 29). Část vzorku jež se
při hydrolýze nerozpustila, se odstraní odstředěním. Na sraženině se může absorbovat
INGOS s.r.o.
Strana 37
3
AAA400
část tryptofanu - údaj o 4% ztrátách [7] se doporučuje přezkoušet přídavkem známého
množství tryptofanu event. analýzou neodstředěného vzorku.
3.8 Literatura
Uvádíme výběr prací souvisejících s přípravou vzorků s krátkými charakteristikami:
1. S.MOORE, W.H.STEIN: Methods Enzymol. 6, 1963, 819 Diskuze klasického způsobu kyselé hydrolýzy.
2. D.ROACH, C.W.GEHRKE: J. Chromatog. 52, 1970, 393 Přehled literatury o kyselé hydrolýze, zrychlení zvýšením teploty. 3. E.J.ROBEL, A.B.CRANE: Anal. Biochem.
49, 1972, 233 Korekce ztrát při hydrolýze - přehled literatury, popis nové metody. 4.
F.SCHRAMM, S.MOORE, E.J.BIGWOOD: Biochem. J. 59, 1954, 33 Oxidace sirných
aminokyselin kyselinou permravenčí.
5. S.MOORE: J. Biol. Chem. 238, 1963, 235 Zdokonalení oxidace.
6. H.MATSUBARA, R.M.SASAKI: Biochim. Biophys. Res. Commun. 35, 1969, 175
Ochrana tryptofanu při kyselé hydrolýze.
7. T.E.HUGLI, S.MOORE: J. Biol. Chem. 247, 1972, 3828 Bazické hydrolýzy bílkovin
a automatické stanovení tryptofanu. 8. J.V.BENSON, J.A.PATTERSON: Anal. Biochem.
13, 1965, 365 Příprava vzorku moči.
9. T.L.PERRY, S.HANSEN: Clin. Chim. Acta 25, 1969, 53 Deproteinace plasmy
kyselinou sulfosalicylovou, zdroje chyb. 10.B.J.BERRIDGE, W.R.CHAO, J.H.PETERS:
Amer. J. Clin. Nutr. 24, 1971, 934 Příprava vzorků krve a moče.
11.J.M.PETERS, B.J.BERRIDGE: Chromatog. Rev. 12, 1970, 157 Přehledný referát
o stanovení aminokyselin v krvi, moči.
12.W.H.STEIN, S.MOORE: J. Biol. Chem. 211, 1954, 915 Deproteinace krevní plasmy
kyselinou pikrovou.
13.H.H.TALLAN, S.MOORE, W.H.STEIN: J. Biol. Chem. 211, 1954, 927 Příprava
tkáňových extraktů kyselinou pikrovou.
14.J.E.KNIPPEL, D,A.CHRISTIANSEN, B.D.OWEN: J. Assoc. Off. Anal. Chem.
92, 1969, 981 Srovnání kyseliny pikrové a sulfosalicylové při deproteinaci krve a tkáňových
extraktů. 15.A.SEIFER: Anal. Biochem. 40, 1971, 412 Porovnání sedmi metod extrakce
a deproteinace mozkových tkání.
16.L.FOWDEN: Progres. Phytochem. 2, 1970, 203 Přehledný referát o volných aminokyselinách v rostlinách.
17.R.M.ZACHARIAS, E.E.TALEY: Anal.Chem. 34, 1962, 1951 Ninhydrinpozitivní
složky rostlinných extraktů.
18.S.T.NGUYEN, R.PAQUIN: J. Chromatog. 61, 1971, 349 Extrakce volných aminokyselin a bílkovin z rostlin, deproteinace, čištění na katexu.
19.V.P.KRIŠČENKO: Izvestia AN SSSR, ser. biol. No 3, 1978, 406 Komplexní metodika stanovení aminokyselin v různých frakcích dusíkatého komplexu rostlin. 20.E.WELTE,
PRZEMECK, R.,M.C.NUH: Z. Pflanzenernahr. Bodenkunde 128, 1971, 243 Příprava
vzorků pro analýzu volných aminokyselin v rostlinách.
20.VRÁTNÝ, P.J.OUHRABKOVÁ: J. Chromatog. 152, 1978, 214 příprava vzorků a
automatická analýza rostlinných extraktů. 22.J.V.CAVINS, W.F.KWOLEK, E.E.INGLET,
INGOS s.r.o.
Strana 38
3
AAA400
J.C.COWAN: J. Assoc. Off Anal.Chem. 55, 1972, 686 Vliv přípravy vzorku na reprodukovatelnost stanovení aminokyselin v soji. 23.R.TKACHUK, G.N.IRVINE: Cereal Chem.
46, 1969, 206 Stanovení aminokyselin v obilovinách a olejninách.
21.KREIENGRING, F.M.MEINL, J.EUNSCHE: Nahrung 16, 1972, 671 Optimalizace
hydrolýzy krmiv.
22.SINNER, J.PULS: J. Chrom 156 (1978) 197-204
23.JOSIČ R.HOFERMAAS, Ch BAUER, W.REUTTER: J. Chrom. 317 (1984) 35-39
24.KENNTH MOPPER, E.NELVIN GINDLER: Analyt. biochem. 56, 1973, 440-442
25.TAKEHARU MASAKI: J. Chrom. 332 (1985) 275-282
26.JOHN O.BAKER, MICHAEL E.HIMMEL: J. Chrom. 357 (1986) 161-181
27.G.ALIQURESHI, A.GUTIERREZ, J.BERGSTR”OM: J. Chrom. 374 (1986) 363369
28.SVEND ERIK MOLLER, J.of Chrom.613,1993,223-230
29.BARRY N.JONES and JAMES P.GLLIGAN,J.of Chromatography 226,(1983)
471-482
INGOS s.r.o.
Strana 39
3
4. BIOGENNÍ AMINY
Biogenní aminy vznikají většinou dekarboxylací aminokyselin (viz několik příkladů v
kapitole 4.2). Mohou se dělit na monoaminy a polyaminy. Některé jsou zdraví prospěšné,
jiné zdraví škodí a jsou důkazem počátku kažení potravin. Mezi nejznámější patří tyramin
(vzniklý dekarboxylací tyrosinu) dopamin (3,4-dihydroxifenylalanin, odvozený od histidinu), serotomin (odvozený od 5-hydroxitryptofanu), putrescin (od ornithinu) cadaverin
(od lysinu) a řada dalších.
Vzhledem k tomu, že firma INGOS chce svým zákazníkm nabídnout další využití
analyzátoru aminokyselin, bez náročných úprav, vypracovala metodiku stanovení nejdůležitějších biogenních aminů. Pro toto stanovení dodáváme veškeré potřebné chemikálie,
včetně standardů pro kalibraci přístroje.
4.1 Základní biogenní aminy
Histamin Je biogenní amin, stimuluje sekreci žaludečních šťáv , rozšiuje krevní kapiláry a snižuje tlak. Zvyšuje permeabilitu buněčných membrán a způsobuje kontrakci
hladkého svalstva trávícího traktu, dělohy a průdušek. Histamin je považován za tkáňový
hormon.
Serotomin Je živočišný hormon, biologicky aktivní látka, tzv. tkáňový hormon, vzniká
hydrolyzací a následnou dekarboxylací tryptofanu. Tvoří se v mnoha živočišných i rostlinných tkáních a působí jako neurotransmiser v místech svého vzniku. Má např. vazkonstrikční účinky (uvolňuje se z krevních destiček při poranění, viz. vazkonstrikce), ve
střevní sliznici povzbuzuje peristaltiku střevní, v CNS je jeho výlev spojen se stavy útlumu
(spánek). Serotomin je prerkursorem hormonu melatoninu.
Tyrosamin Je dekarboxylační produkt tyrosinu.
Dopamin Transmiser na synapsích v centrálním nervovém systému. Nedostatek dopaminu vede ke vzniku parkinsonu. (viz katecholaminy).
Putrescin Jedovatý organický amin, který vzniká mikrobiálním rozkladem bílkovin.
Cadaverin Je zásaditá organická látka, která vzniká při enzymové dekarboxylaci lysinu.
4.2 Pøíklady vzniku biogenních aminù
Vznik putrescinu:
!"#
INGOS s.r.o.
Strana 40
4
AAA400
Kapitola 4: BIOGENNÍ AMINY
Vznik tyraminu:
Vznik histaminu:
Vznik cadaverinu:
4
!
4.3 Úprava AAA400 pro stanovení biogenních aminù
Pro stanovení biogenních aminů je zbytečná předkolona, protože aminy jsou eluovány
prakticky za aminokyselinami. Tzn. že musíme nejprve vytěsnit z kolony aminokyseliny
a potom teprve rozdělit aminy. Předkolona slouží pouze pro pozdržení eluce amoniaku
obsaženém v elučních roztocích, proto je zbytečná.
1. Odpojíme předkolonu od přístroje a uzaveřme ji uzávěrem, aby nám nevyschla.
2. Připojíme analytickou kolonu přímo na odvzdušňovací ventil místo předkolony.
3. Vyprázdníme analytickou kolonu, nebo použijeme prázdnou (novou)
4. Kolonu naplníme (běžným způsobem) ionexem Ostion LG ANB do výše 6 cm a
dotáhneme horní uzávěr na kolonu. Výše ionexového sloupce se má pohybovat v
rozmezí 5,5 až 7 cm Vyšší výška sloupce zlepší dělení některých aminů. Podle našich
zkušeností je pro běžný provoz optimální výška sloupe 6cm.
5. Připravíme si pufry (eluční roztoky pro stanovení biogenních aminů) viz dále příprava
el.roztoků.
6. Příprava detekčního činidla ninhydrinu je totožná s přípravou pro aminokyseliny.
7. Průtoky, teplota reaktoru a ostatní parametry zůstávají stejné.
4.4 Program pro stanovení biogenních aminù
Čas
0.00
2.00
43.00
70.00
74.00
Teplota
60
60
60
60
60
INGOS s.r.o.
Pufr
1
1
2
2
6
Příkaz Poznámka
I
pufr 1
Z
pufr 1
pufr 2
S
pufr 2
0,2 M NaOH
Strana 41
AAA400
79.00
83.00
89.00
94.00
60
60
60
60
1
1
1
1
D
N
pufr
pufr
pufr
pufr
1
1
1
1
4.5 Slo¾ení pufrù pro stanovení biogenních aminù
Ředící pufr je běžný Na pufr pH 2.2, který se používá na ředění standardů a vzorků
pro analýzu hydrolyzátů. Jeho složení je totožné lze jej najít v technologické obrazovce
AAA 400 pod F1.
Pufr
1
2
Kyselina citronová
Citronan sodný
Chlorid sodný
Chlorid draselný
Bromid draselný
Hydroxid draselný
Isopropanol
1,05g
21,0g
5,0 g
41,65g
250,0ml
14,0g
171,5 g
10,0ml
-
Konečný objem
1000 ml
1000 ml
4
Tab.5 Pufry pro biogenní aminy
KOH (hydroxid draselný si připravíme rozpuštěním v H2 O, aby koncentrace na 1 ml
byla 0,5g,
Standardy pro toto stanovení se připravují buď v molární koncentraci běžné u aminokyselin, tzn. 2,5 mikromol na 1ml, nebo ve váhových množstvích v přesné koncentraci
50mg/ml. Firma INGOS připravuje standard v molové koncentraci, na přání zákazníka
vyrobíme i jinou koncentraci. Vzhledem k vysokým pořizovacím nákladům na pevné
(sypké) aminy nedoporučujeme zákazníkům, aby si připravovali tyto standardy. Standardy se přechovávají v chladničce za teploty +5o C. Jsou velice stálé, přibližně tak jako
standardy aminokyselin. Standardy od naší firmy jsou stabilizovány.
4.6 Poznámky ke stanovení biogenních aminù
Příprava pufrů není náročná jak na pH, tak na koncentraci iontů. Postačí navážit na
běžných pedvážkách a doplnit ve válci na předepsaný objem. Doporučujeme vzhledem k
velké spotřebě pufru 1 nahradit v přístroji 1000ml lahev za 2000 ml a připravovat rovnou
2000 ml pufru 1.
Pufr 2 vykazuje občas odskok nulové linie od základu, jelikož bývá vzhledem ke své
koncentraci iontů lehce zbarven do žluta, což není na závadu, pouze se zvýší poněkud
nulová linie.
Nedoporučujeme touto metodou stanovovat tryptamin, vzhledem k jeho nízké odezvě.
Lze jej stanovovat spolehlivě pouze při vyšší koncentrci ve vzorcích. Pokud budete mít
potřebu tryptamin stanovovat, jeho pík vychází těsně za cadaverinem, naše firma vám
připraví jeho standardní roztok ve vyšší koncentraci.
INGOS s.r.o.
Strana 42
AAA400
Také agmatin má malou odezvu při běžných koncentracích, proto o něm platí totéž
co o tryptaminu. Vychází v blízkosti sperminu.
Nemáte-li potebu stanovovat spermin a spermidin, lze celé stanovení zkrátit přibližně
o 40 min. Doporučujeme v tomto případě se obrátit na naše techniky, kteří s vámi tuto
problematiku vyřeší.
Firma vám též pomůže při zavádění tohoto programu, telefonicky, faxem a emailem
bezplatně, nebo placenou službou přímo u vás na pracovišti.
4
INGOS s.r.o.
Strana 43
5.1 Stanovení volných aminokyselin
Standard 25 nmol
Náplň kolony: OSTION Lg FA
Výška sloupce: 20-22 x 0.37 cm
Teplota kolony: Viz program
Pufry:
1: pH
2: pH
3: pH
4: pH
5: pH
6: 0.3
2.8 0.18 M Li+
3.1 0.20 M Li+
3.35 0.35 M Li+
4.05 0.33 M Li+
4.65 1.20 M Li+
M LiOH
Program:
Čas Teplota
0.00 38.00
33.00 38.00
45.00 70.00
50.00 70.00
63.00 70.00
95.00 74.00
120.00 74.00
136.00 53.00
139.00 74.00
144.00 38.00
160.00 38.00
Pufr
2
3
3
4
5
5
6
5
1
1
1
VS - chlor phenyl alanin
INGOS s.r.o.
Strana 44
5.2 Analýza hydrolyzátu
Standard 25 nmol
Náplň kolony: OSTION Lg ANB
Výška sloupce: 35 x 0.37 cm
Pufry:
1: pH
2: pH
3: pH
4:
5:
6: 0.2
2.7 0.2 M Na+
4.25 0.5 M Na+
6.9 1.12 M Na+
M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 50.00
1.00 50.00
29.00 50.00
44.00 60.00
63.00 74.00
66.00 74.00
71.00 74.00
77.00 60.00
82.00 53.00
87.00 50.00
101.00 50.00
INGOS s.r.o.
Pufr
1
4
2
3
3
6
1
1
1
1
1
Strana 45
5.3 Analýza hydrolyzátu
Hydrolyzát želatiny
Pufry:
1: pH
2: pH
3: pH
4:
5:
6: 0.2
2.7 0.2 M Na+
4.25 0.5 M Na+
6.9 1.12 M Na+
M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 50.00
1.00 50.00
29.00 50.00
44.00 60.00
63.00 74.00
66.00 74.00
71.00 74.00
77.00 60.00
82.00 53.00
87.00 50.00
101.00 50.00
INGOS s.r.o.
Pufr
1
4
2
3
3
6
1
1
1
1
1
Strana 46
5.4 Zkrácená analýza sirných aminokyselin
Standard 25 nmol
Pufry:
1: pH 2.7 0.2 M Na+
2:
3:
4:
5:
6: 0.2 M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 60.00
3.00 60.00
8.00 60.00
25.00 60.00
INGOS s.r.o.
Pufr
1
6
1
1
Strana 47
5.5 Zkrácená analýza sirných aminokyselin
Oxidativní hydrolyzát krmné směsi
Pufry:
1: pH 2.7 0.2 M Na+
2:
3:
4:
5:
6: 0.2 M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 60.00
3.00 60.00
8.00 60.00
25.00 60.00
INGOS s.r.o.
Pufr
1
6
1
1
Strana 48
5.6 Zrychlené stanovení TRP na zkrácené koloně
Standard 25 nmol
Pufry:
1: pH
2:
3: pH
4:
5: 0.4
6: 0.2
2.7 0.2 M Na+
6.9 1.12 M Na+
M Na+
M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 50.00
2.30 52.00
13.00 52.00
18.00 52.00
24.00 52.00
28.00 52.00
INGOS s.r.o.
Pufr
3
3
6
1
5
5
Strana 49
5.7 Zkrácené stanovení tyr, phe s použítím vnitřního standardu
Standard 25 nmol
Náplň kolony: OSTION Lg FA
Výška sloupce: 20-22 x 0.37 cm
Pufry:
1: pH
2:
3: pH
4: pH
5:
6: 0.3
2.8 0.18 M Li+
3.35 0.35 M Li+
4.05 0.33 M Li+
M LiOH
Program:
Čas Teplota
0.00 60.00
12.00 70.00
13.00 70.00
18.00 70.00
21.00 60.00
30.00 60.00
Pufr
4
4
6
1
3
3
VS - chlor phenyl alanin
INGOS s.r.o.
Strana 50
5.8 Zkrácené stanovení thr, lys
Standard 25 nmol
Pufry:
1: pH
2: pH
3: pH
4: pH
5:
6: 0.2
2.7 0.2 M Na+
4.25 0.5 M Na+
6.9 1.12 M Na+
3.0
M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 53.00
4.00 60.00
8.00 60.00
20.00 68.00
22.00 68.00
24.00 68.00
36.00 60.00
41.00 53.00
INGOS s.r.o.
Pufr
4
2
3
3
6
4
4
4
Strana 51
5.9 Stanovení biogenních aminů
Standard 25 nmol
AMINOKYSELINY
NEVYHODNOCUJÍ SE
Výška sloupce: 5.5-7 x 0.37 cm
Pufry:
1: Viz tabulka
2: Viz tabulka
3:
4:
5:
6: 0.2 M NaOH
Program:
Čas Teplota
0.00 60.00
48.00 60.00
74.00 60.00
79.00 60.00
94.00 60.00
Pufr
1
2
6
1
1
Tabulka:
Pufr
Kyselina citronová
Citronan sodný
Chlorid sodný
Chlorid draselný
Bromid draselný
Hydroxid draselný
Isopropanol
Konečný objem
INGOS s.r.o.
1
1,05g
21,0g
5,0 g
41,65g
250,0ml
1000 ml
2
14,0g
171,5 g
10,0ml
1000 ml
Strana 52
6. OBSAH
1. ÚVOD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1 Účel publikace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Základní chemická problematika aminokyselin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.1 Aminokyseliny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2 Výskyt aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.3 Historie analýzy aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.4 Reakce ninhydrinu s aminokyselinami . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.5 Detekce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3 Iontoměničová chromatografie aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.1 Stručná teorie iontoměničové chromatografie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 Iontoměniče . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ KAPITOLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1 Ionexy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.1 Ionex pro předkolonu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.2 Ostion LG ANB pro stanovení hydrolyzátů. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.3 Ostion LG FA pro stanovení volných aminokyselin. . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.4 Práce s ionexy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.5 Cyklování ionexu - čištění. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.6 Plnění analytických kolon pro hydrolyzáty Na cyklus. . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.7 Plnění analytických kolon pro volné aminokyseliny Li cyklus. . . . . . . 17
2.1.8 Plnění předkolony. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.9 Vyprazdňování kolon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2 Ninhydrinové činidlo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.1 Chemikálie potřebné pro přípravu ninhydrinového činidla: . . . . . . . . . 18
2.2.2 Ninhydrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.3 2-methoxyethanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.4 4 M acetátový tlumič. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.5 Hydrindantin dihydrát MW 358,31. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.6 Příprava ninhydrinového činidla. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.7 Bezpečnostní předpisy při práci s NHD činidlem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3 Příprava sodno citrátových elučních roztoků. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3.1 Seznam potřebných chemikálií: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3.2 Postup při přípravě elučních roztoků (dále jen pufrů) . . . . . . . . . . . . . . 20
2.3.3 Vlastnosti Na pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.4 Příprava ředícího roztoku pufru O.2 M Na, pH 2.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.5 Příprava regeneračního roztoku NaOH 0,2 M Na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3.6 Bezpečnostní předpisy pro práci s Na pufry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4 Příprava lithno citrátových elučních roztoků. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4.1 Seznam potřebných chemikálií . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4.2 Příprava ředícího pufru 0,1 M Li, pH 2,2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4.3 Příprava regeneračního roztoku LiOH 0,3 M Li . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
INGOS s.r.o.
Strana 53
6
AAA400
Kapitola 6: OBSAH
2.4.4 Příprava elučních roztoků a jejich výpočet podle tabulky. . . . . . . . . . .
2.4.5 Vlastnosti Li pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.6 Poznámky k Li provozu z praxe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.7 Bezpečnostní předpisy pro práci s Li pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5 Příprava elučních roztoků pufrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. PŘÍPRAVA VZORKŮ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Bílkoviny a peptidy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Charakteristika materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Hydrolýza kyselinou chlorovodíkovou [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.4 Příprava vzorku pro stanovení sirných aminokyselin [4] . . . . . . . . . . . .
3.2.5 Urychlené odpařování vzorků po hydrolýze oxidační i běžné . . . . . . . .
3.2.6 Příprava vzorků pro stanovení aminocukrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.7 Příprava hydrolyzátů pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.8 Kyselá hydrolýza [6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.9 Bazická hydrolýza [7] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.10 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Krevní plazma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 Odběr a příprava plasmy pro deproteinaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3 Deproteinace kyselinou sulfosalicylovou . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.4 Deproteinace kyselinou pikrovou [10] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.5 Příprava vzorku plazmy pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.6 Stanovení veškerých nebílkoviných aminokyselin v plasmě . . . . . . . . . .
3.3.7 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Tkáňové extrakty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Příprava vzorku s použitím kyseliny pikrové [13] . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.3 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Moč . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2 Odběr a zpracování vzorku moči . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Rostlinné extrakty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.2 Extrakce rostlinných vzorků a úpravy extraktů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.3 Příprava vzorků pro stanovení aminokyselin rostliny . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.4 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Potraviny a krmiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.2 Příprava vzorků pro stanovení volných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.3 Hydrolýzy potravin a krmiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.4 Zdroje chyb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
INGOS s.r.o.
23
23
25
25
25
26
26
26
26
26
27
28
28
28
28
29
29
30
30
30
30
30
30
31
31
31
31
32
32
33
33
33
33
33
33
33
35
35
35
35
36
36
36
Strana 54
6
AAA400
Kapitola 6: OBSAH
3.7.5 Příprava vzorků pro stanovení sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.6 Příprava vzorků potravin pro stanovení tryptofanu . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. BIOGENNÍ AMINY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1 Základní biogenní aminy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Příklady vzniku biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Úprava AAA400 pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4 Program pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.5 Složení pufrů pro stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6 Poznámky ke stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. VZOROVÉ ANALÝZY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1 Stanovení volných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Analýza hydrolyzátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Analýza hydrolyzátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4 Zkrácená analýza sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5 Zkrácená analýza sirných aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6 Zrychlené stanovení TRP na zkrácené koloně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7 Zkrácené stanovení tyr, phe s použítím vnitřního standardu . . . . . . . . . . . . . .
5.8 Zkrácené stanovení thr, lys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.9 Stanovení biogenních aminů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6. OBSAH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1 Seznam obrázků a tabulek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
37
38
40
40
40
41
41
42
42
44
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
55
6.1 Seznam obrázkù a tabulek
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
Tab.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
2.
3.
4.
5.
Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Přehled aminokyselin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Příprava ninhydrinu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Na Pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Li pufry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Pufry pro biogenní aminy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
INGOS s.r.o.
Strana 55
6

AAA400 chemická část

Transkript

Podobné dokumenty

Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí

Návod k použití

Podpora databáze analytických metod v Elektronickém

MM4Laboratory

Sborník abstraktů konference - Institute of Chemical Process

2 - PiKRON

č. 152/2009 ze dne 27. ledna 2009, kterým se

2. Stanovení obsahu vitaminu C metodou vysoce účinné kapalinové

Praktická cvičení z biologie - ZS - Ústav biologie

VYBRANÉ KAPITOLY Z CHEMIE