Vyšetření B-CLL s použitím protilátky proti ZAP 70

Pavlína Tinavská
Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice

nízce agresivní lymfoproliferativní onemocnění

základem je proliferace a akumulace klonálních maligně
transformovaných vyzrálých B lymfocytů

charakteristický imunofenotyp:
CD19+CD5+CD23+CD20lowCD22+CD200+ bez exprese lehkých
povrchových řetězců kappa i lambda

postupný vzrůst počtu lymfocytů je způsoben nekontrolovanou
klonální proliferací, poruchou jejich zániku, dlouhověkostí

nejčastější leukémie v Evropě a Severní Americe

25 – 30 % všech leukémií

incidence v Evropě 3/100 000

obvyklá je u starší populace, zřídka u lidí mladších 50-ti let,
2x častější u mužů, nepostihuje děti

choroba má dlouhé, roky až desetiletí trvající bezpříznakové
období – jediným znakem nemoci je lymfocytóza v periferní
krvi i kostní dřeni

klinické příznaky až při pokročilejším stadiu onemocnění
(při vyšší mase maligních buněk)


teploty neinfekčního původu

zvýšené noční pocení

úbytek na váze

anémie a trombocytopenie s krvácivými příznaky

zvětšení uzlin a sleziny

infiltrace nelymfatických orgánů
deficit T buněčné imunity – zvýšená náchylnost k častějším
virovým infekcím

3 typy B-CLL

typická (malé uniformní vyzrálé lymfocyty, < 10 % atypických lymfocytů)

smíšená B-CLL/B-PLL (11 – 51 % prolymfocytů)

atypická (> 10 % atypických lymfocytů, < 10 % prolymfocytů)

heterogenní onemocnění s vysoce variabilní prognózou

klinická kritéria pro klasifikaci stupně pokročilosti onemocnění


tumorózní masa

rychlost progrese onemocnění

senzitivita k chemoterapii
2 systémy dle Raie a Bineta
0
Rai
Lymfocytóza přes 15 000
Binet
A
I
Lymfocytóza, lymfadenopatie
B
II
Lymfocytóza,
hepatosplenomegalie
C
III
Lymfocytóza, anémie
IV
Lymfocytóza, trombocytopénie
Postižení méně než 3 lymfoidních
oblastí*
Postižení více než 3 lymfoidních
oblastí
Anémie nebo trombocytopénie
*lymfoidní oblast: uzliny krční, axilární,
linguinální, slezina, játra

na základě systémů klinického stagingu nelze přesně předpovědět prognózu
jednotlivých pacientů zejména v časných stadiích tohoto onemocnění

přesnější a časnější stratifikace tohoto onemocnění pomocí
biologických prognostických ukazatelů

Cytogenetické aberace
pozitivní x negativní
prognostické markery

Del 13q – ovlivnění exprese anti-apoptického proteinu Bcl-2

Trisomie chromozómu 12 – atypická morfologie lymfocytů

Del 17p – rychlá progrese nemoci, špatná odpověď na léčbu

Del 11q – změny v signálních drahách zprostředkovanými
některými supresorovými geny (p53)


Sérové prognostické markery

b2 – mikroglobulin

sérová CD23 (> 2700 U/ml)

thymidin kináza (sTK)
Molekulární prognostické markery

exprese CD38

mikro RNA na 13 chromozómu

Bcl-2 gen – inhibice apoptózy

mutační status genů pro variabilní části těžkých řetězců imunoglobulinů (IgVh)

ZAP70 (70 kDa zeta – asociovaný protein)

vysoká prognostická hodnota

postačující k určení prognózy pacienta

mutované IgVh geny se liší od sekvence odpovídající zárodečné linie o více
než 2 % (s homologií se zárodečnou linií < 98 %) = pozitivní MS


nemutované IgVh (s homologií se zárodečnou linií >98 %) = negativní MS
běžné používání v diagnostice a určování prognózy u nemocných s B-
CLL naráží na časovou a technickou náročnost provedení tohoto
vyšetření

zástupné markery technicky i finančně dostupnější – jedním z genů,
které umožňují odlišit mutovanou a nemutovanou formu B-CLL je gen
pro ZAP-70

zeta – asociovaný protein o molekulové hmotnosti 70 kDa

gen pro ZAP-70 na dlouhém rameni 2. chromozómu

tyrozinkináza složená ze 3 funkčních jednotek

normálně exprimována v cytoplazmě T lymfocytů a NK buněk

je součástí TCR a hraje zásadní roli v T- buněčné signalizaci
vedoucí k aktivaci T lymfocytů

u normálních B lymfocytů není ZAP-70 exprimován

exprese v maligních lymfocytech B-CLL vysoce koreluje s
nemutovanou formou tohoto onemocnění

je prokázána souvislost mezi vyšší hladinou exprese ZAP-70 a
rychlejší progresí nemoci a kratší dobou přežívání pacientů

významný prognostický marker doplňující vyšetření
mutačního stavu genu pro variabilní části
těžkých řetězců imunoglobulinů u pacientů
s B-CLL

Imunohistochemie

Western blotting

Stanovení ZAP-70 mRNA (PCR)

Průtoková cytometrie – nejčastěji používaná metoda

velmi dobrá dostupnost

relativní snadnost a časová nenáročnost

bez potřeby separace čisté populace B lymfocytů

absence jednotně užívané standardizované metodiky

intracelulární značení pomocí MAbs

stanovení exprese ZAP-70 na CD5+ T lymfocytech a CD56+ NK
buňkách jako vnitřní kontrola

hranice pro pozitivitu je volena dle statisticky zjištěné hodnoty
nejlépe korelující s mutačním stavem IgVh nebo s výsledky
citlivějších metod

poměrné vyjádření exprese ZAP-70 pomocí střední intenzity
fluorescence (MeanFluorescenceIndex) maligních buněk B-CLL a
kontrolních T lymfocytů
Hraniční mez pozitivity ZAP – 70:
% ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 %
MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2
MFI (T-ly/B-CLL) < 3

muž K.N., 1936

lymfocytóza 81 %

celkově cca 74 % CD19+CD5+ B lymfocytů

pozitivní mutační status - 93 % homologie

mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část
těžkého imunoglobulinového řetězce
x-mean T - Ly = 1,71
x-mean B - CLL = 0,28

MFI = 0,164

0,67 % ZAP-70+
buněk B – CLL

ZAP – 70 negativní

lepší prognóza

muž Z.Č., 1950

lymfocytóza 93 %

celkově cca 71 % CD19+CD5+ B lymfocytů

negativní mutační status - 100 % homologie

nemutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část
těžkého imunoglobulinového řetězce
x-mean T - Ly = 3,79
x-mean B - CLL = 1,29

MFI = 0,340

79,2 % ZAP-70+
buněk B – CLL

ZAP – 70 pozitivní

horší prognóza

žena A.K., 1943

lymfocytóza 67 %

celkově cca 52 % CD19+CD5+ B lymfocytů

pozitivní mutační status – 90% homologie

mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého
imunoglobulinového řetězce
x-mean T - Ly = 2,52

MFI = 0,163

1,72 % ZAP-70+
x-mean B – CLL = 0,41
buněk B – CLL

ZAP – 70 negativní

lepší prognóza

muž P.P., 1959

lymfocytóza 60 %

celkově cca 53 % CD19+CD5+ B lymfocytů

negativní mutační status - 99,7 % homologie

nemutovaný stav genu Vh5 pro variabilní část
těžkého imunoglobulinového řetězce
x-mean T - Ly = 3,01
x-mean B - CLL = 1,12

MFI = 0,372

59,8 % ZAP-70+
buněk B – CLL

ZAP – 70 pozitivní

horší prognóza

MFI = 0,163 < 0,2

1,72 % ZAP-70+ buněk B – CLL < 20 %

ZAP – 70 negativní

mutovaný gen IgVh

lepší prognóza

MFI = 0,372 > 0,2

59,8 % ZAP-70+ buněk B – CLL > 20 %

nemutovaný gen IgVh

ZAP – 70 pozitivní

horší prognóza

Adams et al., 2014: Prognostic Value of ZAP-70 Expression in Chronic
Lymphocyic Leukemia as Assessed by Quantitative Polymerase Chain
Reaction and Flow Cytometry. Clinical Cytometry. 2014. 86B: 80-90.

Rossi et al., 2010: Prognostic impact of ZAP-70 expression in chronic
lymphocytic leukemia: mean fluorescence intensity T/B ratio versus
percentage of positive cells. Journal of Translational Medicine. 2010.8:23.

Princip et al., 2006: Clinical significance of ZAP-70 protein expression
in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2006, 108/3:853 – 861.

MFI = 0,163 < 0,2

1,72 % ZAP-70+ buněk
B – CLL < 20 %

ZAP – 70 negativní

pozitivní mutační status

lepší prognóza
Hraniční mez pozitivity ZAP – 70:
% ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 %
MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2
MFI (T-ly/B-CLL) < 3

MFI = 0,372 > 0,2

59,8 % ZAP-70+ buněk
B – CLL > 20 %

ZAP – 70 pozitivní

negativní mutační status

horší prognóza
Hraniční mez pozitivity ZAP – 70:
% ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 %
MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2
MFI (T-ly/B-CLL) < 3