CMV-IgM-ELA Test PKS medac Český 0123

CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Český


0123
110-PKS-VPCZ/010416
VÝROBCE
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Theaterstraße 6
D-22880 Wedel
www.medac-diagnostika.de
E-Mail:
[email protected]
Tel.:
++49/4103/8006-0
Fax:
++49/4103/8006-359
ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK
E-Mail:
Tel.:
Fax:
[email protected]
++49/4103/8006-111
++49/4103/8006-113
110-PKS-VPCZ/010416
CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování na průkaz
protilátek IgM proti cytomegaloviru (CMV) v lidském séru a v plazmě
Katalogové číslo: 110-PKS
POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO
ÚVOD
Cytomegalovirus
(CMV)
patří
do
skupiny
lidských
patogenních
herpetických virů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyto
viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat
latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít
k reaktivaci viru.
Infekce zapříčiněné cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních
osob obyčejně nenápadně. U imumosupresivních osob (např. pacienti po
transplantaci, lidé infikování virem HIV, tumoroví pacienti nebo
novorozenci) se však pozorují závažné symptomy nejrůznějšího druhu.
Obzvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto
infekce mohou způsobit vážné poškození dítěte, přičemž nelze vyloučit
pozdější poruchy také u dětí narozených bez symptomů.
Test CMV-IgM-ELA Test PKS medac je vhodný na průkaz specifických
protilátek IgM proti CMV v séru. Průkazem protilátek IgM lze
diagnostikovat akutní infekci CMV. Přitom musíme brát do úvahy, že
protilátky proti IgM se nevytvářejí vždycky. Při reaktivacích a
reinfekcích
u
imunosupresivních
pacientů
jsou
protilátky
IgM
dokazatelné pouze zřídka.
110-PKS-VPCZ/010416
1
PRINCIP TESTU
Mikrotitrační
deštička
protihumánním IgM.
je
pokryta
Frakce IgM ze vzorku pacienta
váže na mikrotitrační deštičku.
se
Protilátky proti protilátkám CMV IgM
se vážou na peroxidázou značený CMVIgM-ELA (AG = antigen, P = peroxidáza).
Inkubace
se
substrátem
TMB
(*).
Reakce se zastaví přidáním kyseliny
sírové. Absorpce se odečte fotometricky.
Výhody testu
 Žádné nespecifické reakce a žádné
způsobené revmatoidními faktory.
falešně
pozitivní
výsledky
 Nedochází k blokování protilátek IgM vysokým titrem IgG.
 Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat každý krok
pipetování, při kterém dochází ke změnám barev.
 Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu.
 Testy lze automatizovat na otevřených zařízeních ELISA.
110-PKS-VPCZ/010416
2
OBSAH SOUPRAVY
Katalogové číslo: 110-PKS
1.
MTP
Mikrotitrační deštička: 12 testovacích proužků po 8 jamkách
(označená jako CMM, s rámikem a desikantem v hliníkovém vakuovém
balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokryta kozími
protihumánními protilátkami IgM, BSA a indikátorem pH, připravená
k použití.
2.
CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum,
připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin
sulfát.
3.
CONTROL +
Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum,
připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin
sulfát.
4.
WB
Promývací roztok: 1 láhev s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), pH
7,2 - 7,4, obsahuje ProClinTM 300.
5.
VIR-DIL
Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/ BSA,
pH 7,2 - 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClinTM 300.
6.
ANTIGEN
CMV-IgM-ELA (enzymem označený antigen): 2 lahvičky každá s obsahem
5,0 ml, lyofilizovaný, obsahuje FKS, zbarvený červeně, konjugovaný
HRP.
7.
TMB
Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití.
8.
STOP
Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 11 ml,
0,5 M kyselina sírová (H2SO4), připravený k použití.
Muze bjt korozivnf pro kovy.
110-PKS-VPCZ/010416
3
1.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Materiál/Reagencie
Stav
Skladování
Zkušební souprava
neotevřená
2...8 °C
Mikrotitrační deštička
otevřená
Kontroly
Promývací roztok
Roztok na ředění vzorků
CMV-IgM-ELA
otevřené
zředěný
otevřený
rozpuštěný
Substrát TMB
Roztok na zastavení
reakce
otevřený
otevřený
Stabilita
do uplynutí
použitelnosti
2...8 °C v sáčku 6 týdnů
s desikantem
2...8 °C
6 týdnů
2...8 °C
6 týdnů
2...8 °C
6 týdnů
2...8 °C
5 dní
6 týdnů
 -18 °C*
2...8 °C
2...8 °C
6 týdnů
do uplynutí
použitelnosti
* Alikvotní části po rozmražení už znovu nezmrazujte!
Reagencie nepoužívejte po uplynutí jejich expirace.
2.
DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENCIE A MATERIÁLY
2.1. Destilovaná nebo deionizovaná voda.
2.2. Mikropipety pro potřebné objemy.
2.3. Čisté skleněné nádoby
promývacího roztoku.
na
ředění
2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních deštiček
multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISY).
(např.
2.5. Inkubátor pro 37
o
nebo
nádoby
z umělé
hmoty
C.
2.6. Fotometr na mikrotitrační deštičky s filtry na 450 nm a 620 650 nm.
3.
PŘÍPRAVA REGENCIÍ
Před zahájením testu vytemperujte všechny
teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci.
komponenty
na
pokojovou
Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek.
3.1. Mikrotitrační deštička
Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření
opět
pevně
uzavřít.
Skladování
a
životnost
nepoužitých
mikrotitračních jamek jsou uvedeny v tabulce číslo 1.
110-PKS-VPCZ/010416
4
Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín.
Rovněž se objevující zeleno-hnědé skvrny v jamkách jsou způsobeny
zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a
výsledek testu.
3.2. Promývací roztok
Smíchejte jednu objemovou část promývacího roztoku
(10x) s 9
částmi
destilované
nebo
deionizované
vody
(např.
50
ml
promývacího roztoku (10x) se 450 ml vody). Na 8 jamek budete
potřebovat 10 ml promývacího roztoku.
Krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit
(max. na 37 °C) nebo promícháním při pokojové teplotě.
ohřáním
3.3. CMV-IgM-ELA
Lyofilizát rozpusťte v 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Lahvičky
před otevřením lehce potřeste, aby se částice z uzávěru dostali
do roztoku.
Po rozpuštění
k použití.
se
CMV-IgM-ELA
zbarví
červeně
a
je
připraveno
Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMVIgM-ELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti
tomu se roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a
roztok na zastavení reakce u všech virologických testů firmy
medac mohou principiálně zaměňovat.
Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat.
Pouze při přesném dodržení pracovních předpisů obdržíte validní a
reprodukovatelné výsledky.
4.
VZORKY
4.1. Test je vhodný pro vzorky séra a EDTA plazmy. Vzorky pacientů
uchovávejte maximálně 7 dní při teplotě 2–8 °C. Delší uchovávaní
se musí provádět při teplotě ≤ -20 °C. Vzorky se nesmí opakovaně
zamrazovat a odmrazovat.
4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu vzorků např.
deaktivaci. Testované vzorky však nesmí být kontaminovány
mikroorganizmami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty.
4.3. Vzorky se musí zředit roztokem na ředění vzorků v poměru 1:100.
Pro stanovení titru lze vzorků dále libovolně zředit.
110-PKS-VPCZ/010416
5
5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU
5.1. Otevřete hliníkový sáček a vyberte
titračních proužků (viz 3.1.).
Mikrotitrační
promývat.
deštičky
jsou
připraveny
požadovaný
k
použití
počet
a
mikro-
nemusí
se
5.2. Jamku A1 nechejte prázdnou (viz 6.A.). Do jamek na deštičce
napipetujte po 50 μl zředěných vzorků, negativní kontrolu a
pozitivní kontrolu pipetujte dvakrát.
Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v
jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví,
znamená to, že nebyly napipetovány sérum nebo kontroly.
V případě potřeby se mikrotitrační deštičky mohou před dalším
zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně po dobu 30 minut
při pokojové teplotě nebo při teplotě 2 – 8 °C maximálně po dobu
60 minut.
5.3. Mikrotitrační deštičku inkubujte 60 minut ( 5 minuty)
teplotě 37 °C ( 1 °C) (vlhká komora nebo inkubační fólie).
při
5.4. Rozpusťte lyofilizované CMV-IgM-ELA (viz 3.3).
5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 μl
promývacího roztoku. Při promývaní dbejte na to, aby se jamky
pořádně naplnily. Po promytí vyklepejte mikrotitrační deštičku na
filtračním papíru.
Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě!
5.6. Do každé jamky (kromě
(zbarvené červeně).
A1)
přidejte
rozpuštěné
CMV-IgM-ELA
Při manuálním zpracování testu napipetujte do každé jamky 50 μl
ELA.
Upozornění:
Při práci na automatizovaných přístrojích musíte naprogramovat
pro každou jamku 60 μl ELA, protože v inkubačních komorách
automatů dochází k intenzivnímu vypařování.
V rámci validace se ukázalo, že tento test je v podstatě vhodný
také na automatické zpracování. Nicméně doporučujeme verifikovat
jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat.
5.7. Inkubujte znovu 60 minut ( 5 minuty) při teplotě 37 °C ( 1 °C)
(vlhká komora nebo inkubační fólie).
5.8. Po inkubaci znovu promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.).
110-PKS-VPCZ/010416
6
5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 μl substrátu TMB a
inkubujte 30 minut ( 2 minuty) při teplotě 37 °C ( 1 °C) ve tmě
(vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví
modře.
5.10.Enzymatickou reakci zastavte přidáním 100 μl roztoku na zastavení
reakce do každé jamky (včetně A1). Modré zbarvení se změní na
žluté.
Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a
zkontrolujte, zda-li v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu.
Odečtení je nutno
zastavení reakce.
provést
během
15
minut
po
přidání
roztoku
na
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Vzorky
Prázdná
jamka (A1)
Negativní
kontrola
Pozitivní
kontrola
Vzorky
-
50 μl
-
50 μl
-
50 μl
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího
roztoku
CMV-IgM-ELA
-
50/60 μl*)
50/60 μl*)
50/60 μl*)
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího
roztoku
Substrát TMB
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 °C
Roztok na zastavení
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
reakce
Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. Délka
620 - 650 nm)
*) manuální/automatický postup (viz 5.6.)
110-PKS-VPCZ/010416
7
6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA)

Odečtěte hodnotu optické density (OD) při vlnové délce 450 nm
(referenční vlnová délka 620 - 650 nm).

Od všech hodnot OD odečtěte OD pozadí (A1 jamka).

Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,100.
Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,800.

Cut-off = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140

Šedá zóna = cut-off  10 %
Pokud tyto
opakovat.
kritériá
validity
nejsou
splněna,
musí
se
test
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Vzorky s hodnotami OD pod dolní hranicí šedé zóny se hodnotí jako
NEGATIVNÍ.

Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako
HRANIČNÍ. Hodnoty v hraniční oblasti se musí opět zkontrolovat po
14 dnech společně s novými vzorkami, aby se zjistil pohyb titru
IgM.

Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako
POZITIVNÍ.

Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým
obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry.

Křížové reakce vyvolané protilátkami proti
virům nelze v jednotlivých případech vyloučit.

Velmi vysoké hodnoty lipidů mohou vést při negativních vzorkách
ke falešně pozitivním výsledkům.
Vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu neovlivňují výsledky
testu.
110-PKS-VPCZ/010416
jiným
herpetickým
8
7.
CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU
V rámkách
diagnostické
evaluace
charakteristické vlastnosti testu.
jsme
obdrželi
následující
7.A. CITLIVOST A SPECIFITA
482 sér od dárců krve a od pacientů bylo testováno testem CMV-IgM-ELA
Test PKS medac. Paralelně byly tyto vzorky testovány vysoko
specifickým referenčním testem ELISA, který se rutinně používá
v laboratořích. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
Referenční test
negativní pozitivní
CMV-IgM-ELA Test PKS
Citlivost
Specifita
=
=
negativní
314
1
pozitivní
1
166
99,40 %
99,68 %
Pozitivní prediktivní hodnota:
Negativní prediktivní hodnota:
99,40 %
99,68 %
7.B. PŘESNOST
Vzorky
Variace intraassay
Vzorky
Střední OD
S
VK (%)
n
NK
0,034
0,005
15
24
SP
0,314
0,013
4
PK
2,269
0,048
Č. 1
0,049
Č. 2
Č. 3
Variace interassay
(n = 11)
Střední OD
S
VK (%)
NK
0,050
0,010
20
24
SP
0,230
0,021
9
2
24
PK
1,456
0,064
4
0,008
16
27
Č. 4
0,058
0,007
12
0,317
0,023
7
27
Č. 5
0,264
0,037
14
2,673
0,086
3
27
Č. 6
0,271
0,039
14
Č. 7
1,788
0,073
4
NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnuta v soupravě);
PK = pozitivní kontrola
110-PKS-VPCZ/010416
9
ŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCÍ SE MANIPULACE

Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých
nezaměňujte lahvičky ani jejich šroubové uzávěry.

Reagencie se musí ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich
vypařování a mikrobiální kontaminaci.

Po skončení testu se reagencie musí uložit tak, jak je uvedeno
v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost.

Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo
šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat
spolu v původním balení (viz také 3.).
reagencií,
INFORMACE TÝKAJÍCÍ SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ

Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti
práce.

Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky
proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou
reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které
obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat
jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy.
RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACE
Chemikálie a přípravky patřící k tomuto produktu a také jejich zbytky,
vznikající při použití tohoto produktu, se považují zpravidla za
odpady, které se musí odstraňovat dle předpisů.
Odstraňování těchto odpadů se řídí národními zákony týkajících se
odpadů. Informace o možnostech odstraňování odpadů Vám podají
zodpovědný úřad nebo společnosti zabývající se odstraňováním odpadů.
Datum vydání: 01.04.2016
110-PKS-VPCZ/010416
10
LITERATURA
Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban
und Schwarzenberg, München, 9-30 (1990).
Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG
antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at
the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995).
Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der
Cytomegalievirus-Infektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum
Nachweis
von
spezifischen
IgM-Antikörpern
in
Serumproben
von
immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9),
480-484 (1996).
Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische
Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag,
279-290 (1996).
Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solid-phase enzyme
immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol.
5, 629-634 (1977).
Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G.
and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy.
Arch. Virol. 53, 177-184 (1977).
Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM
antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an Enzyme-Labelled Antigen
(ELA). J. Gen. Virol. 50, 59-68 (1980).
Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for
the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585-589
(1991).
Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder,
U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate
between primary and recurrent or long-term human Cytomegalovirus
infections
in
pregnant
women.
Poster
presented
at
the
6th
International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997).
Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological
diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme
immunoassays for the detection of HCMV-specific IgM antibody. Clin.
Diagn. Virol. 2, 245-259 (1994).
110-PKS-VPCZ/010416
11