návody do cvičení

Transkript

návody do cvičení

LABORATORNÍ CVIČENÍ
Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Ivo Frébort a Petr Galuszka
Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty
Univerzity Palackého
Olomouc 2006
OBSAH:
Úvod
Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři
Pokyny pro práci s GMO
Laboratorní cvičení č.1
Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční analýza
Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách pomocí PCR
Laboratorní úloha č.3
Genetická transformace kvasinek a její ověření pomocí měření aktivity
rekombinantního enzymu
PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny ječmene
Izolace RNA z rostin a následná RT-PCR vybraných genů
Příloha
Pokyny pro práci v molekulárně biologické laboratoři
1) Během práce v laboratoři molekulární biologie musí být zavřená veškerá
okna a dveře.
2) Osoba pracující v laboratoři musí být oblečená v pracovním plášti či jiném
laboratorním oblečení a pokuď to situace vyžaduje musí mít rukavice a
ochranné brýle.
3) V laboratoři je přísně zakázána konzumace jídel, pití, kouření, šňupání
tabáku, aplikace kosmetických přípravku a skladování pití, jídel a
tabákových výrobků.
4) Je zakázáno pipetovat ústy a doporučuje se používat především mechanické
typy pipet.
5) Minimalizujte vznik aerosolu.
6) Používejte stříkačky, kanyly a jehly jen pokud to je absolutně nutné.
7) Po ukončení práce si vždy umyjte ruce.
8) Udržujte laboratoř uklizenou a čistou, na pracovním stole mějte jen materiál
a pomůcky nutné k práci. Zásoby materiálu skladujte ve zvláštní místnosti.
9) Na práci se sterilním materiálem používejte vždy zapnutý flowbox. Po
skončení práce ve flowboxu pusťte UV lampu.
10) Veškerou práci s karcinogenním ethidium bromidem provádějte ve vyhrazené
místnosti či prostoru a chraňte se nitrilovými rukavicemi.
11) Při práci s RNA používejte vždy rukavice a speciálně označený materiál a
pomůcky. Těchto věci označených značkou „RNase Free“ se nedotýkejte
rukama.
12) Používané chemikálie a reagencie vracejte vždy na místo odkud jste je vzali.
13) Veškeré sklo umývejte jarovou vodou a poté oplachujte v destilované vodě.
Pokyny pro práci s GMO
1) opatření pro případ havárie a požáru, včetně havarijního plánu podle § 5
V případě požáru předměty, zasažené požárem je možno považovat za zbavené
geneticky modifikovaných organismů. Po uhašení požáru osoby zodpovědné za
likvidaci havárie týkající se GMO vyhledají na pracovišti pouze částečně
poškozené kultury GMO a ty pak posléze schválenými postupy inaktivují.
V případě vynášení předmětů mimo budovu vedoucí katedry rozhodne, které
předměty nebudou vynášeny, pokud by mohly být kontaminovány geneticky
modifikovanými organismy. V ostatních bodech se likvidace požáru nebo havárie
řídí požárním a havarijním řádem.
2) povinnosti pracovníků při práci (dodržování pracovních postupů, postup
sanitace prostorů a zařízení po ukončení pracovní činnosti, postup
dekontaminace nástrojů, osobních a ochranných prostředků a oděvů).
Postup sanitace prostorů a zařízení a postup dekontaminace nástrojů při
ukončení pracovní činnosti se řídí podle charakteru činnosti a určuje jej vedoucí
katedry.
Ochranné
oděvy,
kontaminované
geneticky
modifikováni
mikroorganismy, se budou prát jako infekční materiál. Totéž se vztahuje na
ochranné pláště pro studenty poskytnuté
přírodovědeckou fakultou.
Samostatný sběr a oddělená, isolovaná přeprava do prádelny Olomouc adresa:
Prádelna-mandlovna, Sovová Martina, Neředínská 55, 779 00 Olomouc.
Používané ochranné rukavice pro jedno použití budou likvidovány s ostatním
GMO odpadem.
3) systém a četnost kontrol prostoru, zařízení a ochranných opatření
Kontroly budou prováděny proškolenými pracovníky paralelně s požární
kontrolou s četností 4x ročně. Zápis o každé kontrole bude parafován vedoucím
příslušné katedry.
4) povinnosti pracovníků při údržbě
Pracovníci údržby jsou při údržbářských pracích v prostorách pro práci s GMO
povinni dbát pokynů vedoucího katedry, v jejíchž prostorách údržbu provádějí.
Pracovníci údržby jsou povinni při údržbářských pracích v prostorách pro práci
s GMO používat pláště pro práci s rekombinovanou DNA (se značkou
Biohazard), které není možno používat mimo laboratoře pro GMO.
5) zásady hygieny a bezpečnosti práce v souladu s ustanovením zvláštních
právních předpisů
Pracovníci mají povinnost používat v prostorách pro práci s rekombinovanou
DNA pláště, včetně studentů.
6) způsob nakládání s odpady a kontaminovanými materiály a předměty,
zejména postupy zneškodnění geneticky modifikovaného organismu a
způsob kontroly jejich účinnosti
Geneticky modifikované rostliny jsou likvidovány autoklávováním ve
speciálních plastových pytlích. Geneticky modifikované bakterie jsou likvidovány
autoklávováním nebo desinfekčním roztokem (chlornan sodný, chloramin, Ajatin
Incidur v koncentracích doporučených výrobcem).
7) seznam povinných pracovních pomůcek a prostředků osobní ochrany
s uvedením činností, ke kterým musí být používány
Ochranný plášť při práci v prostorech s GMO nesmí být nošen mimo prostory
s rekombinovanou DNA. Gumové rukavice jsou používány při práci
s mikroorganismy a s elektroforezou DNA.
8) zakázané činnosti na pracovišti
V laboratořích a prostorách pro geneticky modifikované rostliny je zakázáno
jíst, pít a kouřit.
9) zásady vedení pracovních protokolů
Každá činnost s GMO musí být denně zapisována do pracovního protokolu s
vyznačením data zápisu. Každý pracovník si vede svůj pracovní protokol.
10) zásady vedení evidence o provozu zařízení, prováděné sanitaci a
kontrolách zabezpečovacích prvků
Ke každému nákladnému investičnímu přístroji patří sešit, do kterého se
zapisuje pracovník, datum a hodiny využití přístroje. Tamtéž se zapisují
záznamy o prováděné sanitaci a kontrolách zabezpečovacích prvků.
11) opatření k zabránění vstupu nepovolaných osob
Laboratorní prostory jsou rozděleny na laboratorní komplexy a funkční jednotky
pracující s GMO a jsou označeny. Součástí laboratorního komplexu je i
kultivační místnosti. Vstup do každé jednotky je možný pouze dveřmi,
otevíratelnými klíčem. Klíče mají proškolení zaměstnanci, kteří umožní do
prostor vstup proškoleným studentům PřF UP, kteří v rámci studia v jednotce
pracují. Kultivační mistnosti a boxu jsou uzamčeny a na dveřích označeny
značkou Biohazard. Pověření pracovníci do nich mají přístup pouze ve
speciálních pláštích, označených značkou Biohazard, které jsou nošeny pouze
v těchto prostorách. Pro běžné návštěvy jsou vyhrazeny klidové pracovny.
12) režim v laboratořích:
V laboratořích se pracuje jak s mikrobiálními kulturami, tak s kulturami rostlin,
ošetřenými geneticky modifikovanými (GM) bakteriemi Agrobacterium. Plazmidy
jsou udržovány v kmenech bakterie Escherichia coli
nebo kvasinek
Saccharomyces cerevicae, Pichia pastoris. K vědeckým účelům se experimentuje
s transgenní (GM) obsahují GM bakterie, rostlinnými pletivy a dále se sterilně i
nesterilně kultivovanými transgenními (GM) rostlinami. Proto je třeba
zachovávat pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak
pro práci s transgenním rostlinným materiálem.
Likvidace tekutých odpadů a GMO: Agarové a tekuté kultury je možno likvidovat
až po autoklávování nebo jiném vhodném ošetření (např. u tekutých kultur po
sterilizaci účinným desinfekčním prostředkem, např. roztokem chlornanu
sodného, Incidur). Pevné odpady, obsahující GMO, jakož i nádoby a pomůcky,
které přišly do kontaktu s GMO je nutno bezprostředně po manipulaci umístit
do sterilizačních pytlů a poté inaktivovat v parním sterilizátoru. Odpadní vody,
obsahující GMO je nutno vylévat do nádob s chloraminem či chlornanem
sodným. V laboratořích není dovoleno jíst, pít a kouřit. V laboratořích kde se
pracuje s GMO je nutno nosit plášť k této práci určený. Při práci s GMO budou
používány ochranné rukavice.
13) režim v kultivačních místnostech:
V kultivačních místnostech se pracuje s mikrobiálními kulturami, rostlinnými
pletivy a s kulturami rostlinami, které obsahají vnesou cizorodou DNA. Tyto
rostliny jsou kultivovány ve sterilních i nesterilních podmínkách. Proto je třeba
zachovávat pravidla, platná jak pro práci v mikrobiologických laboratořích, tak
pro práci s transgenním rostlinným materiálem. Kultivační místnosti jsou
označeny popisem „Zákaz vstupu nepovolaným osobám“. Vstup do těchto
prostor je povolen jen v pracovním plášti. O likvidaci tekutých a pevných odpadů
a odpadní vody platí totéž co pro práci v laboratořích. Přeprava geneticky
modifikovaných rostlin do laboratoří a z kultivační místnosti se provádí jen
v uzavřených nádobách.
14) přepravování GMO materiálu mezi jednotlivými prostorami, určenými
pro práci s GMO na pracovišti PřF UP v Olomouci
Přeprava bakteriálních kultur: bakteriální kultury ve skleněných nádobách je
nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech.Přeprava rostlin kultivovaných
v půdě a obsahující semena, květy nebo části, schopné vegetativní reprodukce
(výhony, oddenky, semena): Nutno dopravovat v uzavřených kontejnerech.
Přeprava GMO mimo areál pracoviště PřF UP v Olomouci – Holice je možná jen v
uzavřených kontejnerech.
15) ostatní zásady
Se všemi transgenními rostlinami zacházet jako s potencionálně nebezpečným
transgenním materiálem až do té doby než se bezpečně prokáže, že jím nejsou.
Pokud jsou rostlinná pletiva, pěstována in vitro v suspenzích nebo agarových
kulturách, kultivována společně s bakteriemi A. tumefaciens nebo obsahující
bakterie, je třeba s nimi zacházet jako s bakteriálním materiálem. Musí se proto
autoklávovat veškeré sklo a nástroje, které přišly do styku s tímto materiálem.
Pracovníci by se měli převlékat, uchovávat protokoly po dobu 10-ti let,
předběžně schvalovat pokusy a znát havarijní plán. Pokusy musí být řádně
označeny a musí být zabráněno vstupu nepovolaným a neinformovaným
osobám.
Mikroizolace plasmidové DNA z Escherichia coli a její restrikční
analýza
Teoretický úvod
Baktérie Escherichia coli a další prokaryota obsahují kromě velké jaderné DNA
(milióny nukleotidů), tzv. "genomu" jestě menší kruhové DNA nazývané plasmidy o
velikosti řádově tisíců nukleotidů, které se velice často využívají při klonování a
genetických manipulacích. Při těchto manipulacích a přípravě určitých fragmentů
DNA se také často využívá enzymů štěpících DNA v určitém specifickém místě
(specifické sekvenci), tzv. restrikčních endonukleas. Tyto enzymy jsou většinou
připravovány z baktérií a označují se zkratkami a římskými číslicemi podle zdroje
(např. EcoRI a EcoRV pocházejí z E. coli).
Příklady restrikčních endonukleas:
BsaI GGTCTCnnnnn
CCAGACnnnnn
EcoRI GAATTC
CTTAAG
EcoRV GATATC
CTATAG
HindIII AAGCTT
TTCGAA
PstI CTGCAG
GACGTC
SmaI
SphI
XbaI
CCCGGG
GGGCCC
GCATGC
CGTACG
TCTAGA
AGATCT
Při separaci malých množství DNA a jejích fragmentů se dnes rutinně
používá elektroforéza v agarosovém gelu, které se stala jednou ze základních
technik molekulární biologie. Agarosa je součástí agaru, což je směs polysacharidů
obsažených v některých mořských řasách. Vedle agarosy (rozvětvený polysacharid
složený z D-galaktopyranosy a 3,6-dehydro-L-galaktopyranosy) obsahuje agar ještě
rozvětvený polysacharid agaropektin. Vizualizace DNA se provádí většinou pomocí
ethidium bromidu, který se interkaluje do zářezů ve šroubovici DNA a při ozáření
UV světlem fluoreskuje. Je tak možné detekovat již po několikaminutové inkubaci
množství od 5 ng DNA. S výhodou se toto barvení používá i při izolacích
specifických fragmentů DNA při klonování neboť jeho vazba je reverzibilní.
Ethidium bromid je ovšem kancerogenní látka a při práci s ní je nutno dodržovat
zvýšená bezpečnostní opatření.
Materiál a chemikálie
•
LB-Amp médium (1% pepton, 0.5% kvasnicový extrakt 1%, NaCl, pH upraveno
na 7.5 pomocí NaOH, autoklávováno), obsahujícím 100 µg/ml ampicilinu.
Uchovávat při +4 oC.
•
Kultury E. coli obsahující plasmidy s Ampr genem rozpěstována na pevném
médiu a Petriho misce.
•
Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0.1
mg/ml Rnasy A
•
Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno)
•
Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5.5, autoklávováno)
•
Isopropanol a 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC)
•
TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA)
•
1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA)
•
Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH
8,0)
•
50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 %
xylenová violeť
•
10% Ethidium bromid
•
GeneRuler 1kb marker
•
UV spektrofotometr, křemenná kyveta
•
Mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky)
•
Termoblok
•
Elektroforeza, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj
•
AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů
•
Mikropipety, špičky
•
PC vybavené programem BioEdit
•
Inkubovaná třepačka 37oC, laboratorní mikrocentrifuga
Experimentální postupy
1.DEN
.
a) Napěstování bakteriální kultury nesoucí plasmid
•
Do sterilní zkumavky napipetujeme 2 ml LB-Amp média a inokulujeme ho
sterilním párátkem neznámou bakteriální kolonií nesoucí plastid s resistencí
k ampicilinu (vydá vedoucí cvičení)
•
Kulturu necháme inkubovat přes noc při 37oC na třepačce.
2.DEN
.
b) Mikroizolace plasmidové DNA
•
1,5 ml podíl kultury inkubované přes noc přeneseme do mikrozkumavek,
centrifugujeme při 5.000 g 1 min (separace buněk od média), médium odlijeme.
•
Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet suspendujeme pomocí vortexu.
•
Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením zkumavky,
ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.
•
Přidáno 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky,
ponecháme stát 5 min na ledě.
•
Centrifugujeme při 13.000 – 21.000 g, 10 min, supernatant přelijeme do nových
ependorfek.
•
Přidáme 0,6 ml isopropanolu (laboratorní teploty), centrifugujeme při 13.000 –
21.000 g, 20 min, supernatant odlijeme. Při vkládání ependorfek do centrifugy
dbej orientace, jelikož často získáš neviditelný pelet.
•
Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20oC), centrifugujeme při
13.000 – 21.000 g, 5 min, supernatant odlijeme, jeho zbytky odstředíme na dno
mikrozkumavky a odpipetujeme. DNA ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.
•
Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0,03 ml TE.
c) Spektrální stanovení DNA
Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance
je při 260 nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší
přítomnost proteinů (280 nm) a aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý,
poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 1.9. Při naší preparační metodě lze množství
získané DNA přibližně vypočítat podle vztahu:
cDNA (µg/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280
Do 1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA (10100x). Na stanovení koncentrace spotřebuj maximálně třetinu objemu vyizolované
DNA. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti
TE pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm.
d) Restrikční analýza DNA
Cílem je naučit se pracovat na PC s programem BioEdit na zpracovávání
sekvencí nukleových kyselin a proteinů. Vedoucím cvičení budou poskytnuty DNA
sekvence plasmidů a do nich naklonovaných genů (insertů) a úkolem studenta je
navrhnout restrikční enzym(y) tak aby bylo možné z velikosti fragmentů určit o
který ze tři možných genů naklonovaný do kterého ze dvou možných plasmidů se
jedná v neznámem analyzovaném vzorku a popřípadě jak je gen v plasmidu
orientovaný.
Studenti mají k dispozici následující restrikční enzymy: BsaI, EcoRI, EcoRV,
PstI, SmaI a XbaI a jejich optimální restrikční pufry.
V případě potřeby štěpit dvěma či více enzymy současně se studenti seznámí
se strategií pro tento typ analýz DoubleDigest firmy New England Biolab
nebo
firmy
(http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp?)
Fermentas (http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html) a k dispozici jim
bude univerzální restrikční pufr YTango®.
Vlastní restrikční štěpení
Do 1.5 ml ependorfky pipetujeme (v tomto pořadí):
2 µl pufr (optimálního pro danou restrikci)
1-10 µl izolovaného vzorku DNA (600-800 ng DNA)
7.8-16.8 µl vody pro PCR
0.2 µl vhodné restrikční endonukleasy
Reakční směs (celkem 20 µl) inkubujeme 1-2 h při 37oC (v případě SmaI při při
o
30 C).
e) Agarosová elektroforéza DNA
•
Z rozpuštěné 1% agarosy v 1x TAE (uložena v inkubátoru na 65 oC) nalijeme
asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se
nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou
skleněnou desku. Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR
KARCINOGEN, DBÁT BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ) a promícháme špičkou.
Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak
aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel ponecháme ztuhnout asi 30
min.
•
Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200
ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala s agarosovým gelem.
•
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Ke vzorku DNA (20 µl) pipetujeme 5
µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10
min.
•
Jako standard použijeme 5 µL GeneRuler 1 kb firmy Fermentas.
•
Po inkubaci odstředíme vzorky na dno mikrozkumavek a pipetou opatrně
naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením
jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo
v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků.
•
Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke
zdroji napětí 120 V po dobu asi 30-40 minut. Průběh elektroforézy je možné
sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.
•
Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném
skle a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.
Používáme ochranné rukavice a dbáme předpisů pro práci s ethidium
bromidem, který je obsažen v gelu.
Vyhodnocení výsledků
Na základě pohyblivosti vzorku DNA je možné porovnáním se standardem
metodou kalibrační křivky zjistit její velikost. Ta se udává v počtu nukleotidů
obvykle označovaném jako kb (tzv. "kilobase pair").
1/ Zjistěte obsah DNA v izolovaných preparátech.
2/ Určete velikost izolované plasmidové DNA na základě její elektroforetické
pohyblivosti a velikosti jednotlivých naštípaných fragmentů
3/ Na základě získaných výsledku rozhodněte který plasmid jste izolovali a který ze
tři možných genů a v jaké orientaci nesl.
4/ Zjistěte z literatury co znamenají zkratky ocDNA a cccDNA, uvedené u vzorového
snímku DNA elektroforezy.
5/ Jak lze matematicky popsat závislost velikosti DNA na její elektroforetické
pohyblivosti?
genomová DNA
ocDNA
cccDNA
1
1
2
2
3 3
M
kbp
23,1
9,4
6,6
4,4
2,3
2,0
0,5
0,12
Obrázek 1. Agarorová elektroforéza DNA, barvení s ethidium bromidem. E. coli
DH5α obsahující plasmid pAO101: 1) vzorek štěpený restrikční endonukleázou
EcoRI, 2) vzorek štěpený restrikčními endonukleázami HindIII a PstI, 3) neštěpený
vzorek, M) marker - DNA bakteriofágu λ štěpená HindIII.
Literatura
Harwood A.J.: Basic DNA and RNA Protocols. Methods in Molecular Biology Vol.58,
Humana Press Totowa, NJ, USA, 1996.
Obrázek 2. Mapy dvou klonovacích vektorů pYES2 (Invitrogen) a pDRIVE (Qiagen)
Obrázek 3. Sekvence genu AtCKX2 (GENBANK AF303978),HvCKX2 (AF540382) a
gHvCKX2 (AF490591).
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ATGGCTAATC TTCGTTTAAT GATCACTTTA ATCACGGTTT TAATGATCAC CAAATCATCA AACGGTATTA AAATTGATTT ACCTAAATCC CTTAACCTCA
CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT
CAGTGAACCA CTACCCTGCT ACACGCCTTT CATCTTTCTC CTGAAAACCT CACCACTAAA CTTATTTATT CTTGACCTAC AGAAGAGCCA TGAGGCAATT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
CCCTCTCTAC CGATCCTTCC ATCATCTCCG CAGCCTCTCA TGACTTCGGA AACATAACCA CCGTGACCCC CGGCGGCGTA ATCTGCCCCT CCTCCACCGC
ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CTGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC
ACTCCTGCAA TACCTGAAGC TGTTCCTGTT GCTAGGCCTT GGCGCAGTCA CAGCTGAGCA TGTGCTTAAA CATGATGTGC TTGCATCCCT GGGGACGCTC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
TGATATCTCT CGTCTCCTCC AATACGCCGC AAACGGAAAA AGTACATTCC AAGTAGCGGC TCGTGGCCAA GGCCACTCCT TAAACGGCCA AGCCTCGGTC
CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT
CCCCTTGACG GGCATTTCAG CTTCCACGAC TTGTCTGCAG CTGCAATGGA CTTCGGCAAC CTCTCTAGCT TCCCGCCAGT CGCTGTGCTT CACCCAGGTT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
TCCGGCGGAG TAATCGTCAA CATGACGTGT ATCACTGACG TGGTGGTTTC AAAAGACAAG AAGTACGCTG ACGTGGCGGC CGGGACGTTA TGGGTGGATG
CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG
CAGTGGCTGA CATTGCCACA ACCGTGAGGC ATGTGTTCTT GATGGGTGAG CACTCCGCGC TCACAGTGGC AGCTCGTGGG CATGGACACT CGCTATATGG
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
TGCTTAAGAA GACGGCGGAG AAAGGGGTGT CGCCGGTTTC TTGGACGGAT TATTTGCATA TAACCGTCCG AGGAACGTTG TCGAATGGTG GAATTGGTGG
GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA
GCAGTCCCAG GCTGCTGGAG GGATTGTCAT CAGAATGGAA TCCCTTCGGA GTGTCAAAAT GCAGGTGCAT CCTGGTGCAT CACCCTATGT GGATGCCTCA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
TCAAGTGTTT CGAAACGGTC CTCTTGTTAG TAACGTCCTT GAATTGGACG TTATTACTGG GAAAGGTGAA ATGTTGACAT GCTCGCGACA GCTAAACCCA
GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT
GGAGGCGAAC TCTGGATAAA TGTCTTGAAT AAGACGTTGA AGTATGGTTT GGCGCCGAAG TCATGGACAG ACTACCTCCA CCTTACGGTT GGGGGCACGT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610
620
630
640
650
660
670
680
690
700
GAATTGTTCT ATGGAGTGTT AGGAGGTTTG GGTCAATTTG GAATTATAAC GAGAGCCAGA ATTGTTTTGG ACCATGCACC TAAACGGGCC AAATGGTTTC
TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGAAGAGGTG ATATTGTCAC
TGTCAAATGC GGGCGTCAGC GGGCAGACAT TCCGGCATGG TCCACAGATC AGCAATGTGA ACGAATTGGA GATTGTGACT GGTATGAACT GGCCTTTATA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
710
720
730
740
750
760
770
780
790
800
GGATGCTCTA CAGTGATTTC ACAACTTTTA CAAAGGACCA AGAACGTTTG ATATCAATGG CAAACGATAT TGGAGTCGAC TATTTAGAAG GTCAAATATT
TTGCTCACCA GAACAGAACT CTGATCTCTT CCGTGCTGCT CTTGGTGGTC TGGGTCAGTT TGGCATCATT ACTCGGGCCA GGATCGCACT TGAGCCTGCT
TTAAGTTGAT TTGAATAACT CGAAGAGTAA AGAATGTAGC TAACTTTGTA CCATGATTTT CAAATGCAGG AAGAGGTGAT ATTGTCACTT GCTCACCAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
810
820
830
840
850
860
870
880
890
900
TCTATCAAAC GGTGTCGTTG ACACCTCTTT TTTCCCACCT TCAGATCAAT CTAAAGTCGC TGATCTAGTC AAGCAACACG GTATCATCTA TGTTCTTGAA
CCACAAATGG TGAGGTGGAT AAGAGTTCTC TACTTAGATT TCATGAGCTT CACCGAGGAT CAGGAGATGC TTATTTCAGC AGAGAAGACC TTCGACTACA
ACAGAACTCT GATCTCTTCC GTGCTGCTCT TGGTGGTCTG GGTCAGTTTG GCATCATTAC TCGGGCCAGG ATCGCACTTG AGCCTGCTCC ACAAATGGTA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
910
920
930
940
950
960
970
980
990
1000
GTAGCCAAGT ATTATGATGA TCCCAATCTC CCCATCATCA GCAAGGTTAT TGACACATTA ACGAAAACAT TAAGTTACTT GCCCGGGTTC ATATCAATGC
TTGAAGGTTT CGTTATCATA AACAGAACAG GCATCCTAAA CAACTGGAGG TCATCGTTCA ATCCACAGGA CCCAGAGCGG GCTAGCCGGT TCGAAACAGA
AATCGCGAGA ACTCATCTGT GACAACCCCA TGCTAGTACA TCTTAGTAAG CATATGCTCA TGAGTTCATT GGATGTACAA TAGGTGAGGT GGATAAGAGT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1010
1020
1030
1040
1050
1060
1070
1080
1090
1100
ACGACGTGGC CTACTTCGAT TTCTTGAACC GTGTACATGT CGAAGAAAAT AAACTCAGAT CTTTGGGATT ATGGGAACTT CCTCATCCTT GGCTTAACCT
CAGAAAAGTG CTCTTCTGCC TCGAGATGAC AAAGAACTTC AACCCTGAAG AAGCTGACAT CATGGAACAG GAGGTCCATG CACTACTATC TCAACTTAGA
TCTCTACTTA GATTTCATGA GCCTCACCGA GGATCAGGAG ATGCTTATTT CAGCAGAGAA GACCTTCGAC TACATTGAAG GTTTCGTTAT CATAAACAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1110
1120
1130
1140
1150
1160
1170
1180
1190
1200
CTACGTTCCT AAATCTCGGA TTCTCGATTT TCATAACGGT GTTGTCAAAG ACATTCTTCT TAAGCAAAAA TCAGCTTCGG GACTCGCTCT TCTCTATCCA
TACACACCAG CCTCCTTATT CCACACGGAC GTCACTTACA TTGAGTTCTT GGATAGGGTG CACTCCTCTG AGATGAAGCT GAGAGCTAAG GGCTTGTGGG
ACAGGCATCC TAAACAACTG GAGGTCATCG TTCAATCCAC AGGACCCAGA GCGGGCTAGC CGGTTCGAAA CAGACAGAAA AGTGCTCTTC TGCCTCGAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1210
1220
1230
1240
1250
1260
1270
1280
1290
1300
ACAAACCGGA ATAAATGGGA CAATCGTATG TCGGCGATGA TACCAGAGAT CGATGAAGAT GTTATATATA TTATCGGACT ACTACAATCC GCTACCCCAA
AAGTCCCACA CCCATGGCTT AATCTCATCA TACCAAGAAG CACTATCCAT ACATTTGCAG AGCAGGTCTT TGGGAAAATC CTCGAAGATA ACAACAATGG
TGACAAAGAA CTTCAACCCT GAAGAAGCTG ACATCATGGA ACAGGTAAGC CGACGATTAA TCCTTGTGTT ACTAAAGATG TTTATGTATG AAGTGCTATC
AtCKX2
HvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1310
1320
1330
1340
1350
1360
1370
1380
1390
1400
AGGATCTTCC AGAAGTGGAG AGCGTTAACG AGAAGATAAT TAGGTTTTGC AAGGATTCAG GTATTAAGAT TAAGCAATAT CTAATGCATT ATACTAGTAA
TCCCATATTG CTCTACCCAG TGAAGAAGTC CAGATGGGAC AACCGAACGT CAGTGGTCAT ACCAGATGAG GAAGTTTTCT ACCTGGTGGG ATTCCTATCC
gHvCKX2
AGGTGGCCTG AGTGGTTGAA TTCCATATGT ATATGTGTTT ACAGGAGGTC CATGCACTAC TATCTCAACT TAGATACACA CCAGCCTCCT TATTCCACAC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1410
1420
1430
1440
1450
1460
1470
1480
1490
1500
AGAAGATTGG ATTGAGCATT TTGGATCAAA ATGGGATGAT TTTTCGAAGA GGAAAGATCT ATTTGATCCC AAGAAACTGT TATCTCCAGG GCAAGACATC
TCGGCGATAG GCCCCCACAG CATCGAACAT ACATTGAACC TGAACAACCA GATAATAGAG TTCTCTAACA AAGCAAGTAT TGGGGTGAAG CAATATCTTC
GGACGTCACT TACATTGAGT TCTTGGATAG GGTGCACTCC TCTGAGATGA AGCTGAGAGC TAAGGGCTTG TGGGAAGTCC CACACCCATG GCTTAATCTC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1510
1520
1530
1540
1550
1560
1570
1580
1590
1600
TTTTGA.... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
CAAACTACAC CACAGAACCC GAGTGGAAGG CCCACTATGG GGCTAGGTGG GACGCATTTC AACAGAGGAA AAACACCTAT GACCCCCTGG CAATCCTAGC
ATCATACCAA GAAGCACTAT CCATACATTT GCAGAGCAGG TCTTTGGGAA AATCCTCGAA GATAACAACA ATGGTCCCAT ATTGCTCTAC CCAGTGAAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1610
1620
1630
1640
1650
1660
1670
1680
1690
1700
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TCCAGGACAG AAAATATTTC AAAAGAAACC AGCATCACTA CCCTTGTCCT CGTTACAGTA CCTACTGTAA AAAATATATA TGTGGAGCAA TATGTCTATG
AGTCCAGGTA AGTTAGCTAA TGTCCCGTAA TAACAAATCC CATTCAGAAA CTATTATACA CCACGCCATA GTGTTGCCAA GTGAATGATT CATCTTGTTT
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1710
1720
1730
1740
1750
1760
1770
1780
1790
1800
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TTAGTATGGA ACTATAGTCG CTTTGCAAAA GATAACGAAC TGCAGCGTGA AGGACACTGT ACAGAGTAGT GACTATTAGT AGTGGTGATG CTCAAAATAC
CATGCAGATG GGACAACCGA ACGTCAGTGG TCATACCAGA TGAGGAAGTT TTCTACCTGG TGGGATTCCT ATCCTCGGCG ATAGGCCCCC ACAGCATCGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1810
1820
1830
1840
1850
1860
1870
1880
1890
1900
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
TTTTAGCACT GAGATCAATG AAGATCAGC. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
ACATACATTG AACCTGAACA ACCAGATAAT AGAGTTCTCT AACAAAGCAA GTATTGGGGT GAAGCAATAT CTTCCAAACT ACACCACAGA ACCCGAGTGG
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1910
1920
1930
1940
1950
1960
1970
1980
1990
2000
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AAGGCCCACT ATGGGGCTAG GTGGGACGCA TTTCAACAGA GGAAAAACAC CTATGACCCC CTGGCAATCC TAGCTCCAGG ACAGAAAATA TTTCAAAAGA
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2010
2020
2030
2040
2050
2060
2070
2080
2090
2100
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AACCAGCATC ACTACCCTTG TCCTCGTTAC AGTACCTACT GTAAAAAATA TATATGTGGA GCAATATGTC TATGTTAGTA TGGAACTATA GTCGCTTTGC
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
2110
2120
2130
2140
2150
2160
2170
2180
2190
2200
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AAAAGATAAC GAACTGCAGC GTGAAGAACA CTGTACAGAG TAGTGACTAT TAGTAGTGGT GATGCTCAAA ATACTTTTAG CACTGAGATC AATGAAGATC
...
AtCKX2
HvCKX2
gHvCKX2
...
...
AGC
Obrázek 4. Sekvence klonovací kazety vektoru pDRIVE s vyznačenými restrikčními
místy. (Poznámka: všechny tři geny byly do vektoru naklonovány pomocí TA
strategie)
Obrázek 5. Sekvence klonovací kazety vektoru pYES2 s vyznačenými restrikčními
místy (Poznámka: v případě genů HvCKX2 a gHvCKX2 byly do vektoru
překlonovány z vektoru pDRIVE pomocí restrikčních enzymů SphI a HindIII, v
případě genu AtCKX2 byl do vektoru naklonován pomocí restrikčního enzymu
KpnI.)
Detekce geneticky modifikovaných organismů v potravinách
pomocí PCR
Teoretický úvod
Důležitým aspektem studia biochemie je získat zkušenosti s novými
metodikami molekulární biologie, které mohou být využity v biotechnologickém
průmyslu. Detekce geneticky modifikovaných organismů je typickým příkladem,
který má široké uplatnění v zemědělství a potravinářství.
Názory na geneticky modifikované organismy jsou v současné době
rozporuplné nejen mezi laickou veřejností, ale i mezi vědeckou komunitou.
Geneticky modifikované rostliny mohou například vést ke zvýšení výnosů
prostřednictvím zvýšené rezistence k chorobám a škůdcům. Na druhou stranu,
mohou takovéto organismy ohrožovat životní prostředí svojí umělou vysokou
rezistencí a možným rozšířením do přírody. Sekundární efekty na životní prostředí a
na lidstvo mohou být dlouhodobé a lze je zatím jen velmi těžko odhadovat. Toto je
hlavním důvodem proč v některých zemích lobující skupiny prosadily důslednou
kontrolu produkce geneticky modifikovaných rostlin a snaží se zamezit jejich
širšímu používání. V Evropských zemích, přítomnost geneticky modifikovaných
organismů v potravinách musí být uvedena. Proto tedy výrobci potravin musí mít
jistotu, že geneticky modifikované organismy nejsou přítomny v jejich surovinách,
pokud uvádějí na trh výrobek jako neobsahující geneticky modifikované organismy.
S ohledem na to že metodika detekce geneticky modifikovaných organismů
v potravinách musí být spolehlivá a rychlá, byly využity metodiky molekulární
biologie pro PCR protokol, který může být jednak využit v kontrolních laboratořích a
jednak použit pro výuku studentů.
V tomto experimentu je použito PCR (polymerase chain reaction) k určení zdali
předložený vzorek obsahuje geneticky modifikované organismy. Tato technika může
být použita také k jiným účelům například v soudní medicíně, či paleontologii. PCR
probíhá ve třech fázích: 1) tepelná denaturace dvouvláknové DNA, 2) navázání
primerů na specifické sekvence ochlazením a 3) narůstání řetězců DNA
prodlužováním primerů. Tyto tří kroky jsou nazývány jeden cyklus a PCR je
založena na opakování takovéhoto cyklu, při němž dochází k exponenciálnímu
nárůstu (2n, kde n je počet cyklů) množství specifického úseku DNA ohraničené
primery. To znamená že po 30 cyklech je tento úsek amplifikován více než 109 x a
může být snadno detekován na elektroforetickém gelu.
Pro tento experiment, primery byly navrženy tak aby detekovaly dva typy genů.
První sada primerů amplifikuje endogenní rostlinné geny, gen chloroplastu,
sojového lektinu a kukuřičného aktinu. To slouží k potvrzení přítomnosti rostlinné
a specificky sojové či kukuřičné DNA ve vzorku. Druhá sada primerů amplifikuje
sekvence které nejsou normálně v rostlinách, ale jsou vneseny genetickou
transformací. V tomto případě jsou těmito cizími úseky DNA konstitutivně aktivní
35S promoter viru květákové mozaiky (35S CaMV) a terminátor genu nopalin
syntetasy (NOS) z Agrobacterium tumefaciens. Pokud kterákoliv z těchto sekvencí je
amplifikována, ukazuje to že cílová DNA je transgenní. Všechny povolené geneticky
upravené zemědělské plodiny byly transformovány s konstrukty obsahujícími jeden
nebo oba tyto prvky. PCR primery byly navrženy tak aby pásy detekované na
agarosovém gelu měly různou pohyblivost (viz Tab. 1) a byly tak snadno odlišitelné.
Tabulka 1. Primery použité pro PCR detekci geneticky modifikovaných rostlin.
Úsek DNA
Orientace, název
rostlinný
pozitivní, CP3
chloroplast negativní, CP4
sojový lektin pozitivní, LEC1
negativní, LEC2
kukuřičný
pozitivní ACTfw
aktin
negativní ACTrev
35S
pozitivní, CaMV1
promoter
negativní, CaMV2
NOS
pozitivní, NOS A
terminátor
negativní, NOS D
Sekvence
5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’
5’-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3’
5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’
5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3’
5´-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA-3´
5´-CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA-3´
5’-GAAGGTGGCTCCTACAAATGCC-3’
5’-GTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’
5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG-3’
5’-GCGGGACTCTAATCATAAAAACCC-3’
Velikost
pásu
(bp)
530
118
551
199
127
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Roztok S1 (10 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100,
autoklávováno).
Roztok S2 (1% SDS, autoklávováno)
směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0)
isopropanol, 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC)
mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky)
Primery dle Tab. 1 (0,01 mM), Taq polymerasa, dNTP mix, PCR pufr, PCR
zkumavky
Termocykler (Biometra)
3 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA)
Zásobní elektrodový pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA,
pH 8,0)
50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 %
xylenová violeť
10% Ethidium bromid
DNA marker (GeneRuler 5Obp nebo λ DNA naštípaná restrikčním enzymem
PstI)
Termoblok
Elektroforeza, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj
AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů
Mikropipety, špičky
Inkubovaná třepačka 37oC, laboratorní mikrocentrifuga
1.DEN
SE SMĚSÍ FENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL PRACUJ VŽDY
V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!
.
a) Extrakce DNA z rostlinného materiálu:
•
K neznámým vzorkům 0,1 g rostlinné mouky (dodá vedoucí cvičení) přidáme
0,45 ml S1 a 0,25 ml S2 protřepeme 10 min na třepačce, centrifugujeme při
14.000 g, 5 min, supernatant přelijeme do čisté mikrozkumavky.
•
Přidáme 0,7 ml směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 8,0),
vortexujeme 15 sec. a centrifugujeme při 14.000 g, 5 min, horní vodnou fázi
přepipetujeme do čisté mikrozkumavky.
•
Přidáme stejný objem isopropanolu (0,3-0,7 ml), vortexujeme 15 sec. a
necháme stát 2 min. na stole.
•
Centrifugujeme při 14.000 g, 10 min, pokojová teplota, supernatant odlijeme.
•
Precipitát promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20oC), centrifugujeme při 14.000
g, 5 min, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a
odpipetujeme, ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.
•
Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0.03 ml TE.
b) PCR
•
Pro detekci jednotlivých fragmentů DNA nastavíme PCR pro každou z pěti sad
primerů viz tabulka 1
•
Do 0,2 ml PCR zkumavky pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto
pořadí:
17,5 µl vody pro PCR
2,5 µl 10x PCR pufru
0,5 µl dNTP mix (každý 10 mM)
1,0 µl pozitivního primeru na stěnu mikrozkumavky
1,0 µl negativního primeru na stěnu mikrozkumavky
2,0 µl DNA matrice
0,5 µl Taq polymerasy
•
•
•
Zvortexujeme a krátkou centrifugací dopravíme všechny reagencie na dno
zkumavek
Současně s amplifikaci DNA z neznámého vzorku nastavte ke každé PCR
negativní kontrolu, do které místo DNA matrice pipetujeme vodu
Na termocykleru nastavíme PCR program:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
•
Počáteční denaturace 94oC, 7 min
Denaturace 94oC, 30 sec
Navázání primerů (annealing) 60oC, 30 sec
Růst řetězce (elongace) 72oC, 1 min
Kroky 2-4 opakovat 40x
Koncová elongace 72oC, 10 min
Chlazení 4oC
Program necháme proběhnout a zatím si připravíme agarosovou elektroforezu.
c) Agarosová elektroforeza DNA
•
Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky rozpustíme 3% agarosu (v 1x
TAE) v mikrovlnné troubě a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální
elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného
postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme
40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN) a promícháme špičkou.
Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak
aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel necháme ztuhnout asi 30 min.
•
Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200
ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala z agarosovým gelem.
•
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: K PCR produktu (25 µl) pipetujeme 5
µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10
min.
•
naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením
jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo
v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků. Do
jedné z jamek neopomeneme nanést DNA marker (5 µL 50bp GeneRuler nebo λ
DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI).
•
zdroji napětí 120 V po dobu 20-30 minut. Průběh elektroforezy je možné
•
1/ Porovnáme výsledek elektroforezy s Obr.2 a z kalibrační křivky markeru určíme
přítomnost a velikost jednotlivých PCR produktů. Porovnáme s očekávanou velikostí
dle Tab. 1.
Obr.6 Výsledky PCR pro vzorky obsahující normální a transgenní rostliny (sója).
2/ Vyhodnoťte který z předložených vzorků obsahuje transgenní rostliny a jaké?
3/ Proč se pro PCR používá DNA polymeráza z termofilních organismů?
4/ Zdůvodněte proč v případě primerů CP3 a CP4 by jste měli vždy u každé rostliny
dostat pozitivní výsledek a v případě primerů pro kukuřičný aktin nikdy
nezamplifikujete aktin sójový?
Literatura:
Thion, L., Vosse, C., Couderc, B., Erard, M., Clemençon, B. (2002) Detection of
genetically modified organisms in food by DNA extraction and PCR amplification.
Biochem. Mol. Biol. Edu. 30, 51-55.
Genetická transformace kvasinek a její ověření pomocí měření
aktivity rekombinantního enzymu
Teoretický úvod
Až donedávna mohly být studovány jen proteiny, které jsou v buňce přítomny
v relativně velkém množství. Pro detailní studium proteinu včetně eventuální
krystalizace a určení trojrozměrné struktury je třeba alespoň 0,1 g čistého proteinu.
Pokud se tedy protein vyskytuje v zastoupení kolem 1%, je nutné začít jeho
purifikaci z několika set gramů buněk. Avšak většina z mnoha tisíců proteinů
eukaryotní buňky včetně těch, které jsou pro život zcela nezbytné tvoří jen zlomek
tohoto zastoupení a je velice obtížné, ne-li nemožné získat byť jen několik
mikrogramů čistého proteinu. Proto bylo velkým přínosem zavedení klonovacích
technik a genového inženýrství, neboť s jejich pomocí lze připravit velké množství i
těch nejvzácnějších proteinů.
Po tvorbu proteinů byly zkonstruovány speciální, tzv. expresní vektory, které
obsahují vhodné regulační sekvence a promoter pro daný organismus (baktérie,
kvasinky, kultury hmyzích nebo savčích buněk) v těsné blízkosti místa do kterého
je vklonován insert s kódující sekvencí. Promoter spolu s regulačními sekvencemi
zajišťuje produkci velkého množství mRNA, která slouží k proteosyntese. Protože se
vektory s každým buněčným dělením replikují, vzniká populace buněk schopná
vytvořit velké množství rekombinantního proteinu.
Obrázek 7. Příprava rekombinantního proteinu.
Pomocí těchto technik bylo vyprodukováno mnoho buněčných proteinů
v množstvích, která byla dostatečná pro detailní strukturní a funkční studie. Navíc
v dnešní době jsou tyto technologie využívány pro produkci mnoha proteinů
používaných v medicíně, jako například insulin a plášťové proteiny virů používané
při očkování.
V našem experimentu připravíme rekombinantní enzym cytokinindehydrogenasu
(1.5.99.12) z Arabidopsis thaliana, který katalyzuje odbourávání rostlinných
hormonů cytokininů:
CH3
CH3
HN CH2 CH C
N
CH2 CH C
CH3
N
N
N
N
HN
N
H
CH3
N
H
N
Isopentenyladenin
Aox
FAD
CKX
el. akceptor
Ared
FADH2
CH3
NH2
N CH CH C
N
N
CH3
+ O CH CH C
N
Adenin
N
H
CH3
+ H2O
N
N
N
CH3
N
H
3-Methyl-2-butenal
Obrázek 8. Katalytická reakce cytokinindehydrogenasy.
Pro expresi genu cytokinindehydrogenasy AtCKX2 v kvasinkách Saccharomyces
cerevisiae použijeme přenosový vektor (shuttle vector) mezi E. coli a kvasinkami.
Tento vektor byl připraven klonováním v E. coli a obsahuje Amp R gen pro selekci
na základě rezistence baktérie vůči antibiotiku ampicilinu. Pro reprodukci v
kvasinkách obsahuje tento vektor replikační signál (2 micro) a pro selekci gen URA3
který umožní kvasinkám autotroficitu na uracil. Jedině transformanty nesoucí
tento gen budou tedy schopny se množit na médiu neobsahujícím uracil. Pro
expresi genu AtCKX2, byl použit silný konstitutivní kvasinkový promoter PMA1 a
ADH terminátor. Transformaci kvasinek provedeme dvěma způsoby pomocí
tepelného šoku při 42 oC v přítomnosti octanu lithného, polyethylenglykolu (PEG) a
nosné jednovláknové DNA (ss-DNA) a elektroporačně.
Exprimovaný gen obsahuje peptidovou signální sekvenci, která způsobuje jeho
vylučování kvasinkami do růstového média. Expresi proteinu lze tedy snadno ověřit
měřením aktivity cytokinindehydrogenázy v médiu, pro kterou se využívá interakce
vznikajícího 3-methyl-2-butenalu s p-aminofenolem v kyselém prostředí, kde
dochází k tvorbě Schiffovy báze absorbující při 352 nm.
HindIII
PMA1 promotor
Pst I
Amp R
CKX2
pDR197-CKX2
BamHI
7.9 kb
ADH terminator
Sph I
URA3
EcoRV
2micro
Obrázek 9. Schéma
cytokinindehydrogenasy.
expresního
vektoru
pro
přípravu
rekombinantní
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kultura 100 ml E. coli obsahující plasmid pDR197-AtCKX2 na Petriho misce s
pevným LB médiem
LB médium (1% pepton, 0,5% kvasnicový extrakt 1%, NaCl, pH upraveno na
7,5 pomocí NaOH, autoklávováno) obsahujícím 100 µg/ml ampicilinu.
Roztok P1 (50 mM Tris/HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno
0,1 mg/ml Rnasy A
Roztok P2 (0,2 M NaOH, 1% SDS, autoklávováno)
Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5,5, autoklávováno)
isopropanol, 70 % ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC)
Médium YPAD (1% trypton, O,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, 0,2 mg/ml
adeninu, autoklávováno, po ochlazení na cca 50 oC přidána 2% glukosa).
Uchovávat při 4oC.
Kultura 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- na Petriho misce
s pevným YPAD médiem uchovávána při 4oC.
0,1 M octan lithný, autoklávováno
1 M octan lithný, autoklávováno
polyethylenglykol (PEG) MW 3350 (50% w/v), autoklavováno
ss-DNA (salmon sperm DNA, 2 mg/ml). Uchováváno při –20 oC.
1M sorbitol, autoklávováno
1M dithiotreitol, sterilizováno filtrem
100% glycerol, autoklavováno
YNB-Glc médium pro selekční agarové desky (0,68% yeast nitrogen base w/o
amino acids – Difco, 2% agar autoklavováno, po ochlazení na cca 50 oC přidat
2% glukosu sterilizovanou přes mikrobiální filtr – Sartorius). Uchovávat při 60
oC.
Médium YNB-Glc-KPB (0,68% yeast nitrogen base w/o amino acids – Difco,
0,15M fosfátový pufr, autoklavováno, po ochlazení na cca 50 oC přidána 2%
glukosa sterilizovaná přes mikrobiální filtr – Sartorius). Uchovávat při +4 oC.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
10 mM isopentenyladenin v DMSO. Uchovávat při +4 oC.
0,3 mM TRIS/HCl, pH 8,0
5 mM DCPIP (dichlorofenol indofenol) ve vodě, Uchovávat při +4 oC.
40% kyselina trichloroctová
2% p-aminofenol v 6% kyselině trichloroctové
UV spektrofotometr, křemenná kyveta
Termoblok
Inkubované třepačky 30 a 37oC, inkubátory 30 a 37oC.
Mikrozkumavky 1,5 ml (ependorfky), centrifugační kyvety 50 ml.
Chlazená laboratorní centrifuga, laboratorní mikrocentrifuga
elektroporátor
Mikropipety, špičky, sterilní Erlenmayerovy baňky
1.DEN
.
a) Příprava kultury E.coli TOP10F nesoucí shuttle vektor s naklonovaným
rekombinatním vektorem
•
Inokulujeme 20 mL LB media s ampicilinem v 250 ml Erlenmayerově baňce
jednou kolonií E.coli nesoucí vektor pDR-AtCKX2 a necháme růst přes noc při
37ºC.
b) Příprava kompetentních buněk kvasinek
•
Kulturu 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c
ponecháme růst v YPAD médiu přes noc při 30 oC.
2.DEN
ura-
z jedné
kolonie
.
•
Přes noc narostenou kulturu kvasinek zředíme na OD600 0,1 do 30 ml YPAD
média a necháme růst dalších 3-5 hodin (do OD600 cca 0,3).
•
Zbytek kvasinkové kultury uchováme do 5 dne v uzavřené zkumavce v lednici.
Zkumavku popiš svými iniciálami.
c) Makroizolace plasmidu pDR197 CKX2 z E. coli
•
Použijeme 20 ml připravené kultury E. coli nesoucí plasmid pDR197-AtCKX2
v LB-Amp médiu.
•
Centrifugujeme ve sterilních 50 mL falkonkách na 2.360 g, 4 min (centrifuga
ROTANTA), resuspendujeme vortexováním ve 2 ml P1.
•
Přidáme 2 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením falkonky,
ponecháme stát 5 min při laboratorní teplotě.
•
Přidáme 2 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky,
ponecháme stát 10 min na ledě.
•
Centrifugujeme při 2.360 g, 5 min, 4 oC (centrifuga ROTANTA) , supernatant i
s případnými nečistotami přepipetujeme v aliquotech do čistých sterilních
ependorfek a dočista centrifugujeme na centrifuze Jouan při 21.000 g 10
minut, 4 oC.
•
Přidáme 0.7 objemového podílu isopropanolu (laboratorní teploty, např. k 0.9
mL supernatantu 0.6 mL isopropanolu), centrifugujeme při 21.000 g, 10 min,
4 oC, supernatant odlijeme. Při vkládání ependorfek do centrifugy dbej
orientace, jelikož často získáš neviditelný pelet.
•
Sraženinu promyjeme s 1 ml 70% ethanolu (-20 oC), centrifugujeme při 21.000
g, 5 min, 4 oC, supernatant odlijeme, zbytky odstředíme na dno ependorfky a
odpipetujeme, ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.
•
Sraženinu DNA resuspedujeme postupným pipetováním v 0,01 – 0,05 ml
sterilní vody (záleží na výtěžku tzn. limitu rozpustnosti DNA, jde o to dostat
maximálně koncentrovaný roztok, proto pokud tušíš, že došlo ke ztrátám začni
pelety rozpouštět v 10 mikrolitrech a pak pokud dojde k nasycení, roztok začne
pěnit, přidej vodu).
•
Centrifugujeme při 13.000 g, 2 min, supernatant přeneseme do nové
ependorfky a uložíme při 4 oC.
•
Do 1 cm křemené kyvety napipetujeme vhodně zředěnou izolovanou DNA (1001000x). Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm
proti sterilní vodě. Koncentraci DNA vypočítáme ze vztahu:
cDNA (µg/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280
d) Chemická transformace kvasinek
Všechny centrifugace prováděj v řádně vychlazené centrifuze (4 oC).
•
Sterilní YNB agar z jedné zásobní baňky (v lednici) rozpustíme v mikrovlnné
troubě a ve flowboxu rozlijeme na 6-8 Petriho misek a necháme ztuhnout.
•
Použijeme kulturu Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- po 2-4 hodinách
růstu (OD600 cca 0,3).
•
Centrifugujeme při 3.000 g, 5 min (v 50 mL falkonkách, centrifuga ROTANTA),
resuspendujeme ve 20 ml ledové vody.
•
Centrifugujeme při 3.000 g, 5 min, resuspendujeme v 1 ml 0,1 M octanu
lithného a přeneseme do sterilní ependorfky.
•
Centrifugujeme při 14.000 g, 15 s, odstraníme supernatant
resuspendujeme v 0,5 ml 0,1 M octanu lithného vortexováním.
•
0,05 ml podíly přeneseme do dvou vychlazených ependorfek.
•
Centrifugujeme při 14.000 g, 15 s, odpipetujeme supernatant.
•
Přidáme v tomto v tomto pořadí (!):
•
240 µl PEG MW 3350
•
36 µl 1 M octanu lithného
•
50 µl ss-DNA
pipetou,
•
1-5 µl DNA pro transformaci (cca 2 µg)
•
32 µl vody
•
Suspendujeme pipetováním, inkubujeme při 30 oC 20 min, dále při 42 oC 30
min.
•
Centrifugujeme
při
14.000
g,
resuspendujeme v 1 ml sterilní vody.
•
Centrifugujeme
při
14.000
g,
15
s,
odpipetujeme
supernatant,
resuspendujeme v 0,2 ml média YNB-Glc, inkubujeme s třepáním 1 h při 30
oC.
•
Rozetřeme na pevné půdy YNB-Glc po 100 µl alikvotech, inkubujeme při 30 oC.
•
Po 2-3 dnech spočítáme kolonie, inokulujeme kapalné kultury vybraných
kolonií v 1,5 ml YNB-Glc-KPB pH 7.2.
15
s,
odpipetujeme
supernatant,
e) Příprava elektrokompetentních buněk Saccharomyces cerevicae (provede
vedoucí cvičení)
•
Kulturu 1,5 ml Saccharomyces cerevisiae 23344c ura- z jedné kolonie
ponecháme růst v YPAD médiu přes noc při 30 oC.
•
Druhý den přeneseme 1 ml kultury do 500 ml YPAD média a v 2L
Erlenmayerově baňce necháme růst přes noc při 30 oC do OD600 = 1,5.
•
Kulturu centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC) a rozsuspendujeme v 80 ml
sterilní vody.
•
Kulturu přelijeme do sterilní Erlenmayerovy baňky a přidáme 10 ml 10x TE
pufru a 10 ml 1M octanu lithného a necháme třepat 45 min při 30 oC.
•
Přidáme 2,5 ml 1M dithiotreitolu a třepeme dalších 15 minut.
•
Přidáme 500 ml vychlazené vody a centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC)
•
Supernatant odlijeme a pelet rozpustíme ve 200 ml vychlazené vody,
centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC), celkem opakujeme 3x
•
Po třetí centrifugaci pelet rozpustíme ve 30 ml 1M vychlazeného sorbitolu a
znovu centrifugujeme (4.000 g, 5 min., 4oC).
•
Pelet rozsuspendujeme v nejmenším možném množství 1M sorbitolu a
naředíme sorbitolem aby výsledné OD600 bylo 200.
•
Přidáme vychlazený glycerol do finální koncentrace 15%, rozpipetujeme po 50
µl do vychlazených mikrozkumavek a okamžitě zamrazíme na -70 oC.
f) Elektroporace kvasinek (provádí studenti)
•
Zamraženou mikrozkumavku s elektrokompetentními kvasinkami vyndáme
z mrazícího boxu a necháme roztát na ledu (5-10 min.).
•
Centrifugujeme v důkladně vychlazené centrifuze (1-2 oC) 2 min při 5.000 g.
•
Supernatant odstraníme a pelet resuspendujeme v 1 ml předem řádně
vychlazeného 1M sorbitolu (30 minut na -20 oC).
•
Centrifugaci a rozsuspendování ještě dvakrát zopakujeme.
•
Mikrozkumavku s kvasinkami stále udržujeme na ledu.
•
Poslední pelet rozsuspendujeme v 80 µl 1M sorbitolu.
•
Přidáme 1 µl izolované plasmidové DNA a zamícháme špičkou pipety.
•
Transformační směs přepipetujeme na dno předem vychlazené elektroporační
cely.
•
Celu důkladně osušíme a vložíme do elektroporátoru nastaveného na 1.500
kV.
•
POZOR! Udělíme elektropuls a do cely okamžitě pipetujeme 300 µl 1M
sorbitolu
(předem
připravený
ve
sterilní
ependorfce)
a
buňky
rozuspendujeme. V případě nesprávně vymyté kyvety či kontaminace DNA
solí hrozí nebezpečí zranění vystřelením víčka např. do oka, proto dbej
opatrnosti a při udělení elektropulsu raději uskoč.
•
Pokud byl elektroimpuls kratší než 4 ms nebo došlo ke vzniku elektrického
oblouku, elektroporaci opakujeme s novou elektroporační celou a novou
alikvotou kvasinek, snížíme množství přidávané plasmidové DNA na 0,5 µl a
kvasinky důkladně promyjeme 1M vychlazeným sorbitolem.
•
Kvasinky po elektrošoku rozuspendované v sorbitolu rozetřeme hokejkou na
YNB selekční agarové plotny a dáme do inkubátoru na 30 oC.
•
Po 2-3 dnech spočítáme kolonie.
5.DEN
.
•
1,5 ml YNB-Glc-KPB média, pH 7.2, ve sterilních zkumavkách inokulujeme
jednotlivými koloniemi kvasinek po chemické a elektrotransformaci (2x2), dvě
další zkumavky inokulujeme netransformovanýma kvasinkama a do jedné
kultury inokulované netransformovanou kvasinkou přidáme 10 µl 100 mM
uracilu.
•
Všechny zkumavky necháme inkubovat dva dny na třepačce při 30
(exprimuje se rekombinační enzym).
7.DEN
g)
oC
.
Měření aktivity rekombinantního enzymu
•
Po 2-3 dnech změříme aktivitu cytokinindehydrogenasy v médiu vybraných
transformantů.
•
Kultury kvasinek přeneseme do 1,5 ml ependorfek.
•
Centrifugujeme při 5.000 g, 5 min.
•
K 0,1 a 0,01 ml supernatantu z každé nastavené exprese v mikrozkumavkách
přidáme 0,30 ml pufru TRIS/HCl pH 8,0; 0,06 ml 5 mM DCPIP a 0,03 ml 10
mM isopentenyladeninu a doplníme vodou na celkový objem 0,6 ml. Ke
každému vzorku připravíme blank, který bude obsahovat všechny komponenty
kromě isopentenyladeninu, který nahradíme čistým DMSO.
•
Inkubujeme 30 min při 37 oC.
•
Enzymovou reakci zastavíme přidáním 0,3 ml 40% kyseliny trichloroctové.
Tvorbu Schiffovy báze iniciujeme přidáním 0,2 ml 2% p-aminofenolu (v 6%
kyselině trichloroctové).
•
Reakční směs centrifugujeme 5 min. při 14.000 g.
•
Měříme absorbanci při 352 nm proti blanku. Odečítáme celá spektra v rozsahu
500-300 nm případné nejasnosti konzultujeme s vedoucím cvičení.
1/
Vypočítáme aktivitu cytokinindehydrogenasy v nkat (nmol vznikajícího 3methyl-2-butenalu za sekundu) produkované kvasinkami v 1 ml média. Schiffova
báze vznikající z 3-methyl-2-butenalu a p-aminofenolu má ε352 = 15.2 mM-1cm-1.
2/ Porovnáme účinnost elektro a chemické transformační metody.
3/ Co je to PMA1 promoter?
4/ Proč není možné získat rekombinantní cytokinindehydrogenasu z kvasinek
pěstovaných v YPAD médiu?
Literatura
Agatep P., Kirkpatrick R.D., Parchaliuk D.L., Woods R.A., Gietz R.D. (1998)
Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single stranded
DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical Tips Online
(http://tto.trends.com).On line.
Frébort I., Šebela M., Galuszka P., Werner T., Schmülling T., Peč P. (2002)
Cytokinin oxidase/dehydrogenase assay: optimized procedures and applications.
Anal. Biochem. 306, 1-7.
Ausubel, F.M. et al. (1990) Current Protocols in Molecular Biology. Greene
Publishing Associates, New York.
PCR screening vybraných genů z lambda FIX II genomové knihovny
ječmene
Teoretický úvod
V poslední době se pro hledání konkrétních genů daného organismu začalo využívat jejich
DNA knihoven. DNA knihovna je soubor fragmentů DNA příslušného organizmu naklonovaný
do určitého vektoru. Podle původu DNA lze knihovny dělit na dva základní typy: genomové
knihovny – představují soubor fragmentů získaných štěpením celého genomu a cDNA
knihovny připravené z fragmentu cDNA získaných zpětnou transkripci mRNA izolované
z buněk určité tkáně v daném vývojovém stádiu organismu. Jeden organizmus proto může
mít pouze jednu genomovou knihovnu kdežto cDNA knihoven lze připravit mnoho typů.
Dalším kritériem pro klasifikaci DNA knihoven pak může být použitý typ klonovacího
vektoru. Při konstrukci genomových knihoven závisí výběr vektoru na velikosti genomu.
Plasmidy jako vektor se používají hlavně pro virové genomy, jelikož umožňují nést pouze
krátké fragmenty cizorodé DNA. Pro konstrukci knihoven eukaryotických organizmů se
nejčastěji používají vektory odvozené od bakteriofága lambda a kosmidy, případně umělé
kvasinkové a bakteriální chromosomy (YAC, BAC) s velkou klonovací kapacitou. V závislosti
na použitém vektoru je pak plasmidová nebo kosmidová knihovna tvořená suspenzí bakterií,
fágová knihovna suspenzí fágových částic a knihovna YAC souborem kvasinkových kmenů.
Důležitou charakteristikou každé genomové knihovny je její velikost, která udává minimální
počet klonů, který zaručuje, že v ní bude obsažen celý genom. Velikost knihovny určitého
organizmu lze vypočítat podle vzorců, do nichž je dosazována průměrná velikost inzertů
použitého vektoru, celková velikost genomu a faktor vyjadřující pravděpodobnost s jakou
bude knihovna obsahovat celý genom. Např. genomová knihovna člověka, jehož genom má
velikost 2,8x109 bp, připravená pomocí bakteriofága lambda jako vektoru s průměrnou
velikostí klonovaných fragmentů 20 kb, musí obsahovat alespoň 6,5x105 klonů, aby bylo s
99% pravděpodobností zaručeno, že nese celý genom.
Obrázek 10. Konstrukce genomové knihovny v substitučním vektoru bakteriofága
2
Lambda FIX II vektor patří mezi substituční vektory, u nichž cizorodá DNA nahrazuje střední
úsek genomu bakterofága, který je z něj restrikčnímu endonukleasami před vložením
cizorodé DNA vyštěpen (obr.1). Klonovací kapacita vektoru je mezi 9-23 kb. Systém lambda
FIX II využívá selekce založené na citlivosti k inhibici profágem P2 hostitele. Lambda fágy
obsahující aktivní geny red a gam nejsou schopný růst na hostitelském kmeni obsahující P2
lysogeny. Lambda fágy bez těchto genů rostou na P2 lysogenních kmenech, jako je např.
kmen E.coli XL1-Blue MRA (P2). Red a Gam geny jsou situovány v substitučním středním
fragmentu fágova genomu, proto divoký typ lambda FIX II fága nemůže růst na bakteriálních
buňkách XL1-Blue MRA (P2). Po vložení fragmentů genomu cílového organismu se fág stává
Red-/Gam-. Proto pěstování knihovny na XL1-Blue MRA (P2) kmeni selektuje pouze
rekombinantní fágy a umožňuje tak množit a používat knihovnu aniž by docházelo ke
ztrátám insertů. Nedoporučuje se však knihovnu přepěstovávat více než jednou, jelikož
pomaleji rostoucí klony (ty s většími inserty) mohou být v knihovně výrazně potlačeny.
Komerčně získaná lambda FIX II genomová knihovna z ječmene byla připravená z genomové
DNA izolované z etiolovaných listů osmidenních semenáčku Hordeum vulgare varieta Igri.
Izolovaná DNA byla před vložením do vektoru naštípána restrikční endonukleasou Sau3A I.
Obrázek 11. Princip hybridizace kolonií plasmidové knihovny s radioaktivně značenou
DNA sondou.
Pro vyhledávání konkrétních genů v knihovně existuje několik způsobů. Nejčastěji se
využívají DNA sondy. Ty mohou být připravené přepisem mRNA z tkáně, v níž dochází k silné
expresi hledaného genu. Fragment této DNA je pak označen buď radioaktivně, nebo
fluorescenčně a použit jako hybridizační sonda. Popřípadě může být jako základ pro sondu
použita sekvence DNA genu příbuzného organizmu. Řada genů vyznačujících se stejnou
funkcí obsahuje konzervativní sekvence s vysokým stupněm homologie. Lze také využít
synteticky připravených oligonukleotidů odvozených ze sekvence aminokyselin proteinu,
kodóvaného hledaným genem. Vzhledem k degeneraci genetického kódu je obvykle třeba
použít několika alternativních sekvencí dohromady tzv. degenerované oligonukleotidy.
Rozpěstováním knihovny na Petriho miskách a následnou hybridizaci s DNA sondou po
přenesení plaku či bakteriální kolonie na vhodnou membránu lze pak vybrat konkrétní klon
mající v inzertu hledaný gen (obr.2). Fágovou částici či plasmid rostoucí na vybrané kolonii
lze pak namnožit, lambda DNA či plasmidovou DNA vyizolovat a odsekvenovat. Alternativní
cestou pro hledání konkrétního genu je pak amplifikace genové DNA pomocí PCR, kde je jako
matrice použitá lambda DNA izolovaná z rekombinatních bakteriofágů dané knihovny. Pokud
známe 5´ a 3´ konce genu, lze na základě jejich sekvence navrhnout nedegenerované
oligonukleotidy (primery) a jednou amplifikací získat celý gen. Většinou však známe pouze
3
část sekvence, pak lze pro amplifikaci využít specifických primerů odpovídajících sekvenci T3
a T7 promoterů bakteriofága v kombinaci s jedním genově specifickým primerem. Výsledkem
je často nespecifická amplifikace, selekci lze pak provést následnou odstupňovanou tzv.
nested PCR, kdy se použije pro amplifikaci genově specifický primer vzdálený několik desítek
bází od prvního primeru ve směru amplifikace. Amplifikovaný úsek však může dosahovat
délky až 23 kb (velikost inzertu) je pak proto vhodné pro PCR používat speciálně upravené
rekombinatní Taq DNA-polymerasy v tzv. LA-PCR ( z angl. long and accurate) systému.
• genomická knihovna z ječmene v lambda FIX II vektoru – zásobní titr, uchovávat na -80°C.
• 50 mL přes noc napěstované kultury bakterií E.coli XL1-blue MRA (P2)
• NZY agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 1,5% agar,
pH 7.5)
• SM médium (50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgSO4.7H2O, 0.01% želatina)
• LB médium (1,0% trypton, 1,0% NaCl, 0,5% kvasničný extrakt, pH 7,0)
• 10 mM MgSO4.7H2O
• NZY Top agar (1,0% NZ amin, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,2% MgSO4, 0,5% NaCl a 0,7%
agarosa, pH 7.5)
• 30% roztok polyethylenglykolu 6000 s 3M NaCl
• Rnasa A, chloroform, DMSO (dimethyl sulfoxid)
• PCR reagencie: PCR voda, 10x PCR pufr, dNTP mix, primery reverse a forward, Taq DNA
polymerasa.
• 5x TBE pufr (45 mM Tris báze, 45 mM kyselina boritá, 12,5 mM EDTA)
• 30% akrylamid + 0,8% N, N´-methylenbisakrylamid
• TEMED, persíran amonný
• vzorkovací pufr (1% SDS, 0,1% bromfenolová modř, 0,1% xylenová modř, 20% glycerol)
• barvící směs ethidium bromidu (tři kapky do 100 mL vody)
• 1 kb DNA marker
• Petriho misky ∅ 90 mm a ∅ 150 mm, sterilní mikrozkumavky 1,5 mL, 0,5 mL, 0,2 mL,
sterilní skleněné zkumavky, sterilní kultivační baňky a sterilní centrifugační kyvety
• flowbox, mikrovlnná trouba, inkubátor 37°C a 30°C, vortex, centrifuga, třepačka, ledová
lázeň, termocykler, skla na vertikální elektroforezu, termoblok, elektroforetická komůrka,
zdroj napětí, transluminátor, AlphaDigiDoc - systém pro digitální fotodokumentaci gelů,
automatické pipety a špičky, Hamiltonova pipeta, rukavice, spektrofotometr, kyveta.
1. DEN
a)
.
Příprava hostitelského kmene E.coli XL1-blue MRA (P2)
• Na LB agarosovou plotnu sterilní kličkou rozetřeme E.coli XL1-blue MRA (P2) ze
zamražené zásobní mikrozkumavky
• Inkubujeme přes noc při 37ºC (připraveno vedoucím cvičení, v lednici).
4
• Další den inokulujeme 15 mL LB media s 0.2% maltosou a 10 mM MgSO4 jednou
kolonií E.coli XL1-blue MRA (P2) a necháme růst přes noc při 30ºC.
• Pěstování na 30°C zajišťuje že buňky nedorůstají do stacionární fáze a neumírají.
Bakteriofág je totiž schopen adheze na mrtvé buňky stejně dobře jako na živé a snižoval
by se tím titr.
2.DEN
.
• Narostlou kulturu zcentrifugujeme 10 min. při 2000 x g.
• Opatrně odlijeme medium a buňky jemně rozsuspendujeme v 10 mL 10 mM MgSO4.
Nevortexujeme.
• Buňky naředíme na OD600=0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 200 µL do
sterilních mikrozkumavek.
b)
Stanovení titru bakteriofága obsahujícího genomovou knihovnu
•
Připravíme si plotny s pevnou půdou NZY agaru pro kultivaci plaků rekombinatního
lambda fága na lysogenním kmenu E.coli XL1-blue MRA (P2).
•
Pod dohledem vedoucího cvičení si v mikrovlnné troubě rozpustíme NZY agar v zásobní
láhvi.
•
Ve flowboxu si nachystáme 5 sterilních Petriho misek a po ochlazení na zhruba 60°C na
ně vlijeme NZY agar, tak aby kompaktně pokryl dno.
•
Po ztuhnutí agaru plotny převrátíme a dáme vyschnout do zadní části flowboxu, tak že
horní část misky nepatrně nadzvedneme. Pracujeme ve sterilních podmínkách!
•
Připravíme si ředící řadu bakteriofága.
•
Nachystáme si 5 0.5mL mikrozkumavek do první napipetujeme 18 µL SM media a
přidáme 2 µL zásobního titru bakteriofága.
•
Do dalších zkumavek pak pipetujeme 18 µL SM media a přenášíme vždy 2 µL roztoku
z předchozí mikrozkumavky. Vytvoříme tím řádu 5 roztoků bakteriofága vždy
s desetkrát nižší koncentrací.
•
Podíl 10 µL z každé mikrozkumavky pak přeneseme do nové čisté a sterilní a přidáme
200 µL bakteriálních buněk lysogenního kmene XL1-blue MRA (P2) rozsuspendovaných
v 10 mM MgSO4 a naředěných na OD600 = 0.5.
•
Buňky s fágem pak necháme inkubovat 15 minut při 37°C za mírného třepání.
•
Mezitím si rozpustíme v zásobní láhvi NZY Top agar v mikrovlnné troubě a necháme ho
zchladit na zhruba 50°C.
•
Do pěti sterilních zkumavek si napipetujeme 2.5 mL NZY Top agaru a přidáme bakterie
s fágem, rychle rozmícháme a lijeme na NZY agarové plotny.
•
Opatrným krouživým pohybem rozlijeme agar kompaktně po celé ploše a necháme
ztuhnout.
•
Po ztuhnutí plotny obrátíme a inkubujeme přes noc při 37°C.
5
c)
PCR amplifikace vybraného genu
•
Jako templáty pro PCR použijeme zbylých 8 µL ředící řady amplifikované genomové
knihovny, kterou předem povaříme 5 min. v termobloku nebo termocykleru.
•
Povařením narušíme kapsidu bakteriofága a umožníme tak jeho DNA kontaktu
s ostatními reagenciemi v PCR zkumavce.
•
Nastavíme si sedm x dvě PCR reakce pro pět různých koncentrací templátu
(bakteriofága), zásobní titr knihovny a negativní kontrolu bez templátu.
•
Do 0,2 ml PCR zkumavek uložených v chladicím stojánku pečlivě pipetujeme (v PCR
boxu) reagencie v tomto pořadí:
16,50 µl PCR vody
2,50 µl 10x PCR pufru
0,50 µl dNTP mix (každý 10 mM)
0,50 µl pozitivního primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky
0,50 µl negativního primeru
4,00 µl DNA matrice
(1/ zásobní roztok bakteriofága, 2/ 10x 3/ 100x 4/ 1.000x 5/ 10.000 6/ 100.000x
ředěn 7/ voda, vše povařeno)
•
Reakci zahájíme přídavkem 0,50 µl Taq DNA polymerasy, zkumavku krátce
zvortexujeme, dopravíme její obsah na dno mikrocentrifugací a okamžitě vložíme do
vyhřátého termocykleru.
•
Na termocykleru předem nastavíme PCR program:
1.
2.
3.
4.
4.
5.
6.
Navázání primerů (annealing) x oC, 30 sec
Růst řetězce (elongace) 72 oC, 1 min
Chlazení 4oC
•
Provedeme tzv. „hot start“, který zabraňuje nespecifické navázání primeru na matrici
během počátečního vyhřívání termocykleru. PCR zkumavky uchováváme v chladicím
stojánku až do doby, kdy je termocykler vyhřán na počáteční 3 min denaturaci při
94oC, poté otevřeme víko a opatrně vložíme PCR zkumavky.
•
Teplotu annelingu zvolíme podle Tm použitých primerů.
•
PCR Program necháme proběhnout a zatím si připravíme elektroforézu
v akrylamidovém nebo 2% agarosovém gelu. Jako marker použijeme λ DNA naštípanou
PstI restrikčním enzymem.
Sekvence použitých primerů:
pro gen aktinu:
5´-AGC AAC TGG GAT GAC ATG GAG AAA A-3´
Tm= 64 oC
negativní ACTrev 5´-CCT GTT CAT AAT CAA GGG CAA CGT A-3´
Tm= 64 oC
pozitivní ACTfw
6
pro gen tRNA-Leu:
pozitivní CP3
5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’
Tm= 54 oC
negativní CP4
5’-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3’
Tm= 52 oC
d) Elektroforeza DNA v akrylamidovém gelu
•
Sestavíme si skla na vertikální elektroforezu a odzkoušíme si jejich těsnost nalitím vody
do prostoru mezi skly. Pokud skla těsní vodu vylijeme a prostor mezi nimi vysušíme
filtračním papírem.
•
Do 100 mL baňky si připravíme akrylamidový gel: 30 mL vody, 10 mL 5x TBE pufr, 10
mL 30% akrylamidu, 42 µl TEMEDu, jednu špachtli persíranu amonného. Intenzivně
zamícháme a okamžitě lejeme mezi skla zhruba 1/2 cm pod okraj. Zasuneme hřebínek
a necháme ztuhnout.
•
Po ukončení PCR pipetujeme ke každé PCR reakci 15 µl vzorkovacího pufru,
zvortexujeme a zahřejeme 10 min. při 75oC.
•
Ze ztuhlého gelu vytáhneme hřebínek, odstraníme ze skel ochranou gumu a skla
s gelem vložíme do elektroforetické komůrky do které předem nalijeme TBE pufr
(naředit!). Pufrem zalijeme i horní katodový prostor.
•
Po inkubaci vzorky naneseme pomocí Hamiltonovy pipety do jamek. Do jedné jamky
nezapomeneme přidat i 10 µl DNA markeru.
•
Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí
na konstantních 30 mA a necháme běžet elektroforézu až první modř dosáhne
anodového konce gelu. (cca 90 min).
•
Vypneme přívod proudu, odejmeme víko a vyjmeme skla z gelem. Opatrně odstraníme
horní sklo pomocí špachtle a gel jemným proudem vody odlepíme od spodního skla.
Poté i se spodním sklem vložíme do barvící lázně ethidium bromidu. Chráníme se
modrými nitrilovými rukavicemi, které na rozdíl od běžných latexových nepropouštějí
ethidium bromid. V barvící lázní ponecháme 5 min. a poté gel přeneseme do lázně
s čistou vodou. Gel opatrně přeneseme ze spodního skla na UV část transluminátoru a
pod dohledem vedoucího cvičení zhotovíme digitální fotografii.
e) Amplifikace genomové knihovny (vzhledem k časové náročnosti provede předem vedoucí
cvičení)
Příprava hostitelského kmene E.coli XL1-blue MRA (P2)
•
Na LB agarosovou plotnu sterilní kličkou rozetřeme E.coli XL1-blue MRA (P2) ze
zamražené zásobní mikrozkumavky.
•
Inkubujeme přes noc při 37ºC.
•
Další den inokulujeme 50 mL LB media s 0.2% maltosou a 10 mM MgSO4 jednou
kolonií E.coli XL1-blue MRA (P2) a necháme růst přes noc při 30ºC.
•
Narostlou kulturu zcentrifugujeme 10 min. při 2000 x g.
•
Opatrně odlijeme medium a buňky jemně rozsuspendujeme v 15 mL 10 mM MgSO4.
Nevortexujeme.
•
Buňky naředíme na OD600= 0,5 pomocí 10 mM MgSO4 a rozdělíme po 600 µL do
sterilních mikrozkumavek.
7
Příprava titru bakteriofága
•
Stanovíme titr bakteriofága (viz výše).
•
Naředíme zásobní roztok bakteriofága tak aby 10 µL obsahovalo 5 x 104 pfu (viz
vyhodnocení). Na ředění použijeme SM médium.
Rozpěstování knihovny
•
Připravíme si 20 sterilních Petriho misek o průměru 150 mm obsahujících NZY agar.
•
20 podílu naředěného bakteriofága po 10 µL (5 x 104 pfu) přidáme do mikrozkumavek
obsahující 600 µL hostitelských buněk.
•
Mikrozkumavky inkubujeme 15 min. při 37ºC.
•
Roztopíme NZY Top agar a zchladíme ho na zhruba 48ºC. Postupně pipetujeme do
sterilních zkumavek 6 mL roztopeného agaru a obsah mikrozkumavek s bakterifágem a
hostitelskými buňkami a po rychlém zvortexování ihned rovnoměrně rozléváme na NZY
agarové plotny.
•
Po ztuhnutí otočíme a inkubujeme 6-8 hodin při 37ºC dokud se nezačnou tvořit
viditelné plaky. Hlídáme, aby plaky nevyrostly více než do průměru 1 mm a nezačaly se
vzájemně překrývat.
•
Každou plotnu zalijeme 8 mL SM média a za mírného třepání na třepačce v lednici
necháme bakteriofágy difundovat přes noc do média.
•
Ráno médium odsajeme sterilní pipetou a desky spláchneme dalšími 2 mL média, které
přidáme ke zbytku.
•
K suspenzi bakteriofága přidáme chloroform do konečné koncentrace 5%, zvortexujeme
a inkubujeme 15 min. při pokojové teplotě.
•
Zbytky buněk a agaru odstraníme centrifugaci 10 min. při 500 x g
•
Supernatant přelijeme do čisté sterilní baňky, pokud není čirý provedeme předešlé dva
kroky znovu.
•
K supernatantu přidáme Rnasu A (0.1 mg/mL) a inkubujeme 1/2 hod. při 37ºC.
•
Poté přidáme k suspenzi bakteriofága vychlazený roztok 30% polyethylenglykolu tak
aby konečná koncentrace byla 5% a inkubujeme na ledu 1 hod.
•
Po hodině zcentrifugujeme fágové částice 10 min. při 10.000 x g.
•
Důkladně odstraníme supernatant, kyvetu necháme několik minut dnem vzhůru, a
pelet rozsuspendujeme přibližně v 1 mL SM média.
•
K takto připravené přepěstované knihovně přidáme chloroform do konečné koncentrace
0,3% a DMSO do konečné koncentrace 7% a zamrazíme na -80ºC.
3.DEN
.
1/ Stanovení titru genomové knihovny: Poté co nám narostou plaky na plotnách, vybereme
vhodnou plotnu a spočteme na ní celkový počet plaků. Lze si pomoci rozdělením prostoru
plotny na několik sektorů. Podle následujícího vzorce pak spočteme hodnotu pfu (plaque
forming unit):
8
pfu/mL = počet plaků na plotně x faktor ředění / objem knihovny rozetřený na plotnu v mL
2/ Určete při jak velké koncentraci virových částic (pfu) lze ještě detekovat v knihovně geny
pro ječmenný aktin a tRNA.
3/ Pomocí DNA markeru a softwaru AlphaDigiDoc 1206 určete velikost amplifikovaných
úseků genů a hodnotu ověřte v databázi GenBank na Internetu.
4/ Proč se pro rozpěstování knihovny použilo právě 20 Petriho misek?
Literatura
Sambrook, J. et al. (2001) „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ Third Ed., Vol. 1, pp.
2.69 – 2.81. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Ausubel, F.M. et al. (1990) „Current Protocols in Molecular Biology“. Greene Publishing
Associates, New York.
Alberts, B. et al. (1998) „Essential Cell Biology“, Garland Publishing, New York.
Rozsypal, S. a kol. (2002) „Úvod do molekulární biologie“, třetí vydání, díl čtvrtý, Grafex,
Blansko.
Izolace RNA z rostlin a následná RT-PCR vybraných genů
Teoretický úvod
Reverzně přepisovaná PCR je metoda používaná pro amplifikaci cDNA (ssDNA
komplementární ke specifické RNA). Pomocí RT-PCR se nejčastěji amplifikují a
následně klonují 5´ a 3´ konce mRNA (tzv. EST klony, expressed sequence tag) nebo
cDNA knihovny, využívané pro hledání nových genů. RT-PCR může být taky velmi
snadno adaptována pro identifikace mutací a polymorfismu v přepisovaných
genových sekvencích a nebo pro kvantifikaci exprese jednotlivých genů, když je
množství izolované mRNA malé a nedostačující pro techniku Northern blotu.
Prvním krokem RT-PCR je vždy enzymová konverze mRNA nebo celkové do
jednovláknové cDNA kdy je deoxyribonukleotidový primer hybridizován s RNA a
rětězec DNA následně prodloužen RNA-dependentní DNA polymerasou (EC 2.7.7.49,
reverzní transkriptasa). Druhým krokem pak je klasická PCR se dvěma genově
specifickými primery , pro kterou je jako templát využita RT reakcí vzniklá cDNA.
Deoxyribonukleotidové primery použity pro přepis cDNA mohou být trojího
typu:
• oligo(dT) primer, který se specificky váže na polyA konec, který je přítomen
v 98% procentech všech zralých eukaryotických mRNA a RT reakcí pak vzniká
cDNA obsahující informací celé mRNA.
• genově specifický primer, který hybridizuje pouze s jednou konkrétní mRNA
nebo příbuznou skupinou mRNA. Genově specifické primery, jak negativní tak
pozitivní, pro následující PCR pak samozřejmě musí ležet „upstream“ od
použitého primeru pro RT. Pokud to lze, doporučuje se také navrhnout každý
primer, jak negativní tak pozitivní, tak aby ležely každý na jiném exonu. Touto
strategií lze pak velice jednoduše při vyhodnocení PCR rozlišit mezi správnou
RT-PCR amplifikací a amplifikací, která vznikla na podkladě kontaminující
genomové DNA, která se často v izolovaným RNA vzorcích nachází.
• náhodné hexanukleotidové primery (random hexamers) jsou schopny se
vázat a zahajovat syntézu cDNA na mnoha místech podél celého RNA
templátu. Jedná se o směs krátkých šestinukleotidových fragmentů, ve
kterých jsou vygenerovány všechny možnosti kombinací čtyř nukleotidů
(A,G,C,T). Používá se především pokud je templát mRNA extrémně dlouhý (přes
3.000bp) nebo když má cílová mRNA komplikovanou sekundární strukturu.
Ve většině případů je cílem vytvořit čím jak nejdelší cDNA a proto se pro
navržení genově specifického primeru nejčastěji využívá nekódující sekvence
3´konce. Druhou nejlepší volbou je pak použití nespecifického oligo(dT) primeru.
Pokud oba pokusy selžou přichází na řadu random hexamer primery.
Nejrychlejším způsobem provedení RT-PCR je jednozkumavková reakce
s genově specifickým primerem pro RT, kdy po proběhnutí RT reakce se pouze přidá
druhý genově specifický primer a termostabilní polymerasa a nechá se proběhnout
PCR.
Nejčastějším problémem RT-PCR je izolace kvalitní RNA. Jednovláknová
molekula RNA je daleko méně stabilnější než DNA a proto je i její životnost velice
limitována. Navíc specifické RNA endonukleasy (RNasy) jsou velice aktivní enzymy,
které pracují v široké škále pH a teplot bez přítomnosti kofaktoru a jsou přítomny
téměř všude (např. na lidských dlaních). Během izolace a při následné RT reakci je
proto nutno vzorek RNA před vlivem těchto enzymů chránit dodržováním
specifických podmínek manipulace a používáním pouze speciálně ošetřeného skla a
plastiku, viz Laboratorní řád molekulárně-biologické laboratoře. Přesto často
dochází k degradaci a fragmentaci mRNA populace a to hlavně od 5´konce, který
není tak dobře chráněn a stabilizován polyA sekvencí jako 3´konec. A u některých
genů je proto velice těžké získat a amplifikovat genetickou informaci jejich počátku.
Pokud chceme pomocí RT-PCR kvantifikovat sílu exprese jednotlivých genů,
tzn. zjistit množství molekul mRNA přepisovaných pro specifické geny zastoupených
v populaci mRNA izolované z určitého ontogenetického stádia organismu či
specifické tkáně či pletiva, je nutné společně se specifickou amplifikaci
kvantifikovaného genu provést současně amplifikaci genu srovnávacího. Jako
srovnávací geny se nejčastěji používají tzv. „house-keeping“ geny. Jsou to geny
kódující proteiny které jsou v organismech esenciální a zastoupeny ve všech
stádiích života organismu ve všech tkáních či pletivech. Tyto geny jsou vždy
exprimovány pod konstitutivními promotery, tzn. že jejich exprese je za všech
podmínek stejná a nebývá ničím ovlivňována. Nejčastěji používaným srovnávacím
genem v rostlinné říši je gen kódující aktin.
Klíčovým enzymem RT-PCR je reverzní transkriptasa, enzym objeven roku
1970 jako hlavní katalytická jednotka RNA virů, které s jeho pomocí přepisují svou
genetickou informaci z RNA do DNA, která se pak začleňuje do genomu jejich
hostitele. V současné době se v molekulární biologii využívají reverzní transkriptasy
ze tři zdrojů:
•
AMV RT enzym izolovaný z viru ptačí myeloblastosy (avian myeloblastosis
virus), kromě RT aktivity, má ještě RNasa H aktivitu, která může rozštěpit delší
fragmenty RNA templátů, optimální teplota enzymu je 42°C.
•
MoMLV RT enzym z Molonyho viru myší leukemie (Moloney strain of murine
leukemia virus), jeho aktivita RNasy H je daleko slabší, jeho teplotní optimum
je při 37°C, proto není moc vhodný pro templáty se složitou sekundární
strukturou. Komerčně dostupné jsou i mutované verze obou enzymů, které
mají inhibovanou RNasovou aktivitu a vyšší teplotní stabilitu (do 50°C), jsou
proto vhodnější pro delší RNA templáty se složitou sekundární strukturou.
•
Termostabilní Tth DNA polymerasa vykazuje aktivitu reverzní transkriptasy
v přítomnosti Mn2+ iontů a je proto využívaná hlavně tak kde je třeba provádět
rutinní a rychlé RT-PCR, jelikož pro oba kroky stačí jediný enzym a obě reakce
běží současně. Její nevýhoda je krátká délka syntetizovaných cDNA (do 2kb) a
nemožnost využití oligo(dT) a random hexamer primerů, protože ty mají nízkou
teplotu hybridizace a při optimální teplotě enzymu a PCR netvoří stabilní RNADNA hybrid.
•
RNA extrakční pufr (8 M guanidin/HCl, 20 mM MES, pH 7,0, 20 mM EDTA, 50
mM 2-merkaptoethanol, neautoklávovat – chaotropický roztok)
•
směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 4,8)
•
1 M octová kyselina (autoklávováno)
•
absolutní ethanol
•
3 M octan sodný, pH 5,2 (autoklávováno)
•
RNase free voda
autoklavováno)
•
100 mM DTT (sterilizováno filtrem)
(deionizovaná
voda
s 0,1%
diethyl
pyrokarbonátem,
•
10 mM dNTP mix, 5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu,10x PCR pufr
•
50 µM oligo(dT) primer, 10 µM genově specifické primery
•
M-MuLV reverzní transkriptasa, Taq polymerasa
•
10x TAE pufr (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0)
•
10x nanášecí pufr (50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová
modř, 0,125 % xylenová violeť)
•
10% Ethidium bromid, DNA marker 50 bp a 1kb GeneRuler, 2% agarosa
v 1xTAE pufru
•
kapalný dusík
•
rostlinný materiál – huseníček (Arabidopsis), kukuřice, ječmen
•
nádoba na kapalný dusík, třecí miska s tloučkem, termocykler Biometra,
termoblok na 37°C UV spektrofotometr, laboratorní centrifuga a pikofuga,
křemenná kyveta, mikropipety, mikrozkumavky 1,5-0,5-0,2 ml, špičky
s filtrem, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj nápětí, AlphaDigiDoc,
systém pro digitální fotodokumentaci gelů
Obrázek 12. Princip RT-PCR reakce s využitím genově specifického primeru,
oligo(dT) primeru nebo random hexamer primerů.
Tabulka 2. Genově specifické primery pro amplifikací několika genů z huseníčku,
kukuřice a ječmene.
Úsek DNA
název
Sekvence
Tm
(°C)
Velikost
pásu (bp)
Genomová
kontaminace
Arabidopsis thaliana
cytokinin oxidasa/ AtCKX1fw
dehydrogenasa 1
AtCKX1rev
dehydrogenasa 2
AtCKX2rev
dehydrogenasa 3
AtCKX3rev
dehydrogenasa 4
AtCKX4rev
dehydrogenasa 5
AtCKX5rev
dehydrogenasa 6
AtCKX6rev
dehydrogenasa 7
AtCKX7rev
aktin
ARAactfw
ARAactrev
Zea mays
aktin
ACTfw
ACTrev
cytokinin oxidasa/ ZmCKX1fw
dehydrogenasa 1
ZmCKX1r
dehydrogenasa 2
ZmCKX2r
dehydrogenasa 3
ZmCKX3r
dehydrogenasa 4
ZmCKX4r
lakasa 1
lac1fw
lac1r
lakasa 2
lac2fw
lac2r
Hordeum vulgare
aktin
ACTfw
ACTrev
α-amylasový
ATI1
inhibitor
ATI2
cytokinin oxidasa/ CKX28
dehydrogenasa 1
CKX30
dehydrogenasa 2
CKX14
dehydrogenasa 4
CKX58
dehydrogenasa 5
CKX60
5´-GAAGTCGTAACCTGTTCTGAGAAGCG-3´
5´-AGAATCGCTAGAGGGTCGTAGGCTTG-3´
5´-CGGATGCTCTACAGTGATTTCACAAC-3´
5´-CGGTTTGTTGGATAGAGAAGAGCGAG-3´
5´-AAACGGACGGTGTAGATTTCTTAG-3´
5´-ATAGCGGCAGACATCCGATCATTCCA-3´
5´-TCTATGGAGTTTTAGGAGGTTTGG-3´
5´-CATAAACCCTGGAGCGAAACCTAGAG-3´
5´-GCACGAATCTCTCTCGAACCAGCTC-3´
5´-CGCTGACGAAGAAGACGACGACG-3´
5´-TGTGGATTCCCCTGCTCCATATGTTG-3´
5´-ACCCTGTCCAAGAATGCTTCATATG-3´
5´-TGGCTAGTAAGTCAGAAGAACGAG-3´
5´-GAGCTACCATTTTCTCTACCGAAG-3´
5´-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3´
5´-GGTGGTGCAACGACCTTAAT-3´
65
66
63
65
59
65
59
65
66
66
61
65
61
61
59
57
919
1196
508
631
486
656
385
1128
893
2018
647
966
600
2074
606
692
5´-ATCCTGCAGGGCACCGACAT-3´
5´-CCGCGCCAGGTAGGTCTTGT-3´
5´-ACGTGATGCTGCGTGAGCT-3´
5´-GTGTAGAACACCTCGTC-3´
5´-ACGAGGAGGTGTTCTACC-3´
5´-GGATTACGTTACGAGTCGG-3´
5´-GCACACCTCTGAGTTGAAACT-3´
5´-TGAATGTGCAATGCTGCC-3´
5´-CTACAACCTGGTGGACCC-3´
5´-GCTGCATACTCCCACCCAAT-3´
5´-ACCAAGCTGTACCCGCTCA-3´
5´-AACTGGATGACCGCCCA-3´
64
64
62
63
59
53
56
57
58
54
58
59
59
55
480
560
245
345
346
?
310
?
283
?
218
?
230
?
5´-ATCCGGGCAGATCGATGA-3´
5´-GCTTTTCGGACCAATCT-3´
5´-CCTCATCCCTGGCTCAACGTGCTCGTGC-3´
5´-CGGGGAGAGCAGCTTCTTGGGGTCGTAC-3´
5´-GCACCCTATCCAAGAACTCAATGTAAGTGA-3´
5´-GATTGTCATCAGAATGGAATCCCTTCGGAG-3´
5´-CCTGGAACCCATGATTGCCTCCAAAG-3´
5´-CTTCGGGGCGAGGTGGGAGACATTT-3´
5´-CCAAGCAGTACCTGCCCAACCACAAG-3´
5´-TGACTACATAGTTGCATGGACGCGACG-3´
64
64
55
50
72
72
65
67
69
71
71
70
495
575
200
200
412
493
750
1012
359
480
389
?
1.DEN
.
SE SMĚSÍ FENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL PRACUJ VŽDY
V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!!
a) Izolace mRNA
•
Pracujeme vždy v rukavicích pouze na vytyčeném místě, používáme pouze
speciálně ošetřené sklo a plastik a špičky na automatické pipety s filtrem!
•
Ve třecí misce zhomogenizujeme na prach 0,5-1,0 g rostlinného materiálu
(dodá vedoucí cvičení) pomocí kapalného dusíku.
•
Do sterilní mikrozkumavky přesně odvážíme 0,3 g zmrzlého rostlinného
prachu a přidáme 650 µl RNA extrakčního pufru, vortexujeme a necháme 5
minut na ledu.
•
Centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C) a supernatant odpipetujeme do nové
mikrozkumavky.
•
Přidáme 720 µl směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol, vortexujeme 15 sec
a centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C).
•
Do nové mikrozkumavky opatrně odpipetujeme horní vodnou fázi a přidáme
120 µl 1 M kyseliny octové a 550 µl absolutního ethanolu.
•
Inkubujeme 30 minut v mrazícím boxu na -75°C .
•
Centrifugujeme (14.000 g, 15 min., 4°C) a supernatant odlejeme
•
Pelet promyjeme dvakrát 0,5 ml 3M octanem sodným, vždy stočíme a
reprecipitujeme (14.000 g, 5 min., 4°C).
•
Nakonec promyjeme 70% vychlazeným ethanolem, stočíme (14.000 g, 5 min.,
4°C), supernatant odlijeme, zbytky supernatantu krátce stočíme na pikofuze
a opatrně odsajeme mikropipetou, pelet necháme 10 minut vyschnout ve
flowboxu.
•
Pelet rozpustíme v 15 µl RNase-free vody a zamrazíme na -75°C, pokud
budeme ihned pokračovat s RT reakcí necháme na ledu.
b) Spektrální stanovení RNA
•
Odebereme 5 µl z celkové vyizolované RNA a vhodně naředíme do kyvety
(100x), měříme absorbanci na 260 a 280 nm.
•
Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2.1
•
Přibližnou koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak
je v kyvetě 40 µg/ml RNA.
c) Reverzní transkripce
•
Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 µg celkové RNA (maximálně
v objemu 5 µl) a přidáme 0,5 µl 50 µM oligo(dT) primeru, doplníme celkový
objem vodou na 6,5 µl a špičkou pipety zamícháme, necháme inkubovat 5
minut v inkubátoru na 70°C.
•
Ochladíme na ledu a ke vzorku připipetujeme 2 µl 5x koncentrovaného pufru
pro M-MVL reverzní transkriptasu, 1,0 µl dNTP mixu.
•
Mikrozkumavku krátce zvortexujeme a
inkubujeme 5 minut v inkubátoru na 37°C.
•
Ke vzorku připipetujeme 0,5 µl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek),
krátce zvortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.
•
Inkubujeme 60-90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce
do cDNA.
•
Vzniklou cDNA zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na led a pokračujeme
v RT-PCR.
krátce
stočíme
v pikofuze,
d) RT-PCR
•
Jako templáty pro PCR použijeme 1 µl RT reakce, kterou jsme předem
dvakrát naředili ultra-čistou PCR vodu.
•
Pro každou dvojicí primerů dle tabulky si nastavíme 2 PCR reakce, vzorek a
kontrolu, kde místo RT reakce použijeme jako templát izolovanou,
nepřepsanou RNA (vhodně naředěnou tak aby množství v 1 µl odpovídalo
množství RNA, které bylo původně v 1 µl RT reakce).
•
Do 0,2 ml PCR zkumavek uložených v chladicím stojánku pečlivě pipetujeme
(v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí:
16,75
2,50
1,25
0,50
1,00
1,00
1,00
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
PCR vody
10x PCR pufru
DMSO
dNTP mix (každý 10 mM)
pozitivního primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky
negativního primeru
cDNA templátu
•
Reakci zahájíme přídavkem 1,00 µl Taq DNA polymerasy, zkumavku krátce
zvortexujeme, dopravíme její obsah na dno mikrocentrifugací a okamžitě
vložíme do vyhřátého termocykleru.
•
Pipetování si můžeme usnadnit přípravou tzv. premixu, kdy do 1,5 ml
mikrozkumavky na ledu pipetujeme všechny komponenty PCR včetně Taq
polymerasy v násobku počtu vzorků které budeme mít (plus jeden či dva
navíc, kompenzace chyby pipetování), premix pak rozpipetujeme v chladícím
stojánku po 22 µl a připipetujeme pouze konkrétní dvojici primeru (2 µl) a
vhodný templát (1 µl).
•
Na termocykleru Biometra předem nastavíme PCR program:
1.
2.
3.
4.
4.
5.
6.
Navázání primerů (annealing) x oC, 30 sec
Růst řetězce (elongace) 72 oC, 2 min
Chlazení 4oC
•
Pro odlišné teploty annelingu jednotlivých vzorků využijeme možnosti
nastavení teplotního gradientu (poradí vedoucí cvičení).
•
Teplotu annelingu zvolíme podle Tm použitých primerů.
•
Provedeme tzv. „hot start“, který zabraňuje nespecifické navázání primeru na
matrici během počátečního vyhřívání termocykleru. PCR zkumavky
uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocykler vyhřán na
počáteční 3 min denaturaci při 94oC, poté otevřeme víko a opatrně vložíme
PCR zkumavky.
•
PCR Program necháme proběhnout a zatím si připravíme elektroforézu v 2%
agarosovém gelu. Jako marker použijeme v jedné jamce 50 bp GeneRuler a
v další 1kb GeneRuler.
d) Agarosová elektroforeza DNA
•
Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky rozpustíme 2% agarosu (v
1x TAE) v mikrovlnné troubě a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do
horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru
ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku.
Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN) a
promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme
do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel
necháme ztuhnout asi 30 min.
•
Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi
200 ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala z agarosovým
gelem.
•
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: K PCR produktu (25 µl) pipetujeme
5 µl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10
min.
•
naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi
nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém
pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených
vzorků. Do jedné z jamek neopomeneme nanést DNA marker (λ DNA
naštípaná restrikčním enzymem PstI).
•
POZOR: Vzorky kontroly a vzorku nanášíme vždy do sousedních jamek!!!
•
zdroji napětí 120 V po dobu 20-30 minut. Průběh elektroforezy je možné
•
1) Na základě pohyblivosti vzorku DNA a DNA standardů určete velikosti
jednotlivých amplifikovaných fragmentů.
2) Expresi kterých genů se vám v daném rostlinném pletivu podařilo prokázat a
které naopak exprimovány nebyly.
3) Proč se jako templát v kontrolní PCR použila nepřepsaná RNA? Výsledky této
kontroly vyhodnoťte.
4) U všech genů, které se vám podařilo detekovat ve vzorku z kukuřice určete
relativní míru exprese vzhledem ke srovnávacímu aktinovému genu. Využijte
k tomu analysis tool programu AlphaDigiDoc (poradí vedoucí cvičení).
Literatura
Sambrook, J. et al. (2001) „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ Third Ed., Vol.
2, pp. 8.46 – 8.65. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York.
Logemann, J. et al. (1987) „Improved Method for Isolation of RNA from Plant
Tissues“. Anal Biochem 163, 16-20.
PŘÍLOHY
λ DNA MARKERY
λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem StyI
1% agarosa v TAE
11 fragmentů: 19.329, 7.743, 6.223, 4.254, 3.472, 2.690, 1.882, 1.489, 925, 421,
74 bp
λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčními enzymy HindIII a EcoRI
1% agarosa v TAE
13 fragmentů: 21.226, 5.148, 4.973, 4.268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375,
947, 831, 564, 125 bp
λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem PstI
1.5% agarosa v TAE
29 fragmentů: 11.501, 5.077, 4.749, 4.507, 2.838, 2.556, 2.459, 2.443, 2.140,
1.986, 1.700, 1.159, 1.093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164,
150, 94, 87, 72, 15 bp
λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem PstI
100bp žebřík
λ DNA PstI
3% agarosa v TAE
Příprava markeru: Do mikrozkumavky pipetujeme 50 µL λDNA (25 µg), 34 µL
vody, 10 µL vhodného restrikčního pufru, 1 µL 0,01% BSA a 5 µL restrikčního
enzymu. Necháme štípat přes noc, poté inaktivujeme reakci 10 min při 65°C a
přidáme 100 µL TE pufru a 30 µL 10x nanášecího pufru.
GeneRuler™ 50bp DNA Ladder
GeneRuler™ 1kb DNA Ladder
POUŽIVANÉ KMENY E.COLI A SACCHAROMYCES CEREVICAE
Escherichia coli TOP10F´
Genotyp: F' (tetR), mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80 ∆lac ∆M15, lacIq, deoR, recA1,
araD139, ∆(ara, leu) 7697, galU, galK, rpSL (strR) endA1
Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2 lysogen)
Genotyp: ∆(mcrA)183 ∆ (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi- gyrA96 relA1
Saccharomyces cerevisiae 23344c uraGenotyp: MATa ura3-52/ MATα ura3-52
VYSVĚTLIVKY:
F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv. pilus na vnější membráně E.coli
tetR gen pro tetracyklinový represor, kmen roste na tetracyklinu
mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové
DNA
lacZ∆M15 element potřebný pro komplementaci β-galaktosidasy pro blue/white screening na miskách
s X-gal, je vložený na profágové částici Φ80
∆lacX74 kóduje lac represor, který brání expresi z lac operonu, dereprese probíhá pomocí IPTG
deoR umožňuje příjem velkých plasmidu (přes 10kb)
recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA
endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA
rpSL (strR) gen pro rezistenci ke streptomycinu
lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru. zrušení přídavkem
IPTG
galK, galU mutace v genu pro galaktokinasu, blokuje metabolismus galaktosy
araD139, ∆(ara, leu) 7697 mutace v ara operonu, blokuje metabolismus arabinosy
supE44 supresor amber (UAG) mutace
thi- mutace v genu metabolizující thiamin, kmen na minimálním médiu neroste bez thiaminu
gyrA96 mutace v genu DNA gyrasy, způsobuje rezistenci k antibiotiku - kyselině naxilové
relA mutace umožňující syntézu RNA bez navazující proteosyntézy
MATα/MATa diploidní kmen schopný pohlavního rozmnožování
ura3-52 mutace v genu podílející se na biosyntéze uracilu, kvasinka neroste na minimálním médiu
bez uracilu
P2 lysogen slouží pro lysogenní selekci, kmen může být napaden pouze bakteriofágem s genotypem
red/gam-, tzn. bakteriofágen nesoucí fragment genomové knihovny, nikoli wild-typovým

návody do cvičení

Transkript

Podobné dokumenty

Materiály k výuce - oddělení molekulární biologie crh

Jiné přístroje

ekotech kurz základních metod molekulární biologie

Skripta EMORR

2013 - Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Infekce močových cest - přehledné sdělení Medicína a

2010 - Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Skripta návodů do cvičení z laboratorní techniky

32P postlabeling_DNA adukty MEDETOX CZ