Řízená degradace proteinů

Signalizace je vlastně
komunikace
a komunikace je základem života….
Signalizace, regulace, komunikace
a integrace v buňce, pletivu a
organizmu
Několik poznámek.
Kvantitativně převažujícím prvkem regulace genové
exprese je represe (a její odblokování).
Většina bílkovin je polyfunkčních a jejich exprese a
funkce je regulována na mnoha úrovních najednou.
Signální dráhy se integrují na úrovni společného
regulačního bílkovinného intermediátu (příklad fosf.),
druhého posla, promotoru, procesu či struktury.
Signál je zesilován, či zeslabován - při tom šum okolí
může být pozitivně využit k zesílení signálu =
stochastická resonance.
http://www.lancs.ac.uk/depts/physics/research/condmatt/lng/srshow/srslide1.html
• Z toho, že organismus vládne buňkám
(nejen buňky organizmu), také plyne, že
také buňka a organizmus vládne signálním
drahám a sítím. Buňka není jen výsledkem
propletence procesů/struktur, které v ní
probíhají/strukturují, ale také jejich
tvůrcem.
Degradace bílkovin
je stejně důležitý regulační krok
jako jejich syntéza.
Signální dráhy často obsahují
vysoce specifickou/regulovanou
degradaci bílkoviny jako důležitý
regulační krok.
(Vzpomeňme na cykliny…)
Proteolýza je ovšem také
konstitutivní proces.
Až 30% translatovaných
bílkovin je nefunkčních.
Degradace buněčných bílkovin
Proteolytické dráhy u eukaryot
- 1. vakuolární/lysozomální
- 2. Na ubiquitinu-proteasomu závislá degradace
- 3. post-proteasomálni degradace : Tricorn, TPII?
- 4. Degradace membranových proteinů
17-1
17-2
Hlavní proteolytické dráhy eukaryot
Mitochondrial
/plastid
proteolytic
systems
endosomelysosome
system
Mitochondria
Lysosome/
endosome
coo
pera
tion
Autophagosome
cytoplasmic
proteins
Ubiquitinproteasome
system
ER proteins
nuclear
proteins
Nucleus
™ endosome-lysosome
pathway degrades
extracellular and cellsurface proteins
™ ubiquitin-proteasome
pathway degrades
proteins from the
cytoplasm, nucleus and
ER
™ mitochondria (and
chloroplasts) have
their own proteolytic
system that are of
bacterial origin
17-3
Dějiny studia proteolýzy
Schoenheimer
uses 15N to
show
continuous
protein
turnover
Folin states
“endogenous
proteins are
stable”
1905
1912
Lewis
discovers
‘bodies’ in
patients with
Parkinson’s
disease
1942
1978
Hershko and
Ciechanover
discover the
process of
ubiquitylation
ubiquitin structure
1987
proteasome structure 1995
Hershko et al.
identify
enzymes of
the ubiquitinprotein ligase
system
1983
1984
26S
proteasome
partly
purified by
Rechsteiner
1986
Varshavsky,
Ciechanover
and Finley
discover
ubiquitylation
is essential
for viability
and cell-cycle
progression
1988
Kischner et
al. discover
that cyclin is
degraded by
the ubiquitin
pathway
1991
Lowe, Landon
and Mayer
discover that
Lewy bodies
are full of
ubiquitylated
proteins
podle John Mayer, Nature reviews 1, 145-148.
1997
Several
groups
discover the
combinatorial
control and
specificity of
SCF ubiquitin
protein
ligases
Vakuolární/lysozomální degradace (viz. min.
předn.)
17-5
™ macroautophagy is the equivalent of forming intracellular endosomes
(phagosomes) that fuse to the lysosome and result in the breakdown of its contents
™ Hsc73 (constitutively-expressed Hsp70 chaperone) is involved in one pathway of
lysosome-mediated degradation
vakuola
Cuervo and Dice (1998) J. Mol. Med. 76, 6-12.
Degradace membránových proteinů.
17-16
™ AAA proteases mediate the degradation of membrane proteins in bacteria,
mitochondria and chloroplasts (i.e., compartments of eubacterial origin)
™ combine proteolytic and chaperone activities in one system, acting as qualitycontrol machineries
- model substrate polypeptides
containing hydrophilic domains at
either side of the membrane can be
completely degraded by either of
two AAA proteases found in
mitochondria, if solvent-exposed
domains are in an unfolded state
- a short protein tail protruding from
the membrane surface is sufficient to
allow the proteolytic attack of an
AAA protease that facilitates domain
unfolding at the opposite side
Leonhard et al. (2000) Mol. Cell 5, 629-638.
p=precursor; m=mature; 25ºC=no unfolding;
37ºC=unfolding of domain(s)
Bílkoviny určené k degradaci
proteasomem jsou modifikovány
ubiquitinem.
Prvním známým proteinem ubq. in
vivo v aktivní formě byl u rostlin
fytochrom.
Řada bílkovin je před ubiquitinací specificky fosforylována.
17-6
Ubiquitinová dráha
™ E1 - ubiquitin activating enzyme
™ E2 - ubiquitin conjugating enzyme
™ E3 - ubiquitin ligase
™ ‘~’ denotes high-energy thioester bond
™ DUB, deubiquinating enzyme
Syntet. z fusních tandemových prekursorů – 3 až 6.
Jsou štepeny deubiqutinačními enzymy/proteasami = DUB
76 AA – rostl. od kvasinek/živočichů se liší 2/3 AA.
Ubq. se kovalentně váže na Lys cílové bílkoviny C´-Gly.
Ubiquitinová dráha
O
ub
O
E1-SH
OH ATP
ub
AMP
E1-SH
O
ub
O
N-H
ub
prot
prot
S-E1
E2
E3
O
ub
S-E2
17-7
™ E1 - ubiquitin activating enzyme
ƒ uses ATP to activate the carboxyl group
of ubiquitin’s C-terminal residue (Gly76).
The outcome of this reaction is the
formation of a thioester between Gly76 of
ubiquitin, and a cysteine residue of E1
™ E2 - ubiquitin conjugating enzyme
ƒ accepts the ubiquitin from the E1 through
a thioester linkage with a cysteine
™E3 - ubiquitin ligase
ƒ transfers the ubiquitin molecule to the
epsilon NH2 group of lysine on the
substrate
™ ubiquitin molecules are then in succession to
the Lysine 48 residue to form a multiubiquitin
chain
™ the DUB enzyme ‘recycles’ ubiquitin
™ the 26S proteasome degrades the substrate
to peptides
E1 – ubq. Aktivace
E2 – ubq. Konjugace
E3 – ubq. Ligace ubq. na
Lys cílové bílkoviny. E3
zajišťuje specifitu
rozpoznání.
Na bílkovině je
ubq. více Lys a
to opakovaně =
polyubiquitin.
E3 ubiquitin ligázy
17-8
™ 4 základní typy E3 ubiquitin ligáz u rostlin: kol.1300 genů Arabidopsis kóduje
podjednotky E3 ligáz.
ƒ s HECT domains (E6AP-related proteins) - monomerní 17x u A.t.
ƒ s Ring/U-Boxem (VHL, SCF, APC, MDM2, c-CBL, etc.) 480x RING a 64x UBox u A.t
SCF komplex 4 podjednotky - podjednotka řídící
specifitu F-box 700x u A.t.
ƒ
ƒ APC
ale také 37x AtE2 = potenciálě obrovské množství spec. ubq. komplexů.
vedle 700 F-boxů má Arabidopsis 21 SKP bílkovin.
Opět velká kombinatorika komplexů – existují ovšem preferované
kombinace.
SCFdependentní
ubiquitinace
u kvasinek
17-11
™ F-box proteins
mediate substrate
selectivity in degrading
various yeast proteins
™ many (all?) of the
substrates need to be
phosphorylated to be
recognized by the F-box
protein
™ WD40 and leucinerich repeats (LRRs)
present in F-box
proteins mediate
protein-protein
interactions
u rostlin je to podobné
Monoubiquitinace může sloužit
jako regulační modifikace. Např.
pro třídění do endocytotické dráhy
a vakuoly/lysozomu či modifikuje
např. transkripci TF-ubq.
Anaphase promoting complex (APC)
17-12
™ The anaphase-promoting complex (also termed ‘cyclosome’) is a ubiquitin-protein ligase
that controls important transitions in mitosis by ubiquitinating regulatory proteins
™consists of many different proteins, including some related to SCF (e.g., ring protein)
™ To initiate sister chromatid separation, the APC has to ubiquitinate the anaphase
inhibitor securin, whereas exit from mitosis requires the ubiquitination of B-type
cyclins
em reconstruction
unprocessed em images
Gieffers et al. (2001)
Mol. Cell 7, 907-913.
Tricorn degradační dráha prokaryot
17-14
™ tricorn protease in prokaryotes may be part of a degradation pathway that
involves proteasome (in archaea) or other ATP-dependent proteases in
archaea/bacteria
™ proteasomes/other oligomeric proteases digest proteins to small peptides
™ tricorn protease then cleaves these to 2-4 mers, which are then degraded down
to the level of free amino acids by aminopeptidases
a modular
system for
protein
degradation
™ probably one of many pathways of protein degradation in prokaryotes
Yao and Cohen (1999) Curr. Biol. 9, 551-553.
Tricorn degradační dráha u eukaryot?
™ tripeptidyl peptidase II (TPPII) is a cytosolic subtilisin-like
peptidase that may be functionally related to Tricorn protease
™but not sure if TPPII is
protease that replaces
proteasome
Multicorn? - popsán u Schizosaccharomyces pombe po inhibici proteasomu
Legend to gels:
Galactosidase (116 kD)
(lane 1), purified TPPII
(lane 2), fast- and slowrunning electrophoretic
isoforms of 26S
proteasomes (lanes 3 and
4, respectively), and
purified 20S proteasomes
(lane 5)
em pictures of TPPII; dumbbell- or ovoid-shaped
Geier et al. (1999) Science 283, 978-981.
17-15
ClpAP je proteázový komplex
aktivní v plastidech (homol.
E.coli).
Brání hromadění nefunkčních bílkovin v plastidech. Podobně je tomu
v mitochondriích.
Proteasom
Topologie proteasomu zajišťuje,
že proteázovou aktivitou nebudou
nespecificky zasaženy
cytoplasmatické bílkoviny.
U Arabidopsis každá podjednotka
= dva geny - to zn. různé subtypy
proteasomu.
1.5 MDa
CSN (COP9 / signalosom)
komplex byl poprvé
objeven u Arabidopsis (viz. dále =
světlo jako signál).
Jeho podjednotky a celková
organizace jsou homologní "víku"
RP proteasomu.
CSN kontroluje aktivitu E3 SCF
ligázy prostřednictvím neddylace
či deneddylace (NEDD8 či
RUB1 jsou peptidy podobné
ubiquitinu)
a pravděpodobně interaguje s
proteasomem.
N-koncové pravidlo
Met, Thr, Ser, Gly a Val na N´stabilizují
bílkovinu, zatímco Lys, Arg, His a další ji
destabilizují.
N-koncová acetylace stabilizuje bílkovinu.
U některých prot. je N´Met odštěpen aminopeptidázou a novou
počáteční AA bývá Glu nebo Asp;takové bílkoviny se stávají
substrátem ubiquitinace teprve po přidání N´- Arg.
• Bílkoviny se mnohonásobně liší
poločasem životnosti a ten se prudce
mění s měnícím se
diferenciačním/regulačním stavem
buňky.
• Klíčové proteiny signálních drah (včetně
transkripčních faktorů) bývají velmi
labilní.
Příklady proteolytických bílk. a
ovlivněných procesů u rostlin.
Inhibitory proteasomu
The peptide aldehydes, MG 132, MG 115,
and PSI, inhibit the complex's chymotrypsinlike activity in a potent but reversible
manner. Lactacystin is a natural,
irreversible, nonpeptide, cell permeable
inhibitor that is more selective than peptide
aldehydes but less selective than peptide
boronates, another class of proteasome
inhibitors.