Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití

Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Elucigene® CF-EU2v1
Návod k použití
Kat. kód:
CF2EUB2 – 50 testů
CF2EUBX – 10 testů
Pro diagnostické použití in vitro
Vyrobeno společností Elucigene Diagnostics.
Greenheys House
Pencroft Way
Manchester Science Park
Manchester
M15 6JJ
Prodej, zákaznický servis a technická podpora:
T: +44 (0) 161 669 8122
F: +44 (0) 161 669 8129
E: [email protected]
E: [email protected]
Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered
in England and Wales, registration number 8696299.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 1 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Elucigene CF-EU2v1
Určené použití
Pro simultánní in vitro kvalitativní detekci následujících mutací lidského genu pro
cystickou fibrózu transmembránového regulátoru vodivosti (CFTR) v DNA extrahované z
plné krve (s přídavkem EDTA) a ze vzorků suchých krevních skvrn:
Tradiční
Podle směrnic HGVS Tradiční *
cDNA name
Protein name
CFTRdele2,3
name
c.54-5940_273+1025delProtein
(c.54-5940_273+10250del21080)
E60X
c.178G>T
p.Glu60X
P67L
c.200C>T
p.Pro67Leu
G85E
c.254G>A
p.Gly85Glu
394delTT
c.262_263del (c.262_263delTT)
p.Leu88IlefsX22
444delA
c.313del (c.313delA)
p.Ile105SerfsX2
R117C
c.349C>T
p.Arg117Cys
R117H
c.350G>A
p.Arg117His
Y122X
c.366T>A
p.Tyr122X
621+1G>T
c.489+1G>T
711+1G>T
c.579+1G>T
L206W
c.617T>G
p.Leu206Trp
1078delT
c.948del(c.948delT)
p.Phe316LeufsX12
R334W
c.1000C>T
p.Arg334Trp
R347P
c.1040G>C
p.Arg347Pro
R347H
c.1040G>A
p.Arg347His
A455E
c.1364C>A
p.Ala455Glu
I507del
c.1519_1521del (c.1519_1521delATC)
p.Ile507del
F508del
c.1521_1523del (c.1521_1523delCTT)
p.Phe508del
1677delTA
c.1545_1546del (c.1545_1546delTA)
p.Tyr515X
V520F
c.1558G>T
p.Val 520Phe
1717-1G>A
c.1585-1G>A
G542X
c.1624G>T
p.Gly542X
S549R(T>G)
c.1647T>G
p.Ser549Arg
S549N
c.1646G>A
p.Ser549Asn
G551D
c.1652G>A
p.Gly551Asp
R553X
c.1657C>T
p.Arg553X
R560T
c.1679G>C
p.Arg560Thr
1811+1.6kbA>G
c.1680-886A>G
1898+1G>A
c.1766+1G>A
2143delT
c.2012del (c.2012delT)
p.Leu671X
2184delA
c.2052del (c.2052delA)
p.Lys684AsnfsX38
2347delG
c.2215del (c.2215delG)
p.Val739TyrfsX16
W846X
c.2538G>A
p.Trp846X
2789+5G>A
c.2657+5G>A
Q890X
c.2668C>T
3120+1G>A
c.2988+1G>A
CF2EUBYCS 002
p.Gln890X
Sep-2014
Strana 2 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Tradiční
Podle směrnic HGVS Tradiční *
cDNA name
Protein name
Protein name
3272-26A>G
c. 3140-26A>G
R1066C
c.3196C>T
p.Arg1066Cys
Y1092X(C>A)
c.3276C>A
p.Tyr1092X
M1101K
c.3302T>A
p.Met1101Lys
D1152H
c.3454G>C
p.Asp1152His
R1158X
c.3472C>T
p.Arg1158X
R1162X
c.3484C>T
p.Arg1162X
3659delC
c.3528del (c.3528delC)
p.Lys1177SerfsX15
3849+10kbC>T
c.3718-2477C>T
S1251N
c.3752G>A
p.Ser1251Asn
3905insT
c.3773dup (c.3773dupT)
p.Leu1258PhefsX7
W1282X
c.3846G>A
p.Trp1282X
N1303K
c.3909C>G
p.Asn1303Lys
* with reference to – Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the
Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz
M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011)
CF-EU2v1 může rozlišit heterozygotní a homozygotní jedince u všech výše uvedených
mutací a variant s výjimkou S549R(T>G) – viz část tohoto dokumentu popisující křížovou
reaktivitu.
Souhrn a vysvětlení
Cystická fibróza (CF) je nejběžnějším délku života omezujícím autozomálně recesivním
onemocněním v bělošské populaci. Výskyt onemocnění je 1:3200 živě narozených dětí
v bělošské populaci (1). V bělošské populaci je četnost heterozygotů cca 1:25.
Cystická fibróza ovlivňuje epitel mnoha orgánů, což vede ke komplexnímu
multisystémovému onemocnění, které napadá exokrinní část slinivky břišní, střeva,
dýchací ústrojí, mužské pohlavní ústrojí, hepatobiliární systém a exokrinní potní žlázy.
Projevy onemocnění se liší podle závažnosti mutací CFTR (2), genetických modifikátorů
(3) a faktorů životního prostředí (4). Rozsah sahá od úmrtí v raném dětství v důsledku
progresivního obstrukčního onemocnění plic s bronchiektázií, přes nedostatečnost
pankreatu s postupně progresivním obstrukčním onemocněním plic v průběhu dospívání a
zvýšenou četnost hospitalizací z důvodu pulmonálních onemocnění v rané dospělosti, po
rekurentní sinusitidu a bronchitidu nebo mužskou neplodnost v rané dospělosti.
Nejběžněji se diagnóza cystické fibrózy stanovuje u jedinců s jedním nebo více
charakteristickými fenotypy CF s výskytem abnormality funkce CFTR na základě jedné z
následujících možností: přítomnost dvou nemoc způsobujících mutací genu CFTR nebo
dvě abnormální hodnoty kvantitativního stanovení chloridů po stimulaci pocení
pilokarpinovou iontoforézou (>60 mEq/l) nebo rozdíl transepiteliálních potenciálů nosní
sliznice (NPD), charakteristický pro CF. Četnost detekce mutací CFTR se liší podle
metody testování a etnického původu. U některých symptomatických jedinců je
detekovatelná pouze jedna nebo žádná nemoc způsobující mutace; u některých
přenašečů není nemoc způsobující mutace detekovatelná.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 3 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Poruchy související s CFTR jsou dědičné autosomálním recesivním způsobem.
Sourozenci probanda s cystickou fibrózou mají 25% pravděpodobnost postižení, 50%
pravděpodobnost toho, že budou asymptomatickými přenašeči, a 25% pravděpodobnost,
že nebudou postižení a nebudou přenašeči. Molekulárně genetické testování nemoc
způsobující mutace (nebo mutací) CFTR genu se používá k detekci přenašečů ve
screeningových programech populace. Jsou k dispozici prenatální testy pro těhotné pro
případy zvýšeného rizika poruch souvisejících s CFTR, je-li známo, že jsou v rodině
nemoc způsobující mutace.
Od objevení genu CFTR v roce 1989 (5) bylo popsáno více než 1700 mutací a variant
genu (6). Mnohé z těchto mutací jsou „privátní“, tj. byly popsány pouze u jednoho
pacienta nebo u jedné rodiny. Rutinní testování všech potenciálních mutací není
realizovatelné ani finančně únosné, a proto se omezujeme na testování nejběžnějších
mutací. CF-EU2v1 je souprava pro testování cystické fibrózy, určená specificky k
identifikaci mutací, které se nejběžněji vyskytují u populace evropského původu. Test
identifikuje celkem 50 mutací a analyzuje také varianty polytymidinového traktu intronu 9
s přesným měřením přilehlého TG repeatu.
Polymorfní tymidinový trakt na junkci intronu 9 a exonu 10 ovlivňuje transkripci. Počet
tymidinových reziduí (5T, 7T nebo 9T) ovlivňuje účinnost splicingu („sestřihu“) exonu 10;
je-li přítomna 5T alela, bude chybět část transkriptu exonu 10 a způsobí tak nefunkční
protein a různé příznaky CF. Je hlášeno, že počet TG repeatů na 5’ konci
polytimidinového traktu může také ovlivnit splicing exonu 10 (7). Při přítomnosti na stejné
alele jako variant 5T existuje přímá úměra mezi délkou počtu TG repeatů a výškou podílu
transkritpů CFTR bez exonu 10. Počet TG repeatů lze určit pomocí CF-EU2v1 změřením
velikosti píků amplikonu 5T.
Principy metody
Princip funkce soupravy Elucigene CF-EU2v1 je založen na použití fluorescenční alelově
specifické amplifikační technologie ARMS (Amplification Refractory Mutation System,
amplifikační refrakční mutační systém), která detekuje genové mutace, inserce nebo
delece v deoxyribonukleové kyselině DNA (8). Princip ARMS je, že oligonukleotidy s
chybně spárovaným reziduem na 3’ konci nebudou za specifikovaných podmínek
fungovat jako primery v polymerázové řetězové reakci (Polymerase Chain Reaction,
PCR). Výběr vhodných oligonukleotidů umožňuje amplifikaci a detekci specifických
zmutovaných nebo normálních sekvencí DNA. Amplifikované sekvence (amplikony) jsou
separovány pomocí kapilární elektroforézy v genetickém analyzátoru společnosti Applied
Biosystems. Analytický software umožňuje identifikovat a označit amplikony podle
velikosti a barvy.
Test Elucigene CF-EU2v1 je vysoce multiplexní analýza sestávající ze dvou PCR reakcí
(A a B). Ve směsi A je detekováno padesát mutantních sekvencí genu CFTR a
zobrazováno jako modré amplikonové píky. Ve směsi B jsou detekovány odpovídající
normální nemutantní sekvence (divokého typu) a zobrazovány jako zelené amplikonové
píky. Směs A také detekuje normální sekvenci pro nejčastěji pozorovanou mutaci
způsobující cystickou fibrózu u bělošské populace (nazývá se F508del), která se
zobrazuje jako zelený amplikonový pík. Kromě toho jsou ve směsi A detekovány
opakované sekvence polyT a zobrazovány jako černé amplikonové píky. Ve směsi A i B
jsou zahrnuty vnitřní kontrolní markery amplifikace (nikoliv cystické fibrózy) za účelem
monitorování účinnosti amplifikace vzorku, které se zobrazují jako červené
amplikonové píky.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 4 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Varování a bezpečnostní opatření
1. Kontrolní vzorek DNA dodaný s touto soupravou je humánního původu a byl
nezávisle testován pomocí rozboru na bázi PCR a shledán negativním na virus
hepatitidy typu B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) na virus lidské
imunodeficience 1 (HIV1).
2. Při manipulaci s materiály humánního původu je nutno postupovat opatrně. Všechny
vzorky se musí považovat za potenciálně infekční. Žádná testovací metoda nemůže
zaručit úplnou jistotu, že produkt neobsahuje HBV, HCV nebo HIV 1 nebo jiná
infekční agens. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání,
skladování a likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými
příslušnými státními normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými
materiály.
3. Podle současné správné laboratorní praxe musí laboratoře při každém testu
zpracovat své vlastní vzorky pro kontrolu kvality se známým genotypem, aby bylo
možné vyhodnotit validitu postupu.
4. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a
likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními
normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály.
5. Pokud je krabice soupravy poškozená, mohlo dojít k poškození obsahu. Soupravu
nepoužívejte a kontaktujte zákaznický servis.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 5 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Symboly použité na štítcích
Symboly použité na všech štítcích a na obalech odpovídají harmonizované normě
ISO15223
Výrobce
Počet testů
Čtěte návod k použití
X°
C
Skladujte při teplotě nižší, než je zde uvedeno
Datum exspirace
Katalogové číslo
Číslo šarže nebo dávky
Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 6 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Dodávané materiály
Reagencie se musí skladovat v oblasti, kde nehrozí riziko kontaminace produktů DNA
nebo PCR.
Všechny reagencie jsou dodávány připravené k použití Neotevřené a otevřené reagencie
skladujte při teplotě -20 °C. Otevřené reagencie lze skladovat až 3 měsíce.
Součástí dodávky jsou materiály dostačující na 50 (10) testů:
2 x 120µl (50µl) lahvičky se směsí primerů CF-EU2v1 A, obsahující primery pro
amplifikaci následujících mutantních alel: R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A,
711+1G>T, R334W, I507del, F508del, 3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT,
V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N,
M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G,
1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C,
1898+1G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X,
3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X a R1158X. Tato směs obsahuje
také primery divokého typu pro detekci normální alely F508del, primery pro detekci
polythymidinových
variant,
IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T a primery pro identifikaci 2 hypervariabilních markerů
typu STR (short tandem repeat) – 404473 (450043).
2 x 120µl (50µl) lahvičky směsi primerů CF-EU2v1 B obsahující primery divokého
typu pro amplifikaci normálních alel mutantů amplifikovaných směsí primerů A, s
výjimkou normální alely F508del, která je amplifikována primery zahrnutými ve směsi
primerů A. Tato směs také obsahuje primery pro identifikaci 2 hypervariabilních
markerů STR – 404474 (450044).
2 x 400µl (75l) lahvičky hlavní směsi pro PCR s obsahem HotStart Taq DNA
polymerázy a deoxynukleotid trifosfátů v pufru – 404480 (450045).
1 x 50µl lahvička s kontrolním vzorkem DNA o 6 ng/µl, normální pro mutace
detekované soupravou Elucigene CF-EU2v1 – 404489
Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky
Laboratorní spotřební materiál – rukavice, mikrocentrifugové zkumavky se šroubovacím
uzávěrem, 0,2ml PCR lahvičky nebo mikrotitrační destičky doporučené výrobcem
použitého termálního cyklovače, pipetové špičky.
Příprava DNA – souprava QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, kat. č. 51304/51306)
nebo ekvivalent.
Kapilární elektroforéza – standard velikosti GeneScan 600 LIZ (kat. číslo ABI 4366589),
standard velikosti GeneScan 600v2 LIZ (kat. číslo ABI 4408399), multikapilární DS-33
(sada barviv G5) standardní matrice (kat. číslo ABI 4345833), polymer POP-7 (kat. číslo
ABI 4352759), 10x pufr pro genetický analyzátor (kat. číslo ABI 402824) a činidlo Hi-Di
Formamid (kat. číslo ABI 4311320).
Poznámka: Zajistěte, aby všechny použité materiály byly v rámci doby stability uváděné
výrobcem.
Požadované vybavení
Vybavení laboratoře – přesné pipety (2 sady: 1 pro manipulaci před amplifikací a 1 pro
manipulaci po amplifikaci); ochranný oděv; třepačka vortex; mikro centrifuga; 96jamková
mikrotitrační destička do centrifugy.
Amplifikace PCR – termální cyklovač kompatibilní s 96jamkovými mikrotitračními
destičkami nebo 0,2ml lahvičkami s minimální tepelnou přesností +/-1 °C mezi 33 °C a
100 °C a rovnoměrností statické teploty +/-1 °C.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 7 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Poznámka: Termální cyklovač a jeho vybavení se musí pravidelně udržovat a kalibrovat v
souladu s pokyny výrobce, aby bylo zajištěno správné provádění PCR a optimální výkon.
Test Elucigene CF-EU2v1 byl vyvinut na termálních cyklovačích Applied Biosystems
9700. Přístroje jiných výrobců (a jiné modely) musí uživatel před oznamováním výsledků
testu CF-EU2v1 plně otestovat a posoudit, zda poskytují optimální výkon.
Kapilární elektroforéza – genetický analyzátor ABI 3130/3500 (se softwarem
GeneMapper pro fragmentační analýzu), 36cm nebo 50cm (ABI3500) kapilární sestava,
96jamkové optické destičky, 96jamková septa, 96jamkové kazety.
Poznámka:Zařízení pro kapilární elektroforézu se musí pravidelně udržovat a kalibrovat v
souladu s pokyny výrobce, aby byl zajištěn optimální výkon.
Odběr a uchovávání vzorku
Podle provedeného hodnocení jsou vzorky plné krve (s EDTA) a suchých krevních skvrn
s tímto testem kompatibilní.
Bylo hlášeno, že zařízení na odběr vzorků v určitých případech poškozují integritu
určitých analytů a mohou rušit některé technologie metody (9). Všem uživatelům
doporučujeme, aby zkontrolovali, zda se zvolené zařízení používá podle pokynů výrobce
a zda jsou zařízení na odběr vzorků kompatibilní s tímto testem.
Před preparací DNA se vzorky krve musí uchovávat při teplotě -20 °C. Zabraňte
opakovanému zmrazování a rozmrazování.
Příprava DNA ze vzorků plné krve (EDTA)
Konzistentní výsledky lze získat z DNA extrahované pomocí soupravy QIAamp 96 DNA
Blood Kit (nebo QIAamp DNA Mini Kit používající K proteinázu) podle protokolu
popsaného v příručce soupravy QIAamp; začněte s 200µl tekuté plné krve a proveďte
ředění v 200µl vody v kvalitě pro použití v molekulární biologii.
Příprava DNA ze suchých krevních skvrn
Konzistentní výsledky lze získat z DNA extrahované pomocí soupravy QIAamp DNA Mini
Kit podle protokolu popsaného v příručce soupravy QIAamp; začíná se však s disky
2 x 3 mm se suchou krevní skvrnou, která se vyplavuje ve 100µl vody v kvalitě pro použití
v molekulární biologii.
Pokud s testem Elucigene CF-EU2v1 použijete jiné metody extrakce DNA a použijete jiné
typy vzorků, doporučujeme je pečlivě vyhodnotit předtím, než se výsledky testů použijí k
diagnostickým účelům.
Důležité faktory – množství DNA
Za optimálních podmínek PCR a s použitím doporučeného nastavení nástřiku vzorků (viz
poznámka v části popisující kapilární elektroforézu) uvedeného v kapilárním sloupci
modulů cyklů byly pravidelně získány přijatelné výsledky z DNA extrahované výše
uvedenými metodami za koncentrací mezi 1,5 ng/µl a 25 ng/µl. Kvantifikace DNA je velmi
důležitá a je nutno měřit koncentraci každého vzorku DNA k testování, aby byly zajištěny
optimální výsledky. Jsou přijatelné metody jako PicoGreen fluorescence nebo UV
absorpce. Vzhledem k rozdílům v metodách kvantifikace DNA musí uživatel zvážit
následující:
Velmi vysoké vstupní množství DNA zvýší pravděpodobnost, že analytický software
označí píky pozadí. Ke snížení pravděpodobnosti označení píků pozadí lze
podniknout následující opatření:
 Zřeďte vzorek DNA a proveďte znovu amplifikaci.
 Zkraťte dobu nástřiku – viz část popisující kapilární elektroforézu.
 Zvyšte práh minimální amplitudy píku, viz příručka k analytickému softwaru
Elucigene CF-EU2v1.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 8 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Nízké vstupní množství DNA zvýší pravděpodobnost, že diagnostické píky budou
slabé a analytický software je neoznačí. K posílení signálu lze podniknout
následující opatření.
 Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund (důrazně se doporučuje pro extrakci z
krevních skvrn), viz část popisující kapilární elektroforézu.
 Opakujte extrakci vzorku krevní skvrny a proveďte vyplavení v menším objemu
vody (50µl).
 Zvyšte počet krevních skvrn k extrakci na 4 x 3mm disky.
Důležité faktory – kvalita DNA
Test CF-EU2v1 je vysoce multiplexní analýza a vyžaduje účinnou PCR amplifikaci, aby
optimálně fungoval. Kvalita DNA může předurčit účinnost PCR procesu. Inhibitory
extrahované spolu se vzorkem DNA mohou způsobit suboptimální amplifikaci a
produkovat slabé a nevyvážené píky. Společnost Elucigene Diagnostics validovala pro
použití se soupravou CF-EU2v1 krevní soupravu QIAamp 96 DNA Blood Kit a
minisoupravu QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH). Jiné soupravy a metody pro
extrakci DNA se musí pro použití s testem CF-EU2v1 validovat a optimizovat.
Poznámka: Další informace vyhledejte v části popisující řešení problémů s Elucigene CFEU2v1.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 9 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Protokol testu
Zamezení kontaminace PCR
PCR proces generuje velký počet amplifikovaných produktů (amplikonů) a má vysoké
riziko kontaminace, která může vést k falešným výsledkům. Kontaminace může pocházet
ze dvou zdrojů:
Křížová kontaminace – kontaminace vzorku neamplifikovaným materiálem z okolí
nebo z jiných vzorků, které obsahují cílovou sekvenci.
Kontaminace výsledného produktu – kontaminace vzorku amplikony z předchozích
PCR cyklů vedoucí k amplifikaci jak cílového, tak kontaminujícího amplikonu.
Laboratoře, které provádějí PCR, musí tyto zdroje kontaminace znát a mít zavedené
postupy, které významně sníží riziko kontaminace. Metody omezení kontaminace jsou
dobře dokumentovány (10) a zahrnují jak fyzické uspořádání laboratoře, postup práce a
manipulaci se vzorkem, tak chemické a enzymatické metody. Dobře definované a
správné laboratorní postupy jsou k omezení kontaminace PCR nezbytné a musí být
zavedeny před testováním klinických vzorků.
Postup amplifikace
Poznámka: K omezení rizika kontaminace se musí kroky 3-5 provádět v oblasti, kde se
nenachází žádné produkty PCR, pokud možno v digestoři s laminárním prouděním.
1. Naprogramujte termální cyklovač na cyklus o jednom kroku pro aktivaci HotStart Taq
při 94 °C po dobu 20 minut s navazujícím programem amplifikačního cyklování se
schématem 1 minuta při 94 °C (denaturace), 2 minuty při 58 °C (anelace) a 1 minuta
při 72 °C (extenze) pro 30 cyklů. Na toto schéma se naváže 20minutový soubor s
prodlevou při 72 °C (extenze) ve finálním cyklu.
2. Součástí každého analytického cyklu PCR musí být negativní kontrola.
3. Nechte roztát směsi primerů a hlavní směs pro PCR a krátce je centrifugujte, aby se
shromáždil obsah uložený na dně lahviček. Lahvičky jemně promíchejte na třepačce
vortex a znovu je krátce centrifugujte. Připravte reakční směs v dostatečném
množství pro počet vzorků a kontrol, které se budou testovat (tabulka 1).
Poznámka: Hlavní směs pro PCR je viskózní a je nutno zajistit, aby byly používány
správné objemy. Doporučuje se přidávat hlavní směs pro PCR do již nadávkovaných
směsí primerů, aby se zajistilo napipetování veškeré kapaliny z pipety do směsi
primeru.
Poznámka: Nepoužívejte odlišné směsi nebo komponenty z různých šarží testu
CF-EU2v1.
Cyklování
Aktivace
enzymů
94 °C
Konečná
extenze
94 °C
20 min 1 min
72 °C
72 °C
1 min
20 min.
58 °C
Pokojová
teplota
2 min
30 cyklů
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 10 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Tabulka 1: Výroba reakční směsi
Směs primeru (μl)
Hlavní směs pro
PCR (μl)
Celkem (μl)
Počet vzorků, které se mají
testovat
1
10
25
50
4,5
45
112,5
225
7,5
12
75
120
187,5
300
375
600
4. Napipetujte 10μl každé reakční směsi na dno patřičně označených PCR lahviček o
objemu 0,2 ml (nebo destiček).
5. Pomocí samostatných pipetovacích špiček přidejte do každé lahvičky 2,5μl
testovaného vzorku DNA a uzavřete ji víčkem. Nepřidávejte vzorek DNA do lahvičky
s negativní kontrolou; nahraďte jej 2,5 µl sterilní deionizované vody.
6. Krátce centrifugujte lahvičky s PCR, aby se shromáždil obsah uložený na dně
lahviček.
7. Lahvičky napevno uložte do bloku teplotního cyklovače. Spusťte cyklus o jednom
kroku při teplotě 94 °C následovaný programem amplifikačního cyklování.
8. Po dokončení programu amplifikačního cyklování lze před provedením analýzy
kapilární elektroforézou vzorky uskladnit v temnu při pokojové teplotě přes noc nebo
při teplotě 2-8 °C pro dobu až 7 dnů.
Kapilární elektroforéza
Všem uživatelům doporučujeme ověřit, že se zvolené vybavení pro kapilární elektroforézu
používá podle pokynů výrobce a že je kompatibilní s testem. Za klíčové prvky se v této
souvislosti považuje polymer a kapilární sestava. Optimálních výsledků lze dosáhnout
v následujících podmínkách kapilární elektroforézy:
1.
Smíchejte 6,8μl standardu velikosti GS600v2 LIZ a 250μl činidla Hi-Di Formamid a
pečlivě promíchejte (dostatek směsi pro 16 jamek). Nakápněte 15μl směsi do každé
jamky 96jamkové PCR destičky.
2.
Odměřte 3µl PCR produktu z amplifikací směsi A a směsi B a přidejte jednotlivě do
jamek destičky, které již obsahují směs standard velikosti/formamid (z kroku 1).
3.
Produkt PCR nadávkovaný v PCR destičce denaturujte v termálním cyklovači
s následujícím nastavením parametrů: 94 °C po dobu 3 minut a poté 4 °C po dobu
30 sekund.
4.
Destičku krátce centrifugujte, aby se shromáždil obsah na dně lahviček a aby se
odstranily všechny vzduchové bublinky z jamek, a poté destičku založte do
genetického analyzátoru.
Poznámka: Nastavení nástřiku vzorku lze upravit tak, aby vyhovovalo množství
amplikonu vyrobeného během PCR, které se může lišit podle množství
přidávané vstupní genomické DNA. Menší množství amplikonu lze do
analytické kolony aplikovat zkrácením doby nástřiku nebo snížením napětí
nástřiku. Naopak prodloužením doby nástřiku nebo zvýšením napětí nástřiku
lze do analytické kolony aplikovat více amplikonu. Vzorky již amplifikované
lze nastříknout vícekrát pro opakovanou analýzu – viz část popisující řešení
problémů s Elucigene CF-EU2v1.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 11 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Přístroje ABI 3130:
Je potřeba vytvořit modul a protokol analytického cyklu CF-EU2, který lze následně
použít v každém analytickém cyklu CF-EU2.
Vytvořte modul analytického cyklu CF-EU2 v programu pro Module Manager (Správu
modulů) softwaru pro sběr dat 3130. Zkontrolujte, zda je vybráno následující nastavení:
•
Type (Typ): Regular (Pravidelně)
•
Template (Šablona): FragmentAnalysis36_POP7
•
Zadejte nastavení, které je podrobně popsáno v níže uvedené tabulce:
36cm kapilární modul
#
Název parametru
1
2
3
4
5
6
7
8
Oven Temperature (Teplota pece)
Poly_Fill_Vol. (Plnicí objem polym.)
Current Stability (Stabilita proudu)
PreRun_Voltage (Napětí předcyklu)
Pre_Run_Time (Doba předcyklu)
Injection_Voltage (Napětí nástřiku)
Injection_Time (Doba nástřiku)
Voltage_Number_Of_Steps
(Napětí, počet kroků)
Voltage_Step_Interval
(Interval kroku napětí)
Data_Delay_Time
(Doba zpoždění dat)
Run_Voltage (Napětí analyt. cyklu)
Run_Time (Doba analyt. cyklu)
9
10
11
12
Hodnota
Rozsah
60
6500
5,0
15,0
180
3,0
12,0**
20
vn.18…65 °C
6500…38000 kroků
vn.0...2000 uA
0…15 kV
1…1000 s
1…15 kV
1…600 s
1…100 nk
15
1…60 s
60
1…3600 s
15,0
1200
0…15 kV
300…14000 s
** Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund pro analýzu DNA extrahované z krevních skvrn
Poznámka: Požadovaná doba analytického cyklu se bude lišit v závislosti na teplotě
prostředí místa, kde je genetický analyzátor instalován. Další informace o
vytváření modulů cyklů vyhledejte v návodu k použití genetického
analyzátoru Applied Biosystems 3130.
Vytvořte protokol CF-EU2 ve Protocol Manager (Správci protokolu) a ověřte, že je
vybráno následující nastavení:
•
Type (Typ): Regular (Pravidelně)
•
Run Module (Modul anal. cyklu): CF-EU2 (viz modul anal. cyklu výše)
•
Dye Set (Souprava barviva): G5
Chcete-li analyzovat vzorky, musíte vytvořit seznam vzorků pomocí Plate Manager
(Správce destičky). Ověřte, že byl vybrán správný protokol přístroje pro CF-EU2v1 (viz
výše).
Poznámka: Další informace o sestavení přístroje, provozu a řešení problémů vyhledejte
v návodu k použití genetického analyzátoru Applied Biosystems 3130.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 12 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Přístroje ABI 3500:
Je potřeba vytvořit Instrument Protocol (Protokol přístroje) CF-EU2, který lze následně
použít v každém analytickém cyklu CF-EU2v1.
Instrument Protocol (Protokol přístroje) CF-EU2 se vytváří pomocí knihovny protokolů
přístroje 3500. Zkontrolujte, zda je vybráno následující nastavení:
•
Run Module (Modul analyt. cyklu): FragmentAnalysis50_POP7
•
Zadejte nastavení, které je podrobně popsáno v níže uvedeném obrázku:
**
** Zvyšte dobu nástřiku na 36 sekund pro analýzu DNA extrahované z krevních skvrn
Chcete-li analyzovat vzorky, vytvořte destičku vzorku tak, že kliknete na příkaz Create
Plate from Template (Vytvořit destičku ze šablony) na Dashboard (Přístrojové desce);
zkontrolujte, zda je přiřazen správný protokol přístroje pro CF-EU2v1 (viz výše).
Nastavení seznamu vzorků pro aplikaci GeneMarker:
Software GeneMarker umožňuje provést přímé srovnání dat A a B stejného jedince. Pro
usnadnění tohoto kroku je důležité, aby byly konzistentní názvy souboru fsa (výstup
nezpracovaných dat) ve všech vzorcích a směsích. Seznam vzorků má obsahovat
jedinečný název vzorku pro každý vzorek, který se má testovat, a příponu _A nebo _B
podle toho, která směs se bude testovat. Pokud má název souboru fsa obsahovat také ID
destičky, musí se používat vždy stejný formát (např. CFEU2 DDMMRRRR).
Parametr Results Destination (cíl výsledků) na přístroji 3130 se musí nastavit tak, aby byl
název vzorku obsažen v názvu souboru fsa (např. CFEU2 DDMMYYYY_1234,5_A_A01).
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 13 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Konvence pojmenovávání souborů na přístroji 3500 se musí nastavit tak, aby byl název
vzorku obsažen v názvu souboru fsa (např. CFEU2 DDMMRRRR_1234,5_A_A01).
Interpretace výsledků
Během shromažďování dat bude možné sledovat fragmenty PCR na elektroforeogramu
nezpracovaných dat jako modré píky (mutantní píky) nebo zelené píky (píky divokého
typu). Každý jedinec má dvě kopie genu CFTR. Pokud mají tyto kopie stejné pořadí pro
každé dané místo, je jedinec v tomto místě popisován jako homozygotní. Pokud mají tyto
kopie v daném místě jiné pořadí, je jedinec v tomto místě popisován jako heterozygotní.
Po dokončení sběru dat je nutno pomocí softwaru pro fragmentační analýzu porovnat
velikost fragmentů PCR CF-EU2v1 proti standardu velikosti GS600v2 LIZ.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 14 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Další podrobné pokyny pro nastavení softwaru a pro analýzu a interpretaci
výsledků obsahuje příručka k analytickému softwaru Elucigene CF-EU2v1. Příručka
k analytickému softwaru GeneMapper a GeneMarker je k dispozici na internetových
stránkách společnosti Elucigene Diagnostics:
www.elucigene.com/products
Výsledky směsi A (mutantní) určují, zda je jedinec nositelem mutace, což je znázorněno
přítomností modrého píku. Mutantní směs obsahuje také primery pro normální alelu
F508, a proto lze pomocí této směsi stanovit, zda je jedinec normální pro F508 (pouze
zelený pík), homozygotní pro mutantní F508del (pouze modrý pík) nebo heterozygotní
pro F508del (modrý a zelený pík).
Pokud je pozorována jakákoliv jiná mutace, lze analyzovat výsledky směsi B (divokého
typu) za účelem zjištění homozygotního nebo heterozygotního stavu. Přítomnost
zeleného píku pro určitou alelu ve směsi divokého typu indikuje, že je jedinec
heterozygotní pro určitou mutaci, a nepřítomnost zeleného píku indikuje, že je jedinec
homozygotní pro určitou mutaci.
V obou směsích jsou obsaženy hypervariabilní markery STR (červené). Ty umožňují
porovnat vzorek amplifikovaný pomocí směsi mutantu a vzorek amplifikovaný pomocí
směsi divokého typu, aby se snížilo riziko záměny vzorků. Odlišný profil STR u obou
směsí poukazuje na to, že došlo k záměně vzorků. Nepřítomnost těchto markerů STR
indikuje selhání vzorku. Přítomnost markerů STR ve velmi nízkých relativních
fluorescenčních jednotkách indikuje slabou koncentraci vzorku, kterou je třeba analyzovat
s opatrností.
Poznámka: Další informace viz část popisující řešení problémů.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 15 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Detekované markery
V níže uvedené tabulce jsou souhrnně uvedeny markery detekované směsí CF-EU2v1.
Markery jsou seřazeny podle rozsahu velikosti sledovaného produktu PCR.
Detekované markery
Marker
(Pík č.)
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
CF2EUBYCS 002
Marker
R347H
R347P
2789+5G>A
3120+1G>A
711+1G>T
R334W
I507del
F508del
3849+10KbC>T
1677delTA
1078delT
V520F
L206W
W1282X
R560T
2347delG
Q890X
R553X
G551D
S549R(T>G)*
S549N
M1101K
G542X
3905insT
Y1092X(C>A)
S1251N
444delA
1811+1.6kbA>G
1717-1G>A
R117H
R117C
N1303K
Y122X
394delTT
G85E
R1066C
1898+1G>A
W846X
2184delA
D1152H
CFTRdel2,3
P67L
2143delT
E60X
3659delC
3272-26A>G
621+1G>T
Sep-2014
Produkt bp Rozsah velikosti
(3130, údaje POP7)
110.5-116.5
117-123
124-130
132.5-138.5
141.5-147.5
147.5-154
156-162.5
163-169
172-178
180-188.5
193-199
206-211.5
215-220
224.5-230.5
234.5-240.5
242-246
250-252
255.5-261.5
265-267
267.5-269.5
275-280
282-288
289-295.5
297-303.5
308-314
315-321
323-326
332-338
341.5-347.5
349-355
357-360
360-366.5
367-373
377-383
384-390
391-397
398.5-404.5
406-411
413-418
423-429
433-439
439.5-445.5
446-450.5
453.5-460.5
461-465.5
470-476
485.5-491.5
Strana 16 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Číslo markeru
48
49
50
5T**
7T
9T
Produkt bp Rozsah velikosti
(3130, údaje POP7)
496-503
506-512
516.5-524.5
110-130
140-160
175-195
Marker
A455E
R1162X
R1158X
IVS8-5T
IVS8-7T
IVS8-9T
*S549R(T>G)
Pík 20 se nachází pouze ve směsi A.
** Velikosti alely 5T
Marker
5T (9)
5T (10)
5T (11)
5T (12)
5T (13)
Produkt bp Rozsah
velikosti (3130, údaje
POP7)
117.25 – 118.75
119.25 – 120.75
121.25 – 122.75
123.25 – 124.75
125.25 – 126.75
POZNÁMKA: Velikosti markerů se mohou lišit v závislosti na použitém přístroji a
polymeru.
Příklady interpretace
I507del
Vzhledem k poloze delece I507del v genu CFTR je možné detekovat přítomnost tohoto
markeru pomocí 3 bp posunu velikosti píku F508del a také mutantního specifického píku
I507del.
Tam, kde je jedna přítomna mutantní alela I507del, bude viditelný mutantní pík I507del
jako modrý pík v cca 159 bp. Lze pozorovat přítomnost píku divokého typu pro F508,
avšak přibližně v polovině výšky píku normálně spojovaného s homozygotním genotypem
divokého typu; zobrazuje se jako zelený pík v cca 167 bp. Také bude viditelný další
zelený pík v cca 164 bp.
Heterozygotní vzorek I507del
Výsledkem vzorku I507del/F508del bude posunutý zelený pík F508del WT v cca 164 bp
(o 3 bp méně než normálně), modrý mutantní pík F508del v 166 bp a modrý mutantní pík
I507del v cca 159 bp.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 17 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Výsledkem vzorku I507del/I507del bude modrý pík v cca 159 bp a jediný zelený pík v cca
164 bp (o 3 bp menší než normální pík F508, který lze pozorovat při nepřítomnosti
I507del).
F508del
Přítomnost mutace F508del brání fungování primeru divokého typu I507del. Proto jedinec
homozygotní pro F508del nebude mít pík divokého typu (WT) I507del ve směsi WT
(viz níže).
U výsledků směsi B pro jedince heterozygotního pro F508del bude možné sledovat
sníženou výšku píku divokého typu I507del a 2 píky vzájemně posunuté o 3 bp na
pozicích 10 a 12 ve směsi WT (viz níže).
Inserce a delece
Vzhledem k povaze designu soupravy CF-EU2v1 bude přítomnost insercí nebo delecí
mezi dvěma protikladnými primery vést ke změně velikosti všech amplikonů
produkovaných mezi těmito dvěma primery. Proto mohou být kromě 50 mutací
detekovaných soupravou CF-EU2v1 detekovány jakékoliv inserce a delece v
amplifikovaných cílových sekvencích podle změny očekávané velikosti amplikonu ve
směsi divokého typu (B). Údaje byly zaneseny do tabulek a jsou k dispozici
v samostatném dokumentu na internetových stránkách společnosti Elucigene
Diagnostics:
www.elucigene.com/products
Příklady insercí a delecí detekovaných soupravou a dopad, který mají na profil směsi B
uvádíme níže.
F508del/1677delTA
U jedince heterozygotního pro mutace F508del/1677delTA bude možné ve výsledcích
směsi B sledovat na pozici 12 dva píky vzájemně posunuté o 1 bp (V520F WT).
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 18 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
V520F
U jedince heterozygotního pro mutaci V520F bude možné ve výsledcích směsi B sledovat
pík divokého typu a snížené výšky na pozici 10 (1677delTA WT), neboť zde dochází
k potlačení funkce primeru 1677delTA WT. U jedince homozygotního pro mutaci V520F
vypadnou píky 10 a 12 z ostatních výsledných píků.
394delTT
U jedince heterozygotního pro mutaci 394delTT budou ve výsledcích směsi B viditelné na
pozicích 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) a 44 (E60X WT) dva píky vzájemně posunuté o
2 bp. Pík 34 vypadne a píky 35, 42 a 44 budou mít očekávanou výšku, ale budou
posunuté o 2 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro
mutaci 394delTT.
F508del/CFTRdele2,3
U jedince heterozygotního pro mutaci CFTRdele2,3 budou ve výsledcích směsi B
viditelné píky snížené velikosti na pozicích 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41
(CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) a 44 (E60X WT). U jedince homozygotního pro mutaci
CFTRdele2,3 ve výsledcích vypadnou píky 34, 35, 41, 42 a 44.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 19 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
444delA
U jedince heterozygotního pro mutaci 444delA budou ve výsledcích směsi B viditelné
dva píky vzájemně posunuté o 1 bp na pozicích 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33
(Y122X WT) a 47 (621+1 WT). Pík 27 vypadne a píky 30, 31, 33 a 47 budou mít
očekávanou výšku, ale budou posunuté o 1 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků
jedince homozygotního pro mutaci 444delA.
2347delG
U jedince heterozygotního pro mutaci 2347delG budou ve výsledcích směsi B viditelné
dva píky vzájemně posunuté o 1 bp na pozicích 39 (2184delA WT) a 43 (2143delT WT).
Pík 16 vypadne a píky 39 a 43 budou mít očekávanou výšku, ale budou posunuté o 1 bp
níže, než je očekávaná velikost u výsledků jedince homozygotního pro mutaci 2347delG.
3905insT
U jedince heterozygotního pro mutaci 3905insT budou ve výsledcích směsi B viditelné na
pozici 26 (S1251N WT) dva píky vzájemně posunuté o 1 bp. Pík 24 vypadne a pík 26
bude mít očekávanou výšku, ale bude posunutý o 1 bp výše, než je očekávaná velikost u
výsledků jedince homozygotního pro mutaci 3905insT.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 20 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
R1158X
U jedince heterozygotního pro mutaci R1158X bude ve výsledcích směsi B viditelný pík
nižší výšky na pozici 49 (R1162X WT). U jedince homozygotního pro mutaci R1158X pík
49 vypadne z výsledků.
Polymorfismus rs4148721 (delAT) v oblasti intronu 22
U jedince heterozygotního pro polymorfismus rs4148721 (delece AT) v oblasti intronu 22
budou ve výsledcích směsi B viditelné dva píky vzájemně posunuté o 2 bp na pozicích 45
(3659delC WT), 49 (R1162X WT) a 50 (R1158X WT). Píky 45, 49 a 50 budou mít
očekávanou výšku, ale budou posunuté o 2 bp níže, než je očekávaná velikost u výsledků
jedince homozygotního pro polymorfismus rs4148721.
Další pozorování
V520F – polymorfismus 1584G>A v exonu 12
Bylo zjištěno, že polymorfismus 1584G>A interferuje s amplifikací mutanty V520F a
sekvencí divokého typu. U jedince heterozygotního na polymorfismus 1584G>A bude
pozorováno ve směsi B snížení výšky píku v pozici 12 (V520F). U jedince homozygotního
na polymorfismus 1584G>A nebude pík 12 ve směsi B přítomen. Jedinec heterozygotní
na mutaci F508del a rovněž heterozygotní na mutaci 1584G>A bude vykazovat pouze
jeden pík 12 ve směsi B, namísto očekávaných dvou píků v pozici 12, které se normálně
objevují u heterozygotů F508del – viz příklad níže. U jedince heterozygotního na V520F
mutaci s polymorfismem 1584G>A na téže alele nebude pík 12 ve směsi A přítomen, což
je výsledek dosud nepozorovaný a pravděpodobně představuje vzácnou kombinaci.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 21 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Křížová reaktivita
Během vývoje testu bylo vynaloženo veškeré úsilí k tomu, aby nedocházelo k ovlivnění
funkčnosti testu přítomností dalších hlášených polymorfismů a mutací genu CFTR.
Bylo zjištěno, že vzácná mutace R1283M způsobuje křížovou reaktivitu a tuto mutaci
nelze detekovat pomocí soupravy Elucigene CF-EU2v1. Dále test nedetekoval
následující polymorfismy: 1655T/G (F508C), 1651A/G.
Vyhodnocení známých mutací a polymorfismů genu CFTR zvýraznilo následující vlivy na
výsledky získané pomocí soupravy Elucigene CF-EU2v1:
1. Mutantní primer G551D ve směsi A bude rovněž detekovat mutaci S549RT>G.
Analytický software tento pík označí jako pík 20. Ve směsi B nebude odpovídající pík
divokého typu.
2. Mutantní primer 2184delA ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA
2183AA>G; výsledkem bude mutantní pík na pozici 2184delA.
3. Mutantní primer 1078delT ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA
F316L; výsledkem bude mutantní pík na pozici 1078delT.
4. Mutantní primer R347P ve směsi A bude křížově reagovat s mutantní sekvencí DNA
R347H; výsledkem bude mutantní pík na pozici R347P, jehož výška bude nižší než
výška skutečného píku R347P.
5. Přítomnost polymorfismu F508C (1655T>G) povede k redukci výšky píku I507del ve
směsi B CF-EU2v1.
6. Přítomnost R117H povede k redukci výšky píku R117C ve směsi B CF-EU2v1. U
vzorků homozygotních pro R117H bude pík R117C chybět.
7. Přítomnost G85E povede k redukci výšky píku 394delTT ve směsi B CF-EU2v1. U
vzorků homozygotních pro G85E bude pík 394delTT chybět.
8. U výsledků heterozygotního F508del a zvláště pak u homozygotního vzorku F508del je
občas možné pozorovat velmi malý artefaktový pík na pozici I507del.
9. U následujících mutací nebyla potenciální křížová reaktivita testována kvůli
nedostupnosti relevantních vzorků a tyto mutace mohou narušovat funkčnost testu:
R117P, R117L, 1717-2A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T,
I506S, I506V a vzácná kombinace I507del s polymorfismem 1651A/G.
Funkční charakteristiky
Bylo provedeno zaslepené testování jednoho sta deseti vzorků DNA extrahovaných z
tekuté plné krve (EDTA) pomocí testu Elucigene CF-EU2v1. Pět vzorků nebylo možno
testovat po PCR kvůli nízké koncentraci DNA (méně než 1,5 ng/μl). Z celkového počtu
vzorků, u kterých byly získány interpretovatelné výsledky, bylo 96 normálních, 5
heterozygotních pro F508del, 1 byl heterozygotní pro 1717-1G>A, 1 byl heterozygotní pro
G551D, 1 byl heterozygotní pro 621+1G>T, 1 byl heterozygotní pro G542X a 1 byl
kompozitně heterozygotní pro G542X/F508del.
Ze vzorků ve formě suchých krevních skvrn bylo extrahováno 91 vzorků DNA a slepě
testováno pomocí testu Elucigene CF-EU2v1. U pěti vzorků amplifikace selhala. U vzorků
se zdařenou amplifikací 20 vzorků nesplňovalo analytická kritéria pro interpretaci po 12
sekundovém nástřiku do genetického analyzátoru 3500. Všechny neúspešné vzorky měly
nízkou koncentraci DNA (méně než 1,5 ng/μl). Těchto 20 neúspěšných vzorků bylo znovu
nastřikováno do genetického analyzátoru 3500 po dobu 36 sekund a znovu analyzováno,
7 vzorků nesplnilo analytická kritéria pro interpretaci. Ze 79 vzorků, které podaly
interpretovatelné výsledky, bylo 38 normálních, 5 bylo heterozygotních na F508del, 3 byly
heterozygotní na G551D, 3 byly heterozygotní na W1282X, 2 byly heterozygotní na
D1152H a 2 byly heterozygotní na G542X. Byly také zjištěny čtyři složené heterozygoty
3120+1G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del a R553X/F508del. Kromě toho
byly při jedné příležitosti jednotlivě pozorovány následující heterozygotní vzorky: E60X,
G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 1717-
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 22 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
1G>A, R553X, 1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X,
3659delC, 3849+10kbC>T, S1251N a N1303K.
Při pěti samostatných testech bylo amplifikováno 46 vzorků DNA reprezentujících všech
50 mutací detekovaných soupravou CF-EU2v1. U všech vzorků byly získány očekávané
výsledky se žádnými falešně negativními nebo falešně pozitivními výsledky, což
prokázalo 100% klinickou specificitu a citlivost.
Řešení problémů
Tento návod k použití se poskytuje k zajištění optimálního výkonu testu. Uživatelé se
nesmí odchylovat od zde popsaných postupů. Jakékoliv odchylky mohou způsobit
suboptimální výkon a vést k získání dat špatné kvality. Návod k řešení problémů, který si
můžete vyžádat od společnosti Elucigene Diagnostics, poskytuje příklady a řešení
nejčastějších otázek, které se mohou u CF-EU2v1 vyskytnout:








Žádné diagnostické nebo STR píky
Slabé diagnostické nebo STR píky
Nadměrný počet píků typu Breakthrough (prolomený) nebo píků pozadí
Neoznačené píky
Slabé píky FAM (mutantní)
Nevyvážený profil směsi A
Nevyvážený profil směsi B
Rozštěpené píky v profilu směsi B
Chcete-li požádat o návod k řešení problémů pro Elucigene CF-EU2v1, kontaktujte
skupinu technické podpory:
T: +44 (0) 161 669 8122
F: +44 (0) 161 669 8129
E: [email protected]
E: [email protected]
Omezení postupu
1.
Výsledky získané při tomto nebo jakémkoli jiném diagnostickém testu je nutno
používat a interpretovat pouze v kontextu celkového klinického obrazu. Společnost
Elucigene Diagnostics neodpovídá za žádná přijatá klinická rozhodnutí.
2.
Nepřítomnost mutace detekované touto soupravou není žádnou zárukou
nepřítomnosti jiných mutací genu CFTR. Existují možnosti jiných mutací, které tato
souprava nedetekuje.
3.
Četnost mutací se u různých populací liší. Údaje o četnosti mutací u různých
populací jsou k dispozici u Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium
(Konzorcium genetických analýz cystické fibrózy) (6).
Uživatel této soupravy musí tyto skutečnosti zdůraznit při hlášení výsledků klinickému
lékaři, který stanovuje diagnózu, nebo lékaři z genetické poradny.
Prohlášení
Výsledky tohoto diagnostického testu i jiných testů musí být interpretovány ve spojení s
jinými laboratorními a klinickými údaji, které jsou dostupné lékaři.
Tyto reagencie Elucigene se dodávají pro diagnostické testy in vitro.
Další podrobné informace pro interpretaci dat jsou k dispozici v postupech v příručce
k analytickému softwaru Elucigene CF-EU2v1:
www.elucigene.com/products
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 23 z/ze 24
Elucigene® CF-EU2v1 Návod k použití
Reference
1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement.
Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589–95.
2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype
correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation.
Hum Genet. 1997;101:208–11
3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M,
Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J,
Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of
lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353:1443–53
4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient
air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J
Respir Crit Care Med. 2004;169:816–21
5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A,
Buchwald M, and Tsui LC. „Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic
Analysis.“ Science 1989; 245 (4922): 1073-8
6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app
7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a
Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): 176–179.
8. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory
Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989).
9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:15091510 (1994).
10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press:
Section 1
ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd.
ARMS je ochranná známka společnosti AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP je ochranná
známka společnosti Qiagen GmbH. PICOGREEN je ochranná známka společnosti
Molecular Probes Inc. GENE MARKER je ochranná známka společnosti SoftGenetics
Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ a HI-DI jsou ochranné známky
společnosti Life Technologies Corporation.
UPOZORNĚNÍ PRO KUPUJÍCÍ: LIMITOVANÁ LICENCE
Polynukleotidy značené barvivy VIC, NED a PET (a jejich použití) mohou být chráněny
jedním nebo několika patenty ve vlastnictví společnosti Life Technologies Corp. Kupní
cena tohoto výrobku zahrnuje omezená nepřenosná práva, vlastněná společností Life
Technologies Corp. v rámci některých patentů, která jsou poskytována pouze v tomto
rozsahu výrobku a výhradně pro aktivity kupujícího při detekci cíle v oboru diagnostiky v
humánní medicíně. Žádná jiná práva se neposkytují. Potřebujete-li další informace o
možnostech zakoupení licencí týkajících se výše uvedených barviv, kontaktujte
vedoucího pracovníka oddělení licencí: Director of Licensing, [email protected]
Copyright  2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd.
CF2EUBYCS 002
Sep-2014
Strana 24 z/ze 24