10-Aplikace biotechnologii ve farmacii

Obsah přednášky
1) Dva základní strategické přístupy
2) Produkty klasických výrob
3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní
4) Biotransformace
5) Rekombinantní léčiva
6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky
7) Neproteinové produkty
2
Přehled základních
biotechnologických výrob ve farmacii







Enzymy
Polysacharidy
Steroidy
Antibiotika
Antimykotika
Vitamíny
Alkaloidy
 Hormony
 Aminokyseliny
 Cytokininy
Dva přístupy
 Produkty získané klasickými technikami
mikrobiální biotechnologie
 Produkty rekombinantních technologií
Nejčastější produkt = ENZYMY
Využití enzymů ve farmacii
 příprava léčiv - antibiotika, steroidy,
aminokyseliny
 léčiva - digestiva, léčba leukémie,
rozpouštění krevních sraženin atd.
 diagnostické účely
Kultivace mikroorganismů
Submersním aerobním postupem
» suroviny: zdroj uhlíku – sacharidy,
polysacharidy
» zdroj dusíku – anorganické soli, amoniak;
» přirozené substráty – kukuřičné výluhy,
rostlinné mouky, kvasničný extrakt
» stopové prvky
Exoenzymy, endoenzymy
Produkty klasické
biotechnologie
mikroorganismů
Příklady enzymů
Proteázy




trypsin, chymotrypsin, pepsin, chymosin
papain, ficin, bromelain
bakteriální proteázy (Bacillus)
proteázy produkované plísněmi (Aspergillus)
Glukosidázy
 α-amylázy, β-amylázy
 produkují bakterie (Bacillus) a plísně
(Aspergillus)
Použití amyláz
Medicína
 usnadnění trávení škrobu při dyspepsii
 omezení meteorismu před chirurgickým výkonem a
v pooperačním období
Potravinářství
 výroba piva, alkoholických nápojů, lihovin
 zpracování škrobu na glukózové a maltózové sirupy
a krystalickou glukózu
 sirupy s vysokým obsahem fruktózy
Lipázy
Katalyzují hydrolýzu triacylglycerolů
Původ
 pankreas
 pšeničné klíčky
 Aspergillus niger, Rhizopus sp., kvasinky
Použití
 součást digestiv
 potravinářský průmysl – výroba sýrů
Penicilinacyláza
Hydrolázy štěpící vazby jiné než C-N
Mechanismus
 hydrolýza penicilinu na kyselinu 6-aminopenicilanovou
Původ
 Escherichia coli, Neurospora crassa, Torula sp.,
Rhodotorulla sp.
Použití
 výroba polosyntetických penicilinů
POLYSACHARIDY
Dextran
Původ
bakterie Leuconostoc mesenteroides
Použití
náhražka krevní plazmy
dextransacharáza
n x sacharóza
(anhydroglukóza)n
+
n x fruktóza
ANTIBIOTIKA
 Produkty buněk schopné v nízkých
koncentracích inhibovat růst jiných buněk
 Nejčastější producenti G+ bakterie rodu
Streptomyces
 Příprava nových ATB modifikací známého
ATB, tzv. mutační syntéza
Mutace MO produkující ATB + vhodný prekurzor
nové ATB
Penicilin
Mikroorganismus
Penicillium notatum
– inhibice stafylokoků Fleming 1928
– izolace surového penicilinu Florey a Chain 1938
P. chrysogenum
– vyšší množství, submerzní kultivace
Mechanismus účinku
 baktericidní
 inhibice syntézy buněčné stěny vazbou β-laktamu
na enzymy vytvářející peptidoglykan
Penicilin G
Penicilin G
(benzylpenicilin)
jádro penicilinů
Postup výroby penicilinu
1)
Naočkování suspenze spor Penicillium
chrysogenum do nutričně bohatého média
2)
Kultivace 1 týden při teplotě 24°C
3)
Převedení do inokulačního fermentoru
4)
Aerobní kultivace 1 až 2 dny  nárůst mycelia
5)
Naočkování inokula do produkčního fermentoru
- kultivace 7 dní
živiny
prekurzor
zdroj C - roztok glukózy, melasa
zdroj N - kukuřičné výluhy
kyselina fenyloctová
Růstová křivka – výroba penicilinu
Nárůst mycelia
Akumulace penicilinu
primární
metabolity
primární i
sekundární
metabolity
pH = 6 !
Izolace penicilinu
1) Odstranění mikrobiálních buněk pomocí rotační
vakuové filtrace
2) Extrakce penicilinu do organického rozpouštědla
3) Re-extrakce do vodné fáze
4) Purifikace opakovanou extrakcí organické
rozpouštědlo–voda
5) Přídavek draselných iontů  krystalická
draselná sůl penicilinu G
6) Izolace filtrací nebo centrifugací
7) Výsledný produkt se usuší
Deriváty penicilínu G
6-aminopenicilanová kyselina = výchozí produkt
kyselina 6-aminopenicilanová
penicilinacylasa z E. coli
H
N
O
O
S
CH3
CH3
N
COOH
CH3
CH3
S
H2N
O
+
OH
N
O
COOH
kyselina fenyloctová
penicilin G
OMe
HOOC
O
OMe
S
N
H
O
N
methicilin
CH3
CH3
H2N
O
S
N
H
O
COOH
S
N
H
O
N
CH3
CH3
COOH
ampicilin
O
N
CH3
CH3
COOH
karbenicilin
Další antibiotika I
 Cefalosporiny - Cephalosporium acremonium
 Tetracykliny - Streptomyces
 Aminoglykosidy (streptomycin) Streptomyces griceus
 Makrolidy (erythromycin) - Streptomyces
erythreus (Saccharopolyspora erythreus)
 Linkosamidy (linkomycin) - Streptomyces
lincolnensis
Další antibiotika II
 Amfenikolová antibiotika (chloramfenikol) Streptomyces venezuelae
 Polypeptidová a glykopeptidová - polymyxin
B, Colistin, Bacitracin, Vancomycin - Bacillus
 Ansamycinová (rifampin) - semisyntetické
odvozené od rifamycinu B - Streptomyces
mediterranei
Postup výroby streptomycinu
1)
Naočkování suspenze spor Streptomyces
griseus do počátečního nutričně bohatého
média, kultivace při 28°C
2)
Nastartování růstu kultury a nárůst mycelia
3)
Převedení do inokulačního fermentoru
4)
Naočkování inokula do produkčního
fermentoru, dokonalá aerace, 10 dní, výtěžek
1g/litr
živiny
zdroj C - roztok glukózy, NaCl
zdroj N - sojová mouka
Antimykotika
 Griseofulvin – Penicillium
 Nystatin – Streptomyces noursei
 Amfotericin B – Streptomyces nodosus
OH
H 3C
HO
OH
O
O
CH 3
OH
OH
OH
OH
OH
O
H
H 3C
H 3C
HO
H 2N
O
OH
O
COOH
STEROIDY
 fyziologický účinek závisí na přesné poloze
substituentů v základním skeletu
 chemická syntéza je velmi náročná
Biotransformace steroidů
1)
Kultivace mikroorganismu - nárůst biomasy
2)
Přidání steroidu, následná biotransformace
3)
Izolace do organického rozpouštědla
4)
Purifikace chromatograficky a krystalizací
Příklady biotransformací I
11α-hydroxylace
příprava 11-a-progesteronu
Rhizopus nigricans, R. arrhizus, Aspergillus ochraceus
11β-hydroxylace
příprava kortisolu
Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana
Příklady biotransformací II
16a-hydroxylace
příprava 16a-hydroxy-9a-fluoroprednisolonu
(triamcinolon)
Streptomyces roseochromogenes
dehydrogenace mezi C1-C2
Bacillus lensus, Arthrobacter simplex
výroba prednisonu, prednisolonu, triamcinolonu,
6-methylprednisolonu, dexamethasonu…
NÁMELOVÉ ALKALOIDY
Zdroje
Claviceps purpurea (pěstování na žitě)
Claviceps paspali (submerzní kultivace)
Sklerocia paličkovice
nachové na žitu
Výtrusnice na
sklerociu
VITAMÍNY
esenciální živočišné nutriční faktory
Výroba




chemická syntéza
izolace z přírodního materiálu
mikrobiální biosyntéza
biotransformace
Vitamíny vyráběné biotechnologicky
 riboflavin (B2)
 kobalamin (B12)
 kyselina askorbová (C)
 ergosterol (D2, D3)
 provitamín A
 provitamín D
AMINOKYSELINY
 Chemická syntéza
 Izolace z přírodních zdrojů
 Enzymové přeměny
- kultivace MO obsahujících příslušný enzym
- separace buněk
- k buňkám se přidá substrát určený pro
enzymovou přeměnu
 Biosynteticky - kultivace mikroorganismu izolace AMK z kultury
Producenti aminokyselin
Bakterie přirozeně se vyskytující
- Corynebacterium
- Brevibacterium
- Micrococcus
Rekombinantní kmeny
- Escherichia coli
- Serratia marcescens
Rekombinantní
léčiva
Typy rekombinantních léčiv
 lídrem jsou USA (Food and Drug Administration)
 desítky léčiv, všechny na bázi proteinů
 hormony






enzymy
hematopoetické růstové a koagulační faktory
cytokiny a interferony
protilátky a jejich deriváty
vakcíny
další produkty
Rekombinantní hormony
alterace sekvence aminokyselin
změny farmakokinetiky
rozdílné biologické účinky
širší léčebné postupy
Rekombinantní hormony byly první
r. 1979 - Goeddel a kol. - produkce inzulínu a
somatotropinu pomocí Escherichia coli
r. 1982 - inzulín - první klinicky použitý
rekombinantní hormon (USA)
r. 1985 - somatotropin
Příprava rekombinantních hormonů
• Bakterie (Escherichia coli)
• Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae)
• Savčí buňky
Analoga inzulínu
Lispro (HUMALOG)
 obrácené pořadí lysinu a prolinu
v pozici B28 a B29
 produkce v Escherichia coli
 krátce působící inzulín
Aspart (NOVORAPID)
 substituce prolinu
kyselinou asparagovou
v pozici B28
 Saccharomyces cerevisiae
 krátce působící inzulín
Další typy inzulínu
Glargin (LANTUS)
 adice 2 argininů k C-konci řetězce B a náhrada
asparaginu glycinem na A21
 Escherichia coli
 prodloužený účinek
Detemir
 odstranění threoninu na B30
a acylace (kys. myristová)
lysinu na pozici B29
 prodloužený účinek
Výhody oproti lidským krátkodobě
působícím inzulínům
 rychlejší a pravidelnější vstřebávání
z podkoží
 nejlépe napodobují prandiální sekreci
 léčba nemocných od 3 let
 kratší biologický účinek – nižší riziko
hypoglykémie
Další hormony vyráběné
biotechnologicky
 Glukagon (E. coli, S. cerevisiae)
 Somatotropin (E. coli)
 Folitropin – FSH (ovariální buňky
čínského křečka)
Glukagon
Polypeptidový hormon (29 AMK)
Účinky
 glykogenolytické
 hyperglykemizující
 relaxace hladké svaloviny GIT
Příprava
 Escherichia coli
 Saccharomyces cerevisiae
Indikace
 hypoglykémie
 radiologická vyšetření – inhibice
pohybu GIT
Somatotropin
Druhově specifický polypeptid (191 AMK)
Účinky
 stimulace růstu
 zvyšuje proteosyntézu
 snižuje proteokatabolismus
Indikace
 poruchy růstu
Příprava
 Escherichia coli (od konce 80. let)
Folitropin
folikulostimulační hormon (FSH)
Dvě podjednotky – alfa (92 AMK), beta (111 AMK)
Produkce
 ovariální buňky čínského křečka
Indikace
 anovulační cykly
 amenorea
 poruchy spermatogeneze
urofollitropin
Rekombinantní enzymy
Příprava léčiv
 antibiotika, steroidy, aminokyseliny
Léčiva
 digestiva (rozpouštění
krevních sraženin, léčba
leukémie)
Diagnostické účely
 Taq polymeráza
Hematopoetické a růstové faktory
Epoetin α (165 AK, glykosylovaný)
Účinky
stimulace tvorby krevních buněk
Příprava
savčí buňky
Indikace
léčba anémie
Cytokiny a interferony
Interleukin IL-2
Účinky
imunomodulační účinky
Příprava
Escherichia coli
Indikace
terapie nádorových onemocnění
Interferony α, β, γ
Protilátky
 první příklad v roce 1989 – myší imunoglobulin IgG1
2. linie
1. linie
gen pro těžký
řetězec γ
F1
gen pro lehký
řetězec κ
oba řetězce v množství až
1,3% celkového proteinu
v listech
Příklad úspěšné rostlinné protilátky
 sekreční sIgA z Nicotiana tabacum
 proti zánětu zubů Streptococcus mutans
 rozpoznává adhesin I/II, kterým se S. mutans váže
na povrch buněk – prevence kolonizace
4 výchozí transgenní linie, trojí křížení
Rekombinantní vakcíny
Hepatitida B
Obchodní název: Recombivax
Produkuje: Saccharomyces cerevisiae
Výrobce: Merck, i další výrobci
Lidský papillomavirus (6, 11, 16, 18)
Obchodní název: Gardasil
Produkuje: Saccharomyces cerevisiae
Výrobce: Merck
První použitelný rostlinný produkt
Květen 2012
Obchodní název: Elelyso
Enzym: taligluceráza alfa
Produkuje: GM kultura mrkve
Výrobce: Protalix BioTherapeutics, Izrael
Pfizer, USA
Schválen FDA pro léčbu Gaucherovy choroby
51
Neproteinové produkty
Fomivirsen
Fomivirsen (Vitravene)
Obchodní název: Vitravene
Produkuje: umělá syntéza
Výrobce: Isis Pharmaceuticals, Inc.
 antivirové léčivo určené k léčbě zánětu sítnice
vyvolanému infekcí CMV u imunohandicapovaných
pacientů (např. pacienti s AIDS), aplikuje se
intravitreálně
Fomivirsen
 licencován FDA v srpnu
1998
 21mer
 5´- gCg TTT gCT CTT CTT
CTT gCg – 3´
 nukleotidy spojené
fosforothionátovou
vazbou (rezistence k
nukleázám)
 blokuje translaci virové
mRNA
Pegaptanib
Pegaptanib (Macugen)
Obchodní název: Macugen
Produkuje: umělá syntéza
Výrobce: EyeTech Pharmaceuticals (OSI
Pharmaceuticals), Pfizer (mimo USA)
 anti-angiogenetikum pro léčbu vlhké formy věkem
podmíněné makulární degenerace (VPMD)
 licencován v roce 2000, FDA schválen v roce 2004
Pegaptanib
 pegylovaný anti-VEGF aptamer, ssDNA, která se
specificky váže k VEGF 165 – protein, který hraje
rozhodující úlohu v angiogeneze a zvyšuje
permeabilitu krevních vlásečnic (tyto dva
patologické procesy jsou zodpovědné za ztrátu
zraku při VPMD)
 aplikuje se intravitreálně
Podrobnosti najdete na stránkách Evropské
lékové agentury
www.emea.europa.eu
Budoucnost?
 Transgenní rostliny
 Transgenní organismy
 DNA vakcíny
 Interferující RNAi
 Genová terapie
 Problematika GMO
… nebo žhavá současnost?
Shrnutí aktuálních technik
1) Výroba a testování léčiv - bakterie a kvasinky
2) Produkce protilátek a šlechtění rostlin - buněčné a
tkáňové kultury, hybridomy
3) Orgány pro transplantace - celé organismy
4) Šlechtění hospodářských zvířat, záchrana
ohrožených druhů - celé organismy
5) Genové terapie (nedědičná změna genetického
kódu člověka) – viry
6) Léčba dědičných chorob, řešení pro bezdětná
manželství – klonování člověka
Shrnutí přednášky
1) Dva základní strategické přístupy
2) Produkty klasických výrob
3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní
4) Biotransformace
5) Rekombinantní léčiva
6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky
7) Neproteinové produkty
59