12. Oligonukleotidy - farmaceuticka

Komentáře

Transkript

12. Oligonukleotidy - farmaceuticka
Oligonukleotidy
12. Oligonukleotidy
12.1. Úvod
Oligonukleotidy jako produkty pro farmaceutickou biotechnologii představují krátké řetězce
chemicky modifikovaných ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů. Jsou schopny se vázat
na komplementární sekvence chromozómové DNA nebo mRNA prostřednictvím standardního
Watson-Crickova nebo alternativního Hoogsteenova párování. Taková vazba je vysoce specifickou
intervencí do celého mechanismu genové exprese, ať už na úrovni transkripce, translace, reparace
nebo rekombinace. A s tím souvisí i vysoký potenciál takových oligonukleotidů pro terapeutické
aplikace.
Jestliže je počet nukleotidů v diploidním genomu člověka roven přibližně 3 miliardy párů bází,
pak délka sekvence, která se v takovém genomu bude vyskytovat pouze jedenkrát, odpovídá vztahu
X
4 = 3 x 109
Rovnici lze řešit logaritmováním
X
ln 4 = ln (3 x 109)
Odtud
ln (3 x 109)
X = ------------------ln 4
A tedy
X = 15,7
Znamená to tedy, že oligonukleotid o délce větší než 16 nukleotidů se bude v genomu člověka
(pokud by byly sekvence nahodilé) vyskytovat jen jedenkrát. Proto jsou oligonukleotidy navrhovány
nejčastěji o délce mezi 15 až 17 nukleotidy, je tak zajištěna, alespoň teoreticky, jedinečnost cílového
místa na sekvenci lidské genomové DNA.
Vedle toho lze terapeutického efektu oligonukleotidů dosáhnout také sekvenčně specifickou
vazbou k transkripčním faktorům nebo intramolekulárním sbalením do komplexů trojrozměrných
struktur, které se vážou k funkčním biomolekulám a interferují s nimi.
V neposlední řadě existují specifické buněčné receptory pro oligonukleotidy a vazba
oligonukleotidu na takový receptor je spojena s odpovědí imunitního systému.
Oligonukleotidy tedy mají různé účinky na genovou expresi a buněčné procesy; z toho důvodu je
Oligonukleotidy
jejich terapeutický potenciál značný. Vedle popsaných pozitivních efektů mají ale také řadu vedlejších
nežádoucích účinků, které zpomalují jejich nasazení v léčbě onemocnění. Například mohou ovlivnit
expresi genů, ke kterým mají jen částečnou sekvenční homologii. Takový vliv se označuje jako
„off-target effect“. Oligonukleotidy mohou také navodit odpověď imunitního systému nebo mohou
změnit aktivitu proteinů a peptidů, na které se nespecificky připojí.
Rychlému zavedení terapie oligonukleotidy brání i další charakteristiky:



jsou rychle pohlcovány makrofágy a vylučovány ledvinami,
nesnadno spontánně vstupují přes buněčné membrány,
jsou citlivé k nukleázám
V posledních letech byly oligonukleotidy modifikovány různým způsobem tak, aby byly jejich
nežádoucí vlastností pokud možno eliminovány. Přehled různých modifikací oligonukleotidů je uveden
na obr. 12.1.
Obr. 12.1: Nejběžnější chemické modifikace, které mají za cíl snížit citlivost k nukleázám a změnit
distribuční profil oligonukleotidů
Modifikace 1. generace
Modifikace 2. Generace
Fosfothioát DNA (PS)
2´-O-methyl RNA (OMe)
a
O
O =P
a
O
O
H
O
O
CH3
-
O
O
a
O
O
O =P O
S
2´-O-methoxy-ethyl RNA
(MOE)
O
O =P O
O CH3
-
O
Modifikace 3. generace
PNA
N3´-P5´-fosfoamidát (NP)
C
C
C
N
C
O
a
O
a
F
O
O =P O
NH
a
O
NH
C
2´-O-fluoro-arabino
nukleová kyselina (FANA)
O
O
-
O = P OO
Oligonukleotidy
LNA
Morfolino fosfoamidát
(MF)
a
O
O
O =P O
O
O
-
B
O
N
O
Tricykl DNA (tcDNA)
O B
O
O = P OO
a
O
O
O =P N
H
Cyklohexen nukleová
kyselina (CeNA)
O = P OO
Oligonukleotidy
12.2. Interference oligonukleotidů s genovou expresí
K oligonukleotidům, které mění genovou expresi, třebaže v různých fázích, patří oligonukleotidy
tvořící triplexy („triple-helix-forming oligonucleotides), antimediátorová RNA (antisense RNA), siRNA,
miRNA, klamné cíle pro transkripční faktory (transcription factor decoys), ribozymy, DNAzymy a EGS
sekvence (external guide sequences).
Oligonukleotidy tvořící triplexy působí na úrovni transkripce. Triplexy vznikají, když se polypurin
nebo polypyrimidin na DNA nebo RNA olidonukleotidu váže k polypurinové nebo polypyrimidinové
oblasti genomové DNA. Na molekule dsDNA se jednotlivé báze párují prostřednictvím standardního
Watson-Crickova párování; přes velký žlábek se pak připojuje oligonukleotid prostřednictvím
Hoogsteenova párování (příklad na obr. 12.2).
Obr. 12.2: Příklad triplexu guanosin-guanosin-cytosin
H
N
N
H
N
H
N
N
O
H
N
H
H
N
O
N
N
H
N
N
N
H
N
O
H
H
H
V důsledku vytvoření triplexu na struktuře dsDNA (obr. 12.3) v oblasti promotoru, vlastního
genu nebo v regulačních oblastech, nemůže dojít k iniciaci nebo elongaci transkripce. Tento koncept
byl potvrzen experimenty v podmínkách in vivo, ale jeho přímé využití s sebou přináší i určité
komplikace. Cukr-fosfátová kostra jednotlivých řetězců DNA nese negativní náboj, elektrostatický
odpor dsDNA vůči vstupujícímu oligonukleotidu je tedy značný. Pro praktické aplikace je nesnadné
najít v genomu dlouhé nepřerušované polypurinové sekvence, které by toto odpuzování dokázaly
překonat a vytvořit stabilní triplexovou strukturu. Proto se využívají oligonukleotidy na bázi PNA
(protein nucleic acid), které nenesou žádný povrchový náboj.
Oligonukleotidy schopné tvořit triplexové struktury na dsDNA jsou rovněž vhodným nástrojem
pro místně-specifickou mutagenezi.
Oligonukleotidy
Obr. 12.3: Schématické znázornění triplexu vzniklého v důsledku vazby oligonukleotidu na dsDNA.
Oligonukleotid se váže k dsDNA Hoogsteenovým párováním
dsDNA
sekvence rozpoznávaná
ligonukleotidem
oligonukleotid
Klamné cíle pro transkripční faktory. Transkripční faktory jsou jaderné proteiny, které obvykle
stimulují a sem tam naopak zeslabují genovou expresi vazbou ke specifickým DNA sekvencím
na promotoru nebo do oblastí zesilovačů či zeslabovačů transkripce. Odpovídající klamný cíl pro
transkripční faktor je obdobná sekvence nesená specifickým oligonukleotidem. Jako klamné cíle se
využívají konvenční sekvence pro příslušný transkripční faktor. Ten se potom váže mylně nikoli na
regulované místo, ale na sekvenci umístěnou na oligonukleotidu. To má samozřejmě významný účinek
na genovou expresi (obr. 12.4).
Funkce klamných míst je omezena skutečností, že se na regulaci určitého genu podílí mnoho
transkripčních faktorů, a že jeden transkripční faktor kontroluje více různých genů. Zvláště důležité je
to v těch případech, kdy chceme klamným místem regulovat expresi určitého genu pouze v určité
tkáni.
Klinicky byla strategie klamných cílů evaluována na pacientech s rizikem post-operativní neo-intimální
hyperplasie po transplantaci žilního bypassu. Oligonukleotidy byly vneseny do transplantátů intraoperativně ex vivo transfekcí tlakem. Cílem oligonukleotidů byl transkripční faktor E2F, který reguluje
rodinu genů podílejících se na proliferaci buněk hladkého svalstva. Zatímco preklinické studie naznačovaly
pozitivní léčebný účinek, v klinických zkouškách byly efekty smíšené. Strategie se neosvědčila a tato léčba
nebyla uznána za bezpečnou. V současnosti probíhají klinické zkoušky lokální administrace klamných cílů
NFƙB při léčbě atopické dermatitidy.
Oligonukleotidy
Obr. 12.4: Mechanismus působení klamného cíle pro transkripční faktor
(­) klamný cíl
transkripční faktor
(+) klamný cí\l
klamný cíl
Konvenční sekvence pro vazbu
transkripčního faktoru
Antimediátorová RNA/ribozymy/EGS sekvence. Funkce oligonukleotidů, které působí jako
antimediátorová RNA byla poprvé popsána Zamecnikem a Stephensonem v roce 1978. Práci těchto
autorů lze považovat za první případ terapie založené na oligonukleotidech. Oligonukleotidy založené
na tomto principu se někdy označují jako „klasické“ antimediátorové oligonukleotidy. Jedná se
o jednořetězcové molekuly DNA nebo RNA o délce 13 až 25 nukleotidů. Jsou komplementární
k příslušné mediátorové RNA, se kterou se párují klasickým Watson-Crickovým párováním. Podle
mechanismu účinku lze odlišit tři základní typy oligonukleotidů, které inhibují translaci následujícím
způsobem (obr. 12.5):
1) Oligonukleotidy blokující mRNA, které fyzicky brání nebo inhibují sestřihu nebo translaci tím,
že se váží na komplementární mRNA
2) Oligonukleotidy štěpící mRNA, které iniciují degradaci mRNA vazbou na komplementární
sekvence mRNA a aktivací cytoplasmatické RNázy H
3) Oligonukleotidy štěpící mRNA, které indukují degradaci mRNA aktivací jaderné RNázy P
prostřednictvím sekvencí EGS nebo aktivací nukleázové aktivity samotné nukleové kyseliny
(ribozymy/DNAzymy)
Většina klinicky testovaných antimediátorových oligonukleotidů působí prostřednictvím
RNázy H. „Knock-down“ způsobený RNázou H zpravidla snižuje expresi mRNA a proteinu o více než
80%. Na rozdíl od prostého blokování prostřednictvím oligonukleotidů inhibuje mechanismus
využívající RNázu H expresi proteinů aniž by nutně muselo docházet k restrikci oblasti mRNA, která je
onou cílovou sekvencí. Většina blokujících oligonukleotidů naopak vyžaduje, aby se cílové místo
nacházelo v 5´nepřekládané oblasti nebo v oblasti kodonu AUG; ribozóm je tedy zřejmě schopen
odstranit antimediátorové molekuly, které se nacházejí v kódující oblasti.
Oligonukleotidy
Obr. 12.5: Mechanismus působení oligonukleotidu, který působí na úrovní mRNA. Antimediátorový
oligonukleotid může inhibovat translaci mRNA sterickým zablokováním nebo aktivací
RNázy H, která rozštěpí mRNA. Mechanismus využívající ribozymu nebo DNAzymu vede
k tomu, že mRNA získává enzymatickou funkci, která vyústí v její degradaci. Strategie siRNA
nebo miRNA využívá krátkých molekul dsRNA, které se rozbalí a navážou na mRNA, která je
pak rozštěpena v komplexu RISC.
DNA
mRNA
antimediátorový
oligonukleotid
siRNA
ribozym
štěpení RNázou H
zastavení ribozómu
štěpení v komplexu RISC
Oligonukleotidy
Jedním ze dvou doposud na trh uvedených léčiv na bázi oligonukleotidů je Fomivirsen (obchodní
název Vitravene) určený k léčbě zánětu sítnice vyvolaného cytomegalovirem u pacientů s AIDS.
Fomivirsen je oligonukleotid (21mer o sekvenci 5´- gCg TTT gCT CTT CTT CTT gCg – 3´), který nemá
standardní cukrfosfátovou kostru, ale má nukleotidy spojené fosfothioátovou vazbou, na kterou
nepůsobí nukleázy. Mechanismus účinku spočívá v tom, že tento oligonukleotid navázaný na virovou
mRNA blokuje její translaci. Vitravene se aplikuje intravitreálně v dávkách 165 nebo 330 µg/oko
v roztoku o objemu 25 µl a to 1x týdně po dobu 3 týdnů, a poté ještě dvakrát v jednom týdnu.
Vedlejšími účinky terapie jsou podráždění a zánět oka, což je ale zřejmě důsledek samotné aplikace.
Lék byl licencován FDA v srpnu 1998. Výrobcem je společnost Isis Pharmaceuticals, Inc.
Dalším produktem je Pegaptanib (Macugen). Jedná se o pegylovaný anti-VEGF aptamer,
respektive ssDNA, která se specificky váže k VEGF 165, což je protein, který hraje rozhodující úlohu
v angiogeneze a zvyšuje permeabilitu krevních vlásečnic (tyto dva patologické procesy jsou
zodpovědné za ztrátu zraku při vlhké formě věkem podmíněné makulární degenerace, VPMD).
Pro zvýšení stability aptameru je několik jeho nukleotidů modifikováno 2´-O-methylem a 2´-O-fluorem
a celá struktura je konjugována s polyethylenglykolem, který stabilizuje výslednou molekulu (jedná se
vlastně o siRNA) v roztoku. Macugen se aplikuje intravitreálně. Je to anti-angiogenetikum určené
k léčbě pacientů s vlhkou formou věkem podmíněné makulární degenerace (anglicky age-related
macular degeneration, AMD). Je aplikován v dávce 1,65 mg (z toho je 0,3 mg vlastního aptameru)/oko
v roztoku o objemu 90 µl každých 6 týdnů. Vedlejšími účinky terapie jsou endoftalmitis a krvácivost
oka, což je ale zřejmě důsledek samotné aplikace. Vliv má taky na diabetickou retinopatii. Lék byl
licencován v roce 2000, FDA schválen v roce 2004, výrobcem jsou společnosti EyeTech
Pharmaceuticals (OSI Pharmaceuticals) a Pfizer (mimo USA).
Podrobnosti k oběma oligonukleotidovým produktům lze nalézt na stránkách Evropské lékové
agentury (European Medicines Agency), www.emea.europa.eu.
Ve fázi III klinických zkoušek však v posledních letech skončila celá řada podobných produktů.
Například Alicaforsen nedokázal navodit zmírnění klinických příznaků u pacientů s Crohnovou
chorobou ve srovnání s placebem. Podobně produkty Affinitak (působící na protein kinázu Cα) a
Oblimersen (Genasense, antimediátorový oligonukleotid proti Bcl-2) nebyly úspěšné, co se týče
schopnosti prodloužit dobu přežití u pacientů s nádorovými onemocněními. Nicméně vlastní
zkušenosti z těchto zkoušek poskytly badatelům nový pohled na to, jak aplikovat Alicaforsen a
Genasense a následně byly tyto látky vráceny do klinických testů. V Tabulce 12. 1 je přehled
antimediátorových molekul, které jsou aktuálně v klinických testech.
Ačkoli je sekvenční specifičnost jedním z nejvíce atraktivních rysů oligonukleotidů, které jsou
určeny k aplikacím na bázi antimediátorových struktur, byly popsány i případy, kdy je snížení exprese
dosaženo i u genů příbuzných, tedy genů s neúplnou sekvenční homologií. Kromě toho je např. vliv
Oblimersenu na expresi Bcl-2 jen částečně důsledkem samotného snížení exprese tohoto genu, ale
kromě toho také výsledkem stimulace imunitního systému a aktivace apoptózy mitochondrií tímto
přípravkem. Přitom stimulace imunitního systému a aktivace apoptózy mitochondrií jsou jevy na Bcl-2
nezávislé.
Oligonukleotidy
Tabulka 12. 1: Antimediátorové molekuly v aktuálně probíhajících klinických testech
Název
Genasense
OGX-011
Cíl
Bcl-2
Clusterin
Indikace
Nádor
Nádor
ATL1102
VLA-4
Sclerosis multiplex
LY2181308
LY2275796
Alicaforsen
ISIS 301012
ISIS 113715
Resten
AVI-4065
AVI-4557
Survivin
eIF-4E
ICAM-1
ApoB100
PTP-1B
MYC
RdRP
CYP450 3A4
Nádor
Nádor
Ulcerativní kolitida
Hypercholesterolémie
Diabetes mellitus 2
Restenosis
Virus hepatitidy C
Metabolismus léčiv
LErafAON
c-raf
Ozařování nádoru
Chemismus
thioát
2´ O-MOE*
2´ O-MOE*
2´ O-MOE*
2´ O-MOE*
thioát
2´ O-MOE*
2´ O-MOE*
morpholino
morpholino
morpholino
enkapsulace
v lipozómech
Společnost
Genta
OncoGenex
Antisense
Therapeutics
Eli Lilly
Eli Lilly
Isis
Isis
Isis
AVI Biopharma
AVI Biopharma
AVI Biopharma
NeoPharm
* 2´ O-MOE = 2´-O-methoxy etyl
Ribozymy a DNAzymy jsou molekuly, které mají sekvenci, kterou se váží k mRNA a zároveň
obsahují katalytickou doménu, která molekulu mRNA rozštěpí. Existuje několik různých druhů
ribozymů, např. hammerhead, hairpin, virus hepatitidy delta, satelitní RNA Varkud, introny typu I a II
nebo RNA podjednotka RNázy P. Menší ribozymy typu hammerhead a hairpin sestávají ze 40 až 150
nukleotidů. Další typy ribozymů jsou ale dlouhé stovky nukleotidů a sbalují se do struktur
podobajících se terciárním strukturám proteinů.
Ribozymy už byly využity i v klinických aplikacích. U HIV pacientů byly hematopoetické zárodečné
buňky transformovány ex vivo retrovirovým vektorem, který nesl ribozym anti-HIV-1. Výsledkem
pokusu byly zralé myeloidní a T-lymfoidní buňky, které tento ribozym skutečně exprimovaly. Znamená
to, že použitý koncept by mohl fungovat.
DNAzymy připomínají ribozymy strukturálně i funkčně, ale jsou složeny z deoxyribonukleotidů.
Jsou to ale uměle zkonstruované molekuly, v přírodě nalezeny nebyly. Mechanismus účinku
DNAzymů se podobá účinku ribozymů. Jejich výhodou je levnější příprava, jsou více odolné vůči
degradaci a jsou to efektivnější katalyzátory. Byly využity ve studiích na zvířecích modelech ischemické
choroby srdeční, zánětu a nádoru.
RNáza P je endogenní jaderný ribozym, který má velikost několik set bází. Kvůli této velikosti se
exogenně hůře využívá. Používá se ve spojení s krátkými oligonukleotidy, které fungují jako malé EGC
sekvence, které se váží na mRNA. RNáza P pak takovou strukturu mRNA-EGC rozpozná jako cílovou
sekvenci a rozštěpí ji. Tento koncept ale ještě nebyl vyzkoušen v podmínkách in vivo.
siRNA/miRNA jsou malé dvouřetězcové molekuly o délce 21 až 26 párů bází, které reprimují
genovou expresi mechanismem tzv. RNA interference. Od objevu mechanismu RNA interference
v roce 1998 došlo na tomto poli k rychlému rozvoji a v současné době je klinicky testováno několik
produktů na bázi molekul miRNA nebo siRNA. Vývojem léčiv na této bázi se zabývají např. společnosti
Oligonukleotidy
Acuity Pharmaceuticals a Sirna Therapeutics Inc., které vyvíjejí produkty pro léčbu makulární
degenerace. Oba jsou založeny na inhibici proteinu VEGF a pracovně se nazývají Cand5 a siRNA-027.
Společnost Alnylam Pharmaceuticals zahájila klinické testování léku ALN-RSV-01, který má inhibovat
geny respiračně-syncyciálního viru.
12.3. Přímá vazba k nenukleovým kyselinám
Schopnost nukleových kyselin sbalovat se do složitých trojrozměrných struktur v oblastech
s alespoň částečnou komplementaritou jim umožňuje vázat se teoreticky k jakékoli molekule a to
s vysokou afinitou. Takové molekuly jsou také extrémně specifické. Např. sekvence na nukleové
kyselině, která se specificky váže k theofylinu má k této molekule milionkrát vyšší afinitu než
ke kafeinu; theofylin a kafein se přitom liší jedinou methylovou skupinou.
Jednořetězcové DNA nebo RNA oligonukleotidy o délce kolem 60 nukleotidů, které se sbalují
do dobře definované trojrozměrné struktury, se označují jako aptamery nebo ribopřepínače
(riboswitch). Vážou se k cílovým molekulám díky komplementaritě ve tvaru příslušné struktury a to
prostřednictvím interakcí založených na náboji a hydrofobicitě a na vodíkových můstcích. Cílovými
strukturami mohou být malé molekuly nebo makromolekuly. Aptamery jsou uměle syntetizované
molekuly, kdežto ribopřepínače jsou přirozeně se vyskytující struktury. Ribopřepínače regulují
genovou expresi u prokaryot, ale jsou také přepisovány z virových genů, váží se s vysokou afinitou a
specifičností na virové nebo buněčné proteiny a modulují aktivitu proteinů podílejících se na replikaci
virů nebo inhibují aktivitu proteinů, které se účastní procesů buněčné odpovědi na virovou infekci.
Aptamery se připravují specifickým postupem označovaným jako SELEX (systematic evolution of
ligands by exponential enrichment) popsaným na obr. 12.6. Příprava aptameru začíná tvorbou velké
knihovny nahodilých sekvencí RNA. Taková knihovna obsahuje až 1015 různých molekul nukleových
kyselin, které se sbalují do různých struktur v závislosti na sekvenci. Knihovna je pak inkubována
s testovanou proteinovou strukturou a ty RNA, které se k proteinu navážou, jsou odděleny
od ostatních, nenavázaných. Získané molekuly RNA jsou pak amplifikovány zpětně-transkriptázovou
PCR a přepsány in vitro, čímž se vytvoří pool RNA obohacený právě o ty RNA, které se vážou
na cílovou strukturu. Tento selekční a amplifikační proces se opakuje obvykle 8-12x za podmínek, při
kterých se postupně zvyšuje jejich přísnost ( stringency) a tímto procesem simulované Darwinistické
selekce se vyprodukují RNA ligandy s nejvyšší afinitou k cílové proteinové struktuře. Tento
„evoluční“ proces může být aplikován taky na DNA, čímž se obejdou kroky RT-PCR a transkripce
in vitro. Dnes je proces tvorby aptamerů plně automatizován, takže namísto dlouhých měsíců trvá jen
několik dnů. Aptamery se pochopitelně mohou vázat na terapeutické proteiny, jako to dělají např.
protilátky. Selekce protilátek ale musí probíhat v živém systému. Naproti tomu aptamery vznikají
chemickým procesem a mohou být připraveny prakticky pro jakýkoli protein. Na rozdíl od protilátek
jsou aptamery náchylné vázat se k funkčním doménám cílových proteinů, jako jsou místa pro vazbu
substrátu nebo alosterická místa a mohou tak modulovat biologickou funkci molekuly. Proč se
aptamery preferenčně vážou k funkčním doménám, není jasné. Obecným problémem pro přípravu
terapeutických aptamerů je to, že jsou tak specifické, že aptamery připravené proti lidským proteinům
nemohou efektivně fungovat s ortology modelových zvířat, což znemožňuje preklinická testování.
Výše zmíněný Pegaptanib je taky aptamer.
Oligonukleotidy
Obr. 12.6: Genotypizace in situ s využitím tzv. „padlock“ sond a amplifikace mechanismem otáčivé
kružnice (rolling circle amplification, RCA). Po fixaci buněk je genomová DNA rozštěpena;
působením restriktázy a 5´-exonukleázy vznikne jednořetězcová struktura. „Padlock“ sonda
se připojí k cílové sekvenci a je cirkularizována spojením konců ligázou. K amplifikaci je pak
využita jako primer cílová sekvence poté, co byly její přečnívající 3´-konce odstraněny
3´-exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy. Tímto způsobem jsou v průběhu replikace
ke 3´-konci genomové DNA připojovány mnohanásobné kopie sondy. Pokud jsou použité
oligonukleotidy značeny fluorescenčně, je možné sledovat pozici 3´-konce přímo v buňkách.
Citlivost metody je tak vysoká, že lze odhalit jedinou molekulu DNA.
G/A
G/A
Vytvoření ssDNA restriktázou a 5´exonukleázou
A
G
Hybridizace sondy
a ligace
A
G
3´-exonukleolýza
A
G
RCA a hybridizace
sondy
Oligonukleotidy
12.4. Reparace genů
Oligonukleotidy tvořící triplexy byly použity k místně-specifické mutagenezi v experimentech,
při kterých byly současně použity mutageny i v pokusech, kdy mutageny použity nebyly. Tento typ
oligonukleotidů byl také testován s cílem opravit genetické poškození, a to buďto samostatně nebo
v kombinaci s donorovým fragmentem k poškozenému lokusu, tedy v podmínkách homologické
místně-specifické rekombinace. Přesné funkci těchto reparačních mechanismů ale stále dostatečně
nerozumíme a kromě toho byly frekvence mutageneze nebo korekce genů stále ještě velmi nízké,
méně než 0,1%, což neumožňuje klinické testy.
Antimediátory indukovaný alternativní sestřih je technika, která má za cíl restaurovat čtecí
rámec tím, že je uměle odstraněn jeden nebo více exonů poté, co byla ve strukturním genu vytvořena
delece nebo bodová mutace. Nejčastěji používaným modelem je Duchennova muskulární dystrofie;
alternativním sestřihem by toto onemocnění mohlo být změněno na mnohem mírnější Beckerovu
dystrofii.
Při této metodě je využívána antimediátorová RNA, která se váže uvnitř nebo po stranách exonu,
který má být z výsledné mRNA odstraněn. Vzniklý duplex pak interferuje s mechanismem sestřihu a
dojde k vyloučení „postižené části“ hnRNA.
V případě Duchennovy dystrofie jsou odstraňovány ty části mRNA, které kódují centrální oblast
dystrofinu. Ty nejsou pro funkci proteinu nezbytné, protože i zkrácený protein ještě funguje
uspokojivě a zajišťuje stabilizaci membrány svalových buněk; jedinci s kratší formou dystrofinu trpí
onou mírnější Beckerovou dystrofií. Po úspěšných testech na myších a psech byly zahájeny klinické
testy na 12 pacientech.
Antimediátory indukovaná inhibice ribonukleoproteinu je další přístup, který využívá specifické
vazby oligonukleotidu k RNA části ribonukleoproteinových enzymů. Takovým enzymem je například
telomeráza. Pokusy s oligonukleotidy zaměřené na vazbu k hTERT doméně telomerázy vedly
k progresívnímu zkrácení konců telomér a v některých případech navodily apoptózu. Telomeráza je
aktivní u celé řady nádorů, proto by inhibice telomerázy mohla být účinná při jejich léčbě.
Metoda byla použita taky k programovanému přesmyku čtecího rámce na úrovni ribozomu a
tvorbě různých proteinů z jednoho čtecího rámce.
12.5. Stimulace imunitní odpovědi
Určité rozdíly v chemické struktuře genetické informace patogenních mikroorganismů a savců
jsou základem rozpoznávacích signálů pro aktivaci imunitního signálu. Savčí buňky obsahují specifické
receptory, které rozpoznávají patogenní DNA nebo RNA, jejichž přítomnost aktivuje sérii specifických
reakcí. Výsledná prozánětlivá aktivace představuje potenciál pro aplikace antivirové, aktivace
imunitního systému pak nástroj pro vývoj adjuvans nebo pro oblast protinádorové terapie.
Prokaryotická DNA má např. vysoký obsah dinukleotidů CpG, savčí jich má naopak málo a ještě
jsou zpravidla metylované. Syntetické oligonukleotidy s CpG motivy tak mohou simulovat
prokaryotickou DNA a navodit imunologickou reakci. Sekvence CpG představuje silný rozpoznávací
signál pro buňky prostřednictví Toll-like receptoru 9 v endozómech, navozuje proliferaci B lymfocytů a
aktivaci buněk myeloidní linie. Existují dva přípravky, které fungují na tomto principu. Přípravek
Oligonukleotidy
CPG 7909 je v současné době klinicky testován v léčbě nádorů. Preparát CPG 10101, který indukuje
interferon α, byl vyvinut firmou Coley Pharmaceutical Group Inc. jako antivirotikum proti viru
hepatitidy C. Stejná firma vyvíjí přípravek VaxImmune, který má podporovat samotný vakcinační
postup; princip účinku je stejný.
Dvouřetězcová dsRNA je jasným signálem přítomnosti viru a je rozpoznávána Toll-like
receptorem 3 v endozómech. Silným aktivátorem imunitní odpovědi je například syntetická dsRNA
složená z kyseliny polyinositolové a pylycytidylové (poly-IC). Je klinicky testována jako poly-ICLC
(Hiltonol) společností Oncovir Inc. Aby nedošlo k destrukci poly-IC vnitrobuněčnými nukleázami, je
tento přípravek aplikován v komplexu s polylysinem. Předpokládá se využití poly-ICLC samostatně
nebo spolu s podporou chemoterapie v léčbě pacientů s gliomem.
12.6. Farmakokinetika terapeutik založených na oligonukleotidech
Farmakokinetické studie na různých typech oligonukleotidů prokázaly, že oligonukleotidy jsou
z parenterálních míst rychle absorbovány. Po intradermální injekci může dostupnost oligonukleotidů
dosahovat až 90%. Při orální aplikaci je ale absorpce velmi nízká, což je asi dáno velkou molekulovou
hmotností těchto molekul, velkými náboji při fyziologickém pH a omezenou stabilitou
v gastrointestinálním traktu kvůli štěpení nukleázami.
Oligonukleotidy jsou distribuovány v periferních tkáních; k jejich nejvyššímu nahromadění
dochází v játrech, ledvinách, kostní tkáni, kosterním svalstvu a kůži. Nebyl prokázán prostup přes
krevní mozkovou bariéru. Distribuce je často rychlá, s poločasem méně než hodinu.
Oligonukleotidy mají molekulovou hmotnost kolem 10 000 až 13 000, což je z hlediska jejich
odbourávání malá hodnota. Proto jsou za normálních okolností z cirkulace rychle odstraňovány přes
renální filtraci; poločas rozpadu v plasmě je menší než 10 minut. Mnoho typů oligonukleotidů, zvláště
ty, které mají fosfothoiátovou kostru, se ve velké míře váže na plasmatické proteiny, které je chrání
před renální filtrací a jejich poločas rozpadu v plasmě se prodlužuje. Renální filtraci lze zabránit
modifikací oligonukleotidů velkými molekulami, jako je polyethylenglykol nebo takovými
modifikacemi, které neovlivňují jejich funkci.
Vedle renální eliminace hrají roli v odbourávání oligonukleotidů taky exonukleázy a
endonukleázy. Tento mechanismus hraje dominantní úlohu u oligonukleotidů distribuovaných
v periferních tkáních nebo u těch, které byly ochráněny před renální eliminací.
12.7. Stabilizace oligonukleotidů
Oligonukleotidy lze stabilizovat především modifikací jejich základní cukrfosfátové kostry. První
generací analog vyvinutou již v 60. letech 20. století byly fosfothioáty, ve kterých je jeden z kyslíků,
který se přímo nepodílí na tvorbě fosfodiesterové vazby, nahrazen sírou (obr. 12. 1). Jsou stabilnější
v séru, ale váží se také více k proteinům, mají zvýšenou toxicitu. Poločas rozpadu takto
modifikovaných oligonukleotidů v séru je 40-60 hodin, pravděpodobně v důsledku snížené renální
exkrece.
Druhá generace modifikovaných oligonukleotidů obsahovala alkyl na uhlíku C2´ ribózy
(obr. 12. 1). Nejsou tak toxické jako fosfothioáty, jejich nevýhodou ale je, že jsou slabým substrátem
Oligonukleotidy
pro RNázu H a mohou tedy inhibovat translaci pouze tvorbou sterických zábran. Deriváty s 2´-O-(2methoxyethylenem) jsou ale v plasmě a tkáních extrémně stabilní, s poločasem rozpadu až 30 dnů. Je
to zřejmě dáno jejich vysokou rezistencí k nukleázám.
Třetí generace tvoří skupina sloučenin s různými modifikacemi (obr. 12. 1), které mají zvýšenou
stabilitu, zlepšené farmakokinetické vlastnosti a interakce s RNA. Jedním z příkladů jsou PNA (protein
nucleic acid), které mají polyaminovou kostru, LNA (locked nucleic acid) s methylenovým můstkem
mezi kyslíkem na C2´ribózy a uhlíkem C4´nebo morpholino nukleové kyseliny, které obsahují
neiontovou morfolinovou subjednotku namísto ribózy; subjednotky jsou spojeny fosfoamidovou
vazbou. Všechny modifikace třetí generace mají vynikající stabilitu a RNA vazebné vlastnosti, ale
nejsou schopny aktivovat RNázu H. Chiméry třetí generace oligonukleotidů s DNA mají dobrou
stabilitu a efektivně aktivují RNázu H.
Rovněž ribozymy a aptamery jsou modifikovány se stejným cílem: zvýšit stabilitu a rezistenci
k nukleázám. I v tomto případě je to na úkor ztráty enzymatické nebo vazebné aktivity. Důsledky
modifikací na stabilitu a aktivitu ribozymů a aptamerů jsou většinou stanoveny empiricky. Poločas
rozpadu DNA ribozymu v séru může být zvýšen 10x tím, že je 3´-konec ochráněn invertovanými
nukleotidy.
Stabilita siRNA v buněčné kultuře a séru není zpravidla limitujícím faktorem, protože RNáza A,
která siRNA štěpí, není tepelně stabilní. Modifikace, které mají chránit siRNA před vnitrobuněčnými
nukleázami, spočívají v začlenění modifikovaných nukleotidů na některý z konců siRNA. Množství a
chemická povaha modifikovaných nukleotidů mohou ovlivnit efektivitu účinku siRNA. Molekuly siRNA
jsou zpravidla rychle odbourány.
12.8. Zlepšení příjmu oligonukleotidů buňkami
Problémem terapeutických aplikací oligonukleotidů je vedle metabolické eliminace nukleázami
taky jejich špatný příjem samotnými buňkami. Ve srovnání s konvenčními léčivy jsou oligonukleotidy
relativně velké a nabité, takže je jejich průchod buněčnou membránou prakticky nemožný. Zvýšit
příjem oligonukleotidů lze fyzikálními metodami, chemickou modifikací nebo pomocí specializovaných
transportních systémů.
Příjem oligonukleotidů zvyšuje elektroporace tkáně po jejich lokální injekci. Při elektroporaci
dochází v důsledku vysokonapěťových pulsů k přechodné perforaci buněčných membrán a vzniklými
póry prostupují nukleotidy do cytosolu. Tuto techniku lze ale využít jen pro některé tkáně, např. kůži,
kosterní svalstvo nebo povrchové nádory.
Alternativní strategií je naroubování kationtů na oligonukleotidy, čímž dochází ke snížení
odpudivých sil mezi nukleotidy a buněčnou membránou. Např. nukleotidy s napojenými guanidiovými
ionty jsou internalizovány endocytózou.
Jiný přístup představuje využití tzv. CPP peptidů (cell-penetrating peptides), které po konjugaci
s oligonukleotidy posilují jejich transport přes membránu. CPP jsou malé bazické peptidy, které jsou
odvozené od proteinových transdukčních domén, které se nacházejí v různých proteinech a mají silné
translokační vlastnosti. CPP proteiny označované jako „transportanty“ byly úspěšně využity
k transportu PNA.
K transportu, příjmu a následnému uspání genů prostřednictvím siRNA byly úspěšně využity
Oligonukleotidy
modifikace lipidy. Konkrétně to byla siRNA proti mRNA pro apoB, k jejímuž 3´-konci pozitivního
řetězce byl připojen cholesterol; působením této siRNA došlo k uspání genu kódujícího
apolipoprotein B.
Většina transportních systémů využívá tvorby komplexu oligonukleotidů s kationty, nejčastěji
s kationtovými lipidy (např. Lipofectamin). Tvorba komplexů má dvě funkce: chrání oligonukleotidy
před působením nukleáz a zesiluje jejich internacionalizaci v buňce. S využitím polyethylenglykolu
mohou být na povrchu vystaveny specifické ligandy a to umožňuje zacílení oligonukleotidu
do specifických buněk. Tento postup byl využit např. pro transport siRNA do angiogenních
vaskulárních buněk endotelu. Zacílení oligonukleotidu lze dosáhnout jeho kovalentním spojením
s protilátkami. Tímto způsobem byla transportována PNA konjugovaná s monoklonální protilátkou
proti receptoru anti-transferinu přes krevní mozkovou bariéru.
12.9. Diagnostické aplikace
Oligonukleotidy nacházejí uplatnění v medicíně nejen jako terapeutika, ale také jako diagnostické
látky. Schopnosti vysoce specifického párování oligonukleotidů s cílovými sekvencemi bylo využito
k detekci genové exprese nebo i mutací. Aptamerů lze využít k ověření přítomnosti specifických látek.
V souvislosti s oligonukleotidy lze zmínit také aplikace na bázi PCR nebo DNA microarraye. Prvním
diagnostickým čipem schváleným FDA pro klinické účely byl v roce 2004 AmpliChip CYP450. Tento čip
pokrývá variace genů, včetně duplikací a delecí, enzymů 2D6 a 2C19 cytochromu P450. Tyto geny se
podílejí na metabolismu přibližně 25% předepisovaných léků, proto je podrobná znalost genetických
variant v příslušných lokusech důležitým krokem směrem k personalizované medicíně.
Ačkoli mohou být aptamery využity k detekci molekul spojených s onemocněním podobně jako
protilátky, takové uplatnění doposud v klinické praxi nenašly.
Tzv. uzamčené sondy (padlock probes) sestávají z dlouhých oligonukleotidů, jejichž konce jsou
komplementární k připojeným cílovým sekvencím. Po hybridizaci se tyto konce dostanou k sobě, což
umožní ligaci konců oligonukleotidu s uzavřenou a propletenou kružnicí, která nemůže být nahrazena
komplementárním DNA řetězcem. Tyto uzavřené kružnice jsou pak amplifikovány mechanismem
otáčivé kružnice pomocí DNA polymerázy z fága φ29 (obr. 12. 6). Tento typ sond má vyšší specifičnost
než standardní oligonukleotidy, protože když se alespoň jeden z konců sondy správně nepřipojí,
nevznikne kružnicová molekula a nemůže dojít k amplifikaci. Uzamčené sondy byly využity k detekci
patogenů v biologickém materiálu, pro stanovení nukleotidových polymorfismů a miRNA, ale i
ke genotypizaci in situ.

Podobné dokumenty

textová verze přednášky

textová verze přednášky Progenitorové buňky se nacházejí ve fetálních a dospělých tkáních a jsou to již buňky částečně specializované. Na rozdíl od somatických kmenových buněk, které se dělí pomalu, asymetricky a při děle...

Více

Životopis doc. MUDr. Petra Svobody, CSc

Životopis doc. MUDr. Petra Svobody, CSc Jsem hlavním řešitelem 9 grantových projektů převáţně IGA MZ, ale i mezinárodních grantů; všechny ukončené byly obhájeny s hodnocením A nebo B. Jako hlavní vyšetřující jsem vedl v centru nebo jako ...

Více

prof.Špičák - Lékárnické dny

prof.Špičák - Lékárnické dny – Astma pod kontrolou – Astma pod částečnou kontrolou – Astma pod nedostatečnou kontrolou

Více

Genomika - evoluce vznik života

Genomika - evoluce vznik života Odvozené typy:  RNA složka RNasy P jiných organismů

Více

chorus u1-70 rnp ref 86088 ref 86088/12

chorus u1-70 rnp ref 86088 ref 86088/12 částečka, složená z malé jaderné RNA bohaté na uridin, (odtud U) a skupiny proteinů: 70 kDa U1-specifického ribonukleoproteinu a proteinů A a C (všechny dohromady dříve označovány jako RNP) a Sm (S...

Více

10-Aplikace biotechnologii ve farmacii

10-Aplikace biotechnologii ve farmacii  5´- gCg TTT gCT CTT CTT CTT gCg – 3´  nukleotidy spojené fosforothionátovou vazbou (rezistence k nukleázám)  blokuje translaci virové mRNA

Více

Prezentace aplikace PowerPoint

Prezentace aplikace PowerPoint Aminopterin Dusíkatý yperit

Více

Selekční znak - farmaceuticka

Selekční znak - farmaceuticka  rezistentní vůči Ostrinia nubilalis  tolerantní ke glufosinátu amonnému (nese gen kódující fosfinothricin-N-acetyltransferasu (PAT) ze Streptomyces viridochromogenes)

Více

Combi PPP Master Mix - Top-Bio

Combi PPP Master Mix - Top-Bio teplotám, (2) reverzibilnímu účinku na Taq polymerázu a (3) zvýšené chemické definovanosti Master Mixu. Master Mix  není vhodný pro aplikace, které využívají fluorescenční DNA sondy pro detekci mno...

Více