Úvodní materiál o dvoufotonovém mikroskopu

Know-how 2p
(04/2010 - 02/2012)
Úvod
Dvoufotonová laserová skenovací mikroskopie je věc poměrně nová a má toho ještě mnoho
co nabídnout. Její hlavní využití je pro calcium imaging in vivo 1. Oproti elektrofyziologickým
metodám je nutné zaplatit daň v podobě horšího časového rozlišení. Dvoufotonová
mikroskopie in vivo ale přináší více než dostatečnou náhradu v podobě submikronového
rozlišení umožňujícího dokonalou identifikaci daného neuronu a jeho prostorového kontextu a
to až do hloubky2 1000 μm (více jak tloušťka kůry myši). Navíc lze metody kombinovat a při
měření Ca zapojit i metody elektrofyziologické, ať už patch-clamp in vivo 3,4, či alespoň
loose-patch5. Doufotonovou mikroskopií je možné vizualizovat i buňky primárně elektricky
neaktivní, např. astrocyty6. Kromě dalších výhod tato metoda také umožňuje využít
obrovského arzenálu vyvinutého molekulárními genetiky za posledních 20 let7 (exprese
různých fluorescenčních proteinů pod různými promotory - identifikace podtypů neuronů,
Cre/Lox systém, transpozony - brainbow myši8).
Mikroskop od PrairieTech je velmi dobrá a schopná mašina. O laseru Coherent Chameleon se
to ohledně jeho spolehlivosti už tak úplně říct nedá, ale i ten se dá k funkčnosti různými triky
přesvědčit a parametry má excelentní. Hardware je tedy k dispozici, software píšeme s
Jakubem (hlavní páteř je již napsaná - funkční) a know-how, které jsem často bolestivě
svépomocí (v České republice je to zcela nová metoda) a mnohdy frustrujícím způsobem
získával za poslední rok a půl, je předmětem tohoto textu. Z teorie vysvětlím hlavní části,
zbytek je na wiki, neváhejte ji použít.
Rutinně fungující experiment tohoto typu a pěkné publikace z něj vycházející mohou
zúčastněným experimentátorům i jejich mateřskému oddělení a domu AV ČR velmi pomoci
zvednout prestiž a realizovat touhu po poznání. Metoda je to mocná, invenci a entuziazmu se
meze nekladou. Byla by blbost toho nevyužít.
Teorie TPLSM (Two-photon laser scanning microscopy)
Fluoroscenční sondy, značky a proteiny
Dvoufotonová mikroskopie je velmi speciálním případem fluorescenční. Nejprve tedy od
začátku.Fluorescenční mikroskopie obecně využívá látek, tzv. fluoroforů. Ty jsou tvořeny
molekulami schopnými absorbovat foton elektromagnetického záření, kde daný foton excituje
elektron-vibrační stav molekuly fluoroforu (viz následující obrázek tzv. Jablonskiho diagrammodrá šipka). Foton molekulu typicky excituje do stavu, který je 2. elektronovým (tlustší
černé čáry v obrázku) a obecně n-tým vibračním. Nejprve následuje takzvaně vibrační
nezářivá deexcitace (šedá vlnovka). Toto se děje velmi rychle, asi o tři řády rychleji, než
poslední proces - zářivá deexcitace (červená šipka), která tak určuje rychlost celého procesu.
Přesto je třeba zdůraznit, že i ona deexcitace je velmi rychlá ~ 10-8 s.
Jablonski diagram jednofotonové excitace fluoroforu.
K uvedenému Jablonskiho diagramu je potřeba zmínit ještě dvě velmi důležité věci. Excitace
(modrá šipka) může principiálně proběhnout do kteréhokoli vyššího elektron-vibračního stavu
Modrá šipka tak může končit na kterékoli tenké šedé lince (vibrační stavy) nad vyšší tlustou
černou linkou (první excitovaný elektronový stav). Kdybychom si vynášeli graf absorpce
fluoroforu na použité excitační vlnové délce, nebyl by tam jeden pík, ale celá řada, kde
některé z nich by byly výraznější a jiné méně. Velikost a pozice píků v takovém grafu
odpovídá pravděpodobnosti, s jakou takový přechod může nastat, a vzdálenosti energetických
stavů v molekule fluoroforu, což jsou zase veličiny dáné aktuálním rozložením atomů a
elektronů molekuly daného fluoroforu (souvisí s konformací). Uvážíme-li, že molekula může
nabývat různých konformací (rotační vazby), píky se tak "rozmlží" až se z uvažovaného grafu
stane poměrně hladký "kopec", viz následující obrázek spekter DAPI (modrá křivka).
Excitační a emisní spektrum fluorescenční sondy DAPI.
Stejná situace nastává v případě fluorescenční emise, kde elektron-vibrační stav molekuly
přechází z prvního elektronově excitovaného a základního vibračního stavu do stavu
elektronově základního a vibračního dle libosti. Opět by se měli objevit píky různé velikosti a
různé pozice odpovídající pravděpodobnostem a rozdílům energií, které závisejí na
konformaci. Opět jsou rozmazány tepelnými pohyby a různými konformacemi (středuje se nikdy nesledujeme pouhou jednu molekulu ale jejich obrovské počty) - červená křivka v
obrázku výše. Křivkám v obrázku se říká excitační a emisní spektrum.
Jistě vám neuniklo, že excitační křivka je v podobných grafech vždy vlevo, tedy u kratších
vlnových délek - tedy vyšších energií fotonů. Říká se tomu Stokesův posuv a je to celkem
intuitivně pochopitelné z Jablonskiho diagramu. Všimněte si, že když budete zkoušet různé
kombinace, kam mohou excitační a emisní šipky jít, tak excitační šipka bude vždy delší než
šipka emisní (pouze v jedné kombinaci budou stejné). Délka šipky odpovídá velikosti energie
daného fotonu, který se účastní procesu. Jak jsem již uvedl, do situace se dále míchá tepelný
pohyb a různé konformace, mezi kterými sonda přechází. To jednak vysvětluje hladkost grafu
a také drobný možný překryv v místě, kde se křivky setkávají.
Využití fluorescence v mikroskopii přineslo revoluci. Magické možnosti s ní spojené jsou
kontrast, afinita a citlivost na vlastní okolí fluorescenční molekuly. Vybrané molekuly
schopné fluorescence přinášející vyjmenované možnosti označujeme jako fluorescenční
sondy, pakliže nejsou k cílené struktuře vázány kovalentně, resp. jako fluorescenční značky,
pakliže k sledované struktuře jsou navázány kovalentně.
Kontrast.
Je dobré si uvědomit, co byste viděli v nativním brightfield uspořádání na živé intaktní buňce
v kultuře, resp. v řezu. Prakticky nic. To proto, že ta buňka je samá voda a tu a tam nějaká
membrána, což nemá moc odlišný index lomu a extinkční koeficient (klíčové pro kontrast
brightfield) od okolního média. Oproti tomu když buňka bude nějakým způsobem vyplněna
fluorescenční barvou a užijete fluorescenční mikroskopii, uvidíte nádherně celou morfologii
do nejmenších detailů, protože kontrastní rozdíl na krajích bude obrovský.
Ukázka rozdílu mezi brightfield zobrazením a použitím fluorescenční mikroskopie
Afinita
To je výhra sama o sobě. Uvažte takovou modře fluoreskující DAPI, to je v roztoku kladně
nabitá molekula, která ze své podstaty vyhledává záporný náboj. Nejvíce záporného náboje v
buňce je tam, kde jsou kyseliny (zbaví se svých protonů a zbude jim O -). Nejvíce kyseliny je
samozřejmě v jádře v podobě fosfátové páteře DNA. Lze tak očekávat, že buňky, ke kterým
byla přidána barva DAPI budou mít ve fluorescenčním modu modře svítící jádra. A taky že
ano! K tomu velmi pěkně ohraničena a kontrastní vůči zbytku buňky (následující obrázek).
Podobné úvahy lze rozvíjet dále - například lipofilní fluorescenční sondy budou barvit
membránu atd...
Ukázka buňky barvené DAPI, která je napadena toxoplasmou (zelené buňky).
Citlivost sondy na své okolí
Pod pojmem "okolí" si lze představit celou řadu fyzikálně-chemických parametrů, např.
přítomnost kationtů/aniontů (sondy na kladný/záporný náboj), přítomnost konkrétního
kationtu/aniontu (sondy na Na+, K+, Ca2+, H+ tedy pH, Cl- atd..), teplota, polarita prostředí,
membránový potenciál atd.
Má-li fluorescenční sonda být na něco citlivá, musí nějakým způsobem v případě
přítomnosti/nepřítomnosti (navázání/nenavázání) detekované veličiny (iontu) změnit svůj
fluorescenční projev. V jakých parametrech se konkrétní fluorescenční projev může změnit?
Například ve tvaru excitačního spektra, v tvaru emisního spektra, ve "velikosti" emisního
spektra při zachování konstantní excitace atd. (existují i další parametry, které se běžně
nevyužívají). Všechny jmenované atributy fluorescence dané fluorescenční sondy souvisí
především se změnou rozmístění elektronové hustoty a konformační změnou fluoroforu po
navázání/detekci daného iontu/veličiny.
Velmi konkrétním příkladem budiž OGB-1, kterou používáme (následující obrázek-vpravo).
Molekula OGB-1 je složenina z fluoresceinového derivátu a Ca2+ chelátoru.
Na obrázku vpravo je strukturní vzorec celé sondy OGB-1. Horní část (nad amidovou vazbou)
je část fluorescenční. Znalému oku to připomene fluorescein. Spodní část (pod amidovou
vazbou) je chelátor vápníku, tzb. BAPTA. Chelaci vápníku částí BAPTA je možné pozorovat
na levé části obrázku. Princip je tedy takový, že po navázání vápníku se "zkroutí" část
BAPTA, čímž lehce změní konformaci a rozložení elektronové hustoty celé molekuly OGB,
tedy včetně její fluorescenční části, a následně se tak změní charakter fluorescence dané
molekuly. Molekula bude tedy rozlišovat stavy s navázaným vápníkem a bez navázaného
vápníku. Kde mezi těmito dvěma stavy bude dynamická rovnováha a populovanost
jednotlivých stavů bude dána dostupností vápníku, tedy jeho koncentrací v okolí sondy.
Budeme-li tuto koncentraci měnit, bude se nám tedy i měnit celková fluorescence molekul v
roztoku resp. buňce, jak lze vidět na následujícím grafu.
Emisní spektrum sondy OGB-1 v závislosti na koncentraci kalcia; konstantní intenzita excitace.
Tento graf vznikl tak, že měli OGB-1 v kyvetách s definovanou koncentrací Ca 2+. Dělat
kalibrovaná kvantitativní měření pomocí fluorescenčních sond v buňkách je extrémně obtížné
(vnitřní koncentrace se nastavuje pomocí koncentrace extracelulární a nucené permeabilizace
membrány - je jasné, že vyvstává celá řada problémů), v buňkách in vivo kvantitativní měření
iontů pomocí fluorescenčních sond je mission impossible. Pro nás budiž důležité, že je vztah
koncentrace kalcia a míry emise positivně korelován. Okolo fyziologických koncentrací velmi
zhruba lineární.
Pro dvoustavovou sondu jako je např. OGB-1 je důležité jedno číslo - tzv. Kd, které určuje při
jaké koncentraci cílového iontu je populovanost stavu 1:1. Čím menší je tedy toto číslo, tím
vyšší má sonda afinitu k danému iontu. Kd také zhruba udává střed použitelného
dynamického rozsahu sondy, což je potřeba vážit při volbě sondy dle typu experimentu.
OGB-1 má Kd cca 170 nM.
Jak je zařízena specifita dané sondy na konkrétní iont. Např. Ca2+ vs Mg 2+ nebo K+ vs Na+,
když náboje jsou stejné? Není ale stejná velikost takového inontu a specifitu tedy lze učinně
zařídit velikostí kavity, kde je iont koordinován, kam se iont do sondy váže. Například u
OGB-1 délka vazeb a možné úhly rotace v části BAPTA zaručují účinné obejmutí
dvoumocného kationtu velikosti Ca2+, ale již s mnohem menší afinitou je do příslušné kavity
vázán mangan. Takže sonda skutečně poměrně slušně reflektuje koncentraci volného vápníku.
Mechanismy, prostřednictvím kterých jsou jiné sondy citlivé na jiné veličiny, rád vysvětlím
při nějakém obědě či kávě.
Všechny fluorescenční molekuly, které jsem zatím dával za příklad, byly syntetického
původu, tedy cíleně designované a uvařené chemiky ve zkumavce. Spousta takovýchto sond
je komerčně dostupných (invitrogen.com). Co ale znamenalo další dříve nemyslitelný přelom
ve fluorescenční mikroskopii, bylo objevení, využití a cílené mutování fluorescenčních
proteinů 9.
Ve spojení s genetickým inženýrstvím ihned plyne celá řada možností. Exprese pod
specifickým promotorem může ukazovat zapnutí tohoto promotoru (GAD67 knock-in) a
odlišovat tak různé buněčné typy. Fůze genu pro fluorescenční protein a genu pro tubulin
(krásně nabarvený cytoskelet v učebnicových obrázcích - v tomto případě je fluorescenční
protein z definice značkou) může odhalovat strukturu a morfologii. Fluorescenční proteiny ale
také mohou být citlivé na atributy svého okolí, například na koncentraci určitého iontu.
Přesněji se povětšinou nejedná o fluorescenční protein samotný ale o jeho fůzi s jiným
proteinem, který má schopnost daný iont vázat. Ano, design je opět stejný jako u syntetických
fluorescenčních sond, tedy složení fluorescenční části a senzitivní části kde po navázání iontu
na senzitivní část následuje změna konformace a elektronové hustota senzitivní části a tím i
celého proteinu (noFRET sondy), a nebou alespoň taková změna konformace sezitivní části,
kdy je dostatečně změněna vzdálenost distálních částí, kde jsou navázané různé fluorescenční
proteiny (FRET sondy). FRET najdete na wiki. Fluorescenční částí jsou zde různé druhy
fluorescenčních proteinů GFP, RFP, YFP, CFP, DsRed atd. senzitivní částí je pak např. pro
vápník calmodulin resp. troponin C.
Jako příklad je na následujícím obrázku ukázaná noFRET sonda GCaMP3, která umožňuje
sledovat kalciovou dynamiku in vivo.
GCaMP3
Mikroskopické techniky
Už jsem zmínil odlišnost brightfield a fluorescenční mikroskopie. Je vhodné ale dodat, že
fluorescenční mikroskopie na živých buňkách vždy znamená jistou míru invazivity, tedy
alespoň z důvodu, že v buňce se objeví cizorodá molekula, která se samotnou buňkou může a
nemusí negativně interagovat. Např. DAPI může ovlivňovat jaderné procesy, vysoká
koncentrace sondy OGB-1 může pozměňovat dynamiku kalcia v buňce, protože její
chelatační schopnosti z ní dělají kalciový pufr, v případě knock-in GFP pod promotorem
GAD67 se ukázalo, že je narušen inhibiční systém, VoltageSensitiveDyes jsou pro buňku již v
nevelké koncentraci jedovaté, protože narušují její membránu atd. Ano, fluorescenční
mikroskopie je revoluce, ale vždy je potřeba vážit, jak moc do systému zasahujeme! V tomto
ohledu poměrně intaktní brightfield má stále svoje uplatnění in vitro. In vivo je brightfield
nonsens, takže dále se budu zmiňovat již jen o metodice vhodné pro uspořádání in vivo, tedy
fluorescenční mikroskopii.
Klsická fluorescenční mikroskopie
Označujeme tak fluorescenční mikroskopii, kdy je najednou snímáno celé zorné pole na
vzorku. Obraz je snímán očima experimentátora prostřednictvím okulárů resp. smímačem
typu CCD/CMOS kamery, tedy matice světlocitlivých sensorů. Základní schéma klasického
fluorescenčního mikroskopu v epifluorescenčním uspořádání je na následujícím obrázku.
Klasická fluorescenční mikroskopie - epifluorescenční uspořádání.
Epifluorescenční uspořádání znamená, že signál je sbírán stejnou čočkou, objektivem, jakou
prochází paprsky iluminace. Zdrojem iluminace je libovolný zdroj studeného světla, nejčastěji
je užívána rtuťová výbojka. Světlo je obecně monochromatické. Jednou z hlavních částí
fluorescenčního mikroskopu je tzv. kostka (na obrázku uprostřed - vše, co je v šedém čtverci).
Kostka se skládá ze dvou cut-off filtrů a dichroického zrcátka. Světlo ze zdroje prochází
prvním cut-off filtrem (short-pass) kostky, kdy kratší vlnové délky filtrem projdou a delší
nikoliv. Dále svazek přichází na dichroické zrcátko, kde se kratší vlnové délky odráží a delší
zrcátkem procházejí. Svazek se tedy odráží směrem ke vzorku, na který je fokusován
objektivem. Získaný signál, tedy fluorescence, má obecně červený Stokesův posuv, delší
vlnovou délku. Takové světlo se již na dichroickém zrcátku neodráží, ale prochází. Před
opuštěním kostky ještě světlo prochází druhým cut-off filtrem (long-pass), který propustí
pouze delší vlnové délky a kratší nikoliv. Světlo je dále fokusováno okulárem na CCD/CMOS
čip resp. na sítnici experimentátora. Obecně se kostky liší vlnovou délkou
Grafy transmitance filtrů a dichroického zrcátka fluorescenční kostky. Olympus.com
Pro každou sondu je vhodné vybrat konkrétní kostku. Např. pro DAPI by vlnová délka filtrů a
dichroického zrcátka, kde je transmitance 50%, byla cca 405 nm (dle 2. grafu tohoto textu).
Nevýhodou tohoto druhu mikroskopie je to, že spolu s fluoroforem v ohniskové rovině
objektivu jsou také excitovány molekuly fluoroforu mimo ohniskovou rovinu, jejichž
fluorescence se přidává do snímaného signálu (viz následující obrázek).
Naznačení kontaminace signálu emisí z out-of-focus rovin.
Signál je tak lehce rozmazán. Možnou cestou je velmi tenký vzorek, nicméně vždy budete
minimálně limitováni tloušťkou buňky a to je dost.
Rastrovací konfokální mikroskopie
Rastrovací konfokální mikroskopie v podstatě řeší problém fluorescence out-of-focus rovin.
V konfokální mikroskopii se jako zdroj excitace bere zářící bod, který je zobrazen na místo ve
vzorku (viz následující obrázek). Ale teoreticky pouze opět jako bod! Celý vzorek v jednom
okamžiku není osvětlen!
Základní schéma konfokálního mikroskopu. Mezi zdrojovou čočkou (Collimating
optics) a dichroickým zrcátkem (beamsplitter) ještě chybí rastrovací zrcátka.
Emise z osvětleného bodu jde v uspořádání epifluorescence zpět, tentokráte skrze dichroické
zrcátko (beamsplitter) na fokusační čočku (tube lens), která signál láme do svého ohniska,
které je vloženo do bodového otvoru v clonce (pinhole). Z jednoduché geometrie tohoto
uspořádání ihned vidíte, že za předpokladu, že je ve vzorku v jednu chvíli osvětlen pouze
jeden bod a do emisní cesty je vhodně vložena pinhole, lze odříznout emise out-of-focus
rovin. Tyto emise neprojdou přes signálovou pinhole. Veškerý signál, který projde pinhole,
okamžitě vstupuje do fotonásobiče (viz wikipedia), kde je zesílen a odeslán do počítače.
No problém je v tom, že v takovém uspořádání máme sice ostrý obraz, ale pouze jeden bod.
Toto se řeší tak, že mezi zdrojovou čočku (Collimating optics) a dichroické zrcátko
(beamsplitter) jsou ještě vložena rastrovací zrcátka (následující obrázek), která (počítačem
řízena) definovaně hýbou o malý úhel se směrem svazku, čímž přejíždějí zmíněným bodem
po vzorku. Zrcátka tímto bodem vzorek doslova rastrují (jako vykreslování na obrazovce staré
televize).
Schéma a reálné foto skenovacích zrcátek (tzv. galvos-podle způsobu jejich
magnetického vychylování).
Obraz je tvořen v počítači tak, že počítač v každý okamžik ví, do kterého bodu části vzorku
právě míří excitační svazek a jakou z tohoto bodu fotonásobič právě eviduje intenzitu emise.
Obrázek je pak v podstatě vykreslen jako velká matice bodů, kde světlost každého bodu
odpovídá příslušné intenzitě emise detekované fotonásobičem.
Co se týče zdroje excitace. Obvykle jsou v konfokální mikroskopii používány různé sady
pevnolátkových laseru, které svou emisí pokrývají viditelné spektrun a část UV spektra.
Lasery nemusí být příliš silné. S použitou vlnovou délkou lasreu a fluorescenční sondou
obvykle souvisí výměna dichroického zrcátka, tak aby mělo vhodně zvolenou cut-off vlnovou
délku.
Konfokální mikroskopie znamenala opět obrovský přelom, protože umožnila velmi dokonalé
subbuněčné rozlišení (ukázka v následujícím obrázku).
Snímky z konfokálního mikroskopu – barvení různých struktur.
Výhody
- patří hlavně neskutečné rozlišení (obrázky výše).
- rozlišení v z-ové ose, kdy můžeme z buňky doslova vytvořit tomografický snímek.
Nevýhody
- snímání rastrováním chvilku trvá narozdíl od principiálně nekonečně rychlé akvizice
v klasické mikroskopii (dáno pouze použitou kamerou resp. snímací metodou).
- pinhole ořízne roviny out-of-focus, ale obecně řečeno velká část excitační energie se
„zahodí“ v out-of-focus rovinách, které jsou odříznuty, čímž má měřený obraz sice vysoké
rozlišení, ale poměrně nízkou světelnost při stále stejném ohřívání vzorku.
- hloubka, do které je s konfokálním mikroskopem „vidět“ je v řádu desítek μ, cca 50 μm.
Pak už je jen tma a nebo musíte tak zesílit excitační svazek, že vzorek upečete. Důvod je
samozřejmě absorpce a rozptyl ve vzorku. Toto v podstatě znemožňuje použití v uspořádání
pokusu in-vivo.
No a teď už se konečně někam dostáváme...
Dvoufotonová rastrovací mikroskopie (TwoPhotonLaserScanningMicroscopy)
Ale nejdříve malá teoretická odbočka...
Dvoufotonová excitace a základní schéma dvoufotonového mikroskopu
Dvoufotnová excitace fluoroforu je podobný děj jako klasická excitace jednofotonová s tím
rozdílem, že energie potřebná pro excitaci elektron-vibračního stavu molekuly je dodána
absorpcí dvou fotonů stejné vlnové délky na místo fotonu jednoho. Na následujícím obrázku
je zobrazen Jablonskiho diagram pro jednofotonovou a dvoufotonovou excitaci. Děje se liší
pouze v části excitace, jakmile je fluorofor excitován do daného vyššího stavu, nezářivá
vibrační a zářivá elektronová deexcitace, tedy emise, pak probíhají identicky jako v případě
děje jednofotonového. Jinými slovy si to fluorofor jakoby nepamatuje.
Jablonskiho diagram pro jednofotonovou a dvoufotonovou excitaci.
Dva fotony se jakoby „složí“ na energii nutnou pro excitaci fluoroforu. Tím může mít každý
z fotonů, mnohem menší energii. Podle prvního pohledu by se mohlo zdát, že přesně
poloviční, nicméně z kvantové mechaniky plyne několik omezení pro tento nelineární jev a
platí zde trošku jiná výběrová pravidla, do kterých stavů se budou přechody realizovat.
Stručně řečeno, dvoufotonové excitační spektrum nějakého fluoroforu není přesnou kopií
jednofotonového spektra s dvounásobnými čísly na ose vlnových délek. Posun nemusí být
úplný a tvar spektra může být také trochu jiný (příklad na následujícím obrázku).
Dvoufotonová excitační spektra (červeně) vs jednofotonová excitační spektra (modře)
s 2x přenásobenou vlnovou délkou10.
Dvoufotonová excitace závisí na pravděpodobnosti výskytu dvou fotonů a její
pravděpodobnost není tedy úměrná první mocnině ale mocnině druhé. Toto má závažné
důsledky. Vezměme opět pomyslné „přesýpací hodiny“, tvořené světelným svazkem pod
objektivem (následující obrázek).
„Přesýpací hodiny“ tvořené excitačním svazkem na vzorku pod objektivem
Když uvážíme, že světelný svazek má konstantní energetický tok ve všech průřezech, mění se
tedy intenzita excitačního svazku jako konst/z2, kde z je vzdálenost od fokální roviny.
Dvoufotonová excitace je navíc jev úměrný druhé mocnině takové intenzity, její
pravděpodobnost tedy bude klesat dle konst2/z4, tedy se čtvrtou mocninou vzdálenosti od
fokální roviny. Díky této prudce klesající funkci se bude dvoufotonová excitace realizovat
prakticky jen v mikrometrové blízkosti fokální roviny (obrázek výše vlevo). Díky tomuto
jevu, nemusí být před fotonásobič předřazena pinhole ořezávající emisi z out-of-focus rovin,
protože již samotný princip metody se stará o to, aby emise byla sbírána jen z chtěné, fokální,
roviny. Fluorofory v out-of-focus rovinách jednoduše vyexcitovány nejsou. Veškerá energie
excitace se uplatní ve fokální rovině, veškerá emise ve vhodném směru je vedena přímo do
fotonásobiče.
Využití veškeré excitace ve chtěné fokální rovině je prvním z pilířů dvoufotonové
mikroskopie.
Dalším pilířem je nízká absorpce tkáně pro relevantní vlnové délky používané
k dvoufotonové excitaci. Někdy se tomuto „údolí“ v grafu absorpčního koeficientu tkáně,
který se nachází cca mezi 700 nm a 1100 nm, říká tzv. infračervené okno (Near-infrared
window in biological tissue - wikipedia). Směrem ke kratším vlnovým délkám již začínají
absorbovat oba stavy hemoglobinu a směrem k delším vlnovým délkám již začíná silně
absorbovat voda.
Třetím neméně významným pilířem dvoufotonové mikroskopie je poměrně nízký rozptyl
světla v oblasti vlnových délek používaných k dvoufotoné excitaci. To je důležité zejména
proto, že se jedná o nelineární jev a jakékoli drobné rozostření fokusovaného bodu, středu
„přesýpacích hodin“, je zaplaceno poklesem efektu dvoufotonové excitace.
Infračervené okno tkáně a závislost rozptylu na vlnové délce jsou ukázány v následujícím
obrázku.
Infračervené okno tkáně a pokles rozptylu s vlnovou délkou.
Zmíněné tři principy tedy umožňují fenomén dvoufotonové mikroskopie in vivo a to až
z hloubek 1000 μm (tloušťka kůry neokortexu myši). Rozlišení v rovině by v ideálním
případě mělo být stejné jako u mikroskopie konfokální. Rozlišení v z-ové ose může být o
kousek horší, ale v podstatě podobné.
Na následujícím obrázku je základní schéma dvoufotonového mikroskopu. Ve vzorku je
v každém čase opět excitován pouze jediný bod. Rastrovací zrcátka (galvos) opět tímto
bodem po fokální rovině přejíždějí a obrázek tak rastrují. Z každého bodu je emise snímána
fotonásobiči a přiřazena souřadnicím. Stejné jako u konfokálu, jen chybí pinhole. V části
detekce signálu je svazek dělen dichroickým zrcátkem oba svazky následně vstupují do
separátních fotonásobičů. To umožňuje současné snímání emise na dvou vlnových délkách,
např. tedy dvou různých fluorescenčních sond, které mají jinou vlnovou délku emise (máme v
laborce).
Základní schéma dvoufotonového mikroskopu.
1) Terminologická poznámka ke konstrukci je taková, že se neříká „dvoufotonový konfokál“.
Konfokální mikroskop má své jméno odvozené od toho, že zobrazovaný bod vzorku a dírka
pinhole leží v opačném (con- je z latiny pro contra) ohnisku téže čočky, objektivu. Jelikož náš
dvoufotonový mikroskop nemá pinhole, žádné takové označení pro něj nemá smysl.
Nepoužívejme jej tedy. Ve světě se také pro takový stroj nepoužívá.
Dvoufotonový konfokální mikroskop existuje, je to dvoufotonový mikroskop doplněný pinhole, což zlepšuje
rozlišení v z-ové ose zpět na úroveň klasického jednofotonového konfokálu. Nicméně takový stroj je nevhodný
pro in vivo mikroskopii, protože zahodí hodně signálu a když si uvědomíte, že se snažíme tahat signál z dosti
značných hloubek, tak je to hned jasné. Měli byste teoreticky super z-ové rozlišení, ale neviděli byste nic.
2) Faktická poznámka: pro fluorescenci s dvoufotonovou excitací neplatí Stokesovo pravidlo,
tedy že excitace je posunutá více směrem k modré a emise více směrem k červené. Upřímně u
fluorescence s dvoufotonovou excitací je tomu spíše naopak (pro daný fluorofor se emisní
spektrum nezměnilo, ale excitační spektrum můžeme hledat někde na dvounásobných
vlnových délkách, než na kterých se nacházelo excitační spektrum jednofotonové. Změnou
z jednofotonového na dvoufotonové excitační spektrum pak jakoby „přeskočí“ spektrum
emisní.
Dvojité barvení (zelená je OGB-1AM a barví neurony a glie, červená
Sulforhodamine101 barví pouze glie) a ve spodní části jsou signály z různých hloubek
Další aspekty a aparatura dvoufotonové mikroskopie
Tři výše jmenované pilíře jsou pěkná věc, ale pro realizaci dvoufotonové excitace je nutné
ještě splnit podmínku vysoké pravděpodobnosti, že „se v jednom okamžiku vyskytnou dva
fotony v prostoru molekuly fluoroforu“, což je úměrné intenzitě iluminace. Problém je v tom,
že tato pravděpodobnost je poměrně malá a musí se tedy kompenzovat obrovskými
intenzitami iluminace. Takto silná iluminace v kontinuálním režimu (kdyby byla
realizovatelná) by prakticky okamžitě tkáň upekla a odpařila. Řešení je pulzní režim laseru
používaného k excitaci (následující obrázek).
Šířka a vzdálenost pulzů v typické emisi laseru pro dvoufotonovou mikrospii
Pulzy jsou velmi úzké, rychle se opakují a mezi nimi laser neemituje. Veškerý výkon laseru je
tak napěchován do těchto pulzů, které tak mají neuvěřitelnou amplitudu. Například náš
Ti:saphir laser má šířku pulsu 140fs (femtosekund) a opakovací frekvenci 80 MHz, při 800
nm má střední výkon cca 3,4 W, což vychází tak, že amplituda pulsu je cca 300 kW. Když
fokusujeme do čtverečního μm (velkorysé), dostáváme tak tok energie cca 300 PW
(petawat)/m2. Pro srovnání od slunce přichází 1,4 kW/m2, což je zhruba 200000000000000x
méně. To jen jaká je ten laser bestie. Čísla sice platí pro fokusovaný svazek, ruku tam ale
radši nestrkejte.
Výsledkem je, že v okamžiku pulzu je v bodě fluoroforu dostatečná energie a vzorek se
nespálí, protože pulzy jsou od sebe relativně (vůči šířce pulzu) vzdálené. Jak funguje
femtosekundový laser, poradí internet, nebo se mne dodatečně zeptat. V tomto textu to není.
Galvo vs AOD
Výše jsem už zmínil způsob rastrovaní vzorku pomocí zrcátek připevněných na
galvalnometrických posuvech, které funguje tak, první zrcátko se trošku nakloní a druhé
zrcátko přejede celý svůj rozsah, pak se první zrcátko nakloní a druhé zrcátko opět přejede
celý svůj rozsah – v obrázku toto odpovídá nasnímání prvního a druhého řádku pixelů.
Zrcátka a jejich úchyty jsou ale mechanická a hmotná věc, s čímž souvisí hybnost a moment
setrvačnosti, takže existuje limit, jak rychle se s nimi dá mávat, než přijdou problémy, nebo se
zrcátka rovnou utrhnou. To omezuje frekvenci akvizice jednotlivých obrázků, pro rozlišení
512x512 je pak maximální frekvence akvizice celého obrázku cca 0,7 Hz.
Skenování vzorku může být urychleno tak, že se zmíněné první zrcátko zastaví uprostřed
svého rozsahu a dále se chová jen pasivně. Místo něj příslušnou osu obrázku rastruje tzv.
acousto optic deflector (AOD), který je na následujícím obrázku.
Schéma AOD
Základem AOD je velmi čistý monokrystal, na který je z jedné strany napařen piezoelektrický
prvek, který transformuje přiváděné sinusové napětí do změny svého objemu a tak vytváří
chvění v krystalu. V krystalu šířící se vlna vytváří periodicky se střídající denzity a zřídčení.
To vytváří něco velmi podobné optické mřížce, kterou si možná pamatujete z gymplu.
Důležité u ní bylo to, že když na ní posvítíte, tak vlivem interference se za ní objeví jeden
výrazný směr (a několik méně výrazných), kam bude prošlé světlo směřovat. Ten výrazný
směr je první řád interference a jeho úhel odklonu od osy krystalu je funkcí mřížkové
konstanty, tedy vzdálenosti jednotlivých periodických denzit v krystalu. Teď je ale dobré si
uvědomit, že frekvenci napětí přivedeného na piezo prvek mohu velmi rychle měnit, čímž
měním vzdálenost denzit v krystalu a tím i úhel, kterým míří svazek po průchodu krystalem.
V celém AOD se nic nepohybuje, nic nemává, takže může běžet opravdu velmi rychle.
Druhé (stále aktivní) zrcátko, které posouvá v y-ose zrychlí a výsledek je takový, že
s použitím jednoho AOD na našem mikroskopu dosáhneme při rozlišení 512x512 akviziční
rychlosti 25 fps (frame per second). To je 35x rychlejší!
Dobrá otázka je, proč nepoužijeme AOD k veškerému rastrování a na zrcátka se nevykašleme
úplně. Jde to11, ale je to zase o level jinde. Důvod je ten, že víc AOD znamená víc problémů a
více korekcí disperzních vad. Navíc když je čas, tak galva díky své stabilitě udělají „přesnější
obrázek“.
Toliko přístrojové principy, nyní je na řadě trocha biologie...
Calcium imaging
Neurony jsou dráždivé buňky, tedy buňky, které po vyhodnocení vstupů odpoví zákmitem
svého membránového potenciálu, akčním potenciálem. Bylo by fajn mít sondy resp. proteiny
citlivé přímo na napětí membrány a dvoufotonovou mikroskopii sledovat přímo toto. Problém
je v tom, že syntetické napěťové sondy (VSD - voltage sensitive dyes 12) a na napětí citlivé
proteiny (VSP – voltage sensitive proteins 13) mají zatím poměrně neuspokojivé vlastnosti. Pro
in vivo experimenty neposkytují dostatečný SNR (Signal to Noise Ratio), VSD barví kde co
(extracellular matrix) a ve vyšších koncentracích jsou pro buňky toxické. Dnes je jejich
technologie tak daleko, že je lze použít in vivo, ale nelze získat buněčné rozlišení. In vitro
jsou možnosti širší. V následujících letech lze očekávat pokrok ve VSP, usilovně se na tom
pracuje. Nyní ale vhodné pro in vivo experiment vhodné nejsou.
Musíme tak měřit aktivitu neuronů nějakým jiným způsobem. Nejvhodnější způsob je měření
intracelulární koncentrace kalcia, přestože to se přímo nepodílí na řízení membránového
potenciálu (jeho funkce je spíše jako mesenger). Kalcium je k tomuto účelu také vhodné
z toho důvodu, že jeho koncentrace se po odpálení AP mění v poměrně širokém rozsahu, až
dva řády. Intracelulární koncentrace kalcia v neaktivovaném neuronu se pohybuje je cca 10100nM. Extracelulárně je koncentrace kalcia řádově něco přes 1 mM. Toto vytváří obrovský
koncentrační gradient. Po odpálení akčního potenciálu se otevřou napěťově sensitivními
kalciové kanály VSCC v membráně a následuje influx kalcia do buňky (následující obrázek),
který je dále podpořen kladnou zpětnou vazbou efluxu kalcia z ER (rezervoár buňky pro
kalcium), CICR (calcium-induced calcium release).
Mechanismy zvýšení intracelulární koncentrace volného kalcia v neuronu.
Krátce po odpálení AP tedy vyskočí cytosolová koncentrace volného kalcia, a to k hodnotám
cca 1μM. VSCC jsou otevřené pouze při depolarizaci membrány, což je poměrně krátký
okamžik. Po jejich uzavření okamžitě začíná aktivní (ATP dependentní) pumpování kalcia
ven z buňky a do ER. Kanály v membráně retikula se taktéž uzavírají a intracelulární
koncentrace kalcia se vrací na původní klidovou hodnotu. Co je ale důležité je to, že celý
tento pokles koncentrace je zhruba exponenciální a jeho charakteristický čas je cca 0,5-1,0s.
Na následujícím obrázku je znázorněna modelovaná elektrická aktivita neuronu a příslušná
teoretická kalciová koncentrace.
Modelovaná elektrická aktivita neuronu a souvisejících změn koncentrace kalcia
Na následném obrázku je ukázáno totéž, ale z reálného experimentu.
Reálný experiment, kdy je současně zaznamenávána elektrická aktivita neuronu a
příslušný kalciový signál (tiše tu předpokládám lineární závislost míry emise sondy na
koncentraci kalcia).
Odpálení AP tedy implikuje silné zvýšení somatické cytoplasmatické koncentrace kalcia.
Ekvivalence? Můžeme tvrdit i opačnou implikaci, tedy že značné zvýšení somatické
cytoplasmatické koncentrace kalcia značí AP? Empiricky zhodnoceno (měření stejného typu
jako na obrázku výše): ano!
Nuže. Je vidět, že dynamika kalcia je poměrně líná. Minimálně tedy línější než dynamika
membránového potenciálu. Náš cíl je ale reprodukovat APs trains ze zaznamenané kalciové
koncentrace. Již z podstaty metody a pomalosti změny cytoplasmatické koncentrace kalcia
nemůžeme očekávat, že moment odpálení každého AP určíme s přesností milisekundy.
Naštěstí existuje jistý způsob, jak se k této hranici alespoň přiblížit.
Konvoluce, dekonvoluce a jiné metody
Důležité jsou zejména dvě věci. 1) náběh kalciového spajku je poměrně strmý, 2) můžeme
předpokládat, že na jeden AP bude mít systém (tedy neuron) vždy stejnou odezvu, co se týče
koncentrace kalcia (pakliže neuron neodpálí další AP, následuje exponenciální pokles
koncentrace).
První bod říká, že když budeme mít řídké spajkování a nebudou realizovány dříve, než se
somatická koncentrace volného kalcia opět ustálí na klidové hladině, můžeme moment
otevření VSCC určit jako počátek náběhové hrany kalciového spajku. Moment otevření
VSCC v podstatě odpovídá okamžiku realizace AP (Upozorňuji, že mám tendenci tyto pojmy
zaměňovat). Tento postup nám umožní určit okamžik AP s přesností na desítky ms, ale
selhává, když je kadence APs hustší.
Druhý bod vysvětlit bude trošku složitější. Obecně. Když víme, jakou má systém na výstupu
odezvu (kalciová koncentrace - jediný spajk) při nekonečně krátkém pulzu na vstupu (AP –>
otevřenost VSCC) a předpokládáme, že taková odezva je vždy stejná, můžeme určit i tvar
výstupu (kalciová koncentrace) pro složitější vstup (rychle se opakující APs). Výstupní funkci
(kalciovou koncentraci) lze vypočítat jako konvoluci funkce vstupní (elektrické spajkování) a
tzv. jádra konvoluce, což je odezva (ojedinělý kalciový spajk) na nekonečně krátký pulz (1
AP za něj můžeme zhruba prohlásit). Doporučuji mrknout se na stránky wikipedie a další
texty, lze to pochopit. Případně se pokusím vysvětlit více osobně. Jistě vám došlo, že toto je
ale opačný proces (tvoření kalciové koncentrace ze spajkových trainů), než potřebujeme. No
jo, ale teď už je to jednoduché. Existuje inverzní operace, které se říká dekonvoluce. Když
znáte jádro a výstup, dopočítá se vstup. A to je náš případ. Je to jediný způsob, jak se někam
dobrat, jelikož je spousta neuronů (např. většina interneuronů), které rozhodně nebudou čekat
sekundu, až se jim koncentrace kalcia vrátí na klidovou hodnotu. Z kalciového signálu se tak
stává podivná hora s malými špičkami, kde od oka nic moc vidět není, ale metoda
dekonvoluce i tady velmi slušně funguje (viz následující obrázek).
Použití metody dekonvoluce v reálných datech získaných in vivo. Modře jsou nalezené
spajky, červeně jsou reálné spajky (nucené externě patch-clampovou pipetou).
In vivo se tedy za ideálních podmínek dostáváme zhruba na rozlišení ±20 ms. To není nijak
zázračné, ale třeba u 200ms stimulace to už umožňuje odlišit onset/offset neurony.
Máme tedy zvíře, které je v narkóze, byla provedena kraniotomie a chceme, aby neurony
měly v sobě OGB-1 citlivou na vápník a astrocyty byly odlišeny pomocí Sulforhodaminu101.
Ale jak tam ty barvy dostat? Existuje hned několik možností, kde každá má své pro a proti.
4 hlavní možnosti, jak vizualizovat mozkové buňky in vivo.
Na obrázku výše jsou 4 hlavní metody, jak vizualizovat neurony a astrocyty in vivo.
Zcela vlevo je pipeta pomalu naváděna k tělu neuronu, vytvoří se gigaseal (přilnutí obvodu
špičky k membráně), je provedena ruptura membrány a obsah mikropipety se nechá volně
difundovat do buňky se všemi jejími částmi. Na stranové projekci je vidět, jak pěkně se vyplní
např. dendritický strom. Roztok v pipetě obsahuje ionty v koncentracích napodobujících
intracelulární prostředí a nějakou kalciovou sondu (např. OGB-1), která byla původně do
roztoku přidána ve formě soli. Podíváte-li se na nákres OGB-1 na počátku tohoto textu
(skutečně tak učiňte), uvidíte, že z části BAPTA čouhají 4 karboxylové zbytky (Sůl znamená,
že na příslušných kyslících původně byl vázán např. draslík, který ve vodném roztoku
okamžitě disocioval.). Sonda má tedy v těchto zbytcích 4 záporné náboje (O-) a ještě dva
záporné náboje (O-) na fluoresceinu, je tedy 6ti násobně záporně nabitá. Taková sonda ani
omylem nemůže projít intaktní buněčnou membránou (membrána je lipofilní prostředí).
Sonda se tedy do neuronu dostává pouze rupturou prostřednictvím volné difuse. Obrovská
výhoda tu je, že se nebarví extracelulární matrix a jiné neurony, jejichž neurity by se pletly do
snímání daného neuronu. Nevýhoda samozřejmě je, že takto obarvíte pouze jeden neuron.
Záleží na smyslu vašeho pokusu. Nádherný kontrast daný pěkným vyplněním a nulovým
barvením okolí neuronu umožňuje v ideálním případě dokonce snímkovat vápníkové signály
in vivo z jednotlivých dendritických spinů11.
V metodě, která je na obrázku zobrazena druhá zleva jsou neurony značeny tzv. elektroporací.
Malé množství obsahu pipety, opět obsahujícího sondu ve formě bývalé soli (neprochází
intaktní membránou), je vystříknuto do extracelulárního prostoru mezi shluk několika somat
neuronů. Následně nato jsou na špici pipety přivedeny jemné elektrické pulzy, které
v přilehlých neuronech přechodně naruší integritu membrány, která tím dočasně přestane být
propustná pro nabité molekuly. V těchto přechodných okamžicích se část molekul nabité
sondy OGB-1 dostane do neuronů. Zbytek sondy difunduje tkání pryč. Kontrast takového
barvení je stále docela slušný.
Třetí metoda zleva se jmenuje MCBL14,15 (MultiCell Bolus Loading) je založená na drobné
fintě. I když v obrázku již není zakreslena, sonda je k neuronům opět dopravena
prostřednictvím patch-clampové mikropipety. Mikropipeta ale v tomto případě obsahuje ionty
v koncentracích napodobujících extracelulární prostor mozku a sonda (sondy vícenásobném
barvení) má formu takzvaného acetoxymethyl-esteru (následující obrázek).
Mechanismus zachycení sondy Fura-2 AM v cytosolu.
Na obrázku výše je znázorněn mechanismus zachycení sondy Fura-2 AM (také kalciová
sonda) v buňce. Všimněte si, že část sondy se opět podobá struktuře BAPTA. Skutečně, touto
částí fura-2 koordinuje (váže) kationt Ca2+. Rozdíl je ale v tom, že z komplexu nečouhají
karboxilové zbytky, ale na příslušné kyslíky těchto zbytku jsou navázány (esterová vazba)
zbytky methylové (zde jsou methylové zbytky dokonce přes dvě esterové vazby, aby se to
pojistilo). Totéž platí i pro původně nabitá místa ve fluorescenční části sondy. O takovém
„ověšeném“ tvaru sondy mluvíme jako o acetoxymethyl-esteru, značeno zkráceně vždy za
jménem sondy velkými písmeny AM. Taková sonda je ale nenabitá a dokonce dost lipofilní
na to, aby prošla membránou. Jakmile jí projde, vrhnou se na její esterové vazby tzv.
nespecifické esterázy, což jsou hojné enzymy, které rádi podobné vazby štípou (adice vody).
Methylové zbytky jsou uštípnuty, zbudou karboxylové skupiny, sonda se tím stává nabitou a
již neprojde membránou, již nemůže ven z buňky. That’s the spirit! Sondu tedy v dostatečném
množství vstříkneme do extracelulárního prostoru mezi neurony (v ten okamžik vidíme
v negativním kontrastu – viz další část textu o experimentu) a jen počkáme cca 30-45 minut,
až neurony získají pozitivní kontrast, tedy až se sonda natáhne do buněk. Nevýhoda této
metody je v tom, že sonda vleze i do neuritů (také umí kalciový změny), které se jen v daném
místě motají a třeba ani nepochází od právě barvených somat neuronů. Když uvážíme, jak je
v takové tkáni husto, je vidět, že to snižuje kontrast a vytváří nám to šum. Tyto neduhy jsou
ale vyváženy obrovskou výhodou v podobě toho, že najednou můžeme obarvit třeba 1000
neuronů a pak si snímat z libovolného z nich.
Čtvrtou metodou, kterou lze realizovat přítomnost fluoroforu citlivého na kalcium je exprese
příslušného designovaného proteinu, tzv. GECI (genetically encoded calcium indicator). Ve
vývoji takových proteinů se za posledních pět let udála doslova revoluce a nyní je již dokonce
možné, použít tyto proteiny pro sledování kalciové koncentrace v jednotlivých neuronech 2/3
vrstvy neokortexu myši in vivo16. Existují principielně dva způsoby, jak neuron přinutit, aby
takový protein vyráběl – 1) knock-in, 2) virová transfekce; většinou AAV
(AdenoAsociatedVirus). Vždy však musí být použit velmi silný promotor.
První způsob je přímočařejší, ale má značné neduhy. Jednak to, že myš protein produkuje
v podstatě od svého splození, tedy i v průběhu vývoje. Mít v průběhu vývoje cytosol
napěchovaný cizím proteinem přináší komplikace a malformace. Zvláštní na tom je, že se
dlouhou ukazovalo, že i knock-in pod takto silným promotorem nevytvoří dostatečnou
koncentraci17.
Mnohem lépe použitelný je druhý způsob, tedy exprese pod vlivem virové transfekce. Podle
nedávných výsledků16 je již dosažitelné buněčné rozlišení in vivo. Zhruba za to můžou dva
efekty. Jednak se zase o kousek posunul vývoj GECI (silnější fluorescence, dynamický rozsah
atd.) a dále se přidává efekt samotného viru, kdy při kopírování virové DNA vzniká o pár
řádů větší počet templátů pro transkripci příslušného genu pro GECI oproti pouhému
knock-in. Tato metoda je velmi slibná oproti zásahu do tkáně (zapíchnutí pipety při MCBL) je
poněkud méně invazivní. V podstatě cca 2-3 týdny před samotným imagingem stačí titr viru
nanést malinkou kraniotomii (drobný vrtáček) na duru nad sledovanou oblast kůry a zvíře se
opět nechat zotavit. Po uplynutí této doby je tkáň obarvena jako na následujícím obrázku.
Exprese GECI v neuronech vlivem transfekce AAV.
Podívejte se na video: Video1-Tian et al2009.avi
Myš, motorický kortex, 2/3 vrstva, 10x zrychleno.
Ze jmenovaných způsobů již v naší laboratoři běžně funguje MCBL. Již jsem optimalizoval i
parametry. Od dubna snad začneme i s expresí GECI pomocí AAV. Vybavení na to budeme
mít. Časem až budeme mít slušný data-aquisition systém k patch-clampovému zesilovači
(sledovat impedanci pipety je v takovém pokusu nezbytné), pokusíme se i o první metodu,
tedy o plnění jednotlivých neuronů in vivo.
Tak to by bylo k teorii samotného experimentu. Některé další používané věci bude možná
také potřeba osvětlit. To ale ponechejme to vždy k příslušné části, bude to přehlednější.
1
Lutcke, H. & Helmchen, F. Two-photon imaging and analysis of neural network
dynamics. Reports on Progress in Physics 74, 19, doi:086602
10.1088/0034-4885/74/8/086602 (2011).
2
Helmchen, F. & Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods 2,
932-940, doi:10.1038/nmeth818 (2005).
3
Margrie, T. W. et al. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.
Neuron 39, 911-918 (2003).
4
Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W. & Hausser, M. Targeted patchclamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nature
Methods 5, 61-67, doi:10.1038/nmeth1150 (2008).
5
Runyan, C. A. et al. Response Features of Parvalbumin-Expressing Interneurons
Suggest Precise Roles for Subtypes of Inhibition in Visual Cortex. Neuron 67, 847857, doi:10.1016/j.neuron.2010.08.006 (2010).
6
Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D. & Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as
a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nature Methods 1, 31-37,
doi:10.1038/nmeth706 (2004).
7
Luo, L., Callaway, E. M. & Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron
57, 634-660, doi:10.1016/j.neuron.2008.01.002 (2008).
8
Livet, J. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent
proteins in the nervous system. Nature 450, 56-+, doi:10.1038/nature06293 (2007).
9
Shimomura, O., Johnson, F. H. & Saiga, Y. EXTRACTION, PURIFICATION AND
PROPERTIES OF AEQUORIN, A BIOLUMINESCENT PROTEIN FROM
LUMINOUS HYDROMEDUSAN, AEQUOREA. Journal of Cellular and
Comparative Physiology 59, 223-&, doi:10.1002/jcp.1030590302 (1962).
10
Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E. & Rebane, A. Two-photon
absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods 8, 393-399,
doi:10.1038/nmeth.1596 (2011).
11
Chen, X. W., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I. & Konnerth, A. Functional
mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature 475, 501-U597,
doi:10.1038/nature10193 (2011).
12
Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W. F., Huang, X. Y. & Wu, J. Y. Methods for
voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio.
Journal of Neurophysiology 98, 502-512, doi:10.1152/jn.01169.2006 (2007).
13
Baker, B. J. et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.
Brain Cell Biology 36, 53-67, doi:10.1007/s11068-008-9026-7 (2008).
14
Garaschuk, O., Milos, R. I. & Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent
indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nature Protocols 1, 380-386,
doi:10.1038/nprot.2006.58 (2006).
15
Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K. & Konnerth, A. In vivo two-photon calcium
imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 100, 7319-7324, doi:10.1073/pnas.1232232100 (2003).
16
Tian, L. et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP
calcium indicators. Nature Methods 6, 875-U113, doi:10.1038/nmeth.1398 (2009).
17
Reiff, D. F. et al. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural
activity in flies. Journal of Neuroscience 25, 4766-4778, doi:10.1523/jneurosci.490004.2005 (2005).