Metody práce s proteinovými komplexy Proteinové komplexy
Transkript
Metody práce s proteinovými komplexy Proteinové komplexy
Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy • tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce • nekovalentní asociace mohou být narušeny odchylkou od fyziologických podmínek Možný vliv proteinových interakcí • změna kinetiky proteinů • konverze substrátu • vytvoření nového vazebného místa • inaktivace proteinu • změna substrátové specifity Stabilita proteinových komplexů faktory ovlivňující stabilitu: • iontová síla • pH • teplota • použití detergentů proteiny jsou nejstabilnější ve vodném prostředí při neutrálním pH, při fyziologické iontové síle (330 miliosmolů) a v přítomnosti dalších proteinů Význam studia proteinových interakcí identifikace partnera interagujícího se známým proteinem Obecný postup studia 1. určení všech případných vazebných partnerů i v případě nedodržení fyziologických podmínek 2. ověření existence interakcí, nalezených v kroku 1, za fyziologických podmínek 3. studium povahy nalezené interakce (např. její modulace v buňce nebo stabilita) Metodické přístupy • nativní izolace a separace • hmotnostní spektrometrie • crosslinking • funkční testy – dvojhybridní systém • genetické metody – mutační analýza vzhledem v obtížnosti udržení fyziologických podmínek při studiu nekovalentních proteinových interakcí je nutné ověřit výsledky alespoň dvěma nezávislými metodami Purifikace a separace komplexů • afinitní chromatografie – imunoprecipitace, značené fúzní proteiny • gelová filtrace – separace podle velikosti částic • centrifugace ‐ diferenční c. – oddělení kompartmentů • použití sacharosových nebo glycerolových gradientů: ‐ izokinetická c. – separace podle hmotnosti a tvaru částic v mírném gradientu ‐ izopyknická c. – separace podle hustoty částic ve strmém gradientu Purifikace a separace komplexů (pokr.) • elektroforetická separace ‐ BN‐PAGE (Blue Native PAGE ‐ separace podle molekulové hmotnosti komplexu) ‐ CN‐PAGE (Colorless Native PAGE ‐ separace podle celkového náboje komplexu) ‐ nativní agarosová gelová elektroforesa (separace velkých částic – např. virové partikule) Afinitní chromatografie • proteinový komplex izolován přes specifickou afinní vazbu protein‐ligand • ligand kovalentně navázán na nosič • ligand – protein, cukr, nukleová kyselina, protilátka, kofaktor, ATP, ... Molekula Ligand antigen protilátka enzym substrát receptor ligand protein važící nukleovou kyselinu nukl. kyselina polysacharid, glykoprotein lektin Afinitní chromatografie (pokr.) • eluce komplexu z kolony – změna pH, zvýšení koncetrace solí, přebytek volného ligandu, chaotropní činidla • imunoprecipitace – ligandem je protilátka • koimunoprecipitace – izolace nekovalentně asociovaných proteinů, proteinových komplexů – detekce protein‐proteinových interakcí Imunoprecipitace Eluce proteinů z kolony za fyziologických podmínek • eluce volným ligandem • eluce kompetujícím proteinem Afinitní značky • peptidy (proteiny) kovalentně připojené na studovaný protein (takto značený protein vzniká expresí fúzního genu) • interagují s malou molekulou ligandu zakotveném na pevném povrchu NEBO vazebným partnerem zakotveném na chromatografické matrici NEBO protilátkou připojenou na matrici • nástroj pro purifikaci rekombinantních proteinů a nativních proteinových komplexů • umožňují izolaci z hrubých buněčných extraktů Přehled používaných afinitních značek J. J. Lichty et al., 2005 Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification 41, 98‐105 Faktory ovlivňující úspěšnost afinitní purifikace • struktura proteinu (malý protein se lépe produkuje a imobilizuje, reaguje méně nespecificky) • výběr buněčného materiálu (purifikovaný protein/komplex musí být přítomen ve vzorku v dostatečném množství) • volba nosiče a protokolu (nespecifická vazba na nosič může být minimalizována volbou vhodného typu oplachů a blokací) • separace a detekce izolovaných proteinů/komplexů – na SDS‐PAGE, na 2D‐IEF/SDS‐PAGE nebo pomocí hmotnostní spektrometrie (rozhodujeme se podle síly nespecifického pozadí a podle složitosti izolovaného komplexu) Tandemová afinitní purifikace • izolace proteinového komplexu za nativních podmínek pomocí dvou značek • kazeta obsahující sekvenci: ‐ nízkoafinní značka (calmodulin‐binding peptide) ‐ místo enzymatického štěpení ‐ vysokoafinní značka (protein A) Afinitní purifikace/MS analýza • limitace – množství proteinu potřebné pro MS analýzu band detekovatelný CBB barvením ~ 50 ‐ 10 ng ~ 50 kDa protein obsažený v 1 buňce v 10 000 kopiích izolovaný z 6 x 107 buněk je výhodné obohatit výchozí frakci o izolovaný protein, tj. izolovat předem buněčný kompartment, v němž se protein vyskytuje Gelová filtrace • separace podle velikosti částic • stacionární fáze tvořena kuličkami z porózního materiálu, póry mají různou velikost • náplně: dextran (Sephadex), agarosa (Sepharose, Bio‐Gel A), polyakrylamid (Bio‐Gel P) nejmenší molekuly putují nejpomaleji – jsou zdržovány průchodem všemi póry, střední molekuly prochází jen některými póry a putují tedy rychleji, velké molekuly obtékají kuličky a rychle vytékají z kolony ven Gelová filtrace BN‐PAGE (Blue Native PAGE) • separuje proteinové komplexy v nativním stavu při pH 7,5 • separace v gradientovém gelu probíhá v rozsahu 30 ‐ 1 500 kDa • CBB G udává proteinům záporný náboj • aminokapronová kyselina udržuje komplexy v solubilním stavu během separace, zabraňuje arteficiálním agregacím RNA Pol I membrány kvasinek jádra HeLa buněk BN‐PAGE gel RNA Pol II nuclear DNA helicase II • v kombinaci s SDS‐PAGE vznikají dvourozměrné mapy proteinů, z nichž je možné určit podjednotkové složení proteinových komplexů blot MW [kDa] MW [kDa] 669 440 669 232 140 67 440 232 2D – BN/SDS-PAGE 2. dimension – SDS-PAGE proteiny cytoplasmatické membrány kDa 135 1. dimension – BN-PAGE 97 78 57,5 38,5 33,5 140 232 440 669 kDa Hmotnostní spektrometrie • MALDI – analýza jednotlivých separovaných proteinů • iontová past – analýza proteinových komplexů, směsných vzorků Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003 Crosslinking vznik nové kovalentní vazby mezi proteinovými řetězci • chemický – crosslinkery o různé délce (řádově 1 nm), formaldehyd • indukovaný UV – arylazidy, benzafenony • indukovaný dlouhovlnným světlem – Ru(II)(bpy)32+ 2. rozměr – SDS-PAGE redukující 1. rozměr – SDS-PAGE neredukující Dvojhybridní systém • studium přímé interakce mezi dvěma proteiny • detekce neznámých asociačních partnerů • kvasinkový Gal4 protein ‐ tvorba fúzních proteinů • omezení pro: proteiny ovlivňující reporterový gen proteiny vyžadující posttranslační modifikaci nebo neproteinovou složku (např. DNA) Princip metody nativní Gal4 transkripce UASG hybridní Gal4 - X GAL1-lacZ X DNA vazebná doména Gal4 GAL1-lacZ UASG hybridní Gal4 - Y Y X UASG aktivační doména Gal4 GAL1-lacZ UASG interakce mezi X a Y obnoví Gal4 aktivitu aktivační doména nativního Gal4 proteinu Y transkripce GAL1-lacZ vazebná doména nativního Gal4 proteinu X hybrid vazebné domény a proteinu X Y hybrid aktivační domény a proteinu Y Literatura • Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003 • Protein‐Protein Interactions, E. Golemis, CSHL Press, 2002 • E. M. Phizicky and S. Fields, 1995, Microb Rev, Protein‐Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis, 59, 1, 94‐123