Úvod Barvící (a další) metody Posmrtné změny

Patologie
Úvod
Barvící (a další) metody
Posmrtné změny
[email protected]
[email protected]
Úvod
•
•
•
•
•
•
úloha patologie v současné době
zpracování materiálu
barvící (a další) metody
historie patologie na lékařské fakultě v Praze
historie pitev a patologie
výuka patologie na LF v Praze (Ústav patologie
1. LF UK a VFN)
Úloha patologie v současné
době
Patologie
• vědecký obor / obor medicíny zabývající se
diagnostikou a zkoumáním chorobných stavů na
podkladě vyšetřování orgánů, tkání, tělesných tekutin a
případně celého těla (pitvy)
• analyzuje mechanizmy vzniku a rozvoje chorob
(etiologie a patogeneze) a jejich projevy na různých
úrovních (makroskopické, mikroskopické,
imunohistochemické a molekulárně-biologické)
• v rámci prediktivní patologie dochází u onkologicky
nemocných k určení typu léčby individuálně pro
každého jednotlivého pacienta (tzv. cílená léčba)
Metody v patologii
•
•
•
•
•
•
Makroskopické hodnocení
Mikroskopické vyšetření (histopatologie)
Cytopatologie
Elektronová mikroskopie
Průtoková cytometrie
Molekulární patologie
Makroskopické hodnocení
Charakter tkáně pro bioptické vyšetření
• fixovná/ nefixovaná tkáň
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
diagnostické odběry
- endoskopické biopsie
- kyretáž
- punch biopsie
- true-cut biopsie
terapeutické výkony
- excize
- konizáty
- resekáty
- lymfadenektomie
Fixace tkáně
• Fixace = rychlé vysrážení (denaturace) bílkovin
•
•
•
•
Fixační prostředky musí splňovat 3 hlavní podmínky:
1) zachovat strukturu tkáně
2) zachovat barvitelnost tkáně
3) rychle pronikat do tkáně
•
•
•
•
Fixační tekutiny:
1) Formol (formalín) = 40% roztok formaldehydu
2) Alkohol (100%)
3) Bouinův roztok (kyselina pikrová a formol 3:1)
Fixace tkáně
• Fixace = rychlé vysrážení (denaturace) bílkovin
• cílem je zabránit autolýze
•
•
•
•
Fixační prostředky musí splňovat 3 hlavní podmínky:
1)strukturu
zástavatkáně
buněčného metabolismu
1) zachovat
2)barvitelnost
zábrana autolýzy
2) zachovat
tkáně
3) usmrcení
patogenních organizmů
3) rychle pronikat
do tkáně
(bakterie, viry, plísně)
4) ztuhnutí tkáně (zkřížená vazba
• Fixační tekutiny:
denaturovaných
• 1) Formol (formalín)
= 40% roztokproteinů)
formaldehydu
• 2) Alkohol (100%)
• 3) Bouinův roztok (kyselina pikrová a formol 3:1)
Mikroskopické vyšetření
Mikroskopické vyšetření
(světelná mikroskopie)
• vyšetření tkáňových řezů s použitím
histologických technik
• standardní barvení hematoxylineozinem – základ mikroskopické
patologie (histopatologie)
• existuje množství dalších barvení
(speciální indikace)
• zahrnuje imunohistochemická vyšetření
(použití značených protilátek k detekci
konkrétních antigenů, molekulární
charakteristika nádorů…)
Možnosti a limity světelné mikroskopie
• světelný mikroskop nemůže
rozlišit objekty menší než ½
vlnové délky světla
• bílé světlo vlnová délka kolem
0,55 μm
• jakékoliv 2 body blíže než 0,275
μm nebudou rozlišitelné
• schopnost objektivu zachytit
světelné paprsky z pozorovaného
objektu záleží na médiu, kterým
světlo prochází a numerické
apertuře objektivu – pozorování
při větším zvětšení není možné
bez použití imerze (imerzní
objektivy)
Barvící metody
hematoxylin-eozin
• základní barvení histologických
preparátů
•
•
•
•
jádra zbarvena modrofialově
cytoplazma růžová
červené krvinky jasně červené
hydrofóbní struktury (tuky,
myelin) nezbarvené =
vodojasné
• další případné barvy v
preparátu (žlutá, hnědá, černá)
- pigmenty
hematoxylin
• bazické barvivo
• přírodní – extrakt z
kampeškového dubu
• barví bazofilní struktury
• - obvykle obsahující
nukleové kyseliny
• - jádra, oblasti cytoplazmy
bohaté na RNA
eozin
• eosin Y, eosin B
• fluorescentní červené
barvivo vzniklé působením
bromu na fluorescein
xantinový derivát
• eosin Y = tetrabrom
fluorescein
• barví acidofilní struktury
• pojmenováno podle řecké
bohyně ranních červánků
Éós
Další (speciální) barvící metody














průkaz určitých substancí
hlen (alciánová modř, mucikarmín, PAS)
amyloid (Kongo červeň, saturnová červeň)
hemosiderin (Pearlsova modř)
kalcium (van Kossa)
vazivo (van Gieson, trichrom)
tuky (sudan)
glykogen (PAS, A-PAS)
melanin (Masson-Fontana)
průkaz mikroorganismů
bakterie – Gram, Giemsa, Warthin Starry, Ziehl Neelsen
plísně – PAS, Groccot
přesnější hodnocení struktury jader
Giemsa, toluidinová modř, polychrom
Imunohistochemické metody
• detekce specifických antigenních
determinant s využitím
imunologické vazby
• vazba antigenu s protilátkou
• protilátky značeny např. kovem,
fluorochromem či enzymem
vizualizace
• přímá metoda - přímé označení
primární protilátky
• nepřímé metody (2 nebo 3
stupňové) – citlivější
• - primární protilátka neoznačená
• - sekundární protilátka (x primární)
značená fluorochromem či
enzymem
Protilátky
• polyklonální - produkt
• monoklonální - produkt
mnoha aktivovaných klonů
jednoho klonu B lymfocytů
B lymfocytů
• specifické proti jedné
• získávají se imunizací
antigenní determinantě
zvířete (myš, králík, koza) - • fúze imunizovaného B
následně se odebere
lymfocytu a neoplastické
sérum či ascites
myelomové buňky
• obvykle vazba na různé
oblasti antigenu (menší
specifita než
monoklonální)
Význam a využití IHC
• IHC v současné době zcela nepostradatelná
• využití v diagnostice i v prediktivní patologii
• nejčastěji používaná v diagnostice nádorových
onemocnění (včetně diferenciální diagnózy
proti nenádorovým lézím)
• význam i v patologii nenádorových lézí (průkaz
infekčních agens, enzymů, přítomnosti a
charakteru zánětlivého infiltrátu…)
IHC – nádory (diagnostika)
•
•
•
•
•
určení základní diferenciace tkáně:
- epitelová
- mesenchymální
- neuroektodermová
- hematopoetická
• podrobné hodnocení exprese jednotlivých antigenů (častěji jejich
skupin)
• - diferenciální diagnostika mezi různými nádory
• - bližší subtypizace nádorů (např. lymfomy)
• metastázy neznámého primárního zdroje – určení východiska
nádoru
IHC – nádory (léčba - predikce)
• stanovení přítomnosti / absence terapeuticky ovlivnitelných molekul
(receptorů, antigenů)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
karcinom prsu
- Her2/neu (c-erbB-2)
- estrogenové receptory
- progesteronové receptory
- androgenové receptory
karcinom plic
- exprese ALK
maligní lymfomy
- exprese CD20
gastrointestinální stromální nádory
- exprese CD117 (c-kit)