01. Struktura proteinu

METODY STANOVENÍ PROSTOROVÉ
STRUKTURY PROTEINŮ
David Kopečný
KBC/BAM - Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
garant Ivo Frébort
ZS 2011, pátek 10:45 – 12:15, učebna SE-E1
1
Outline
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Krystalizace,
Elementární buňka,
Krystalové soustavy,
Bravaisovy mřížky,
Braggův zákon, Millerovy indexy,
Synchrotron,
Strukturní faktor, Elektronová hustota,
Fázový problém, MAD, SAD, IR, MR,
R-faktor, rozlišení, teplotní faktor,
PDB proteinová databanka,
PDB formát,
Sofware pro refinement a vizalizaci struktur
2
The science of X-ray crystallography is based on the diffraction of X-rays
by a crystalline material. It is the only analytical technique that can
provide the molecular structure of a given compound in the solid
crystalline state.
3
a) Refraction of light from a microscope; (b) diffraction of X-rays in a crystallography experiment
X-ray crystallography
small-molecule crystallography
macromolecular crystallography
(protein crystallography)
Inorganic molecules
Organic molecules
Organometallic molecules
• to identify accurately all of the atom types
within the molecule
• identification and structural confirmation
of newly synthesized molecules from
catalysts and new materials to new drugs
Nucleic acids – DNA, RNA
Proteins
• to identify the secondary structures – the
shapes and motifs of the overall structure
• identification of deoxyribonucleic acid (DNA) Watson, Crick, and Wilkins, Nobel Prize in 1962
4
4 levels of the protein structure
primary
tertiary
secondary
quaternary
5
How to determine 3D protein structure?
secondary
primary
Modelling
NMR
difficult > 30 kDa
X-ray crystallography
Modelling
tertiary
+
quaternary
electron microscopy
weak resolution
6
PDB content growth
March 2011
71516 structures total
62185solved by X-ray (86%)
8791 solved by NMR (13%)
353solved by electron microscopy (0.5%)
www.pdb.org
92 % proteins
2 % DNA
1 % RNA
4 % Protein DNA/RNA complexes
7
Nukleární magnetická rezonance (NMR)
• Principem vzniku signálů v nukleární magnetické rezonanci (NMR) je absorpce
radiofrekvenčního záření.
•Mnoho jader biologicky důležitých prvků má magnetický moment. Postrádají
ho pouze jádra, která mají sudá atomová i hmotnostní čísla např. 12C nebo 16O.
Pro měření NMR spekter v biochemii nachází použití 1H, 13C, 15N a 31P.
Nevýhodou je nízké izotopové zastoupení 13C a 15N.
• NMR spektra biomolekul (peptidy, proteiny, nukleové kyseliny) jsou
velmi složitá z důvodu přítomnosti značného množství jader. Spektra ve více
dimenzích - 2D /3D spektra
spektra. Vícerozměrný experiment se skládá ze série 1-D
experimentů, sekvence pulsů s časovými prodlevami.
• Pro řešení problému se měří 2D COSY spektra („correlated spectroscopy“).
Dále se určují HSQC spektra (Heteronuclear Single Quantum Correlation),
NOESY spektra (Nukleární Overhauserův Efekt) a TOCSY spektra (Total
correlation spectroscopy).
Například:
Pro proteiny 10-15 kDa je třeba 3D experimentů s 15N značeným proteinem (3D HSQCTOCSY, 3D HSQC-NOESY). Pro proteiny 15-30 kDa je třeba 3D experimentů a dvojího
značení 15N a 13C (3D HSQC-NOESY, triple resonance)
Cryo-EM (cryo-electron microscopy)
• Studium virů, malých organel, biologických a makromolekulárních
komplexů 200 kDa nebo větších uchovaných v amorfním ledu při 4-20 Ǻ
•Snímky získané z kryo-elektronové mikroskopie obvykle mají značný šum a
jsou velmi málo kontrastní. Během refinementu je nutné snížit šum i zvýšit
kontrast. I když nelze získat atomární detaily, je možné rekonstruovat sek.
strukturu:
RTG záření (X ray)
•RTG záření (0.01-100 Ǻ) je užitečné
pro zobrazování složení molekul,
jelikož jeho vlnová délka pokrývá
velikosti atomů a jejich vzdálenosti
v molekulách.
• RTG paprsky jsou rozptylovány na
elektronech atomů a tvoří difrakční
obrazec
• Rozptyl je přímo úměrný počtu elektronů
• Difrakce na jednom atomu, molekule je příliš malá, aby šla měřit přímo.
• Krystaly obsahují miliony kopií daného atomu, molekuly (a tím i
elektronů) – v tomto případě difraktovaný signál měřit lze.
• Hodnota jednoho angstromu je rovna 0,1 nm
10
4 steps in structure determination
Highly concenrated and pure protein
Crystallization
Collection of
diffraction data
1. Protein crystal
Phasing
2. Diffraction spots
Model
construction and
refinement
4. Determined structure
3. Electron density
11
Krystalizace je druh fázové přeměny, při které dochází k
pravidelnému uspořádání částic do krystalové mříže.
Roztok proteinu musí být v „přesyceném stavu“
• Metastabilní oblast – nukleační rychlost je malá
• Labilní (nukleační, krystalizační) oblast – dochází k nukleaci
• Precipitační oblast – vznikají neorganizované formy shluky a precipitáty
Zvyšování úrovně nasycení roztoku použitím vhodného precipitačního činidla ((NH4)2SO4,
PEG,…) a dále na modifikaci pH, teploty, koncentrace proteinu nebo typu rozpouštědla. 12
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method)
•Pro krystalizace nízkomolekulárních látek stačí odpařování rozpouštědla.
•V případě biomakromolekul takto získáme pouhý precipitát.
Raoultův zákon- závislost tlaku syté páry nad kapalným roztokem
Parciální tlak vody nad precipitantem (reservoir solution) je menší než
nad vzorkem - vodní páry difundují ze vzorku, kde roste koncentrace
proteinu.
Hanging drop
Sitting drop
Microdialysis
water
water
Sandwich drop
13
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method) II
Hanging drop
14
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method) III
Komerční krystalizační kity:
•
Hampton Research (www.hamptonresearch.com)
•
Molecular Dimensions (www.moleculardimensions.com)
•
Nextal/Qiagen (www.qiagen.com)
Obsahují sadu roztoků s množstvím pufrů, které pokrývají širokou oblast pH, s
množstvím organických a anorganických precipitantů, solí a aditiv.
(NH4)2SO4
PEG
pH
15
Nejčastější precipitanty
Organické precipitanty, soli:
Anorganické precipitanty:
•(NH4)2SO4
•NaCl
•CH3COONa
• PEG
Polyethylenglykol (PEG) 400, 1000, 1500, 4000, 6000, 8000, 10000, 20000
• rozpouštědla (isopropanol, etanol a terc-butanol)
• 2-methyl-2,4-pentandiol (MPD)
16
KRYSTALOVÁ STRUKTURA
= rozmístění základních stavebních částic (iontů, atomů, molekul) v prostoru krystalu
• k popisu se používá pojmu MŘÍŽOVÝCH BODŮ –imaginární body, jejichž okolí je
identické !! Nemusí jít o atom nebo molekulu!!
• KRYSTALOVÁ MŘÍŽKA (lattice) je spojením mřížových bodů
Volba počátku mříže je libovolná
mřížový bod
•
mříž
motiv
nejmenší jednotkou je ELEMENTÁRNÍ BUŇKA (unit cell)
17
ELEMENTÁRNÍ BUŇKA (unit cell)
•
nejmenší jednotkou je ELEMENTÁRNÍ BUŇKA
• ‘nejlepší’ elementární buňkou je ta nejmenší buňka, která má nejvyšší symetrii
(square has a higher internal symmetry than the diamond shape)
18
„ASYMMETRIC UNIT“ VS. „UNIT CELL“
• Krystal je tvořen identickými elementárními buňkami, které se symetricky v
prostoru opakují (operací translace).
• Obsah elementární buňky lze většinou operacemi symetrie (rotací, inverzí…)
zredukovat na 2 a více asymetrické jednotky. Asymetrická jednotka = nejmenší
repetice, ze které lze krystal zkonstruovat.
Příklad1:
Elementární buňka - tvořena 4 asymetrickými jednotkami
Příklad2:
Solvent
Protein
19
Elementární buňka - tvořena 2 asymetrickými jednotkami
7 KRYSTALOGRAFICKÝCH SOUSTAV
(CRYSTAL SYSTEMS)
Známe 7 krystalografických soustav, podle toho, jakých os se použije k popisu
ploch krystalu. Postupujeme tak od trojklonné soustavy s rozdílnými
parametry os a úhlů k vysoce symetrické soustavě kubické.
•trojklonná (triclinic
(triclinic))
•jednoklonná (monoclinic
(monoclinic))
•kosočtverečná (orthorhombic
(orthorhombic))
•romboedrická - trigonální (rhombohedral
rhombohedral,, trigonal
trigonal))
•čtverečná (tetragonal
(tetragonal))
•šesterečná (hexagonal
(hexagonal))
•krychlová (cubic
(cubic))
20
BRAVAISOVY TRANSLAČNÍ MŘÍŽKY
Auguste BRAVAIS ukázal, že existuje 14 způsobů, jak vytvořit
prostorovou periodickou mřížku
• 14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek, liší
se operacemi symetrie (7 primitivních a 7 centrovaných)
c
a
g
b
b
a
P
• pro primitivní buňky (P) platí, že na jednu buňku připadá
jeden mřížový bod.
• bazálně centrovaná buňka (C) – 2 mřížové body
• plošně centrovaná buňka (F) - 4mřížové body
• objemově (prostorově) centrovaná buňka (I) – 2 mřížové body
C
F
I
21
7 krystalografických soustav (crystal systems)
Bravaisovy mřížky
krychlová (cubic)
čtverečná (tetragonal)
kosočtverečná (orthorhombic)
šesterečná (hexagonal)
trigonální (rhombohedral)
jednoklonná (monoclinic)
trojklonná (triclinic)
22
7 krystalografických soustav (crystal systems) II
Teoreticky:
4 typy elementárních buněk (primitvní a 3 centrované) x 7 krystalografických
soustav = 28 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek
Ve skutečnosti:
14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek
Důvod:
14 zbylých teoreticky možných mřížek je možno rozložit na jednodušší typ
mřížky.
Příklad:
Bazálně centrovaná kubická mřížka lze zjednodušit a rozložit na
primitivní tetragonální mřížku
23
Shrnutí
•4 typy elementárních buněk (primitvní a 3 centrované) P, I, F, C
+
• 7 krystalografických soustav
=
•14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek (teoreticky 28)
24
Interakce rentgenových paprsků s krystalem
Difrakci RTG paprsků lze prezentovat jako „odraz“ na soustavě
rovnoběžných atomových rovin v krystalu. Všechny vlny „odražené“
jednou rovinou jsou ve fázi. Naproti tomu vlny „odražené“ různými
vrstvami budou spolu ve fázi jen za určitých podmínek. Úhel pod nímž
dopadají paprsky musí být takový, aby dráhový rozdíl mezi vlnami
odraženými od kterýchkoli sousedních rovin byl roven celistvému
násobku vlnové délky.
AY + YB = n λ
25
Zákon, rovnice Braggů Lawrence Bragg, 1914 Nobelova cena za chemii
AY + YB = n λ
sinΘ = AY/d
AY = YB
n.λ = 2.d.sinΘ
n je celé číslo (řád difrakce), λ je vlnová délka dopadajícího RTG paprsku, d je
mezirovinná vzdálenost v krystalu, Θ (theta) je úhel dopadu.
Zákon říká, že k difrakci dojde když platí n.λ = 2.d.sinΘ, tzn. když vlnová
délka dopadajícího záření je rovna součinu dvojnásobku mezirovinné
vzdálenosti a sinu úhlu dopadu.
26
Zákon, rovnice Braggů
n.λ = 2.d.sinΘ
William Henry Bragg a jeho syn William Lawrence Bragg
V trojrozměrném krystalu musí být Braggova rovnice splněna ve
všech třech rozměrech.
Laueho podmínky difrakce
2.a.sin  = h.λ , 2.b.sin  = k. λ, 2.c.sin  = l.λ
kde a, b a c jsou vzdálenosti rozptylových center (mřížových bodů v
elementární buňce), h, k a l jsou Milerovy indexy - celá čísla
reprezentující orientaci atomové roviny v krystalové mřížce.
Definovány jako převrácené hodnoty průsečíků, které rovina vytíná
na osách.
27
Millerovy roviny a indexy
• Mimo znalosti krystalografických soustav a Bravaisových translačních
mřížek, lze mřížku rozdělit na imaginární roviny tzv. Millerovy roviny, na
nichž dochází k difrakci.
• Roviny jsou definovány třemi celými čísly h,k,l – Millerovy indexy
x
y
z
Kartézské souřadnice
Elementární buňka
a
b
c
Millerovy indexy
h
k
l
• Je-li rovina paralelní k dané ose, pak má hodnotu nula
z
Kartézské souřadnice
x
y
z
1. Průsečíky
∞
1
∞
2. Převrátit hodnoty
1/∞
1/1
1/∞
3.Upravit/zredukovat
0
1
0
x
Miller indices (0,1,0)
y
William Hallowes Miller
28
Millerovy roviny a indexy
29
Synchrotron
• Synchrotron je urychlovač částic kruhového tvaru (unvitř je vakuum),
který se používá buď k získání energetických částic nebo záření, které
tyto částice produkují. Má-li být synchrotron zdrojem záření, jsou
částicemi elektrony nebo pozitrony.
• Je zde synchronizováno magnetické pole (k ohybu dráhy částic) a
elektrické pole (k urychlování částic) k udržení svazku částic v
uzavřeném kruhu a k fokusaci.
• Vysokoenergetické záření (nejčastěji formou rentgenových paprsků)
je v synchrotronu emitováno v okamžiku, kdy se paprsek elektronů o
rychlosti blížící se rychlosti světla ohýbá působením silného
magnetického pole.
•čím menší zakřivení, tím větší
zrychlení elektronů lze dosáhnout
30
Ohýbání dráhy elektronů
Elektrony procházejí skrze magnety jsou nuceny oscilovat a uvolňovat energii zářením
WIGGLERS (dříve)
Skupina „bending magnetů“ za sebou
+ Intenzivní záření v širokém spektrálním rozsahu
- Většina experimentů si vystačí s úzkým spektrem,
většina zůstává nevyužita a to vede k nežádoucí
tvorbě tepla a ovlivnění měřící optiky.
Dipólové magnety
UNDULATOR (dnes)
Upgraded wiggler
Užívají slabší magnetické pole a kratší magnety
+ Užší paprsek – λ ~ 0.1 nm
31
Charakteristika synchrotronu
magnety DIPOLE, QUADRUPOLE,
SEXTUPOLE a CORECTOR
4
3
2
1
6
5
SPring-8, Japonsko, obvod 1.4 km, 8GeV
APS, USA, obvod 1.1 km, 7GeV
ESRF, Francie, obvod 850 m, 6GeV
1. ELEKTRONOVÉ DĚLO
2. LINAC (Lineární urychlovač) - zhuštění a urychlení na energii v řádech stovek MeV
3. BOOSTER (urychlovač) - urychlení na rychlost blízkou rychlosti světla a energie v řádech jednotek GeV
4. STORAGE RING (skladovací prstenec)
5. BEAMLINE (paprskovod)
32
6. WORKING STATION
EU synchrotrons
SOLEIL, Source optimisée de lumière d’énergie
intermédiaire du LURE, Paris, 2.8 GeV
DESY, Deutsches Elektronen Synchrotron,
DORIS III, Hamburg, 4.5 eV
společné zařízení původně 12 evropských zemí
(plus 7 včetně ČR)
ESRF, European Synchrotron Radiation
Facility, Grenoble, Francie, obvod 850 m, 6GeV
33
Pracovní stanice (ID14)
34
Kryoprotektanty
2 způsoby sběru dat:
Bez kryoprotekce – dochází k poškození krystalu RTG zářením, rozpadá se
pravidelná mřížová struktura krystalů, klesá intensita difraktovaných bodů.
(minusy: Často nutné sbírat data při nižším a vyšším rozlišení z více krystalů)
2. Rychlé zmrazení v dusíku (flash freezing). Jelikož krystaly obsahují množství
vody, je nutno použít kryoprotektantů, které molekuly vody částečně vytěsní.
(minusy: MOZAICITA- nepravidelnost uspořádání mříže krystalu).
1.
Nejčastější kryoprotektanty: Glycerol (13-25%), Ethylenglykol (11-30%), PEG 400
(25-35%), MPD (2-methyl-2,4-pentanediol) (do 28%), Glukosa (do 25%)
Je nutná optimalizace:
Vysoká mozaicita - NE
Nízká mozaicita - OK
35
Glycerol
Paratone-N
SBĚR DAT, INDEXACE
• Difrakční obrázky jsou nejčastěji sbírány po 1°rotace, lze volit i jinak, např. 0.5°
• Nejdříve se sbírá prvních 5-10 obrázků (5-10°), pak se data indexují, stanovují
se mřížkové parametry, rozlišení….ověřuje se, zda data půjdou zpracovat
• Určují se prostorová grupa (space group) a Matthewsův koeficient
Obsah solventu a Matthewsův koeficient
Vm = V/M.Z
Vs = 1.23/Vm
Vs – obsah solventu, M – molekulová hmotnost proteinu, V - objem elementární buňky, Z – počet
molekul proteinu v elementární buňce), Vm – Matthewsův koeficient
36
Matthewsův koeficient
Rozmezí 1.68 - 3.53 Å3/Dalton
průměr 2.69 Å3/Dalton, medián of 2.52 Å3/Dalton
Solvent content ∼47%
Krystaly, které dávají nepřirozené hodnoty Vm nebo obsahu solventu,
indikují možné problémy a jsou vyřazeny
37
Difrakční obraz („pattern“) proteinového krystalu
(n.λ /2). (1/d)= sinΘ
Čím blíže jsou Millerovy roviny (menší
hodnota vzdálenosti d), tím větší úhel
difrakce, a body jsou lépe diferencované
jeden od druhého.
Závislost difrakčního obrazu na 1/d
1/d je znám pod pojmem RECIPROCAL SPACE (reciproký prostor)
tzn . každému bodu v Millerově rovině odpovídá bod reciprokém prostoru,
Výsledně mluvíme o reciproké mřížce.
Během RTG analýzy měříme intenzitu bodů v reciprokém prostoru,
abychom vytvořily mapu elektronové hustoty pro elementární buňku ve
sktečném prostoru.
38
Difrakční obraz („pattern“) proteinového krystalu
(n.λ /2). (1/d)= sinΘ
Čím blíže jsou Millerovy roviny (menší
hodnota vzdálenosti d), tím větší úhel
difrakce, a body jsou lépe diferencované
jeden od druhého.
Závislost difrakčního obrazu na 1/d
Real space
Reciprocal space
Crystal structure
Diffraction pattern
Electron density
Amplitudes and phases
Crystal lattice, unit cell
Reciprocal lattice, cell
Coordinates (x,y,z)
Coordinates (h,k,l)
•Rsym (also called Rmerge) is almost universally used for describing X-ray
diffraction data quality
39
STRUKTURNÍ FAKTOR Fhkl
Vlna difraktovaná v prostoru hkl je popsaná strukturním
faktorem Fhkl.
Je to komplexní číslo: Fhkl = |Fhkl| e i(h, k, l)
|Fhkl| je amplituda
(h, k, l) fí je fáze, celá čísla hkl jsou Millerovy indexy
určující vektor v reciprokém prostoru.
• Pro výpočet elektronové hustoty je nutno znát obojí tz. amplitudu
|Fhkl| a fázi (h, k, l). První parametr lze změřit, ale fáze nelze.
• Amplituda |Fhkl| je úměrná odmocnině intensity naměřeného
reflexního bodu v prostoru hkl: |Fhkl| = K √ I(hkl).
40
ELEKTRONOVÁ HUSTOTA (x, y, z)
Elektronovou hustotu lze spočítat ze strukturních faktorů pomocí
inversní Fourierovy transformace.
Elektronová hustota v každém bodě (v reálném prostoru, koordináty x, y,
z) je definována jako suma všech difraktovaných amplitud a fází.
(x, y, z) = 1/V hkl |Fhkl | e i(hkl) e-2i(hx+ky+lz)
- vzorec je vztažen na objem elementární buňky 1/V.
Fourierova transformace je dlouhým a komplikovaným matematickým
výpočtem na počítači. Každý atom přispívá k amplitudě a fázovému posunu
každého jednotlivého odrazu. Mapa elektronové hustoty je tedy výslednou
sumací.
41
ELEKTRONOVÁ HUSTOTA (x, y, z)
Jelikož informace o fázi (hkl) je ztracena, vylučuje to přímý výpočet elektronové
hustoty. Vzniká tzv. „fázový problém“ a v praxi se řeší metodami:
anomalous scattering (s použitím těžkých kovů)
a isomorfním nahrazením (isomorphous replacement)
nebo molekulovým nahrazením (molecular replacement).
MOLEKULOVÉ NAHRAZENÍ (MR)
• Nejpoužívanější technika
• Využijí se koordináty jiné již známé struktury
struktury, která je hledané molekule
podobná. Pro úspěšný výsledek se uvádí podobnost sekvencí alespoň 30%.
• programy MOLREP, PHASER, AmoRe, XPLOR-CNS
• Řeší se šestiprostorový problém ve 2 krocích - rotace a translace = hledá se
Pattersonova rotační a translační funkce
• Při úspěšném hledání by měl být R-faktor méně jak 50%
M2=M1.[R] +T
M2- řešený model,M1 - templát z PDB databáze, [R] – rotační funkce, T – translační vektor
42
ISOMORFNÍ NAHRAZENÍ (IR)
• Není-li k dispozici podobná struktura. Jedná se o zavedení iontů těžkých kovů
do struktury proteinů (těžké v tom smyslu, že mají vysoké atomové číslo, tj.
množství elektronů), které zásadně mění intenzitu rozptýleného záření.
• Krystaly prozeinu jsou kokrystalizovány nebo infiltrovány v roztocích solí
těžkých kovů (Hg, Pt, lanthanidy) jako např. HgCl2, K2[HgI4] nebo PCMB (pchrolomercuribenzoate). Úspěšnost metody závisí vazbě těžkých atomů na
protein. Připojení může být zprostředkováno kovalentní vazbou, iontovou vazbou
nebo slabší (vW) interakcí.
•Refinement se provádí na základě diferencí difrakčních obrazů.
• Strukturní faktor modif proteinu (FPH) je roven sumě strukturního faktoru
proteinu (FP) a těžkého kovu (FH): F = F + F
PH
P
H
• Amplitudy strukturních faktorů |FPH| and |FP| jsou změřeny experimentálně,
|FH| a fázový úhel are jsou získány užitím Pattersonovy funkce a Harkerova
zobrazení.
43
•Pattersonova funkce hraje nezastupitelnou roli v metodách řešení problému
fází v proteinové krystalografii.
•Je to vlastně mapa všech meziatomových vektorů v základní buňce. Může
být vypočtena přímo z difrakčních dat. Fáze nejsou zapotřebí.
• Jde o modifikaci funkce elektronové hustoty:
(x, y, z) = 1/V  hkl |Fhkl | cos2Π (hx + ky + lz - Φ(hkl)) - Electron density function
•Místo x,y,z koordinát se objevují u,v,w pro |Fhkl |2 prostor
• Fáze Φ(hkl) je rovna nule
P(u, v, w) = 1/V  hkl |Fhkl |2 cos2Π (hu + kv + lw) - Patterson Function
|Fhkl| = K √ I(hkl)
| Fhkl | 2 = I(hkl) / K.A.L.p
The relationship between structure factor amplitude and intensity. K is a scale factor, A is the
absorption factor, L is the Lorentz factor, and p represents the polarization factor
Pattersonova funkce pro základní buňku s 5,000 atomy má 24 995 000
meziatomových vektorů.
44
ANOMÁLNÍ ROZPTYL (AS)
•je rozptyl na atomu za podmínek, kdy dopadající záření má dostatečnou
energii ΔΕ (h), aby způsobilo přechod elektronu mezi orbitaly (absorpční
hrana). Atom pak rozptyluje záření anomálně, s fázovým posunem až -90 °
a se sníženou amplitudou.
•pokud dopadající foton má energii rozdílnou od ΔE mezi orbitaly, pak je k
anomální rozptylu nedochází.
• na synchrotronu může být energie dopadajícího záření přesně naladěna na
hodnotu ΔE. ΔE for C, N, O jsou mimo rozsah měření s RTG zářením.
•Běžně používaná technika je příprava selenomethioninových derivátů
proteinu (Se místo S, 1SeMet/100 residuí). Nebo jodouracil nebo
jodocytosin u nukleových kyselin
•Metoda single anomalous diffraction (SAD)
je populární
metaloproteinů, které obsahují prvek s vlastnostmi anomálního rozptylu.
u
• Metoda Multiple anomalous scattering or diffraction (MAD) využívá
sběru dat z jednoho krystalu při různých vlnových délkách (různých ΔΕ).
•AS also includes a combination of methods combining a single wavelength
analysis with SIR or MIR method (SIRAS, MIRAS).
45
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
R-faktor -
je měřítkem kvality modelu získaného z krystalografických dat. Rhodnota porovnává, jak dobře se simulovaný difrakční vzor vytvořeného modelu
shoduje s experimentálně pozorovaným difrakčním obrazcem. Jde o podíl sumy
rozdílu strukturních faktorů pozorovaných (observed, Fo) a vypočítaných
(calculated, Fc) k sumě strukturních faktorů pozorovaných (Fo).
R =  ||Fo | - |Fc ||
 | |Fo |
Čím nižší hodnoty, tím větší shoda.
Pomůcka: Struktury při 2 Ǻ mají hodnotu R-faktoru kolem 0.20 (20%) a r free je
0.25 (25%).
Free R faktor - je odvozen od R-faktoru, ale porovnává strukturní faktory
náhodně vybrazných odrazů (reflections) – běžně 5 nebo 10% všech odrazů
– které nejsou použity běhěm refinementu a modelování struktury
46
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
Rozlišení (resolution)
- je měřítkem kvality dat, běžně pod 2 Å = při tomto
rozlišení je možno rozlišit 2 atomy při vzdálenosti 2.0 Å.
• Struktury s vysokým rozlišením
(1.0 Å) jsou velmi spořádané a je
snadno vidět každý atom.
• Struktury s nízkým rozlišením
(3.0 Å) - jsou zobrazeny pouze
základní kontury proteinu.
47
PROTEIN DATA BANK
www.pdb.org
48
49
50
51
52
53
PDB file download
PDB file: 1KSI.pdb
54
PDB formát
"header section" summarizes the protein, citation, the details of the structure solution,
"core" - long list of the atoms and their coordinates.
Header details
Oligomerization status
55
PDB formát
1
2
3
4
5
6
7
8
12345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
ATOM
8239 ND2 ASN B 386
12.379 49.612 24.586 1.00 19.98
N
HETATM 8240 N
TPQ B 387
15.526 46.735 23.732 1.00 19.99
N
Columns:
1-6 Record name "ATOM " or "HETATM"
7-11 Atom serial number
13-16 Atom name
17 Alternate location indicator
18-20 Residue name
22 Chain identifier
23-26 Residue sequence number
27 Code for insertion of residue
31-38 X Angstrom coordinates
39-46 Y Angstrom coordinates
47-54 Z Angstrom coordinates
55-60 Occupancy
61-66 Temperature factor (B-value)
73-76 Segment identifier, left justified (used by XPLOR)
77-78 Element symbol
79-80 Charge on atom
56
Co nás dále zajímá v PDB souboru?
Teplotní faktory (B-values) - pozorovaná elektronová hustota představuje
průměr malých pohybů, vibrace atomů, což vede k mírně rozmazanému obrazu
molekuly
•Sloupec 61-66 v pdb souboru, standardní hodnoty 1-50
•Hodnoty pod 10 ukazují na model atomu, který je velmi ostrý.
•Hodnoty nad 50 ukazují, že atom se pohybuje tak moc, že může být stěží
pozorován. To je často případ pro atomy na povrchu proteinů.
Occupancy and Multiple Conformations
• postranní řetězce a ligandy se objevují ve vícero konformacích (Tyr, Arg, Lys)
• ionty kovů a jiné ligandy nemusí být přítomny ve všech molekulách
57
Low B-values are shown in blue
Two conformations of tyrosine
Refinement struktur – nejčastější programy
CCP4, obsahuje MOLREP, PHASER, Refmac
Coot, Wincoot – snadná vizualizace struktur a elektronových map
58
Refinement struktur – nejčastější programy
Phenix
CNS
59
Molecular Graphics Software
VMD – Visual molecular dynamics – vizualizace struktur
UCSF Chimera – vizualizace struktur, tvorba obrázků
60
PyMOL – vizualizace struktur, tvorba obrázků
http://pymol.org/
PyMOL is a molecular viewer, render tool, and 3D molecular editor for
visualization of 3D structures of: proteins, nucleic acids (DNA, RNA, & tRNA),
and carbohydrates, as well as small molecule structures of drug leads, inhibitors,
metabolites and other ligands including inorganic salts and solvent molecules.
• Download and unzip pymol-0_99rc6-bin-win32.zip
• Install PyMOL by clicking on "Setup.exe"
61
MGL tools
ADT – AutoDock Tools – dokování ligandů do vazebných míst
PMV – Python molecular viewer – vizualizace struktur
62
Jak prezentovat struktury?
PDB databanka
PyMOL
Pisum satium amine oxidase (PBD 1KSI)
63
Pseudomonas aeruginosa betaine aldehyde dehydrogenase (PDB 2VE5)
Řešeno na katedře biochemie
Cytokininoxidasa/dehydrogenasa
Aminoaldehyddehydrogenasa
Aminoaldehyddehydrogenasa
Ukázka elementární buňky