IF-VIDITEST anti

Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními.
Používejte ochranné pracovní pomůcky (oděv, gumové rukavice, roušku) a po práci si důkladně
umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu.
.
10. Upozornění:
a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. Kombinování složek různých šarží souprav
se nedoporučuje.
b. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií.
c. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné
kontaminaci, či kontaminaci látkami zhášejícími fluorescenci.
d. Některá kontrolní séra a anti IgG FITC konjugát jsou konzervovány azidem sodným.
Anti IgG FITC konjugát obsahuje Evansovu modř.
11. Skladování a exspirace:
Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě –18 až -28°C. Expirační doba celé
soupravy je uvedena na obalu a v certifikátu diagnostické soupravy, expirace jednotlivých složek je
uvedena na jejich obalu.Nespotřebovaná rozpuštěná kontrolní séra a konjugát rozplňte na menší objemy a uskladněte při –18 až -28°C. Vyhněte se jejich častému zmrazování a rozmrazování. Pokud skladujete séra a konjugáty při teplotě +2 až +10 °C, pak je spotřebujte do jednoho týdne.
Soupravy se přepravují v termotaškách s chladicími vložkami, doba přepravy do 72 hodin nemá na
expiraci vliv.
12. Doporučená literatura:
Anisimová E., Prachová K., Roubal J.& Vonka, V.: Effects of n-butyrate and phorbol ester (TPA)
on induction of Epstein-Barr virus antigens and cell differentiation, Arch. Virol. 81: 223–237, 1984.
Henle W. & Henle G.: Immunofluorescence in cells derived from Burkitts lymphoma, J. Bacteriol.
91: 1248–1256, 1966.
Henle W. & Henle G.: Seroepidemiology of the virus. In: The Epstein-Barr virus, pp. 61-73, eds.
Epstein M. A. & Achong B.G., Springer, Berlin, 1979.
Roubalová K., Roubal J., Staňková M., Vrbová K., Jandová M. & Kouba K.: Protilátková odpověď
proti EB viru u pacientů s infekční mononukleosou, Čas. lék. čes. 125: 337–341, 1986.
Pulvertaft R.J.: A study of malignant tumours in Nigeria in shortterm tissue cultures. J. Clin.
Pathol. 18: 261–273, 1965.
Datum poslední revize návodu: 08/2010
IF-VIDITEST anti-EA(D) EBV IgG
Návod k použití soupravy
Výrobce: VIDIA s.r.o.
Nad Safinou II č.365, Vestec
252 42 Jesenice u Prahy
Tel./fax: 261 090 566
1. Název soupravy:
IF-VIDITEST anti-EA(D) EBV – souprava pro imunofluorescenční detekci IgG protilátek proti
difúzní složce časného antigenu (EA(D)) viru Epsteina a Barrové (EBV).
2. Použití:
Souprava je určena pro detekci IgG protilátek proti EA(D) EBV. Používá se pro diagnostiku chorob
vyvolaných nebo souvisejících s EBV, jako je infekční mononukleóza, chronická aktivní EBV
infekce, Burkittův lymfom, lymfomy odvozené z Waldayerova okruhu, oportunní lymfomy
u imunosuprimovaných jedinců a nasofaryngeální karcinom. Souprava má své uplatnění i při
komplexní charakterizaci imunodeficientních syndromů a chronického únavového syndromu, kde
bývá EBV často aktivován.
3. Princip testu:
Lidská lymfomová linie buněk Raji je latentně infikována EBV a za fyziologických podmínek u ní
nedochází ke tvorbě EA. Určitými chemickými látkami lze u části populace buněk indukovat
zahájení abortivní replikace viru, která začíná syntézou EA. Z indukovaných buněk jsou připraveny
nátěry, které jsou vhodným způsobem zafixovány. Na EA obsažený v těchto buňkách se
v nepřímém fluorescenčním testu naváží lidské protilátky proti EA(D), pokud jsou přítomny
v testovaném séru. Komplex antigenu a lidské protilátky se potom zviditelní navázáním protilátky
proti lidskému IgG označené fluorescein-izothiokyanátem (FITC konjugát). Tento komplex je pak
detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu.
4. Obsah soupravy:
Rastrovaná podložní sklíčka s fixovanými nátěry indukovaných buněk Raji
0,1 mL lyofilizovaného pozitivního kontrolního séra s protilátkami
proti EA(D) EBV ve třídě IgG
0,1 mL lyofilizovaného negativního kontrolního séra bez protilátek
proti EA(D)
0,25 mL lyofilizované zvířecí protilátky proti lidskému IgG
značené fluoresceinizothiokyanátem – anti IgG FITC konjugát
s obsahem Evansovy modře
5,0 mL montovacího roztoku
5 x 2 sklíčka
d. Na takto připravené preparáty nakapejte anti IgG FITC konjugát v pracovním ředění. Preparáty
opět umístěte do vlhké komůrky a inkubujte 60 ± 5 minut při laboratorní teplotě.
1 lahvička
Nátěry buněk musejí zůstat po celou dobu inkubace vlhké.
e. FITC konjugát odsajte a preparáty promyjte v PBS (3x po 5 ± 1 minutách) a krátkým ponořením do destilované vody. Obarvený preparát umístěte ve svislé poloze na savou podložku a
nechte při laboratorní teplotě oschnout.
1 lahvička
f. Na preparát naneste dvě kapky montovacího roztoku a přikryjte krycím sklíčkem tak, aby se
nevytvořily vzduchové bubliny.
1 lahvička
1 lahvička
Certifikát diagnostické soupravy
5. Potřebný materiál a pomůcky neobsažené v soupravě:
Fosfáty pufrovaný fyziologický roztok (PBS) pH 7,2 na ředění sér, konjugátů a promývání preparátů;
destilovaná voda na rozpouštění lyofilizovaných složek soupravy; vlhká komůrka (vhodná
plastiková krabice s víkem, vyložená vlhkým savým materiálem); zkumavky a pipety na ředění sér
a konjugátů a na kapání těchto složek na sklíčka; hematologické kyvety na podložní skla k promývání preparátů; krycí sklíčka rozměru 50 x 25 mm; tužka na sklo; fluorescenční mikroskop.
6. Příprava reagencií:
Kontrolní séra rozpusťte v 0,1 mL destilované vody a řeďte dále PBS v poměru 1:10. Testovaná
séra řeďte pro orientační vyšetření 1:10. Pro titrační vyšetření, které je u diagnostiky EBV
podstatně důležitější, si připravte řadu sér v ředěních např. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 ... atd.
Ke všem ředěním testovaných sér použijte PBS.
g.
Obarvené preparáty odečítejte ihned, nebo je uchovávejte ve tmě při +2 až +10°C. Imunofluorescence je dobře patrná minimálně jeden týden po obarvení.
8. Hodnocení testu:
Obarvený preparát prohlížejte ve fluorescenčním mikroskopu v modrém excitačním světle.
Při pozitivním výsledku vykazují buňky brilantní zelenou fluorescenci. Svítit může difúzně celá
cytoplazma (zvláště v submembránové oblasti), případně cytoplazma. Imunofluorescence omezená
pouze na buněčná jádra může znamenat přítomnost autoprotilátek a nehodnotíme ji proto jako
pozitivní výsledek tohoto testu. Při negativním výsledku jsou uvedené buněčné struktury olivově
nazelenalé až temně červené. Slabá membránová fluorescence, jejíž příčinou je přítomnost
Fc receptoru, se nepovažuje za pozitivní výsledek. Preparát inkubovaný s negativním kontrolním
sérem by měl být při správném provedení testu negativní. Preparát s pozitivním kontrolním sérem
obsahuje nejméně 3 % pozitivních buněk, zpravidla však kolem 20 % (procento pozitivních buněk
je udáno v certifikátu diagnostické soupravy).
Anti IgG FITC konjugát obsahující Evansovu modř rozpusťte v 0,25 mL destilované vody a dále
řeďte 1:20 (v/v) PBS (tj. přidáte 4,75 mL PBS). Na jednu jamku potřebujete cca 30 µl FITC konjugátu, tj. 320 µl na sklíčko. Rozpuštěný konjugát před naředěním můžete skladovat při –18 až 28°C.
Při orientačním vyšetření na přítomnost protilátek v lidském séru se vyšetřuje sérum v ředění 1:10
a zjišťuje se, zda v tomto ředění vykazuje pozitivní reakci. Při titračním vyšetření se zjišťuje
nejvyšší ředění séra, které ještě vykazuje pozitivní reakci. Reciproká hodnota tohoto ředění se
uvádí jako titr protilátek proti testovanému antigenu. Pro diferenciální diagnostiku chorob asociovaných
s EBV je důležité právě titrační vyšetření protilátek proti EA(D).
7. Pracovní postup:
a. Všechny složky nechejte několik minut vytemperovat na laboratorní teplotu. Sklíčka vyjměte
z obalu. Nespotřebujete-li obě sklíčka najednou, vložte neupotřebené sklíčko ihned zpět
do sáčku, uzavřete a uložte při –18 až -28°C.
Protilátky proti EA(D) se objevují po primární infekci EBV (většinou o něco později než IgM
protilátky proti VCA) asi u 50 % případů infekční mononukleosy. Mohou být přítomny
i u reaktivací EBV. Vysoké titry protilátek proti EA(D) bývají nalézány u pacientů s EBV
pozitivním nasofaryngeálním karcinomem. Jejich nepřítomnost však nevylučuje aktivní infekci
EBV a proto musí být toto vyšetření v rámci komplexní sérologické diagnostiky EBV doplněno
ještě dalšími vyšetřeními (stanovení IgG a IgM protilátek proti VCA EBV a EBNA).
b. Sklíčka umístěte do vlhké komůrky.Na jamky sklíčka nakapejte pasteurkou nebo mikropipetou
po cca 30 μL naředěných sér. Na první jamku pozitivní kontrolní sérum, na druhou negativní
kontrolní sérum a na další jamky testovaná séra ve zvolených ředěních. Dbejte na to, aby se
kapka rozprostřela vždy po celé ploše jamky a aby se séra vzájemně neslévala. (Tomu lze zabránit obtažením jednotlivých jamek mastnou tužkou na sklo.) Uzavřete vlhkou komůrku a inkubujte 60 ± 5 minut při laboratorní teplotě.
Nátěry buněk musí zůstat po celou dobu inkubace vlhké.
c. Séra odsajte do pojistné láhve s dezinfekčním roztokem, preparáty vložte do hematologických
kyvet s PBS. Po 5 ± 1 minutách vyměňte PBS za čerstvý – promytí opakujte celkem 3x.
Z promytých preparátů opatrně odsajte zbytky PBS tak, abyste nepoškodili nátěry buněk.
9. Bezpečnostní předpisy:
Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely.
Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, protilátek anti-HIV-1,2
a HCV. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly
do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 °C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3 % roztokem
chloraminu. Séra odsávejte do pojistné láhve s 3 % roztokem chloraminu. Likvidaci obsahu pojistné láhve provádějte nejdříve po uplynutí 30 minut od skončení práce.
S FITC konjugátem a Evansovou modří pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo
sliznice, či k zasažení oka. Stane-li se , omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody.
Evansova modř je potenciální kancerogen a teratogen.