Diplomové práce absolventů studijního oboru „Kvasná chemie a

Diplomové práce absolventů studijního oboru „Kvasná chemie a

Diplomové práce absolventů studijního oboru „Biotechnologie a Biotechnologie léčiv“,
obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha
v akademickém roce 2014/2015
prof. Ing. Jan Masák, CSc., Ústav biotechnologie, VŠCHT Praha
V akademickém roce 2014/2015 se konaly na Ústavu biotechnologie Fakulty
potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha státní závěrečné zkoušky včetně
obhajob diplomových prací posluchačů magisterského studijního programu „Biochemie a
biotechnologie“ studijního oboru „Biotechnologie“ a studijního programu „Syntéza a výroba
léčiv“ studijního oboru „Biotechnologie léčiv“. Státní zkouška se v souladu se statutem
VŠCHT Praha a FPBT skládala z ověření znalostí z tématických okruhů Mikrobiologie a
buněčná biologie, Bioinženýrství, Molekulární biologie a genové inženýrství, Biotechnologie,
Bioinženýrství a inženýrské základy procesů a Farmakologie a farmakochemie. Státní
zkoušku a obhajobu diplomové práce úspěšně složilo a tím zakončilo vysokoškolské studium
celkem 31 studentů 2. ročníku magisterského studia.
Následující abecední přehled obhájených diplomových prací uvádí jméno diplomanta,
název diplomové práce, v závorce jméno vedoucího diplomové práce a pracoviště, kde byla
diplomová práce vypracována, a její stručnou charakteristiku.
Obhajoba konaná dne 3. 6. 2015
studijní obor „Biotechnologie“
Bc. Martina Brožová: Modelová predikce a skutečná adheze bakterií kazících pivo na
koloidní částice nerzové oceli (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Striktně anaerobní bakterie rodu Pectinatus a Megasphaera představují v pivovarském
průmyslu značné riziko. V této práci se vycházelo z předpokladu, že tyto anaerobní bakterie
mohou dlouhodobě přežívat i v aerobním pivovarském prostředí, díky své schopnosti
vytvářet, nebo se inkorporovat do mikrobiálních biofilmů. Cílem předložené práce bylo
vyjádřit schopnost buněk bakterií Pectinatus frisingensis DSM 20465 a Megasphaera
cerevisiae DSM 20461 interagovat s nerezovou ocelí. K predikci mikrobiální adheze na ocel
byl použit koloidní interakční model (XDLVO). Výsledky matematické predikce byly
porovnány s výsledky reálné adheze zkoumaných bakterií na částice nerezové oceli. Podle
XDLVO teorie lze nejsilnější interakce mezi buňkami zkoumaných bakterií a částicemi
nerezové oceli předpokládat v 10 mM roztoku KCl při pH 3 a pH 7. Tyto předpoklady byly
potvrzeny i experimentálně adhezními testy. Z výsledků lze formulovat také praktické závěry,
týkající se čistoty a hygieny provozu. V případě zkoumaných anaerobních bakterií je
nejvýhodnější prostředí (nejnižší míra adheze) pro zabránění adheze na nerezovou ocel
zásadité (pH 12), přičemž míru adheze na ocelové povrchy lze potlačit v celém rozsahu
hodnot pH také vyšší iontovou silou (vysoká koncentrace elektrolytu v mycím prostředku).
Model prediction and real adhesion of beer spoiling bacteria to stainless steel colloidal
particles
Strictly anaerobic bacteria of the genus Pectinatus and Megasphaera present in the brewing
industry a significant risk. In this work, based on the assumption that these anaerobic bacteria
1
can survive long term and in an aerobic brewing environment, thanks to their ability to form,
or incorporate into microbial biofilms. The aim of the study was to assess the ability of cells
Pectinatus frisingensis DSM 20465 and Megasphaera cerevisiae DSM 20461 to interact with
stainless steel. The prediction of microbial adhesion onto steel was carried out by colloidal
interaction model (XDLVO). The results of the mathematical predictions were compared with
real adhesion of bacteria onto stainless steel particles. According to XDLVO theory, the
strongest interactions between cells and stainless steel particles can be expected in 10 mM
KCl solution at pH 3 and 7. These assumptions were confirmed experimentaly by adhesion
tests. The results can also lead to practical conclusions regarding cleaning and process
hygiene. In the case of anaerobic bacteria the most suitable environment (lowest degree of
adhesion) to prevent adhesion to stainless steel is alkaline (pH 12), while the degree of
adhesion to steel surfaces can be suppressed in the entire range of pH values also by higher
ionic strength (high concentration of electrolyte in the detergent composition).
Bc. Anna Čadková: Vliv mikroelementů na kinetiku růstu a výtěžnost biomasy
mikroorganismů řádu Thraustochytriales (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT
Praha)
Tato práce se zaměřuje na vliv mikroelementů (lanthanoidů, železa, zinku) na růst a výtěžnost
biomasy mikroorganismu Schizochytrium limacinum PA968 patřícího do řádu
Thraustochytriales, což jsou mořské jednobuněčné vodní hlenky. Tyto mikroorganismy jsou
schopny produkovat velké množství polynenasycených mastných kyselin (PUFA), zejména
omega - 3 kyseliny, které mají značně příznivý vliv na lidské zdraví. V experimentální části se
práce zaměřuje na mikroelementy a jejich optimální koncentrace, které by stimulovali růst S.
limacinum PA968 při kultivaci na médiu obsahujícího odpadní solný roztok pocházející z
demineralizace syrovátky (ORS médium). Výsledky celé řady experimentů prokázaly, že
přídavek lanthanoidů a železa do kultivačního média má statisticky bezvýznamný vliv na
produktivitu biomasy S. limacinum PA968. Naopak na hranici významnosti se pohybuje vliv
koncentrace zinku. Z dalších výsledků vyplývá, že současné přidání železa (2,45 mg.l-1 ) a
zinku (1,487 mg.l-1 ) se sníženou dávkou kvasničného extraktu vedlo k nejvyšší pozorované
produktivitě biomasy S. limacinum PA968. Přidáním nízkých koncentrací mikroelementů (Fe,
Zn) do ORS média bylo možné snížit spotřebu kvasničného extraktu a tím snížit produkční
náklady na biomasu S. limacinum PA968.
The influence of microelements on growth kinetics and biomass yield of microorganisms
of the order Thraustochytriales
This work focuses on the influence of microelements (lanthanides, iron, zinc) on the growth
and biomass yield of the microorganism Schizochytrium limacinum PA968 belonging to the
order Thraustochytriales, which are marine unicellular aquatic slime molds. These
microorganisms are capable of producing large amounts of polyunsaturated fatty acids
(PUFA), particularly omega - 3 fatty acids, which have considerable beneficial effects on
human health. In the experimental part, the work focuses on micronutrients and their optimal
concentrations, which would stimulate the growth of S. limacinum PA968, when grown in a
medium containing waste brine from whey demineralization (ORS medium). Results of
numerous experiments have shown that the addition of lanthanides and iron into culture
medium has statistically insignificant effect on the productivity of S. limacinum PA968
biomass. Conversely, borderline significance on biomass productivity had the concentration
of zinc. Additional results indicate that the simultaneous addition of iron (2.45 mg.l-1 ) and
zinc (1.487 mg.l-1 ) with a reduced dose of yeast extract, led to the highest observed
productivity of S. limacinum PA968 biomass. The addition of low concentrations of
2
microelements (Fe, Zn) into the ORS medium reduced the consumption of yeast extract and
thereby reduced the production costs of S. limacinum PA968 biomass.
Bc. Andrea Heřmanová: Vliv baicaleinu na tvorbu a stabilitu biofilmu kvasinek (prof. Ing.
Alena Čejková, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Biofilmy, které vytvářejí zástupci oportunně patogenního rodu Candida, jsou příčinou mnoha
infekcí. Tyto infekce jsou zvláště zavažné, protože buňky rostoucí ve formě biofilmu jsou
velmi odolné vůči mnoha běžným antimykotikům. Z tohoto důvodu se vědci snaží nalézt jiné
cesty vedoucí k léčbě perzistentních infekcí způsobených biofilmy. Flavonoid baicalein, který
je hlavní složkou kořene Šišáku bajkalského, by mohl představovat nový směr v řešení
problémů rezistence biofilmů vůči antibiotikům. Cílem této studie bylo vyhodnotit aktivitu
baicaleinu, chitosanu a amphotericinu B proti biofilmu kvasinek Candida albicans, Candida
krusei, Candida parapsilosis a Trichosporon cutaneum. Stanovením minimálních inhibičních
koncentrací (MIC) pro suspenzní populace a minimálních koncentrací eradikující biofilmové
populace (MBEC) byla zjištěna schopnost látek inhibovat růst suspenzních buněk či biofilmu.
Byl pozorován synergický účinek na suspenzní populace v případě kombinace baicaleinu s
amphotericinem B i chitosanem. Konfokální mikroskopie ukázala, že kvasinkové buňky v
přítomnosti baicaleinu tvořily shluky. Baicalein způsoboval utlumení metabolické aktivity i
rozvolňování buněk z biofilmu. Data získána v této práci dokazují významnou antifungální
aktivitu baicaleinu proti biofilmu hub rodu Candida a vláknité kvasinky T. cutaneum.
Influence of baicalein on yeast biofilm formation and stability
Fungal biofilms, especially those of the pathogen genus Candida, are the cause of many
infections. Such infections are particularly serious, because biofilm cells are relatively
resistant to many common antifungal agents. Due to this finding, scientists are trying to find
alternative ways to cure persistent infections caused by microorganisms living in biofilm.
Flavonoid baicalein,a major component from the Scutellaria baicaleinsis root, can present a
new direction in resolving the resistance problems of biofilms. The aim of the present study
was to evaluate the activity of baicalein, chitosan and amphotericin B against yeast biofilm
Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis and Trichosporon cutaneum. The
ability to inhibit cell growth was described as minimum inhibitory concentrations (MIC) for
planktonic cells and minimum biofilm eradicating concentration (MBEC) for biofilm
populations. A synergistic effect of baicalein and amphotericin B and chitosan as well against
planktonic cells was observed. Confocal microscopy showed that yeast cells exposed to
baicalein produced a cell clusters. Baicalein caused a decrease in the biofilm metabolic
activity of cells and dispersion of cells from biofilm. In conclusion, our data confirm the
significant antifungal activity of baicalein against the biofilm of Candida species and
filamentous yeast T. cutaneum.
Bc. Markéta Ivanišová: Zvýšení trvanlivosti nefiltrovaného piva pomocí vysokého
hydrostatického tlaku (prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Nefiltrované pivo se vyznačuje obsahem živých kvasinek a proto je doba jeho trvanlivosti
omezená. Klasická tepelná pasterace pro zvyšování trvanlivosti tohoto nápoje není vhodná,
jelikož působení vysoké teploty vede nevyhnutelně k destrukci kvasinek, což nepříznivě
ovlivňuje senzorický profil. Pro účely této práce byly pro tlakovou pasteraci nefiltrovaného
piva vybrány dvě metody, které jsou průmyslově používány pro zvyšování biologické
stability džusů a ovocných šťáv. Jednalo se o ošetření 400 MPa po dobu 25 minut a 550 MPa
po dobu 10 minut. U takto ošetřených vzorků byl proveden mikrobiologický rozbor zaměřený
na množství a viabilitu pivovarských kvasinek i kontaminujících mikroorganismů a GC-MS
analýza senzoricky aktivních těkavých látek (alkoholů, karbonylů, esterů a organických
3
kyselin). Poslední část této práce byla věnována senzorickému hodnocení tlakem ošetřených
piv prostřednictvím trojúhelníkového testu shodnosti a deskriptivní analýzy, zaměřené
zejména na intenzitu ovocné, kvasnicové, autolyzační, oxidační, lepenkové a máselné chutě
piva.
Improvement of unfiltered beer shelf-life by high hydrostatic pressure
Active yeast content is a common phenomenon for non-filtered beer, which has, due to the
yeast fermentation, short shelf life. Thermal pasteurization is not suitable for biological
stabilization of non-filtered beer for the reason of that the heat damages sensory profile
because of the yeast destruction. Two methods, which are used in food industry for
stabilization of fruit juices, were chosen to be applied on the beer. The first method uses
hydrostatic pressure treatment of 400 MPa, for 25 min. whereas the second one uses 550 MPa
for 10 min. High-pressure treated samples were microbiologically examined, focusing on the
viability of the yeasts and the contaminating bacteria, obtaining their total numbers. Profile of
sensory volatile compounds (alcohols, carbonyls, esters and organic acids) was gathered,
being analyzed with GC-MS. The last part of this work was dedicated to the sensory
evaluation, the two types of sensory analyses were undertaken – Triangle Test of Similarity
and Descriptive Analysis, which was focused on evaluating of intensities of fruity, yeasty,
oxidative, cardboard, buttery flavor and autolysis off-flavor.
Görkem Koyun: Production of microalgal exopolysaccharides by Distyosphaerium
chlorelloides (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Microalgae are capable of producing numerous valuable compounds including
exopolysaccharides (EPS) with wide industrial applications in food, pharmaceutical and
cosmetic industries. The amount and properties of EPS produced depend on many factors
such as species employed, cultivation conditions and the type of bioreactors used. Fresh water
green algae Dictyosphaerium chlorelloides (CCALA 330) has the ability to produce EPS in
the late stationary phase. The optimum growth and EPS production conditions were
determined in laboratory scale photobioreactors (PBR). Macronutrients limitation was proved
as an effective method for enhancement of EPS production due to earlier induction of
stationary phase. The effect of different nitrogen sources on growth and EPS production was
examined and the microalgae exhibited the fastest initial growth in media containing
ammonium nitrate. Accordingly, the earlier start of stationary phase was stimulated and the
EPS concentration reached 9.3 g.l-1 at the end of 16 days. A new methodology was developed
for separation of cells from culture broth containing EPS. Due to the strong attachment
between cells and EPS, high-pressure homogenization was carried out before centrifugation
process. Subsequently, EPS in supernatant was isolated by using ultrafiltration.
Bc. Lukáš Linha: Biofiltrace těkavých látek za použití termofilní populace (doc. Ing.
Martin Halecký, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tato práce se zabývá degradací organických těkavých látek emitovaných do životního
prostředí v odpadních plynech pomocí termofilních mikroorganismů. První část práce byla
zaměřena na izolaci a kultivaci termofilních mikroorganismů schopných degradace vybraných
těkavých organických látek a přípravy inokula pro kombinovaný biofiltrační reaktor. Čisté
mikrobní kmeny byly podrobeny identifikaci a základním testům, v nichž byla ověřena
schopnost degradace vybraných látek a teplotní rozmezí růstu. Identifikace odhalila
přítomnost rodů Bacillus, Geobacillus, Aeribacillus a Breavibacillus. Druhá část práce
zahrnuje biofiltraci plynu kontaminovaného směsí těkavých organických látek (ethyl acetát,
propionová kyselina, triethylamin a α-pinen) při 55 °C. Byla stanovena eliminační kapacita
pro jednotlivé látky při různých vstupních podmínkách, kdy se měnily hodnoty vstupní
4
koncentrace, průtoku plynu a organické zátěže. Nejlépe byl odstraňován ethyl acetát a nejhůře
triethylamin. S výjimkou testů při 25 °C byla koncentrace rozpuštěného kyslíku rovna nule,
biologické
procesy při 55 °C tedy byly limitovány kyslíkem. Kromě rozpuštěných
vstupujících látek byly detekovány také metabolity a to formaldehyd, acetaldehyd, mravenčí
kyselina, octová kyselina, butanol, aceton, L-pinokarveol, 2-pinen-4-on a cis-karveol. Byla
také pozorována schopnost bioreaktoru účinně odstraňovat polutanty i při teplotě 25 °C.
Biofiltration of volatile compounds using thermophilic population
This thesis deals with the thermophilic degradation of volatile organic compounds emitted
into the environment from waste gases. The first part was focused on the isolation and
cultivation of thermophilic microorganisms with the ability to degradation of selected volatile
organic compounds and further on the preparation of inoculum for the combined bioreactor.
The microbial strains were identified and tested on degradation ability of selected substances
and on temperature ranges for growth. The identification revealed the presence of the genera
Bacillus, Geobacillus, Aeribacillus and Breavibacillus. The second part of the work was
focused on biofiltration of a gas contaminated with mixture of volatile organic compounds
(ethyl acetate, propionic acid, triethylamine, and α-pinene) at 55 °C. The elimination capacity
was determined for each compound at various input conditions when inlet concentration,
volumetric flow rate and organic load were changed. Ethyl acetate was removed with the
highest removal efficiency and triethylamine with the lowest removal efficiency. Except for
the degradation tests at 25 °C, dissolved oxygen level was zero, thus the oxygen limitation
ocurred. Beside the entering substances, the dissolved metabolites were detected, namely,
formaldehyde, acetaldehyde, formic acid, acetic acid, butanol, acetone, L-pinocarveol, 2pinene-4-one and cis-carveol. It was also observed an ability of bioreactor to degrade
pollutants effectively even at 25 °C.
Bc. Aneta Lučoková: Identifikace produktů termických a oxidačních reakcí polyfenolů
ječmene a chmele (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce byla věnována studiu degradačních reakcí polyfenolových sloučenin
sladu a chmele v modelových a čtvrtprovozních podmínkách. V modelových experimentech
byla u 21 polyfenolových sloučenin sledována míra degradační reakce a vznik nových
produktů, k jejichž identifikaci bylo využito kombinace HPLC s UV detekcí a UHPLC s
vysokorozlišovací tandemovou hmotnostní spektrometrií. U pěti zkoumaných polyfenolů byla
prokázána úplná degradace za daných podmínek a u dalších devíti přesahovala míra
degradace 70 rel. %. Bylo zjištěno, že na míru termické a oxidativní degradace polyfenolů má
zásadní vliv nejen teplota prostředí a koncentrace kyslíku, ale i počet a poloha navázaných
substituentů, případně také vzdálenost karboxylové skupiny od aromatického jádra
fenolových kyselin. Výsledky modelové studie byly ověřeny i v reálných podmínkách
čtvrtprovozních sladovacích pokusů. Byl potvrzen rozhodující vliv dotahování na obsah
polyfenolů, nicméně velmi významný je i vliv podmínek klíčení, zejména s ohledem na
uvolňování polyfenolových látek z vazby na ostatní složky zrna.
Identification of thermal and oxidative transformation products of polyphenols derived
from barley and hops
This thesis describes the degradation reactions of polyphenolic compounds derived from hops
and malt under model and pilot-scale malting conditions. Most attention was paid to the effect
of oxygen and metal ions presence, as well as increased temperature. Under the model
conditions, the extent of degradation reaction of 21 polyphenolic compounds and the
corresponding products were studied. These new products were identified by HPLC
accompained with UV detector and UHPLC-HRMS/MS. Five compounds were degraded
5
completely and another nine by more than 70 rel.%. It was shown that the extent of the
polyphenol degradation strongly depends not only on temperature and the concentration of
oxygen, but also on the number and position of substituents, and in the case of phenolic acids
also on the distance between the carboxyl group and the aromatic ring. The results were
confirmed by pilot-scale malting tests. The kilning temperature was proven as a decisive
factor for the changes in content of polyphenols, although the germination conditions have
also significant influence, mainly due to release of polyphenols from fractions bound to other
constituents of the grain.
Bc. Lilla Melczer: Vliv složení média a kultivačních podmínek na obsah
polynenasycených mastných kyselin v biomase mikroorganismů řádu Thraustochytriales
(doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Kyselina dokosahexaenová (DHA, n-3) patří mezi polynenasycené mastné kyseliny a
představuje důležitou esenciální látku v lidské výživě. Vhodným alternativním zdrojem DHA
mohou být jednobuněčné mořské mikroorganismů. Vodní hlenky Japonochytrium marinum a
Schizochytrium limacinum z řádu Thraustochytriales akumulují vysoké množství lipidů, ve
kterých je značný podíl omega-3 polynenasycených mastných kyselin. V této práci byl
studován vliv složení média a vybraných kultivačních podmínek na výtěžek DHA v biomase
dvou zástupců řádu Thraustochytriales. Základem nově navrženého média byl odpadní solný
roztok pocházející z procesu odsolování sladké syrovátky. Byl zkoumán vliv teplotního stresu
a limitace živinami na tvorbu biomasy a na produkci lipidů. Zjistilo se, že limitace dusíkem
vede v případě S. limacinum ke zvýšení množství lipidů v biomase o 29,82 % hm., zatímco u
J. marinum o 27,28 % hm. Snížením kultivační teploty (na 23 °C) ve fázi akumulaci lipidů
bylo u J. marinum dosaženo zvýšení obsahu lipidů o 11 % hm. Dále bylo při fed-batch
kultivaci J. marinum dosaženo koncentrace suché biomasy 26,02 g/l s obsahem celkových
lipidů 72,24 % hm., z nichž 63,25 % hm. byly mastné kyseliny. Studovaný proces se v této
fázi vývoje jeví z hlediska produktivity i výrobních nákladů jako perspektivní.
The influence of medium composition and cultivation conditions on the polyunsaturated
fatty acid content in microorganisms of the order Thraustochytriales
Docosahexaenoic acid (DHA, n-3) belongs among polyunsaturated fatty acids and it is an
important and essential component in human diet. A suitable alternative source of DHA can
be marine unicellular microorganisms. Water slime molds Japonochytrium marinum and
Schizochytrium limacinum, from the order of Thraustochytriales, accumulate high amounts of
lipids, which contain a significant amount of omega-3 polyunsaturated fatty acids. In this
work, the effect of medium composition and selected cultivation conditions on yield of DHA
in biomass of two Thraustochytrids was studied. The new medium was based on waste brine
from desalination process of sweet cheese whey. The influence of thermal stress and nutrient
limitations on the formation of the biomass and production of lipids was studied. It was found
that nitrogen limitation leads in the case of S. limacinum to increase of lipid content in
biomass by 29.82 % wt., while for J. marinum by 27.28 % wt. Lowering the culture
temperature (to 23 °C) in the phase of lipid accumulation using J. marinum increased the lipid
content by 11 % wt. Furthermore, during fed-batch cultivation of J. marinum in laboratory
bioreactor, dry biomass concentration of 26.02 g/l was reached, with total lipids content of
72.24 % wt., of which 63.25% wt. were fatty acids. The studied process at this stage of
development appears to be in terms of productivity and production costs as promising.
Bc. Natálie Moravcová: Fenotypová analýza produkce rhamnolipidů (prof. RNDr.
Vladimír Jirků, DrSc., ÚB VŠCHT Praha)
6
Rostoucí snaha o nahrazení některých syntetických surfaktantů látkami biologického původu,
tj. biosurfaktanty produkovanými mikrobiálními producenty, vyžaduje (mimo další) detekci
faktorů, které indukují i potlačují jejich biosyntézu. Produkce rhamnolipidů je závislá na
mnoha faktorech, zejména pak na produkčním mikroorganismu, způsobu vedení kultivace,
složení média, pH, teplotě, míchání či vzdušnění. V tomto kontextu, byla předcházející
charakterizace třech producentů vícesložkových směsí rhamnolipidů: Acinetobacter
calcoaceticus, Enterobacter asburiae a Pseudomonas aeruginosa 188, získaných ze sbírky:
ARS Culture Collection (Bacterial Foodborne Pathogens and Mycology Research Unit,
USA), doplněna charakteristikou vlivu složení média a vlivu dvojmocných kationtů. Další
(fenotypově necharakterizovaný) producent rhamnolipidů: Enterobacter hormaechei (ARS
Culture Collection) byl použit pro detekci vlivu již dříve testovaných zdrojů C a N (viz výše
uvedené kmeny). Výsledky získané v této souvislosti umožnily pro tento kmen navrhnout
různé poměry C/ N, a tyto ověřit jako faktory ovlivňující reprodukovatelnost s růstem spojené
produkce rhamnolipidů. Dále se práce zabývá vlastnostmi směsi rhamnolipidů produkované
na upraveném médiu.
Phenotype analysis of the rhamnolipid production
The increasing effort to replace some of the synthetic surfactants by compounds of biological
origin, that is, by biosurfactants produced by microbial producers, needs to detect the
inducing as well as supressing factors of their biosynthesis, among others. Rhamnolipid
production is dependent on a large scale of factors, such as the used microorganism, way of
leading the cultivation proces, medium composition, pH, temperature, stirring and aeration
level. In this context, three bacterial producers of the multicomponet rhamnolipid mixtures:
Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter asburiae and Pseudomonas aeruginosa 188,
obtained from the ARS Culture Collection (Bacterial Foodborne Pathogens and Mycology
Research Unit, USA) were used (further to the preliminary screening assayes) to elucidate the
effect of divalent cations. Another (not phenotypically described) rhamnolipid producer:
Enterobacter hormaechei (ARS Culture Collection) was used to find out the effect of a few
already tested carbon and nitrogen sources (above strains). In this connection, the results
obtained made it possible to suggest different C/N ratios and verify their effect as factors
affecting reproducibly the yield and pattern of growth-associated production of rhamnolipids.
After modulation of the medium the thesis than deals with the properties of the produced
rhamnolipid mixture.
Bc. Vít Paulíček: Struktura a vlastnosti biofilmů vláknitých eukaryot (prof. Ing. Jan
Masák, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Cílem této práce bylo stanovit podmínky pro reprodukovatelný vznik a kultivaci vláknitých
biofilmů (způsob inokulace, materiál nosiče, kultivační teplota a doba kultivace), nalézt
vhodnou metodu pro jejich kvantifikaci a vizualizaci, a tím umožnit následné sledování vlivu
antibiotik a přírodních látek na jejich tvorbu. Jako modelové mikroorganismy byly vybrány
Aspergillus fumigatus a Trichosporon cutaneum. Pro kvantifikaci biofilmu byl použit
automatický mikroskop se softwarem umožňujícím obrazovou analýzu (Cellavista), barvení
biofilmu krystalovou violetí, gravimetrie a kvantifikace metabolické aktivit metodou XTT.
Vizualizace biofilmu byla prováděna pomocí konfokální mikroskopie (SDCM). Rovněž jsme
se zabývali sledováním vlivu amfotericinu B (polyenové antibiotikum) a chitosanu
(deacetylovaný derivát chitinu) na tvorbu biofilmu vybraných mikroorganismů. Vhodná
počáteční koncentrace inokula pro tvorbu biofilmu A. fumigatus byla stanovena jako 104 a
106 konidií/ml (v závislosti na použité inokulační metodě). Vhodná kultivační teplota jako
37 °C a doba kultivace na polystyrenovém nosiči, 96-ti jamkové mikrotitrační destičce i
titanových nosičích Ti6Al4V jako 72 h. Dále bylo zjištěno, že chitosan o koncentraci 25 mg/l
7
vykazuje výrazné inhibiční účinky vůči tvorbě biofilmu A. fumigatus. Oproti tomu aplikace
chitosanu (koncentrace 15 mg/l, 75 mg/l a 150 mg/l) vedla k významnému zvýšení tvorby
biofilmu T. cutaneum na titanových nosičích Ti6Al4V.
The structure and characteristies of filamentous eukaryotes biofilms
Our study is aimed to find a procedure how to obtain a biofilm with reproducible properties
(method of inoculation, cultivation temperature, carrier material, length of cultivation) and the
suitable methods of biofilm quantification and visualization. Based on these results, the effect
of antibiotics and natural substances on biofilm could be observed. As a model
microorganisms Aspergillus fumigatus and Trichosporon cutaneum were chosen. For
quantifications of biofilms were used colorimetric method based on the staining of biofilms
by crystal violet, the quantification of metabolic activity by XTT assay, gravimetry and image
analysis by automatic microscope Cellavista. Visualisation was performed by confocal
microscopy (SDCM). The effect of amphotericin B (polyene macrolide antibiotic) and
chitosan (deacetyled derivate of chtitin) towards biofilms was studied. Based on our
experiments with A. fumigatus, concentration of inoculation suspension as 104 and 106
conidia/ml (depending on a method of inoculation), cultivation temperature as 37 °C and
length of cultivation as 72 h were determined as suitable conditions. The cultivations of
biofilms were realized on polystyrene carriers, polystyrene 96 multi wells and titan carriers
(alloy Ti6Al4V). It was confirmed that chitosan (in concentration 25 mg/l) has inhibitory
activity against A. fumigatus biofilm. On contrary to the application of chitosan in
concentration range (15 mg/l, 75 mg/l and 150 mg/l) which resulted in a significant increase
of T. cutaneum biofilm formation on titanium carriers (alloy Ti6Al4V).
Bc. Jana Smolová: Sklízení jednobuněčných sladkovodních řas metodou flokulace (doc.
Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Řasová biomasa je využitelná k výrobě biopaliv a mnoha dalších látek s přidanou hodnotou.
Sklízení jednobuněčných řas se v průmyslovém měřítku provádí např. centrifugací, ale jelikož
řasová biomasa dosahuje při fototrofních kultivacích obvykle jen velmi malých koncentrací
(0,5 až 5 g.l-1), je nutné zpracovávat velké objemy, což je energeticky náročné. Proto je snaha
řasovou biomasu nejprve více zakoncentrovat. Jednou z možností je použití metody flokulace.
Tato práce se zabývá sklízením zelené řasy Chlorella vulgaris pomocí dvou flokulačních
činidel, která byla připravena z vedlejších produktů pivovarského průmyslu, konkrétně se
jedná o použité kvasinky a mláto. Tyto materiály lze účinně modifikovat pomocí činidla 2chloro-N,N-diethylamin hydrochloridu (DEAE). Takto připravená kationtová činidla velmi
dobře interagují se záporně nabitými buňkami řas a způsobují tak jejich flokulaci. V
provedených flokulačních experimentech byla tato činidla testována jak v modelovém
prostředí 10 mM KCl, tak v reálných podmínkách kompletních. Pro každé prostředí byla
určena dávka flokulačního činidla (mg/g) účinná pro nejméně 90 % účinnost flokulace. Byla
provedena bilance výrobních a provozních nákladů vyvinutých flokulantů a tyto ekonomické
parametry byly srovnány s flokulačními činidly z dostupné literatury.
Harvestinf of freshwater microalgae by flocculation
Algal biomass is applicable for production of biofuels and a number of other added value
substances. Harvesting of unicellular algae at industrial level is carried out e.g. by
centrifugation. However, since the algal biomass during phototrophic cultivation achieves
usually very low concentrations (0.5 to 5 g.l-1), it is necessary to handle large volumes of
liquids, which increases energy costs. Therefore, there is an effort to concentrate the algal
biomass and the method of flocculation is one of the options. This work deals with the
harvesting of green algae Chlorella vulgaris using two flocculating agents, which were
8
prepared from brewing industry by-products, namely waste yeast and spent grains. These
materials can be effectively modified using the reagent 2-chloro-N,N-diethylamine
hydrochloride (DEAE). These newly prepared cationic reagents interact well with negatively
charged algae cells and cause their flocculation. In the performed flocculation experiments
these reagents were tested both in model environment of 10 mM KCl, and under real
conditions. For each environment the dose of flocculant (mg/g) leading to at least 90 %
flocculation efficiency was determined. A balance of production and operating costs was
carried out for each flocculant and these economic aspects were compared with data on
flocculating agents available from the literature.
Bc. Andrej Suchánek: Vliv kultivačních podmínek na produkci rhamnolipidů (Ing. Olga
Schreiberová, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Rhamnolipidy jako povrchově aktivní látky biologického původu přitahují pozornost, protože
představují ekologickou alternativu k jejich syntetickým protějškům. Velká výhoda v použití
biosurfaktantů oproti chemickým surfaktantům spočívá v jejich velmi malé toxicitě a vysoké
stabilitě vůči extrémním vnějším podmínkám prostředí (pH, obsah solí, teplota). V nízkých
koncentracích rhamnolipidy zároveň nabízí vyšší aktivitu v kombinaci s velmi dobrou
biologickou degradovatelností, což z nich dělá ekologicky šetrné sloučeniny. Biosurfaktanty
nabízejí možnost širokého uplatnění například ve farmaceutickém, potravinářském a
kosmetickém průmyslu, využití nachází také v ochraně životního prostředí při degradacích
hydrofobních polutantů. Biosyntéza rhamnolipidů je regulována složitým genetickým
regulačním systémem. Ve značné míře také závisí na vnějších podmínkách kultivace, jako
jsou například teplota, pH, či složení média. Tato práce je zaměřena na sledování produkce
rhamnolipidů v reaktoru pod vlivem vnějších podmínek kultivace a také systému quorum
sensing. Byl sledován vliv přídavku jak autoinduktorů tak inhibitorů QS a také vliv
vzdušnění, pH, teploty, salinity a zdroje uhlíku. Zkoumána byla také možnost změny vedení
kultivace. Byl také pozorován průběh koncentrace HSL molekul během kultivace na produkci
rhamnolipidů.
The influence of cultivation conditions on rhamnolipid production
Rhamnolipids as surfactants of biological origin logically attract attention. They represent
ecological alternative to their syntetic counterparts. A great advantage in using biosurfactants
over chemical surfactants is their low toxicity, high stability against extreme environmental
conditions (pH, salt content, temperature). At low concentrations, rhamnolipids offer higher
activity and in combination with very good biodegrability they are environmentally friendly
compounds. Biosurfactants offer the possibility of wide application such as pharmaceutical,
food and cosmetic industries, as well as in environmental protection by enhancing the
degradation of hydrophobic pollutants. Biosynthesis of rhamnolipids is regulated by a
complex genetic regulatory system. In a great manner it also depends on external culture
conditions, such as temperature, pH or medium composition. Aim of this work is to monitor
the ramnolipid production in laboratory bioreactor under the influence of external culture
conditions and also quorum sensing system. The effect of the addition of autoinducer and
inhibitors of quorum sensing system, aeration, pH, salinity and carbon source, as well as
change of cultivation strategies was examined.
Bc. Magda Ševčíková: Odbourávání směsí nitroaromatických látek v různých typech
reaktorů volnými a imobilizovanými buňkami (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚB VŠCHT
Praha)
Cílem této práce bylo zkoumat odbourávání směsí nitrofenolů a nitrotoluenů z modelové
odpadní vody imobilizovanými buňkami v jednostupňovém a dvoustupňovém náplňovém
9
reaktoru a volnými buňkami směsné mikrobiální populace a posoudit vliv jednotlivých látek
na odbourávání ostatních látek ve směsi. Rychlost odbourávání imobilizovanými buňkami
byla 10x větší než u volných buněk v suspenzi. Nejvyšší dosažená rychlost odbourávání v
náplňovém reaktoru byla 37,9 mg.l-1 .h-1 . Pro odbourávání směsí špatně odbouratelných látek
se ukázal vhodný dvoustupňový reaktor tvořený dvěma sériově zapojenými náplňovými
reaktory. Tento systém vykazoval vyšší celkovou účinnost odbourávání a vyšší stupeň
nitrifikace uvolněných dusitanů. U třepaných baněk s volnými buňkami byla prokázána
interakce mezi mononitrofenoly a mononitrotolueny jak na substrátové úrovni, tak kompetice
mezi degradéry mononitrofenolů a mononitrotoluenů ve směsné populaci. Velkým vlivem
byla prokázána adaptace. Rychleji se indukovala degradace mononitrofenolů než
mononitrotoluenů. Nejobtížněji odbouratelný substrát a nejhorší růstový substrát byl 3nitrotoluen. Účinnost odbourávání byla zvýšena pouze prodloužením doby zdržení, nikoliv
však přídavkem kosubstrátů. Ty zvýšily pouze nárůst mikroorganismů, které se nepodílejí na
degradaci 3-nitrotoluenu.
Degradation of nitroaromatic compound mixtures in various reactor types by free and
immobilized cells
The objective of present study was to explore biodegradation of nitrophenol and nitrotoluene
mixtures by immobilized cells in a single-stage or double-stage aerated biofilters and by
suspended cells of a mixed microbial culture and to evaluate the effects of individual
nitroaromatic compounds on the biodegradation of other compounds in the mixture. The rate
of degradation by immobilized cells was 10x higher than that of free suspended cells.
Maximal degradation rate in the bioreactor was 37,9 mg.l-1 .h-1 . For the efficient degradation
of recalcitrant mixtures, a double-staged bioreactor was used, consisting of two serially
connected biological aerated filters. This system showed higher total removal efficiency and
higher level of nitrification of released nitrites. Upon the degradation of mononitrophenol and
mononitrotoluene mixtures, interactions on the substrate level were observed as well as the
competition between mononitrophenol and mononitrotoluene degrading microorganisms in
the mixed population. Adaptation had a huge influence on the degradation rate. Degradation
of mononitrophenols was induced faster than that of mononitrotoluenes. 3-Nitrotoluene was
found to be the least biodegradable substrate. Its removal efficiency could be improved only
by increasing the hydraulic retention time. The addition of glucose as a co-substrate did not
affect 3-nitrotoluene removal efficiency, only increased the growth of biomass in the reactor.
Bc. Veronika Zajícová: Produkce mastných kyselin psychrofilními kvasinkami (Ing. Irena
Kolouchová, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Mastné kyseliny jsou významné sloučeniny s širokým uplatněním. Mezi nejzajímavější
mastné kyseliny patří esenciální mastné kyseliny ω3 a ω6. Tyto kyseliny mají významné
postavení ve výživě člověka, a proto se využívají jako doplněk stravy. Mezi významné
esenciální mastné kyseliny patří linolová (18:2), α-linolenová(18:3), arachidonová,
eikoisapentaenová (EPA) a dokosahexaenová (DHA). V dnešní době jsou tyto mastné
kyseliny získávány především z ryb. Nicméně stále stoupá zájem o výzkum nových zdrojů
pro jejich výrobu. Mezi možné alternativy by se mohly zařadit psychrofilní kvasinky.
Psychrofilní kvasinky si vyvinuly řadu mechanismů, které jim umožňují adaptaci na chladné
prostředí. Mezi tyto mechanismy také patří vyšší obsah nenasycených mastných kyselin v
buněčné membráně. V předložené práci jsme se proto zaměřili na studium profilu mastných
kyselin u vybraných psychrofilních kvasinek Cryptococcus vistoriae, Cystofilobasidium
capitatum, Holtermanniella wattica, Kondoa malvinella, Mrakiella aquatica, Mrakiella
cryoconiti a Rhodotorula lignophila získaných ze sbírky DBVPG Industrial yeast collection, a
Trichosporon sp. izolované z jeskyně Domica na Slovensku. V první části experimentální
10
práce byl sledován růst studovaných mikroorganismů v závislosti na čtyřech teplotách (4 °C,
10 °C, 20 °C a 28 °C). Druhá část práce je pak věnována kvantitativní a kvalitatinví analýze
lipidů v získané biomase.
Production of fatty acids by psychrophilic yeasts
Fatty acids are important compounds having a wide range of applications. Among the most
interesting fatty acids belong essential fatty acids ω3 and ω6. These acids have high status in
human nutrition; therefore they are used as dietary supplement. The important essential fatty
acids include linoleic (18:2), α-linolenic (18:3), arachidonic, eicosapentaenoic (EPA) and
docosahexaenoic acid (DHA). Nowadays, these fatty acids are primarily obtained from fishes.
Nevertheless, there is still increasing interest in new resources for their production. Among
possible alternatives could sort psychrophilic yeast. Psychrophilic yeast developed several
mechanisms which enable them adaptation in cold environment. Among these mechanisms
belongs, beside others, the increased representation of unsaturated fatty acids in the cell
membrane. In the submitted thesis, we focus on the study of the fatty acid profile of selected
psychrophilic yeast: Cryptococcus vistoriae, Cystofilobasidium capitatum, Holtermanniella
wattica, Kondoa malvinella, Mrakiella aquatica, Mrakiella cryoconiti and Rhodotorula
lignophila obtained from the collection DBVPG Industrial yeast collection and the
Trichosporon sp. isolated from a cave in Slovakia. The first part of the experimental work was
the monitoring of growth and accumulation of studied microorganisms in relation to different
temperatures of cultivation (4 °C, 10 °C, 20 °C and 28 °C). The second part of the study is
devoted to the qualitative and quantitative analysis of lipids present in the gained biomass.
Bc. Karel Zeman: Antibiofilmová aktivita rhamnolipidů (prof. Ing. Jan Masák, CSc., ÚB
VŠCHT Praha)
Biofilmy jsou společenství jednoho či více mikroorganismů, žijících přisedle na fázovém
rozhraní. V případě patogenních mikroorganismů je tvorba biofilmu nežádoucím efektem,
jelikož se buňky v tomto stavu stávají odolnějšími vůči vnějším vlivům. Tato odolnost
vychází z tvorby tzv. extracelulárního matrixu, který například zvyšuje rezistenci vůči
antibiotikům. Z tohoto důvodu je nutné nalézt nové strategie k zabraňování tvorby a eradikaci
biofilmu. Jednou z možností je použití biosurfaktantů, které jsou schopné destabilizovat
strukturu biofilmu, ovlivňují hydrofobitu povrchových struktur buněk a v některých případech
mají antibakteriální účinek. Zároveň jsou biodegradovatelné a méně toxické, což je značnou
výhodou oproti chemickým surfaktantům. Tato práce je zaměřena na sledování eradikace
biofilmu podmíněně patogenní kvasinky Trichosporon cutaneum, aplikací rhamnolipidových
směsí různého složení. Eradikace biofilmu je sledována za statických i dynamických
podmínek na skleněném povrchu. Vyhodnocení eradikace biofilmu je prováděno analýzou
obrazu.
Antibiofilm aktivita of rhamnolipids
Biofilm is a group of one or more microorganisms living adherent to the surface on a phase
boundary. Formation of biofilm is, in the case of pathogenic microorganisms, undesirable as
cells become more resistant to external influence. This resilience is based on the cells being
embedded within self-produced extracellular matrix which, for example, heightens their
antibiotics resistance. This improved endurance makes finding new strategies of how to
forestall, or outright destroy biofilm essential. One of the options is to use bio surfactants as
they destabilize biofilm´s structure, influence cellular surface structure hydrophobicity and
may even possess, in certain cases, antibacterial qualities. Moreover, unlike many chemical
surfactants, these compounds are biodegradable and less toxic which is a considerable
advantage. This thesis is focused on pathogenic yeast Trichosporon cutaneum biofilm
11
eradication by application of rhamnolipidic mixtures of various composition. Biofilm
eradication is studied under both static and dynamic conditions on glass surface. Image
analysis is then used for biofilm eradication evaluation.
Obhajoba konaná dne 4. a 5. 6. 2015
studijní obor „Biotechnologie léčiv“
Bc. David Kadlec: Syntéza a vlastnosti 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerolu (Ing. Iveta
Hrádková, Ph.D., ÚMTK VŠCHT Praha)
Diplomová práce se věnuje vlastnostem parabenů a syntéze jejich polárnějšího analogu 1-O(4-hydroxybenzoyl)-glycerolu, jenž byl připraven transesterifikací methylparabenu
s glycerolem za velmi vysoké teploty.
Byly
zkoumány
a
vzájemně
porovnávány
vlastnosti
standardu
(kyselina
p-hydroxybenzoová), komerčně dostupných parabenů (methyl-, ethyl- a propylparaben)
a syntetizovaného 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerolu. Bodu tání a NMR bylo použito
pro identifikaci připravené sloučeniny. Byla určována rozpustnost ve vodě (25 °C).
A zejména se stanovovala antimikrobiální aktivita uvedených konzervantů. Indikátorovými
kmeny byly: gramnegativní bakterie Escherichia coli CCM 4787, grampozitivní bakterie
Staphylococcus aureus CCM 4516, kvasinka Saccharomyces cerevisiae DMF 1017 a plíseň
Fusarium culmorum DMF 0103. Inhibiční účinky parabenů byly zkoumány v modelovém
systému (mikrotitrační destičky) i v reálném systému emulzního kosmetického přípravku.
Prokázalo se, že s rostoucí délkou alkylového řetězce rozpustnost parabenů
ve vodě klesá, zatímco jejich konzervační účinnost vzrůstá. Testované konzervanty
vykazovaly především antifungální aktivitu. V reálném systému emulze působil
1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerol na mikroorganismy silnější inhibiční aktivitou
než ostatní parabeny.
Synthesis and properties of 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerol
This thesis is devoted to properties of parabens and synthesis of their more polar analogue, 1O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerol,
which
was
prepared
by
trasesterification
of methylparaben with glycerol at very high temperature.
Properties of standard (p-hydroxybenzoic acid), commercially available parabens (methyl-,
ethyl- and propylparaben) and synthesized 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerol were researched
and
compared
mutually.
Melting
point
and
NMR
were
used to identification of the prepared compound. The solubility in water (25 °C) was
determined. In particular, antimicrobial activity of the mentioned preservatives was
determined. The indicator strains of microorganisms were: Gram-negative bacterium
Escherichia coli CCM 4787, Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus
CCM 4516, yeast Saccharomyces cerevisiae DMF 1017 and mould Fusarium culmorum
DMF 0103. The inhibitory effects of parabens were studied in the model system (microplates)
and in the real system of an emulsion cosmetic product.
It
was
demonstrated,
that
paraben
solubility
in
water
decreases
with the increased alkyl ester chain length, whereas preservative efficiency
of parabens increases. The tested preservatives showed the antifungal activity, especially. In
the
real
system
of
an
emulsion,
1-O-(4-hydroxybenzoyl)-glycerol
had
an effect on microorganisms with stronger inhibitory activity than other parabens.
12
Bc. Kristýna Bajerová: Vliv nanočástic železa na růst mikrobních populací (prof. Ing.
Alena Čejková, CSc., ÚB VŠCHT Praha)
Nanočástice nulamocného železa se primárně používají díky svým výborným redukčním
vlastnostem při čištění kontaminovaného prostředí. Vysoká reaktivita však přispívá k toxicitě
nanočástic, která se projevuje především vznikem oxidativního stresu. Vzhledem k
cytotoxickým účinkům se hledají způsoby možné protekce. Jedním ze způsobů, jak ochránit
mikroorganismy před toxicitou nanočástic bez ovlivnění jejich reaktivity, je aplikace
huminových látek, které mohou interagovat s mikroorganismy nebo nanočásticemi a bránit
tak fyzické interakci nanočástic s buněčným povrchem. Experimentální část je zaměřena na
studium vlivu nanočástic železa nulové valence na přítomnost oxidativního stresu u
prokaryotní (Rhodococcus erytrhopolis) a eukaryotní (Trichosporon cutaneum) buněčné
populace. Další část byla zaměřena na omezení toxického účinku nanočástic nulamocného
železa aplikací huminových kyselin. Po expozici buněk nanočásticím železa a huminových
kyselin byly sledovány změny vybraných projevů oxidativního stresu – peroxidace lipidů,
karbonylace proteinů, akumulace reaktivních forem kyslíku a aktivita superoxiddismutasy.
Influence of iron nanoparticles on the growth of microbial populations
Nanoscale zero-valent iron particles are primarily used because of their excellent properties in
the treatment of the environment as remediation agents. However, the high reactivity of
nanoscale iron particles contributes to their toxicity that is manifested mainly as an oxidative
stress. Because of the cytotoxicity, possible means that would allow to protect the cells are
searched for. The application of humic substances is one of ways to protect microorganisms
and preserve the reactivity of nanoparticles at the same time. Humic substances are able to
interact with both microorganisms and nanoparticles and thus hider the physical interactions
of nanoparticles with cell surface. The first part of this experimental work was focused on the
effect of nanoscale zero-valent iron particles on the presence of oxidative stress in prokaryotic
(Rhodococcus erythropolis) and eukaryotic (Trichosporon cutaneum) cell population. Another
part of the experimental work was aimed on the topic of reducing the toxic effects of zero
valent iron nanoparticles by application of humic substances. Changes in selected
manifestation of oxidative stress – lipid peroxidation, protein karbonylation, the accumulation
of reactive oxygen species and the activity of superoxide dismutase – were observed after
cells were exposed to the zero-valent iron nanoparticles and humic acids.
Bc. Eliška Beldíková: Hodnocení chování mikro/nanoenkapsulovaných nutraceutik v invitro modelovém trávicím systému (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Kurkuma, látka s nízkou toxicitou, má zároveň široké spektrum biologických a
farmaceutických vlastností, kam patří například protinádorová, antioxidační či antivirová
aktivita. Kurkuma má však kvůli své nízké rozpustnosti ve vodě i velmi nízkou biologickou
dostupnost. Z tohoto důvodu bylo v této práci sledováno chování enkapsulované kurkumy v
nanoemulzích typu olej ve vodě a vícevrstvých nanoemulzích s přidanou vrstvou chitosanu
(připraveny pomocí vysokotlaké homogenizace) v in-vitro gastrointestinálním modelovém
systému. Podle výsledků vzrůstá velikost částic nanoemulzí během procesu trávení, což může
být způsobeno porušením nanoemulzí, či agregací částeček oleje způsobených drastickými
změnami pH, či přítomností enzymů během trávicího procesu. Větší částice mohou být také
přítomny z důvodu koalescence kapek, která mohla být způsobena změnami na mezifázovém
rozhraní či ve složení olejové fáze. Aby mohly být nanoemulze použity jako systém pro
dopravu kurkumy, musí být fyzikálně stabilní. Výsledky naznačují, že nanoemulze s
kurkumou jsou stabilní při skladování po dobu jednoho měsíce při teplotě 4 °C. Dalšími
měřeními bylo zjištěno, že enkapsulace kurkumy do nanoemulzí zvyšuje její biologickou
dostupnost až na 55 %.
13
Evaluation of micro/nanoencapsulated nutraceutic compounds´behaviour in an in vitro
gastro-intestinal model system
Curcumin, while having low toxicity, has also various biological and pharmaceutical
properties, where belongs for example antitumor, antioxidant or antivirus activity.
Nevertheless, curcumin possesses low bioavailability due to its poor solubility in water. The
behaviour of these nanoemulsions was evaluated by measuring the particle sizes and zeta
potential after every step of digestion and also by performing free fatty acid and
bioaccessibility test. According to the results the size of particles is increasing during
digestion. This could happen because of bursting of nanoemulsion droplets or oil aggregation
due to drastic pH change or the presence of enzymes during the digestion process. Larger
particles could be also present because some droplet coalescence could occur caused by
changes in interfacial or oil phase composition. Nanoemulsions have to be also physically
stable in order to be used as delivery system for curcumin. Our results from stability test
suggest that curcumin nanoemulsions are stable during one month storage at 4 °C. According
to other measurements, it was found out that encapsulation of curcumin into nanoemulsion
can improve its bioaccessibility up to 55 %.
Bc. Alžběta Dostálková: Vliv bazické oblasti nukleokapsidového proteinu na tvorbu zralé
a nezralé retrovirové částice (Dr. Ing. Michaela Rumlová, ÚB VŠCHT Praha)
V mé diplomové práci jsem se zaměřila na studium bazické oblasti nukleokapsidového
proteinu Mason-Pfizerova opičího viru a jejího vlivu na tvorbu a infektivitu částic. Byla
připravena série tří provirových konstruktů kódujících mutace bazické oblasti. Nejprve byla u
připravených konstruktů studována schopnost tvořit nezralé, intacytoplasmatické, částice v
tkáňových buňkách HEK 293 pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM). K
ovlivnění tvorby nezralých částic nedošlo ani u jednoho z mutantů. Ze snímků je však patrné,
že dva mutantní konstrukty ovlivnily proces pučení virových částic z buněk. Pro stanovení
infektivity byla zavedena a optimalizována imunochemická metoda ELISA. Dvě ze
zavedených mutací infektivitu zásadně ovlivnily, oproti divokému kmenu u nich došlo ke
snížení na 13 % až 60 % infektivity divokého kmenu. Kvantifikací inkorporované virové
genomové RNA jsme zjistili, že u mutantů se sníženou infektivitou také dochází k nižší
inkorporaci RNA. Z mé práce vyplývá, že bazická oblast se podílí na inkorporaci virové
genomové RNA a ovlivňuje proces pučení. Zda tyto kroky spolu souvisí je předmětem
dalšího studia.
The effect of a nucleocapsid protein basic region on the formation of mature and
immature retroviral particles
In my diploma thesis I focused on the study of basic region of Mason-Pfizer monkey virus
nucleocapsid protein and its role in assembly and infectivity of retroviral particles. For this
purpose series of three mutants of the basic region was prepared and cloned into M-PMV
proviral vector. The ability of these three mutants to assemble immature, intracytoplasmatic,
particles and to release from HEK 293 cells was studied using transmission electron
microscopy (TEM). None of the introduced mutations affected the assembly of immature
particles. Interestingly, the release of viral particle was affected in two basic region mutants.
To determine infectivity an immunochemical method ELISA was established and optimized.
Two out of the three basic region mutants decreased the infectivity, from 13 % to 60 % in
comparison to that of the wild type. Using quantitative RT-PCR, we found that the infectivity
decrease corresponds to the lower content of viral genomic RNA incorporated into the
particles. Our work shows that the basic region of M-PMV NC participates in the
14
incorporation of viral genomic RNA and affects budding of retroviral particles. The question
whether these two steps are related is the aim of our future study.
Bc. Adriana Hejdušková: Sledování prekurzorů hyaluronanu v bakterii Streptococcus
equi subsp. zooepidemicus (doc. Mgr. Andriy Synytsya, Ph.D., ÚSC VŠCHT Praha)
Úkolem této práce bylo sledovat koncentraci intracelulárních prekurzorů hyaluronanu při
různých kultivačních podmínkách a jejich vliv na koncentraci syntetizovaného hyaluronanu.
Pro výrobu mikrobiální kyseliny hyaluronové v průmyslovém měřítku se v současné době
běžně využívá Streptococcus zooepidemicus, který syntetizuje HA jako extracelulární kapsuli.
Kyselina hyaluronová je přírodní lineární polymer s vynikajícími viskoelastickými
vlastnostmi, zvlhčujícími schopnostmi a vysokou biokompatibilitou. Během kultivací byl
kontinuálně sledován růst biomasy, koncentrace utilizované sacharózy, koncentrace
produkovaného hyaluronanu, molekulová hmotnost hyaluronanu a koncentrace UDPprekurzorů tvorby hyaluronanu. Změna vnějších kultivačních podmínek neměla v
exponenciální fázi růstu mikroorganismů žádný přímý vliv na koncentraci intracelulárních
prekurzorů, které jsou společné jak pro tvorbu HA, tak pro tvorbu buněčné stěny. Pomocí
regulace kultivačních parametrů tedy zřejmě nelze zásadním způsobem optimalizovat
koncentraci UDP-prekurzorů HA nebo jejich poměr.
Monitoring of hyaluronan precursors in bacteria Streptococcus equi subsp.
zooepidemicur
The aim of this work was to monitor the concentration of hyaluronan intracellular precursors
under various culture conditions and their effect on hyaluronan synthesis rate. Streptococcus
zooepidemicus is commonly used strain for microbial hyaluronic acid production on an
industrial scale, which produce hyaluronic acid as an extracellular capsule. Hyaluronic acid is
a natural, linear polymer having the excelent viscoelastic properties, wetting ability and high
biocompatibility. Biomass growth, sucrose concentration, hyaluronan concentration,
molecular weight, and concentration of hyaluronan UDP-precursors were continuously
monitored during cultivation proces. Changes in external culture conditions had no direct
effect on the concentration of intracellular precursors which are common for both formation
of hyaluronic acid and cell wall biosynthesis. Regulation of cultivation parameters can not
obviously optimize the concentration or the ratio of hyaluronan UDP-precursors.
Bc. Veronika Holečková: Příprava a antimikrobiální vlastnosti esterů fenolových kyselin
s glycerolem (Ing. Iveta Hrádková, Ph.D., ÚMTK VŠCHT Praha)
Diplomová práce je zaměřena na přípravu a testování antimikrobiálního působení
glycerylesterů fenolových kyselin, které by v budoucnu mohly nahradit parabeny a které by
mohly být používány jako konzervanty hlavně v kosmetických přípravcích. Látky byly
připraveny tříkrokovou syntézou, prvním krokem byla esterifikace fenolové kyseliny na
methylester, vzniklý ester byl transesterifikován na isopropylidenglycerylester a posledním
stupněm byla hydrolýza, kterou byl získán glycerylester fenolové kyseliny. Touto cestou byly
připraveny glycerylestery kyselin ferulové, salicylové, p-kumarové, syringové, vanilové a
phydroxybenzoové. U připravených glycerylesterů fenolových kyselin byla testována
antimikrobiální aktivita, nejdříve v modelovém systému, kterým bylo tekuté médium v
mikrotitračních destičkách. Nejúčinněji na všechny testované mikroorganismy (Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans a Aspergillus
brasiliensis) působil glycerylester kyseliny salicylové, ten byl proto dále testován spolu s
glycerylparabenem a glycerylesterem kyseliny p-kumarové i v reálném systému kosmetické
emulze. Účinnost konzervace testovaných látek neodpovídala kritériím podle normy ČSN EN
15
ISO 11930 kvůli nedostatečné inhibici růstu kvasinky, u všech ostatních testovaných kmenů
mikroorganismů byly však podmínky pro kritérium A splněny.
Preparation and antimicrobial propeerties of phenolic acid esters with glycerol
This thesis is focused on the development and testing of antimicrobial action of phenolic acids
esters of glycerol, which could replace parabens and serve as preservatives mainly in
cosmetics in the future. The three-step synthesis was applied to the process of preparation
involving the esterification of phenolic acids to methyl ester, transesterification to afford
isopropyliden glycerol ester and hydrolysis to obtain glycerol ester. Glycerol esters of ferulic,
salicylic, p-coumaric, syringic, vanillic and p-hydroxybenzoic acid were prepared by the same
procedure. Then antimicrobial action of the products was tested, in the first instance in a
model system, namely liquid medium in microtiter plates. The glycerol ester of salicylic acid
appeared to be most effective on all of the tested microorganisms (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans a Aspergillus
brasiliensis). Therefore, it was tested together with glycerol ester of p-coumaric acid and
glycerylparaben in the real system of cosmetic emulsions. The effectiveness of the
conservation of the tested substances didn´t respond to the criteria according to the norm CSN
EN ISO 11930 due to lack of inhibition of growth of yeast. For all other strains tested
microorganisms were conditions for criterion A met.
Bc. Dominika Jírová: Imunochemické stanovení stanazolu (prof. Dr. RNDr. Oldřich
Lapčík, ÚCHPL VŠCHT Praha)
Cílem diplomové práce bylo připravit komponenty pro vývoj a sestavení imunochemické
metody pro stanovení stanazolu. Nejprve byly připraveny konjugáty stanazolu s hovězím
sérovým albuminem (BSA), králičím sérovým albuminem (RSA) a ovalbuminem (OVA).
Konjugáty stanazolu s BSA byly použity jako imunogeny pro získání králičích polyklonálních
protilátek, RSA a OVA byly použity jako bílkovinný nosič pro imobilizaci stanazolu na
povrch mikrotitrační destičky. Konjugáty byly následně charakterizovány. Připravené
protilátky byly testovány v systému nepřímé kompetitivní ELISA a vybrána jedna, která byla
vhodná pro vývoj metody. Byly ověřeny tři varianty systému ELISA metody využívající
různé způsoby imobilizace stanazolu na povrch mikrotitračních destiček a byla u nich
změřena hodnota IC50 a detekčního limitu. Dvě z nich využívají pro imobilizaci konjugáty
stanazolu s RSA, jedna biotinylovaný konjugát a jeho vazbu na biotin. Nejlepšího výsledku
dosáhl jeden ze systémů využívajících konjugát stanazol s RSA, u nějž byla naměřena
hodnota IC50 0,3 ng.ml-1 a detekční limit 0,02 ng.ml-1. U druhé varianty byl IC50 0,8 ng.ml-1
a detekční limit 0,03 ng.ml-1. Hodnota IC50 u varianty využívající biotinylovaný konjugát
byla 3,9 ng.ml-1 a detekční limit 0,57 ng.ml-1. V sestavených systémech byla ověřena křížová
reaktivita dalších steroidů. Jako křížové reaktanty byly u systémů s využitím bílkovinného
nosiče RSA zjištěny 17-α-methylované steroidy 17-α-methyltestosteron
(81,2 %), methandienon (10,0 %), oxymetholon (30,4 %) a methyldihydrotestosteron (7,7 %).
U systému avidin – biotin křížově reagovaly 17-α-methyltestosteron (34,5 %), methandienon
(14,2 %), oxandrolon (1,2 %), oxymetholon (22,7 %), 9-dehydromethyltestosteron (12,5 %),
methyldihydrotestosteron (2,4 %) a fluoxymesteron (32,1 %). Funkčnost metody byla
potvrzena stanovením stanazolu a jeho křížových reaktantů v souboru faramaceutických
přípravků a potravinových doplňků. Testována byla i možnost využití pro detekci stanazolu v
moči. U sestavených systémů byla vyzkoušena stabilita povlečené mikrotitrační destičky.
Immunoassay of Stanazol
The aim of my diploma thesis was to prepare components for development and formation an
imunochemical method for stanazol determination. At first conjugates of stanazol with bovine
16
serum albumine (BSA), rabbit serum albumine (RSA) and ovalbumine (OVA) were prepared.
The conjugates of stanazol with BSA were used for immunization after which the rabbit
polyclonal antibodies were gained. RSA and OVA were used as the carrier protein for
immobilization of stanazol to the microtitration plates. Conjugates were then characterised.
Prepared antibodies were tested in an indirect competitive ELISA and one of them was
chosen for the method development. Three variants of ELISA system were gained, Two of
them use the conjugates of stanazol with RSA for immobilization, the last one uses
biotinylated conjugate and its bond to biotin. The IC50 and limit of detection were measured.
The most favorable parameters were obtained using one of the systems with conjugate
stanazol with RSA. Its IC50 was 0,3 ng.ml-1 and the limit of detection 0,02 ng.ml-1. IC50 0,8
ng.ml-1 and the limit of detection 0,03 ng.ml-1 were measuered using the system with the
second conjugate stanazol with RSA. The parameters of system using biotinylated conjugate
were IC50 3,9 ng.ml-1 and the limit of detection 0,57 ng.ml-1 . The crossreactivity of these
systems with other steroids were determined. The crossreactants by using the carrier protein
RSA were 17-α-methylated steroids 17-α-methyltestosterone (81,2 %), methandienone (10,0
%), oxymetholone (30,4 %) and methyldihydrotestosterone (7,7 %). The crossreactants by
using system avidin – biotin were 17-α-methyltestosterone (34,5 %), methandienone
(14,2 %), oxandrolone (1,2 %), oxymetholone (22,7 %), 9- dehydromethyltestosterone
(12,5 %), methyldihydrotestosterone (2,4 %) and fluoxymesterone (32,1 %). Several types of
protein concentrates, vitamin food supplements and pharmaceutical formulations have been
tested demonstrating the potential of the method to detect per orally active 17- methyl
steroids in these complex matrixes. The possibility of determination of stanazol in urine was
tested, too. The stability of imobilized microtitration plates was tried.
Bc. Anna Kastnerová: Izolace a vlastnosti laktorerinu (doc. Ing. Ladislav Čurda, CSc.,
ÚMTK VŠCHT Praha)
Diplomová práce se v teoretické části zabývá strukturou, výskytem, funkcemi a využitím
laktoferinu, dále i metodami využívanými k jeho detekci a izolaci. V experimentální části se
práce zabývá popisem suroviny, ze které je laktoferin izolován. Hlavním využívaným
materiálem bylo syrové mléko, ze kterého byla připravena syrovátka, z níž byl izolován
laktoferin. Mezi metodami izolace laktoferinu byla použita chromatografie na iontoměničích,
50 kDa ultrafiltrace a reverzní micelární extrakce. Čistota laktoferinu byla zkoumána pomocí
SDS-PAGE, chromatografie s reverzními fázemi nebo vylučovací chromatografie. Výsledky
byly hodnoceny z hlediska čistoty, výtěžnosti, časové náročnosti a ekonomického kritéria.
Laktoferin může být oddělen od syrového mléka, odstředěného mléka nebo syrovátky v
průmyslovém měřítku pomocí dvou kroků. Prvním je katexová chromatografie pro zachycení
laktoferinu ze syrového materiálu. Druhým je ultrafiltrace pro odsolování a odstranění
nízkomolekulárních proteinů. Čistota laktoferinu v konečném roztoku se může pohybovat v
rozmezí od 70 % do 83 %. Čistota laktoferinu může být stanovena pomocí SDS-PAGE, RPC
nebo vylučovací chromatografie s použitím buď guanidin hydrochloridu, citrátového pufru
nebo fosfátového pufru, neboť bylo zjištěno, že linearita je u všech použitých pufrů výborná a
korelační koeficient R2 > 0,9763. Laktoferin může být extrahován pomocí reverzní micelární
extrakce, avšak s nízkými výtěžky, jelikož surfaktanty nevychytají všechen laktoferin ze
vzorku.
Isolation and properties of lactoferrin
The teoretical part of thesis deals with structure, occurrence, function and aplications of
lactoferrin, as well as methods used for the detection and isolation of lactoferrin. The
expertimental part of the thesis describes material from which is lactoferrin isolated. The main
material used for isolation of lactoferrin was raw milk from which was prepared whey from
17
which was lactoferrin isolated. Among the methods of isolation of lactoferrin was used ionexchange chromatography, 50 kDa ultrafiltration, reverse micellar extraction. Lactoferrin’s
purity was investigated by SDS-PAGE, reverse chromatography or size exclusion
chromatography. The results were evaluated in terms of purity, yield, needed time and
economic criteria. Lactoferrin may be separated from raw milk, skimmed milk or whey on an
industrial scale using two steps.The first is the cation exchange chromatography. The second
is ultrafiltration for desalination and removel of low molecular weigh proteins. The purity of
lactoferrin in the final solution may range from 70 % to 83 %. The purity of lactoferrin can be
determinated by SDS-PAGE, RPC or size exlusion chromatography using either guanidine
hydrogchloride buffer, citrate buffer od phosphate buffer. It was found excellent linearity in
all used buffers and the correlation coefficient R2 > 0,9763. Lactoferrin can be extracted
using reverse micellar extraction, but with low yields, because surfactants doesn’t capture all
of lactoferrin from the sample.
Bc. Veronika Komárková: Nové ligandy stabilizující DNA G-kvadruplex v promotorové
oblasti onkogenu c-mys (Dr. Ing. Michaela Rumlová, ÚB VŠCHT Praha)
Transkripční faktor c-Myc se významně podílí na regulaci proliferace, diferenciace, apoptózy,
metabolismu a dalších dějů v normálních buňkách. Cílení proteinu c-Myc nebo jeho genu cmyc je perspektivní oblastí protinádorové terapie. Jednou skupinou stabilizátorů c-myc Gkvadruplexu jsou helquaty, syntetizované ve skupině Dr. Filipa Teplého (ÚOCHB AV ČR,
v.v.i.). Jedná se o sloučeniny se strukturní podobností s již známými ligandy G-kvadruplexu,
jako je například ligand TMPyP4. V rámci této diplomové práce byla testována série více než
400 helquatů z laboratoře Dr. Teplého. Schopnost stabilizace c-myc G-kvadruplexu byla
potvrzena metodou FRET (Försterův resonanční přenos energie). Helquaty byly testovány na
schopnost inhibovat expresi luciferázy řízené promotorem c-myc (pomocí duální luciferázové
reportérové analýzy). Dále byl zjišťován cytotoxický účinek helquatů na nádorové a normální
buněčné linii a jejich vliv na inhibici c-Myc na úrovni mRNA (pomocí kvantitativní real-time
polymerázové řetězové reakce) a proteinové úrovni (pomocí Western blot). Ze série více než
400 helquatů se podařilo vybrat 28, které snižují expresi luciferázy řízené promotorem c-myc
alespoň o 20 %. Sedm z těchto 28 látek má schopnost stabilizovat c-myc G-kvadruplex
(zjištěno FRET analýzou). Nezávisle na FRET analýze byly vybrány 3 helquaty se
selektivním cytotoxickým účinkem na několika nádorových buněčných liniích ve srovnání s
normální buněčnou linií. Oba typy těchto látek, tj. 7 látek stabilizujících c-myc G-kvadruplexu
a 3 látky se selektivní cytotoxicitou, byly testovány, zda ovlivňují expresi c-Myc na mRNA a
proteinové úrovni. Dvě z těchto látek byly vybrány pro preklinické testování in vivo.
Novel ligands stabilizing DNA G-quadruplex in the c-mys oncogene promoter
The transcription factor c-Myc plays a major role in regulation of proliferation, differentiation,
apoptosis, metabolism and other processes in normal cells. Targeting c-Myc protein or c-myc
gene is a promising strategy of cancer therapy. One group of the c-myc G-quadruplex
stabilizers are helquats, prepared in the laboratory of Dr. Filip Teply (IOCB AS CR, v.v.i.).
These are compounds with structural similarity with known G-quadruplex ligands, such as
ligand TMPyP4. In this diploma thesis a series of more than 400 helquats from Dr. Teply
laboratory was tested. The ability of the c-myc G-quadruplex stabilization was confirmed by
FRET (Förster resonance energy transfer). Helquats were also tested for the ability to inhibit
luciferase expression driven by the c-myc promoter (using Dual luciferase reporter assay). We
also studied cytotoxic effect of helquats on tumor and normal cell lines, and on inhibition of
c-Myc mRNA (using real-time quantitative polymerase chain reaction) and protein levels (by
Western blot). From series of more than 400 helquats we managed to select 28 compounds,
which reduce the luciferase expression driven by the c-myc promoter by at least by 20 %.
18
Seven of these 28 compounds have the ability to stabilize the c-myc G-quadruplex
(determined by FRET analysis). Three of the 28 helquats revealed cytotoxic effect on several
tumor cell lines in comparison to that of normal cell line. Both types of these compounds, i.e.
seven c-myc G-quadruplex stabilizers and three helquats with selective cytotoxicity were
tested whether they affect c-Myc mRNA and protein levels. Two of these helquats were
chosen for preclinical in vivo testing.
Bc. Tereza Kubů: Vliv biologicky aktivních látek na tvorbu biofilmu na titanových
materiálech používaných v ortopedii (Ing. Olga Schreiberová, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Tvorba biofilmu na zdravotnickém materiálu představuje významný problém v humánní
medicíně. Mikroorganismy tvořící biofilm často osidlují ortopedické titanové náhrady a
způsobují řadu nozokomiálních infekcí. Buňky přítomné v biofilmu jsou charakteristické
schopností odolávat působení antibiotik nejen tvorbou trojdimenzionální struktury
extracelulárních polymerních látek, ale i zvýšenou rezistencí na běžně dostupná antibiotika. V
této práci byl sledován vliv biologicky aktivních látek na tvorbu biofilmu gram-negativní
bakterie Escherichia coli, grampozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis a kvasinek
Candida albicans a C. parapsilosis na titanových materiálech. Cílem této práce bylo nalezení
biologicky aktivních látek izolovaných z přírodních zdrojů, které mají prokazatelný
antimikrobiální účinek na tvorbu biofilmu sledovaných mikroorganismů a porovnat jejich
účinnost s běžně používanými antibiotiky. Přírodní látky použité v této práci na inhibici
tvorby biofilmu byly s– polysacharid chitosan, stilbeny – pterostilben a biosurfaktant
rhamnolipid. Byl sledován vliv těchto látek na mikrobiální adhezi a následnou tvorbu
biofilmu na titanových materiálech používaných v ortopedii. Jako nejúčinnější přírodní látka
se v naší práci při sledování jejich vlivu na tvorbu biofilmu sledovaných mikroorganismů
prokázal chitosan.
The influence of biologically active substances on biofilm formation on titanium
materials employed in orthopedics
Biofilm formation on various surfaces is a significant problem in human medicine. Biofilms
often colonize medical devices and cause nosocomial infections. Microorganisms in the form
of biofilm exhibit dramatically lower susceptibility to antimicrobial agents, especially to
commercially available antibiotics. The reason is three-dimensional structure formation and
the production of the extracellular polymeric substances. In this work the influence of
biologically active substances on biofilm formation on titanium materials used in orthopedics
by gram-negative bacteria Escherichia coli, gram-positive bacteria Staphylococcus
epidermidis and yeasts Candida albicans and C. parapsilosis. The aim of this thesis was to
find natural substances with antimicrobial effect on selected microorganisms biofilm
formation in comparison to antibiotics action. In this work the influence of three biologically
active substances – chitosan, pterostilbene and rhamnolipid on microbial adhesion was
studied. The effect on biofilm formation on titanium materials was studied. During the
observation of the influence of these substances on biofilm formation on titanium maretials
the most effective natural substance was found to be chitosan.
Bc. Veronika Martinská: Charakterizace membránových proteinů ve vztahu
k chladovému stresu (doc. Dr. Ing. Radovan Hynek, ÚBM VŠCHT Praha)
Plasmatická membrána je první částí buňky, která je vystavena působení chladového stresu, v
jehož důsledku dochází ke změnám její fluidity a ovlivnění exprese membránových proteinů;
ty zprostředkovávají přenos látek a signálu přes membránu do buňky. Identifikace
markerových proteinů, které se účastní reakce na stres, by mohla v budoucnu napomoci
šlechtění odolnějších rostlin posílením exprese těchto proteinů technikami genového
19
inženýrství. Pro studium vlivu chladového stresu na membránové proteiny a jejich expresi
byla použita rostlina ječmen setý (Hordeum vulgare). Analýza membránových proteinů byla
provedena po izolaci mikrosomální frakce z homogenizovaných listů ječmene centrifugací a
zahrnovala rozdělení proteinů pomocí SDS-PAGE s následným štěpením proteinů trypsinem
v gelu, po kterém byla provedena analýza pomocí kapalinové chromatografie spojené s
tandemovou hmotnostní spektrometrií. Pomocí těchto technik byly identifikovány proteiny
ječmene, jejichž funkce souvisí s reakcí na chladový stres (např. Heat shock proteiny nebo
Cold acclimation protein). Metodika použitá v této práci je aplikovatelná i na živočišné tkáně
a mohla by být využita např. pro studium nových receptorů pro léčiva.
Characterization of membrane proteins in realtion to cold stress
The plasma membrane is the first part of the cell which is exposed to cold stress. This results
in changes of membrane fludity and it influences the expression of membrane proteins which
mediate transfer of substances and signals across the membrane into the cell. In the future, an
identification of marker proteins, which participate in response to cold stress, could help to
create more resistant crops by enhancing the expression of these proteins using methods of
genetic engineering. Barley (Hordeum vulgare) was chosen as a plant for studies of the effects
of cold stress on the membrane proteins and their expression. The analysis of the membrane
proteins was carried out after microsomal fraction isolation from homogenized barley leaves
by centrifugation. Isolated proteins were separated by SDS-PAGE and then digested by
trypsin in gel. In-gel digestion was followed by liquid chromatography coupled with tandem
mass spectrometry. Using these techniques we identified proteins, whose functions are related
to response to cold stress (eg. Heat shock proteins or Cold acclimation protein). The
methology used in this work is applicable to animal tissues too and could be used eg. for
studies of new receptors for drugs.
Bc. Martina Paldrychová: Využití přírodních látek k regulaci tvorby biofilmu (Ing. Irena
Kolouchová, Ph.D., ÚB VŠCHT Praha)
Mikroorganismy způsobující chronické infekce se převážně vyskytují jako stabilní struktury
připojené k povrchu, známé jako biofilmy. Biofilmy mají vysokou toleranci vůči antibiotikům
a jiným formám antimikrobiální léčby a jsou zodpovědné za více než 65 % nosokomiálních
infekcí. Moderní medicína se neustále snaží o vývoj nových léků, úpravu stávajících struktur
nebo zvýšení biologické aktivity antibiotik přidáním různých antimikrobiálních látek. Novou
možností by mohlo být využití rostlinných fenolických sloučenin. V experimentální části
práce byl studován vliv vybraných fenolů, známých jako stilbeny, na mikrobiální růst a jejich
vliv na růst mikrobiální populace v kombinaci s konvenčními antibiotiky. Účinek těchto
sloučenin byl studován jak na suspenzní populaci, tak na růst mikrobiálních buněk ve formě
biofilmu. Výsledky byly porovnány s účinky běžných antibiotik.
Use of natural compounds as regulators of biofilm formation
Microorganisms causing chronic infections predominately grow as surface-attached stable
communities known as biofilms. Biofilms are responsible for more than 65 % nosocomial
infections, because of their tolerance to antibiotics and other forms of antimicrobial treatment.
The modern medicine is still trying to develop new drugs, to modify existing structures or to
increase the biological activity of antibiotics by adding various antimicrobial agents. New
possibilities could be the application of plant phenolic compounds. In the experimental part of
the thesis was studied the influence of some selected phenols called stilbenes on microbial
growth and their influence on microbial growth in combination with conventional antibiotics.
The effect of these compounds was studied on microbial biofilms. Results were compared
with the effects of conventional antibiotics.
20
Bc. Vladimíra Pavlíčková: Intracelulární lokalizace a fototoxita fluorescenčních derivátů
nandrolonu (prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc., ÚBM VŠCHT Praha)
Nandrolon je anabolický androgenní steroid, který vzniká v lidském těle jako produkt
aromatizace testosteronu. Anabolické androgenní steroidy, a tedy i nandrolon, jsou díky svým
androgenním a anabolickým účinkům hojně využívány v medicíně. Zvýšená exprese
androgenních receptorů je stále častěji spojována s nádorovými onemocněními prostaty.
Cílem této práce bylo studium biologických účinků nových fluorescenčních derivátů
nandrolonu určených pro specifické cílení buněk exprimujících androgenní receptory. Byly
ověřeny anabolické vlastnosti těchto derivátů a testován jejich vliv na proliferaci nádorových
buněk. Dále byla studována intracelulární lokalizace derivátů nandrolonu, jejich fototoxicita a
možnost aplikace ve fotodynamické terapii. Přítomnost derivátů nandrolonu byla detekována
v endoplasmatickém retikulu, mitochondriích a cytoplazmatické membráně. Stanovením
metabolické aktivity buněk ošetřených konjugátem nandrolonu s feoforbidem a osvícených
světlem od vlnové délce nad 450 nm byly potvrzeny jeho fototoxické účinky. Potvrdili jsme
expresi androgenních receptorů v buňkách nádorových linií LNCaP, C2C12 a AR U-2 OS.
Intracellular localization and phototoxicity of nandrolone fluorescent derivatives
Nandrolone is an anabolic androgen steroid originating from testosterone aromatization in a
human body. Owing to the androgenic and anabolic activities of the anabolic androgen
steroids, thus as well nandrolone, they have been commonly used in medicine.
Overexpression of the androgenic receptors has been very often associated with prostate
cancer. The aim of this work was to study the biological effects of novel fluorescent
nandrolone derivatives developed for selective targeting of cells expressing the androgenic
receptors. The anabolic properties of these derivatives were tested together with their
influence on cancer cell proliferation. Moreover, the intracellular localization, phototoxicity
and the possibility of application of nandrolone derivatives in photodynamic therapy was
studied. The derivatives were detected in the endoplasmic reticulum, mitochondria, and
cytoplasmic membrane. By determination of metabolic activity of cells treated by a
nandrolone conjugate with pheophorbide and illumination with light of wavelength above 450
nm, we verified the phototoxic activity of the conjugate. Finally, we have confirmed the
androgen receptor expression in cells of the following cancer cells lines: LNCaP, C2C12, and
AR U-2 OS.
Bc. Jana Pekárková: Biologicky aktivní alkaloidy v surovinách a herbálních doplňcích
(doc. Dr. Ing. Věra Schulzová, ÚAPV VŠCHT Praha)
Cílem této práce byl vývoj a validace metody pro stanovení chinolizidinových alkaloidů, které
jsou hlavními antinutričními látkami semen lupiny. V teoretické části práce byl popsán
význam chinolizidinových alkaloidů, jejich výskyt v rostlinách a význam těchto rostlin. Také
byly popsány metody používané pro analýzu chinolizidinových alkaloidů. V experimentální
části byla pro analýzu chinolizidinových alkaloidů v lupině zavedena UHPLC-MS metoda.
Její výtěžnost byla 95 % a opakovatelnost byla 1,7‒4,4 %. Zavedená metoda byla použita pro
stanovení chinolizidinových alkaloidů v semenech lupiny, v lupinových produktech i v jiných
rostlinách. V lupinových matricích bylo identifikováno 16 alkaloidů. Nejvíce
chinolizidinových alkaloidů obsahovala semena lupiny (26‒39 g/kg), méně alkaloidů
obsahovaly lupinové produkty (255‒334 mg/kg) a jiné rostliny ‒ plavuň (736 mg/kg),
kručinka (114 mg/kg) a štědřenec (3 mg/kg). Navíc byly v lupinových semenech a produktech
stanoveny aminokyseliny, a to převzatou UHPLC-MS metodou.
Biologically active compounds in raw materials and herbal supplements
21
The aim of this thesis was to develop and validate a method for the determination of
quinolizidine alkaloids, which are the main antinutritive components of lupine seeds. The
theoretical part of the thesis describes the importance of quinolizidine alkaloids, their
occurrence in plants, and the importance of these plants. The methods which are used for
analysis of quinolizidine alkaloids are described as well. In the experimental part, a UHPLCMS method was established for analysis of quinolizidine alkaloids in lupine. Its yield was
95% and its repeatability was 1.7 to 4.4%. The established method was used to determine
quinolizidine alkaloids in lupine seeds, in lupine products, and in other plants. Sixteen
alkaloids were identified in the lupine matrices. The highest content of quinolizidine alkaloids
was observed in lupine seeds (26‒39 g/kg), fewer alkaloids were found in lupine products
(255‒334 mg/kg), and other plants ‒ clubmoss (736 mg/kg), broom (114 mg/kg), and
laburnum (3 mg/kg). Furthermore, amino acids were determined in lupine seeds and products
by an adopted UHPLC-MS method.
Bc. Tereza Streckerová: Příprava rekombinantních nukleas s potenciálním
farmakologickým účinkem (doc. Ing. Petra Lipovová, Ph.D., ÚBM VŠCHT Praha)
Cílem této práce byla příprava dvou rekombinantních nukleas s farmakologickým
potenciálem – TBN1 z rajčete (Lycopersicon esculentum) a TrypN z prvoka Trypanosoma
brucei. Jako produkční organismus pro tyto nukleasy byla zvolena kvasinka Pichia pastoris.
Kvasinky byly transformovány různými formami genu pro TBN1 a sekrečního signálu α-MF,
který směruje produkci rekombinantních proteinů do extracelulárního prostoru. Gen pro
TBN1 byl modifikován tak, aby vznikl jednak neaktivní mutant bez nukleasové aktivity,
jednak forma s kodonovou optimalizací pro P. pastoris. Nejlepším dosaženým výsledkem
byla intracelulární stabilní produkce nukleasy. Příčina neúspěšné sekrece a nízké hladiny
exprese TBN1 kvasinkami nebyla zjištěna. V případě produkce TrypN byl nejdříve gen pro
nukleasu vnesen do vhodného plasmidu, kterým byly kvasinky transformovány. Stejně jako v
případě TBN1, i u nukleasy TrypN byla pozorována pouze intracelulární exprese proteinu.
Ten byl v buňkách navíc pravděpodobně degradován. Rekombinantní nukleasy se z buněk P.
pastoris nepodařilo purifikovat.
Preparation of recombinant nusleases with pharmacological potencial
The aim of this work was to produce two recombinant nucleases with pharmacological
potential – TBN1 originating from tomato plant (Lycopersicon esculentum), and TrypN from
the protozoa Trypanosoma brucei. As a host for production of these nucleases the yeast Pichia
pastoris was chosen. Yeast cells were transformed with several different forms of TBN1 gene
as well as a secretion signal α-MF which directs the production of recombinant proteins into
the extracellular space. The TBN1 gene was modified in order to gain firstly an inactive
mutant without any nuclease activity and secondly a codon optimized gene form of TBN1.
The best achieved result, however, was stable intracellular production of the nuclease. The
cause of unsuccessful secretion and low intracellular expression levels of TBN1 remains so
far unknown. Concerning TrypN, the gene for the nuclease was first inserted into the plasmid
appropriate for the yeast transformation. Identically, only intracellular expression of this
protein was detected. Moreover, this nuclease was probably degraded within the cells.
Purification of recombinant nucleases from the P. pastoris cells was not successful.
Bc. Adéla Urbanská: Mikrobiální produkce kyseliny jantarové (doc. Dr. Ing. Petra
Patáková, ÚB VŠCHT Praha)
Kyselina jantarová je látkou s mnoha využitelnými vlastnostmi a zároveň také důležitým
prekurzorem mnoha průmyslově významných chemických látek. V současnosti je její výroba
zajišťována především chemickým procesem z ropného oleje nebo ropného plynu, ovšem
22
alternativní možností je biotechnologická výroba. Tato práce byla zaměřena právě na
biotechnologickou produkci kyseliny jantarové. Kyselina jantarová byla produkována pomocí
bakterií střevního obsahu žížal, bachorovými bakteriemi a také fakultativně anaerobní bakterií
Actinobacillus succinogenes. Bakterie Actinobacillus succinogenes byla kultivována
vsádkově a přítokovaně v bioreaktorech. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při kultivaci s
počáteční koncentrací glukózy 60 g/l a dodáváním oxidu uhličitého, kdy bylo získáno až 50
g/l kyseliny jantarové, při výtěžnosti 83 %. Při přítokované kultivaci bylo dosaženo nejlepších
výsledků při počáteční vsádce glukózy o koncentraci 25 g/l a následném přítokování glukózy
3 g/l/h mezi 15. a 25. hodinou, a to výtěžnosti 52 % a koncentrace kyseliny jantarové 28,5 g/l.
Microbial production of succinic acid
Succinic acid has many useful properties and also is important precursor of many industrially
important chemicals. Production of succinic acid is provided mostly by chemical process from
coal oil or coal gas nowadays. Other possibility is biotechnological production. This work was
just focused on the biotechnological production of succinic acid. Succinic acid was produced
by bacteria from worn intestinal, rumen bacteria and also facultative anaerobic bacteria
Actinobacillus succinogenes. This bacteria was cultivated by batch and fed-batch cultivation.
Cultivation with initial glucose concentration of 60 g/l and adding of carbonyl oxide leads to
the best results. It was obtained 50 g/l of succinic acid which corresponds to the 83 % yield.
In case of fed-batch cultivation the best results was reached with initial glucose concentration
of 25 g/l and following glucose feeding of 3 g/l/h between 15th and 25th hour. It was reached
concentration of succinic acid 28,5 g/l, which corresponds to 52 % yield.
23