Lidský papillomavirus - Laboratoře Mikrochem

HPV - Lidský papilomavirus –
průkaz DNA typů s vysokým
rizikem kancerogenity
MUDr. Petra Novotná
Laboratoře Mikrochem
Lidský papilomavirus v elektronovém mikroskopu



Neobalený DNA virus z
čeledi Papillomaviridae
Existuje více než 150
genotypů, které mají 90%
shodné DNA
Každý genotyp má
specifickou afinitu buď
ke kůži nebo ke sliznici





HPV jsou epiteliotropní, napadají pouze buňky
kůže a sliznic.
Způsobují lokální infekce, kdy vstupní branou
infekce jsou trhlinky ve sliznici nebo v pokožce.
Virus se replikuje v pouze bazálních buňkách
epitelu.
Viriony se vytváří spolu s diferenciací
epiteliálních buněk, takže kompletní virové
částice můžeme nalézt v nejvyšší vrstvě buněk
diferencovaných keratinocytů.
Důležité pro dobu a způsob odběru.
Každý typ HPV se množí jen na predilekčních
místech a má vztah k určitým klinickým projevům:




Nejběžnější infekce jsou infekční bradavice
(verruca vulgaris, plana a plantaris)
Následují perigenitálně lokalizovaná condylomata
accuminata
Dále dysplázie děložního čípku
Vzácně se vyskytuje laryngeální papillomatóza a
epidermodysplasia verruciformis
Nejčastější lokalizace nákaz lidskými papilomaviry:
Lokalizace:
Onemocnění:
Typy HPV:
KŮŽE
Verruca vulgaris
Verruca plana
Verruca plantaris
Epidermodysplasia verr.
2,4, 1,7,26,29
3,10,27,28,41
1,2,4
5,8,17,20, 36,9,12,14,15,19,21-25,38,46
ANOGENITÁLNÍ
OBLAST
Condyloma accuminatum 6,11, 1,2,10,16,30,44,45,54,55
Dysplasie děložního
16, 18,
čípku (adenokarcinom)
31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68
ÚSTNÍ DUTINA
Hyperplasie epitelu
13,32
LARYNX
Papilom
6, 11
OČNÍ SPOJIVKA
Papilom
11
Epidemiologie HPV


Přenos papilomavirů usnadňuje jejich rezistence
k zevnímu prostředí. Při pokojové teplotě vydrží vyschlé
nejméně týden. Nedají se inaktivovat alkoholem a
zachovávají si infekčnost i po hodině zahřívání na 56oC.
Jak již bylo zmíněno, vstupní branou infekce HPV jsou
trhliny kůže a sliznic. V oblasti genitálu jsou k přenosu
postačující koitální frikční mikrotraumata. Uvádí se, že
infekce papilomaviry je nejčastější sexuálně přenosnou
nemocí.
Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ



19. stol. italský lékař Rigoni-Stern si povšiml
výskytu KDČ u prostitutek oproti jeptiškám
60.léta 20.stol. – podezření na HSV2 – vyvrátila
prospektivní studie prof. Vonky (1975-83)
1983 prof. Hausen z Heidelbergu vyslovil na
základě svých studií hypotézu, že virem hrajícím
velkou etiologii u KDČ je genotyp 16 popř. 18
viru HPV
Důkazy pro etiologický vztah HPV a karcinomu
děložního čípku jsou následující:
Důkazy molekulárně-biologické
- téměř všechny KDČ obsahují DNA HPV
Důkazy epidemiologické
- DNA HPV je zjišťována mnohem častěji u pacientek s KDČ
nebo prekancerózními stavy
- toto spojení je nezávislé na jiných faktorech zvyšujících
riziko vzniku KDČ
- předchozí infekce HPV zvyšuje riziko vzniku nemoci
Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ
Důkazy imunologické
pacientky s KDČ mají častěji protilátky k HPV než
kontrolní osoby
existuje vztah mezi přítomností protilátek k HPV a
stavem nemoci
existuje vztah mezi přítomností protilátek a prognózou
nemoci
Důkazy virologicko-biologické
- HPV jsou schopny imortalizovat lidské buňky kultivované
in vitro
Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ

Definitivním důkazem kauzálního spojení mezi
HPV a KDČ je fakt, že preventivní vakcinace
zabraňuje vzniku prekanceróz vyvolaných HPV
(prof. V.Vonka – Časopis pro celoživotní vzdělávání lékařů č.4 r. 2006)

Infekce HPV působí jako iniciátor maligního
procesu, nicméně ke vzniku KDČ jsou potřebné
další příčinné faktory: kouření, imunodeficit,
imunosuprese, hormonální terapie aj.
Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři
Hybrid Capture 2 HPV DNA Test
Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři 13 typů: 16, 18, 31,33,35,39, 45, 51,52,56,58,59,68

Principem metody, kterou používá naše laboratoř a která je doporučována NRL pro
papilomaviry a která nese jméno „Hybrid Capture 2 HPV DNA Test“ firmy
Quiagene, je mikrodestičkový test se zachycující protilátkou proti hybridizovanému
amplifikovanému signálu používající ke stanovení chemiluminiscentní detekci.Vzorky
obsahující cílovou DNA hybridizují se specifickým koktejlem sond HPV RNA.
Výsledné hybridy RNA:DNA jsou zachycovány na povrchu jamek mikrodestičky,
které jsou potažené specifickými protilátkami proti RNA:DNAhybridům. Zakotvené
hybridy potom reagují s konjugátem specifických protilátek proti RNA:DNAhybridům
a alkalické fosfatázy a jsou následně prokazovány pomocí chemiluminiscentního
substrátu. Ke každé protilátce je konjugováno několik molekul alkalické fosfatázy.
Mnohočetně konjugované protilátky se váží na každý zachycený hybrid, což vede k
podstatnému zesílení signálu. Při rozkládání substrátu navázanou alkalickou fosfatázou
je emitováno záření, které je měřeno luminometrem jako relativní jednotky záření
(RLU). Intenzita emitovaného záření ukazuje na přítomnost či nepřítomnost cílové
DNA ve vzorku.
Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři




Výsledky jsou udávány v indexu pozitivity, což je
poměr naměřené hodnoty RLU vzorku k
průměrné RLU cut-off.
Stanovení klinické cutt-off je důležité pro
predikci onemocnění
Klinická citlivost – (schopnost detekovat léze)
počet žen s ONEMOCNĚNÍM správně
identifikovaných jako HPV pozitivní
Analytická citlivost
Nastavení hranice analytické citlivosti metody pro
klinickou využitelnost HPV testu Snijders et al 2003: J.Pathol 201:1
Hodnocení výsledků HPV vyšetření v naší laboratoři








RLU/cutt-off:
< 0,7
≥0,7 a <1,0
≥1,0 a <2
≥2 a <10
≥10 a <100
≥100 a <1000
≥1000
negativní
hraniční
ŠEDÁ ZÓNA
hraničně pozitivní ŠEDÁ ZÓNA
slabě pozitivní
pozitivní
silně pozitivní
velmi silně pozitivní
Klinická progrese HPV infekcí
lokální infekce
intraepiteliální neoplázie
karcinom
Speciální odběrová souprava pro genové sondy





Odběry se provádějí speciálním kartáčkem pro stěr z děložního čípku tak, aby
se na kartáček nachytalo co nejvíce buněk z přechodu dlaždicového do
cylindrického epitelu, který se nachází v endocervixu. Tento přechod z
epitelu do epitelu je rizikovým místem vzniku ca děložního čípku, proto je
důležité udělat razantní odběr právě odtud a to tak, že se kartáček vsune do
ektocervixu asi 1 až 1,5 cm a 3x se otočí proti směru hodinových ručiček.
Po odběru se kartáček opatrně vloží do přepravní zkumavky se speciálním
odběrovým médiem a přitom se dbá na to, aby nedošlo k dotyku mezi
štětinkami kartáčku a stěnou zkumavky
Vzorky mohou být skladovány po dobu 2 týdnů při pokojové teplotě a poté
odeslány do laboratoře, kde mohou být uskladněny další týden při teplotě 28°C, nebo mohou být zamrazené na teplotu –20°C po dobu 3 měsíců před
testováním
Odběr se provádí nejdříve za měsíc po předpokládané infekci
Odběrová souprava a způsob odběru pro průkaz Chlamydia trachomatis a
Neisseria gonorrhoeae ze stěru z děložního čípku je stejná jako pro stěr u
HPV – všechno se dá udělat z jedné odběrovky.
Prevence KDČ



1x ročně cytologický stěr z
děložního hrdla - problémem je
docházka – 56% žen chodí na
pravidelné preventivní prohlídky
(máme kvalitní cytologické
laboratoře).
návrh pro vyšetření HPV je 1x za
3 roky (nejasná cytologie, časná
prevence)
KDČ je zařazen mezi tři základní
screeningové onkologické
programy (ca mammy, ca recta)
Prevence KČD
Státem podporované screeningové programy
(www.cervix.cz)
Screeningový
program
Počet pozvaných
1.čtvrtletí 2014
Míra účasti 1.pololetí
2014 (%)
cervikální
209 018
8,1% (16 930)
mamografický
181 650
12,6%
kolorektální
525 225
14,2%
(Speciální odběrová souprava pro
samoodběr)


tato odběrová souprava je nově k dispozici
filozofie tohoto výrobku je taková, že by se tato odběrová
souprava rozeslala pacientkám, které by nereagovaly na
zvací dopis, pacientka by se odebrala sama podle návodu
a odebraný vzorek by odnesla přímo do laboratoře k
vyšetření
Očkování






Na trhu jsou tyto vakcíny:
Cervarix 16,18 (fa GSK)
Silgard 6,11,16,18 (fa Merck)
Obě jsou bezpečné a mají klinicky ověřenou účinnost (v
současné době 15 let)
Obě mají cross protect (zkříženou ochranu) proti dalším
typům karcinogenních HPV (zkoumáno na genotypech
31,33,45,51), která trvá 4 roky
K dispozici již je nová nonavalentní vakcína Gardasil 9
(fa Merck), která obsahuje 9 genotypů
(6,11,16,18,31,33,45,52,58)
Dávkovací schéma www.actamedicinae.czliteratura


Bivalentní vakcína Cervarix je indikována ve dvoudávkovém
schématu pro dívky ve věku 9-14 let ideálně ve schématu měsíc 0-6,
druhá dávka se může podat 5-7 měsíců po první dávce. Pokud se
druhá dávka podá dříve než za 5 měsíců po dávce první, je nutno
aplikovat tři dávky.
Kvadrivalentní vakcína Silgard je ve dvoudávkovém schématu
určena pro dívky ve věku 9-13 let ve schématu měsíc 0-6. Pokud se
druhá dávka podá dříve než za 6 měsíců po první dávce, je nutno
aplikovat tři dávky.
Vyšetření HPV vysokého rizika v naší laboratoři
140
120
100
80
negativní
60
pozitivní
40
20
0
11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71 a 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71 a 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71 a
více
více
více
2012
2013
2014
Děkuji za pozornost