lncRNA a epigenom

lncRNA a epigenom
Molekulární mechanismy formování
epigenomu
Epigenetika = věda o stabilních genetických modifikacích, které vedou
ke změně exprese a funkce genů beze změny sekvence DNA
Epigenetické procesy – klíčové pro:
- diferenciaci a vývoj
- funkci mozku
- dlouhodobé odpovědi na proměnlivost
prostředí
Základní nástroje epigenetických procesů:
Metylace DNA
Modifikace histonů
RNAi + nekódující RNA
Metylace DNA
Metylace DNA = přidání metylové skupiny na cytosin
5-metylcytosin
- u prokaryot i eukaryot (rostliny, houby, živočichové)
- u savců metylace hlavně na CpG
- u savců 3 metyltransferázy:
DNMT1 – udržuje metylaci
DNMT3A a DNMT3B – metylace de novo
- 2 vlny demetylací u savců: v zárodečných buňkách a před implantací embrya
Význam:
- ochrana před TEs
- embryonální vývoj
- diferenciace kmenových buněk
- genomový imprinting
- inaktivace X
Modifikace histonů
= Kovalentní připojení skupiny, většinou na N-konec (tail)
- Známo 8 typů, nejstudovanější acetylace, metylace,
fosforylace, ubiquitinace
- > 60 aa pozic pro modifikace
Epigenetické změny a RNA
Modifikace histonů, metylace DNA a modulace chromatinu
prováděny komplexy – jejich směřování často řízeno RNA
- 20% lncRNA asociována s chromatin modulujícími komplexy
- RNA asociována s chromatinem
funkce a směřování komplexů modulujících chromatin jsou
řízeny RNA
Dlouhá nekódující RNA (lncRNA)
- > 200 bp (až stovky kbp)
- cca 80% RNA v buňce
- v savčích genomech desítky tisíc typů lncRNA
- polyadenylovány, sestřihovány, regulovány TFs
- většinou neznáme funkci, ale jsou indicie, že nějakou mají:
- 1) exprese a alternativní splicing během diferenciace
- 2) tkáňově a buněčně specifický pattern exprese
- 3) regulace exprese morfogeny, TFs a hormony
- 4) asociace s chromatinem v oblasti aktivních genů
- 5) změna exprese v rakovinných buňkách
Funkce lncRNA
Přibývají informace o funkcích konkrétních
lncRNA
- reprogramování kmenových buněk
- regulace homeotických genů
- metastáze rakoviny
- genomový imprinting
- inaktivace chromosomu X
Obecně regulace epigenetických procesů (diferenciace, reakce
genomu na vnější prostředí, funkce mozku).
Morris and Volt 2010
Dobře charakterizované lncRNAs u
živočichů
Xist a inaktivace savčího X
Kompenzace genové dávky
= potřeba vyrovnat genovou dávku
mezi samicí (XX) a samcem (XY)
Různé skupiny živočichů dělají různě.
Kompenzace genové dávky u savců
- u vačnatců inaktivace paternálního X (asi primitivní stav)
- paternální X označeno v samčí meióze
- nevýhoda: škodlivé recesivní mutace na X odhaleny u
samce i samice
- u placentálů náhodná inaktivace – v různých
buňkách různá Xa
- výhoda – samice chráněny před
škodlivými recesivními mutacemi na X
- potřeba mechanismu, který spočítá
poměr X:A a vybere Xi
- u myši kombinace:
embryo – náhodná inaktivace
placenta - paternální Xi
Inaktivace X v období implantace
embrya (Hore et al. 2007)
Výběr Xi
Komunikace mezi Xic obou X – synapse v období inaktivace X
Regulační složky Xic
- Xist (X inactive specific
transcript)
delece Xist inaktivuje druhé X
chybí u ptakořitných
- Tsix – exprese na obou X, ale na
Xa déle
delece = inaktivace nositele
Exprese Xist
- Dlouhá nekódující RNA – šíření po celém X (cis)
- Exprese Xist jen na počátku inaktivace, udržení inaktivace jinými
faktory
- Translokace Xist na autosom = inaktivace autosomu x méně efektivní
- Na X mimořádně vysoká koncentrace LINEs, zřejmě místa interakce s
Xist RNA
Xist inaktivuje X u placentálů i vačnatců
Inaktivace Xi
Rozprostření Xist
- vyloučení RNApol II z blízkosti Xi
- ztráta epigenetických značek
- povolání komplexů PRC2 a PRC1 (polycomb
repressive complex) represivní modifikace
histonů.
Chromosomy myši s chromosomem X
pokrytým Xist RNA
lncRNAs a genomový imprinting
Air, Kcnq1ot1
- Relativně dobře prostudované
- Součásti klastrů imprintovaných genů
- Aktivní u paternální alely - podílejí se na umlčení genů v cis
- Mechanismus umlčování není znám (RNAi, chromosome coating, ...)
V klastrech IGs další ncRNAs i jiné typy nekódujících RNA (snoRNA)
Genomový imprinting
- Většina genů exprimována bez ohledu na původ (M/P)
X
některé podle původu (maternální vs. paternální) = genomový imprinting
-
Objev v 80. letech 20. století u myší – 2 typy pokusů:
1) Výměna prvojader – vznik zygoty s pouze paternálním / maternálním
genomem
Vzniklé potomstvo nebylo životaschopné
M i P genom je potřeba
2) Výměna jednotlivých chromosomů (křížení linií s translokacemi) –
uniparentální disomie
- 90. léta 20. století – objev prvních imprintovaných genů (Igf2 a Igf2r) – růst
embrya
První objevené imprintované geny
Igf2 – růstový faktor
- PEG u vačnatců a placentálů
- aktivní v celém embryu a placentě
- delece paternální kopie
embryo 40% normální velikosti
- 2 paternální kopie u člověka Beckwith-Wiedermannův
syndrom = přerostlý plod a vysoký výskyt nádorů
První objevené imprintované geny
Igf2r – receptor Igf2
- MEG u vačnatců a placentálů (kromě
primátů
- opačná funkce než Igf2
- u obratlovců vazebné místo pro proteiny
označené manoso-6- fosfátem + fosfatázy
degradace proteinů v lysozomech
- u živorodých savců navíc vazba Igf2
degradace
- delece maternální kopie
130% normální velikosti
embryo 125-
Imprinting Igf2 a Igf2r u savců
Vejcorodí
Igf2
Igf2r
není imprintovaný
nemá vazebné místo pro Igf2
Vačnatci
Igf2
Igf2r
PEG
MEG, má místo pro Igf2
Placentálové
Igf2
Igf2r
PEG
MEG, má místo pro Igf2 (u
sudokopytníků, hlodavců, ale ne u primátů)
Imprinting Igf2 a Igf2r zřejmě souvisí s těsným spojením matky a
embrya během embryonálního vývoje prostor pro manipulaci.
Genomový imprinting se děje v
zárodečných buňkách
Kota and Feil 2010
Kinship theory
IGs jsou nástrojem v boji matky a otce o zdroje, které matka poskytne
potomkovi
- Otec chce pro svého potomka maximum
zdrojů na úkor matky (další potomci nemusí
být jeho)
X
- Matka chce racionalizovat distribuci zdrojů
mezi všechny své děti
- Imprintované geny jsou exprimovány
hlavně v embryu/extraembryonálních
tkáních a mozku (manipulace chování)
Kinship theory
Hore et al. 2007
Další taxony s predikovaným
imprintingem
Živorodí obratlovci – hadi, ještěři, žáby, ryby
aktivní extrakci živin z matky
prostor pro
Haplodiploidní sociální hmyz – různé
příbuzenské vztahy mezi pohlavími - otec
příbuzný s dcerami 100% - chce jen dcery,
matka 50% - chce 1:1
Vysoká otcovská investice u
mořských koníků predikované
opačné role MEGs a PEGs
Lidské choroby způsobené chybou
imprintingu
Příčiny:
1) Chromosomální aberace
2) Uniparentální disomie
Manipalviratn et al. 2009
Syndrom Prader-Willi
Projev:
- malý vzrůst
- snížená inteligence (IQ ~ 70)
- problémy s učením
- chronický pocit hladu
přejídání obezita
chorobné
-…
Příčina:
- delece části paternálního
chromosomu 15 – ztráta genu, který je
maternálně imprintován jedinci s
PWS nemají aktivní alelu.
Sesterský syndrom - Angelmanův
La monstrua desnuda (1680)
od de Juan Carreño de Miranda
- pravděpodobně dívka s PWS
Zdroj: Wikipedia
Angelmanův syndrom
Projev:
- problémy s koordinací pohybu, nemotorná chůze
- neschopnost mluvit (max. několik slov)
- opožděný psychosomatický vývoj
- zvláštní chování, stále se usmívá
-…
Příčina:
Delece části maternálního chromosomu 15
Důvodem je zřejmě chybějící maternální
aktivní alela genu UBE3A (ubiquitin ligáza)
Chlapec s loutkou
Giovani Francesco Caroto
Imprintované geny
- U myši známo 145 imprintovaných genů (IG) x
predikováno cca 1300
- Cca 1/2 z nich imprintována i u člověka
- Některé IGs konzervované (i u vačnatců)
- 80% v IGs v klastrech
- V klastru bialelické, maternálně (MEGs) i
paternálně (PEGs) inprintované geny
- Celkový poměr MEGs a PEGs v genomu
vyrovnaný
- IGs nejsou sekvenčně homologické
- Promotory bohaté na CpG
Reik a Walter 2001
Vznik a regulace PWS-AS lokusu
Oblast 15q-11-13
- delece způsobuje Prader-Willi / Angelmanův syndrom
- dvě oblasti:
PWS – 5 PEGs + snoRNA
AS – 2 MEGs (exprese v mozku)
IC řídí expresi genů v obou oblastech
Vznik a regulace PWS-AS lokusu
U vačnatců a vejcorodých
- většina genů chybí
- chybí snoRNA
- nalezené geny na různých místech genomu
- chybí ICR bialelická exprese
PWS-AS lokus vznikl po odštěpení vačnatců před radiací placentálů
Čtení epigenetických značek
- Komplexní – IGs jsou v klastrech
sekvence
mohou sdílet regulační
- Metylace regulační sekvence ≠ nutně umlčení genu
- Regulace většinou na úrovni transkripce
- Regulace běžnými nástroji (metylace promotorů, silencery,
antisense RNA, hraniční sekvence)
Čtení epigenetických značek
Metylace promotoru
- promotory IGs bohaté na CpG
- vazba komplexu MBDs + Dnmt1 +
deamináz histonů modulace
chromatinu
Antisence RNA
- část IGs asociována s antisense RNA
(př. Air, Kcnq1ot1)
- antisense transkriptů sama
imprintována
Čtení epigenetických značek
Hraniční oblasti
- oblast mezi enhancerem a
promotorem IG
- hraniční oblast nemetylována
vazba represoru inhibice IG
čili metylace = aktivita IG
Umlčovací faktor (silencer)
- některé DMRs metylované na
aktivní alele – obsahují silencer
Myší chiméry
- Studium vlivu imprintovaných genů na myších chimérách
- Chiméra = směs wt buněk s androgenickými (2 P genomy)/
partenogenetickými (2 M genomy)
Výsledek:
1) Množství P a M buněk koreluje s velikostí embrya (P zvětšuje, M zmenšuje)
a mozku (P zmenšuje, M zvětšuje)
2) Frekvence P a M buněk je v různých tkáních různá:
Vyšší koncentrace P buněk: extraembryonální tkáň, hypothalamus,
chondrocyty, tuk a zubní sklovina
Vyšší koncentrace M buněk : embryo, mozková kůra, dentin, nosní sliznice
V souladu s kinship theory
IGs a regulace chování
U savců pokračuje rodičovská investice i po narození
pro manipulaci chování
- IGs hojně exprimované v mozku (i u dospělců)
ovlivňují chování
- Knock-outy IGs
kinship hypotézu
změny v chování podporující
-Peg3 a Gnaxl – podorují sání mléka
- Mest, Peg3 a Magel2 – kritické pro normální
mateřské chování
- PEGs podporují vydávání UZ volání matky X
MEGs ho potlačují
prostor
IGs a regulace chování u myši
Grb10 a sociální chování
- MEG v embryu – inaktivace alely
v regulaci insulinu a glukózy
nadměrný růst embrya, poruchy
- PEG v dospělém mozku – inaktivace alely
sociální nekompetence
Curley 2011
zvýšená dominance a
Paternální Grb10 potlačuje agresivitu
Mateřská péče a imprinting
Špatné zkušenosti během raného vývoje mají dlouhodobý efekt
(nemoci a poruchy chování v dospělosti).
U lidí týrání/přehlížení v dětství zvýšená pravděpodobnost fyzických a
psychiatrických onemocnění, užívání drog.
U myší, potkanů a makaků – oddělení mláďat od matky silnější
reakce na stres, poruchy sociálního a reprodukčního chování
(infanticida, týrání)
Mateřská péče a imprinting
Peg3
- reguluje přežívání buněk v placentě,
embryu a mozku
- knock-out vede k poruchám mateřské
péče - dodávání živin embryu, kojení,
olizování a opečovávání, či stavba hnízda.
- výměna potomstva mezi wt a Peg3liniemi chování převzato od náhradní
matky, přeneslo se na vnoučata
1) Peg3 manipuluje matku směrem k péči o potomstvo
2) Zkušenosti z raného vývoje se přenášejí až do následující generace
Jak to funguje na molekulární úrovni
GR (hippocampal glucocorticoid receptor)
- Řídí odpověď na stres regulací osy hypothalamus – šišinka –
nadledvinky ( kortizol, adrenalin, …)
- Vysoká hladina GR
slabá odpověď na stres
- Samičky lépe pečující o mladé méně metylovaný promotor GR
může nasednout TF (NGFI-A -indukovaný nervovým růstovým
faktorem) vyšší exprese GR
- Metylační pattern se ustaví v prvním týdnu života – zůstává po
celý život.
Sociální mozek
Lidský mozek selektovaný na řešení sociálních interakcích
- IGs nadprůměrně exprimované v mozku ovlivňují chování
- analogie placenty = řídí distribuci zdrojů mezi příbuzné
- nerovnováha imprintingu psychická porucha
- dva extrémy: autismus (porucha PEGs) a psychóza (porucha MEGs)
Crespi and Badcock 2008
Vliv prostředí na epigenom
Embryonální vývoj vs. dospělost – jiné vlivy a intenzita dopadu
Aguilera et al. 2010
Vliv výživy na epigenom
Myší linie s mutací Avy (agouti viable yellow) – model pro vliv epigenomu na
fenotyp
- vložení TE do genu agouti
nesprávná exprese
žlutá myš
- krmení matek stravou s donory metylových skupin (methionin, cholin) a
kofaktory (kyselina listová, B12) represe promotoru TE hnědé
potomstvo
Žluté myši - sklon k
obezitě a rakovině
Feil a Fraga 2012
Vliv výživy na epigenom
Přísun živin během embryonálního vývoje a na
počátku života může ovlivnit zdraví v dospělosti (krevní
tlak, kardiovaskulární choroby, cukrovka, rakovina).
Příjem potravy v rané fázi života ovlivňuje metylaci DNA
- obzvláště citlivé jsou TEs a IGs
- málo metylace mobilita TEs + aktivita jejich promotorů
exprese „downstream“ genů
- málo metylace
bialelická exprese IGs
- příliš mnoho metylace
umlčení aktivních alel IGs
změna
Vliv výživy na epigenom
Hladomor v Holandsku 1944
-srovnání lidí počatých v tomto období s nepostiženými sourozenci
rozdíly v metylacích Igf2 po 60 letech
vnější vlivy na počátku těhotenství přetrvávají po celý život
Prostředí a epigenom
Strava
- Dostatek složek metabolismu S-adenosylmethioninu (kyselina
listová, vitamíny B6, B12, methionin, …)
- Butyrát (sýry), sulforaphan (brokolice) – inhibice HDAC
promotorů tumorsupresorů
acetylace
Léky
Diethylstilbestrol - zvýšené riziko rakoviny prsu, vaginy a děložního
krčku a vývojovými anomáliemi
změny exprese metyltransferáz a metylace DNA
Valproát sodný – inhibice HDAC
Prostředí a epigenom
Životní/pracovní prostor
- Ionty kovů (kadmium, nikl a chrom) - redukce metylace a inhibice
metyltransferáz, nikl mění modifikace histonů
- Bisfenol A - využíván v plastovém průmyslu + vinclozolin - fungicid
používaný na vinicích - mění metylaci DNA na některých promotorech,
účastní se vývojových poruch a rakoviny.
Nezdravé návyky
- Kouření - hypermetylace promotorů tumor-supresorů v plicích
- Alkohol - u alkoholiků nalezeny změny v metylacích CpG
- u potkanů – alkoholiků - rozsáhlé epigenetické změny
- Kokain – konzumace matkou změna metylací a genové exprese
v hippokampu novorozenců a prepubertálních potomků.
O čem to bylo
- Epigenetické měny umožňují genomu pružně reagovat na vnější
podmínky
- Hlavními nástroji modulace epigenomu jsou modifikace histonů a
metylace DNA
- Směřování modulujících komplexů je často řízeno RNA
- Genomový imprinting savců – ovlivňuje růst embrya a mozek, zřejmě
reakce na vznik placenty, boj otce a matky o matčiny zdroje
- Epigenetické změny mohou být ovlivněny prostředím a mají
dlouhodobý efekt
- Správná výživa v těhotenství a mateřská péče vytvářejí odolnost vůči
stresu a chorobám
- Strava, životní prostředí, léky a návykové látky ovlivňují epigenom
Konec