Návod bakterie 2

Návod bakterie 2
Jednoduché barvení bakterií a diagnostické barvení podle Grama
Užívaná barviva:
Karbolfuchsin dle Ziehl - Neelsena: 1 g bazického fuchsinu se rozetře v porcelánové třecí
misce s 10 ml 96% ethanolu a ke směsi se přidá 100 ml vodného roztoku fenolu. Nechá se
stát do druhého dne, pak se přefiltruje. Uchovává se v tmavých lahvích se zabroušenou
zátkou. K barvení se používá zředěný vodný roztok - 10 ml koncentrovaného
karbolfuchsinu se zředí 90 ml destilované vody
Methylénová modř dle Lofflera:
roztok A - 0,2 g methylénové modři, 60 ml ethanolu;
roztok B - 2 ml 0,1 M NaOH, 200 ml destilované vody
Roztoky A a B se smíchají a uchovávají v tmavé lahvi
GRAMOVO BARVENÍ
Krystalová violeť
roztok A: 5 g krystalové violeti se rozpustí přes noc v termostatu při 37°C v 200 ml 96%
ethanolu; zfiltruje se přes filtrační papír do tmavé reagenční láhve se zabroušenou zátkou.
roztok B : 2 g šťavelanu amonného se rozpustí v 200 ml destilované vody a zfiltruje se přes
filtrační papír do tmavé reagenční láhve se zabroušenou zátkou.
OBA TYTO ZÁKLADNÍ ROZTOKY JSOU STÁLÉ A DO ZÁSOBY SE UCHOVÁVAJÍ ODDĚLENĚ.
Příprava barviva : 1 díl roztoku A a 4 díly roztoku B se smísí.
SMĚS NENÍ STÁLÁ, UCHOVÁVÁ SE V TMAVÉ LAHVIČCE NEJDÉLE 7 - 14 DNÍ.
BARVIVO JE TŘEBA TĚSNĚ PŘED BARVENÍM FILTROVAT PŘES FILTRAČNÍ PAPÍR.
Lugolův roztok (IIK): 1 g jódu a 2 g jodidu draselného se dobře rozetře v třecí misce s 10
ml destilované vody. Doplní se 290 ml destilované vody. Uchovává se v tmavých
reagenčních lahvích se zabroušenou zátkou.
Aceton - ethanolová odbarvovací směs : 4 díly 96% ethanolu + 1 díl acetonu
Karbolfuchsin dle Ziehl - Neelsena : viz výše
1. Bakterie mléčného kvašení – Jednoduché barvení
Teorie : Mléčné kvašení je děj způsobený bakteriemi mléčného kvašení. Díky jejich činnosti
neupravované mléko během 24 hodin (při teplotě 15 - 35°C) samovolně kysne. Vzniklá kyška má
dietetické účinky. Při zkvašování cukrů produkují bakterie značné množství kyseliny mléčné, která
snižuje pH prostředí a tím znemožňuje rozvoj jiných nežádoucích druhů bakterií např. bakterií
hnilobných. V potravinářském průmyslu a zemědělství jsou bakterie využívány při přípravě kysaného
zelí, kvašených okurek, řady mléčných výrobků (jogurty, podmáslí, zákysy, acidofilní mléko, kefir
apod.), silážování píce atd. Potrava i píce získává při tomto procesu na stravitelnosti i chuti.
Nejčastějšími zástupci bakterií mléčného kvašení v mléčných výrobcích jsou streptokoky
(Streptococcus lactis; S. termophillus), diplokoky (Diplococcus cremoris), tyčinkovité laktobacily
(Lactobacillus bulgaricus; L. jogurti; L. acidopihlus)
Úkol: Zhotovte preparát bakterií z donesených mléčných výrobků
Materiál a pomůcky : Bílý jogurt, mléčný zákys, podmáslí, karbolfuchsin nebo methylénová
modř podle Löfflera, kahan, bakteriologické očko, potřeby pro mikroskopování.; imerzní olej,
mikroskop s imerzním objektivem (preparáty prohlížejte v obyčejném mikroskopu – zv. 600x bez
imerze, i v laboratorním mikroskopu s imerzí)Provedení :
Ve všech případech zhotovíme preparát nátěrem. Do kapky destilované vody na sterilním
ožehnutém sklíčku přenesem bakteriologickým očkem jogurt (podmáslí, zákys) v množství
cca velikosti špendlíkové hlavičky a očkem provedeme nátěr. Preparát po oschnutí fixujeme
plamenem a barvíme karbolfuchsinem 3 - 5 min (methyl. modří 5 - 10 min). Barvivo
opláchneme destilovanou vodou, necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem.
Mikroskopujeme bez
vody a krycího
sklíčka, v případě
imerzní mikroskopie
s imerzním olejem.
Zjištění: V zákysu
nalezneme řetízky
streptokoků, v
preparátu z jogurtu
tyčinky laktobacilů a
řetízky streptokoků,
v preparátu podmáslí
diplokoky a
streptokoky.
Poznámky :
V široké škále
mléčných výrobků
současného trhu je
možné objevit
jednotlivé zástupce
mléčných bakterií v
různých
kombinacích.
Používají se též jiné
druhy, než výše
zmíněné.
2. Téma : Bakterie zubního hlenu – Jednoduché barvení, negativní barvení
Teorie : Ústa, stejně jako další dutiny v těle člověka jsou díky svému teplému a vlhkému prostředí
vhodným místem pro výskyt bakterií. Stejně jako např. trávicí trubice, dýchací či pohlavní ústrojí
obsahují svoji přirozenou mikroflóru a stejně jako další části těla jsou vstupní branou pro průnik
patogenních (choroboplodných) mikroorganismů do těla.
Hlavním zdrojem živin pro bakterie jsou sliny obsahují rozpuštěné pevné látky - anorganické (např.
sodík, draslík, vápník aj. stopové prvky; chloridy, bikarbonáty, fosfáty aj. sloučeniny) a organické
(bílkoviny - např, enzymy; cukry, aminokyseliny, vitamíny, amonikak apod.). Ve slinách byly objeveny
i látky s antibakteriálním účinkem (např. lysozym). Reakce slin se pohybuje v rozmezí pH 5,7 - 7,0.
Složení slin u různých lidí se do jisté míry liší (je ovlivněno např. fyziologickými předpoklady,
emocionálním stavem apod.).
Mikroflóra je závislá na přítomnosti a stavu zubů (flóra bezzubých úst a úst se zuby se výrazně liší, s
růstem zubů se mění od aerobní k převážně anaerobní).
Na povrchu zubů se tvoří tenký, pevně přisedlý film, který nelze úplně odstranit ani při čištění zubů
kartáčkem (tloušťka filmu je cca 60 mikrometrů na nepřístupných místech; 1 - 3 mikrometry na
čištěných místech). Tento film obsahuje hlavně vláknité gramnegativní bakterie, které zkvašují cukry
na kyselinu mléčnou, dále pak menší počet dalších bakterií, jako streptokoky, koryneformní tyčky,
gramnegativní koky a jiné.
Dutina ústní obsahuje pak další bakterie - např. grampozitivní koky, mikrokoky, stafylokoky,
streptokoky, gramnegativní koky a tyčky (z hlediska systému se jedná o zástupce rodů Streptococcus,
Neisseria, Veillonella, Lactobacillus, Leptotrichia, Corynebacterium, Bacteroides, Fusobacterium,
Spirillum apod.) Všechny tyto organismy jsou za normálních podmínek neškodné, dojde-li však k
poškození sliznice, pronikají do tkání a mohou vyvolat onemocnění.
Ústní mikroflóra se významně podílí na vzniku zubního kazu. Nejvýznamější je podíl bakterií, které
zkvašují cukry na kys. mléčnou (Lactobacillus, Streptococcus, Leptotrichia aj.). Kyselina mléčná
způsobuje odvápnění zubní skloviny a umožňuje vznik zubního kazu.
Úkoly :
A. Obarvěte bakterie zubního hlenu metodou jednoduchého barvení
B. Obarvěte bakterie zubního hlenu metodou negativního barvení
Materiál a pomůcky :
Zubní hlen (bílý povlak zubů), párátka, zředěný roztok tuše, kahan, potřeby pro
mikroskopování, voda, karbolfuchsin, imerzní olej, mikroskop s imerzním objektivem (preparáty
prohlížejte v obyčejném mikroskopu – zv. 600x bez imerze, i v laboratorním mikroskopu s imerzí)
Provedení :
ad A. Tupou stranou párátka opatrně seškrábneme bílý zubní povlak ze zubů (pozor na
poranění dásní) a provedeme nátěr na ožehnuté podložní sklíčko (nátěr provádíme párátkem,
jímž jsme povlak seškrábli). Necháme na vzduchu vyschnout, fixujeme plamenem (několikrát
protáhneme plamenem kahanu, nátěrem vzhůru) a barvíme metodou jednoduchého barvení cca 3 minuty zředěným karbolfuchsinem. Po té opatrně opláchneme destilovanou vodou,
necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem a mikroskopujeme pod imerzí.
Zjištění : Pozorujeme růžově zbarvené bakteriální buňky rozmanitých tvarů (vlákna, spirály,
tyčky, koky, stafylokoky, streprokoky aj. Převažují vláknité bakterie.
ad B. Na čisté ožehnuté podložní sklíčko dáme kapku zředěné tuše a do ní párátkem
přeneseme zubní hlen získaný jako v úkolu č. 1. Párátkem provedeme nátěr hlenu společně s
kapkou tuše, necháme na vzduchu oschnout, nefixujeme. Na suchý preparát kápneme kapku
cedrového oleje a pozorujeme pod imerzí.
Zjištění: Na tmavém tušovém pozadí vidíme světlé buňky bakterií. Tvary buněk zakreslíme.
V závěru protokolu vyjmenujeme nejčastější zástupce (podle úvodu protokolu či podle
dostupné literatury)
Poznámky :
S metodou negativního barvení se seznamujeme pouze informativně, velikost buněk
neměříme. V praxi se metoda negativního barvení používá v případě, kdy potřebujeme zjistit
nejen tvar ale i velikost buněk. Při běžných metodách barvení jednotlivé kroky postupu
mohou velikost buněk výrazně měnit (např. fixace, působení chemikálií z barviv aj.)
3. Diagnostické barvení bakterií podle Grama
Teorie : Diagnostické barvení je barvení, které pomáhá diagnostikovat - určovat bakterie a zařazovat
je do systému. Gramova reakce je založena na reakci některých látek v buněčné stěně bakterií s
určitými barvivy. Buněčné stěny některých bakterií obsahují kyselinu teichovou, která po obarvení
krystalovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný komplex (kyselina, barvivo,
jód z IIK) který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem či jejich směsí). V preparátu
mají tyto bakterie barvu krystalové violeti - fialovou až modofialovou. Jsou grampozitivní - G+.
Druhá skupina bakterií neobsahuje kyselinu teichovou v buněčné stěně, takže zmíněný komplex se
netvoří a modrá violeť se rozpouštědlem vymývá. Po dobarvení světlejším barvivem např.
karbolfuchsin nebo safranin se tyto bakterie obarví na růžovo (příp. růžovočerveno). Jsou
gramnegativní - G .
Za určitých podmínek (stáří bakteriálních kultur, nevhodné kultivační podmínky apod.) se něktré
bakterie mohou jevit jako gramlabilní anebo se z grampozitivních mění na gramnegativní.
Gramovo barvení je tedy metodou potvrzující, nikoli vyvracející. Jiný výsledek gramova barvení sám o
sobě nevyvrátí zažazení druhu do systému, pokud není podpořen dalšími zkouškami, např.
biochemickými testy apod.
Úkol : Obarvěte gramovou metodou zadaný vzorek, pozorujte tvary bakterií,
rozhodněte, zda jsou bakterie ve vzorku grampozitivní či gramnegativní.
Materiál a pomůcky :
Bakteriální kultura (mléčný výrobek, kolonie na agaru, zooglea senného nálevu apod.),
bakteriologické očko, kahan, mikroskop s imerzním objektivem a potřeby pro
mikroskopování, imerzní olej (oleum cedri), destilovaná voda, barviva a roztoky:
Provedení : Připravíme preparát - nátěr vzorku ožehnutým bakteriologickým očkem,
necháme na vzduchu oschnout, fixujeme plamenem kahanu. Na takto připravený preparát
kápneme kapku krystalové violeti a necháme působit 20 sekund. Bez opláchnutí přikápneme
kapku Lugolova roztoku, který slejeme i s původním barvivem (violetí), znovu nalejeme
dostatečné množství Lugolova roztoku a necháme působit 20 - 30 sekund. Preparát
odbarvujeme aceton-ethanolovou směsí (pipetou, odbarvovací směs lijeme opatrně na
zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát necháváme volně stékat) a dobře opláchneme
destilovanou vodou (stříčkou nebo pipetou, stejně opatrně jako při odbarvování). Preparát
dobarvíme zředěným karbolfuchsinem 30 - 60 sekund. Nakonec preparát znovu opláchneme a
necháme oschnout či opatrně osušíme filtračním papírem. Mikroskopujeme v olejové imerzi.
Mnemotechnická pomůcka pro snadnější zapamatování si postupu gramova barvení :
VLAK = Violeť - Lugol - Aceton(alkohol) - Karbolfuchsin
příp.
VLAS = Violeť - Lugol - Aceton(alkohol) - Safranin
Zjištění: V preparátu pozorujeme tvary a zbarvení bakteriálních buněk. Výsledky
konfrontujeme s literaturou.
Např. V jogurtu jsme pozorovali grampozitivní řetízky koků - streptokoky. Po konfrontaci
výsledků s literaturou jsme druh určili jako Streptococcus lactis.
Poznámky :
Nejčastější chyby, které mohou způsobit chybný výsledek :
sušení preparátu za přílišného tepla - uvaření buněk
příliš dlouhé odbarvování acetonem (odbarvení i barevného komplexu b. stěny G+ bakterií)
lití vody nebo odbarvovací směsi přímo na preparát - znehodnocení preparátu, odplavení
objektů.