Full text

THE USE OF GENETICALLY MODIFIED PLANTS FOR REMEDIATION
OF CONTAMINATED SOILS
VYUŽITÍ GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ROSTLIN
PRO REMEDIACI KONTAMINOVANÝCH ZEMIN
Martina Nováková1,2), Martina Macková1,2), Tomáš Macek2,1), Jan Fišer1), Jáchym Šuman1),
Veronika Kurzawová1)
1) Institute of Chemical Technology Prague, Faculty of Food and Biochemical Technology,
Technická 5, 166 28 Praha 6, Czech Republic, e-mail: [email protected]
2) Czech Academy of Science, Joint Laboratory of ICT Prague and IOCB CAS, Flemingovo nam. 2,
166 10 Praha, Czech Republic
Abstract:
One possibility of the removal of environmental contaminants represents the biological remediation
methods. These techniques don’t destroy the environment and are public acceptable. Among
biological methods the use of genetically modified organisms, such GM microorganisms or GM plants
can be considered. Using genetically modified microorganisms on contaminated sites, however, hints
on their viability on such sites and on the legislative problems. Research is therefore nowadays
oriented to the possibility of using GM plants with increased degradative abilities. The aim is the
formation of plants combining a high ability to accumulate, detoxify, or degrade xenobiotics and
pollutants, with resistance toward the toxic compounds present and with suitable agrotechnical
characteristics. There has been already prepared several transgenic plants to accumulate heavy metals
or to degrade aromatic pollutants. Suitable genes for preparation of transgenic plants with increased
heavy metals accumulation or tolerance to heavy metals are genes for peptides or proteins
accumulating heavy metals, for glutathione, metallothioneins, or genes for metal transportes. Suitable
genes for preparation of transgenic plants metabolising organic pollutants are genes from degradation
pathways of such pollutants. This paper generally summarizes the various options of use of genetically
modified plants for phytoremediation purposes.
Keywords:
Bioremediation, phytoremediation, genetically modified organisms, organic pollutants, inorganic
pollutants, plants
Abstrakt:
Jednou z možností odstranění kontaminantů z životního prostředí je využití metod biologické
remediace. Tyto techniky neničí vzhled životního prostředí a jsou akceptovány širokou veřejností.
Mezi biologické metody patří i využití geneticky modifikovaných (GM) organismů, např. GM
mikroorganismů nebo GM rostlin. Využití geneticky modifikovaných mikroorganismů na
kontaminovaných plochách nicméně naráží na jejich schopnost přežít v kontaminovaném prostředí a
zvláště na legislativní problémy. Proto je výzkum více orientován na využití GM rostlin se zvýšenou
schopností degradovat kontaminanty životního prostředí. Cílem je připravit takovou rostlinu, která by
dokázala polutant nejen akumulovat a detoxikovat nebo jej degradovat, ale aby byla také resistentní
k daným koncentracím polutantu a aby její agrotechnologické vlastnosti byly pro pěstování výhodné.
Již byla připravena řada transgenních rostlin akumulujících těžké kovy nebo degradujících aromatické
polutanty. Vhodné geny pro přípravu transgenních rostlin se zvýšenou akumulací nebo tolerancí
k těžkým kovům jsou geny pro peptidy nebo proteiny chelatující těžké kovy, pro glutathion,
metalothioneiny nebo geny pro transportéry iontů kovů. Vhodné geny pro přípravu transgenních
rostlin metabolizujících organické polutanty jsou geny z degradačních drah daných organických
kontaminantů. Tento příspěvek shrnuje obecně jednotlivé možnosti použití geneticky modifikovaných
rostlin pro fytoremediační účely.
Klíčová slova:
Bioremediace, fytoremediace, geneticky modifikované organismy, organické polutanty, anorganické
polutanty, rostliny
Úvod
Snaha o odstranění polutantů z životního prostředí, popř. zabránění další kontaminace, vedla
k přípravě mnoha geneticky modifikovaných rostlin. Jedním ze způsobů ochrany životního prostředí
s použitím transgenních rostlin je jejich aplikace v oblasti fytoremediace. V současnosti je uplatňována
snaha genetickými manipulacemi získat rostliny upravené na míru požadavkům fytoremediace (Macek
a kol., 2008). Do rostlin se za účelem zlepšení jejich fytoremediačních vlastností vnášejí bakteriální,
kvasinkové a savčí geny nebo se zvyšuje exprese již přítomných rostlinných genů. Exprese těchto
genů by měla zajistit zvýšení účinnosti přirozených metabolických drah a schopností rostlin.
Transgenní rostliny pro fytoremediaci anorganických látek
Od devadesátých let dvacátého století byla charakterizována řada rostlinných mechanismů rezistence
vůči kovům na buněčné i molekulární úrovni a identifikovány některé geny zodpovědné za tuto funkci
(Zhang a kol., 2006). Přírodní hyperakumulátory, které lze nalézt v oblastech kontaminovaných
těžkými kovy, jsou většinou rostliny malého vzrůstu, tvořící malé množství biomasy, tolerantní a
specifické pouze pro jeden typ kontaminantu (Cunnigham a Ow, 1996; Chaney a kol., 1997). Znalosti
mechanismů rezistence u přírodních hyperakumulátorů vedly k přípravě transgenních rostlin s vyšší
rezistencí nebo vyšší akumulací těžkých kovů, které zároveň tvoří velké množství biomasy a jsou tak
pro fytoremediace vysoce účelné. Na druhou stranu se objevila také snaha potlačit translokaci těžkých
kovů do nadzemních částí rostliny u plodin určených pro konzumaci, aby se tak zabránilo šíření
těžkých kovů potravním řetězcem (Zhang a kol., 2006).
Rostlinné mechanismy rezistence spočívají v imobilizaci těžkých kovů v buněčné stěně, vyloučení
kovů přes membránu, chelataci v cytoplasmě, oddělení ve vakuole, přeměně a volatilizaci kovů
a syntéze stresových proteinů (Ma a kol., 1997; Guo a kol., 1998; Song a kol., 2001; Tang a kol.,
2005). Klonováním genů klíčových enzymů tak lze dosáhnout požadované vlastnosti
u transformované rostliny.
Většina připravených transgenních rostlin pro fytoremediace anorganických polutantů je založena na
znalostech mechanismů akumulace těžkých kovů, tzn. přenos těžkých kovů přes membránu nebo
z kořenů do nadzemních částí rostliny, jejich chelatace v cytosolu s fytochelatiny, metalothioneiny,
glutathionem a následné uskladnění ve vakuole. Byly však studovány také transgenní rostliny
exprimující bakteriální gen pro deaminasu aminocyklopropankarboxylové kyseliny (ACC deaminasu)
(Grichko a kol., 2000). ACC deaminasa přeměňuje ACC na α-ketobutyrát a amoniak, přičemž ACC je
prekurzorem ethylenu v rostlinách. Proto připravené transgenní rostliny Lycopersicon esculentum
(rajče jedlé) obsahující bakteriální ACC deaminasu produkují méně ethylenu než netransgenní druh.
Transgenní rajčata s nižšími koncentracemi ethylenu jsou méně náchylná ke stresu a jsou schopná růst
v přítomnosti Cd, Co, Cu, Ni, Pb a Zn, případně je i akumulovat (Grichko a kol., 2000). Protože je
však využití zemědělských plodin ve fytoremediacích nevhodné, byl gen pro ACC deaminasu vnesen
i do rostlin Brassica napus (brukev řepka olejka) (Nie a kol., 2002; Arshad a kol., 2007), které tvořily
i delší a hustší kořeny oproti netransgennímu druhu.
Transgenní rostliny pro fytoremediaci organických látek
Životní prostředí je v současné době kontaminováno nejen těžkými kovy, ale i organickými látkami,
jako jsou např. organická rozpouštědla benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (BTEX), výbušniny,
polychlorované bifenyly (PCB), pesticidy aj. Aby rostliny mohly tyto látky lépe degradovat,
v nejlepším případě až mineralizovat, lze vnášet do rostlinného genomu geny z prostudovaných
bakteriálních degradačních drah. Úspěšně se tedy dají využít některé bakteriální, ale i savčí geny pro
vnesení do rostlin za účelem zvýšení biodegradace nebezpečných látek. Z bakteriálních genů to jsou
např. některé geny pro degradaci trinitrotoluenu (TNT) (French a kol., 1999; Hannink a kol., 2007),
geny pro degradaci aromatických uhlovodíků (Shimizu a kol., 2002) a polychlorovaných bifenylů
(Frančová a kol., 2001; Novakova a kol., 2009, 2010). Savčí geny, např. pro cytochrom P450,
představují rovněž významnou kapitolu pro transformaci xenobiotik (Doty a kol., 2000; Inui a kol.,
2000; Kawahigashi a kol., 2002, 2005).
V rámci práce naší laboratoře se zabýváme přípravou transgenních rostlin jak pro fytoremediaci
anorganických polutantů, tak i organických polutantů (Novakova a kol., 2009, 2010). Pro transformaci
rostlin za účelem získání rostliny s vyšší účinností degradovat organické polutanty byla použita
rostlina Nicotiana tabacum a bakteriální geny bphC a todC1C2. Gen bphC kóduje 2,3dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasu katalyzující štěpení aromatického kruhu dihydroxybifenylu a byl
klonován ve fúzi s genem pro ß-glukuronidasu (GUS), s genem pro luciferasu (LUC) a s histidinovou
kotvou (Novakova a kol., 2009). Geny todC1C2 byly klonovány s histidinovou kotvou (gen todC1) a
kódují bakteriální dioxygenasu ISPTOL, která je součástí multikomponentního enzymu
toluendioxygenasy a katalyzuje oxygenaci toluenu a jiných organických sloučenin.
Toluendioxygenasa je enzym se širokou substrátovou specifitou, popsáno bylo již přes 60 substrátů,
mezi něž patří také bifenyl, trichlorethylen, 2,3-dichlor-1-propen aj.
Materiály a metody
Zdrojové organismy
Jako zdrojové organismy lze využít celou škálu prokaryot i eukaryot. V případě klonování genu bphC
byla použita bakterie Pandoraea pnomenusa B-356 (Hein a kol., 1998), kdy byl gen bphC klonován
ve fúzi s genem pro ß-glukuronidasu (GUS), s genem pro luciferasu (LUC) a s histidinovou kotvou.
V případě klonování genů todC1 a todC2 byly tyto amplifikovány z bakterie Pseudomonas
testosteroni F1.
Bakteriální kmeny
Pro metody klonování lze využít např. kmeny (v případě klonování genů bphC a todC1C2)
Escherichia coli DH5α, Escherichia coli S17-I, Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK),
Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pCH32). Bakterie jsou kultivovány v médiu dle LuriaBertani (LB) při 37 °C (E. coli) nebo 28 °C (A. tumefaciens).
Příprava transgenních rostlin
Před samotnou transformací rostlin je nejprve amplifikován požadovaný gen, který je následně pomocí
metod genového inženýrství vnesen do zvoleného rostlinného vektoru pod kontrolou vhodně
vybraného promotoru. Využití agrobakteriálního přenosu je v současnosti jednou z hlavních technik
využívaných pro vnesení požadovaných genů do rostlinného genomu (Barret a kol., 1997). Tato
metoda přenosu genetické informace do rostlinných buněk je založena na přirozené vlastnosti půdních
bakterií Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes infiltrovat poraněnou tkáň vyšších
rostlin a vnášet své specifické geny do rostlinného genomu. Při laboratorní přípravě transgenních
rostlin infikuje kmen agrobakteria, obsahující připravený vektor poraněné buňky, rostliny, které
následně regenerují a jednotlivé regeneranty jsou pěstovány na selekčním médiu s cílem získat pouze
ty, které obsahují nový transgen.
Testování transgenních rostlin
Výsledné transgenní rostliny jsou dále testovány na přítomnost transgenu metodou PCR a dále na
přítomnost transkribované mRNA metodou RT-PCR. Exprimované proteiny jsou poté studovány
technikami např. SDS-PAGE, MALDI-TOF, Western blot, popřípadě jsou tyto rekombinantní
proteiny izolovány z rostlinných pletiv a podrobeny analýze. Vlastnosti transgenních rostlin
využitelných pro fytoremediační účely musí být dále studovány z hlediska jejich viability na toxických
substrátech a fytoremediačních schopností, ať je to akumulace anorganických polutantů, nebo
metabolizace organických polutantů.
Výsledky a diskuse
V naší laboratoři se již dlouhodobě zabýváme tématikou bioremediací polutantů životního prostředí
pomocí mikroorganismů metabolizujících nejen polychlorované bifenyly (PCB) (Beranova a kol.,
2007; Dudkova a kol., 2009; Uhlik a kol., 2009), dále fytoremediací těchto polutantů vybranými druhy
rostlin (Mackova a kol., 2009; Rezek a kol., 2009; Zlamalikova a kol., 2009), kooperací rostlin
a mikroorganismů v procesu remediace (Stursa a kol., 2009; Trbolova a kol., 2009; Vrchotova a kol.,
2009), stimulací indigenní mikroflory utilizující tyto látky (Leigh a kol., 2006, Uhlik, 2009) nebo
ekotoxicitou a genotoxicitou vybraných polutantů (Lovecka a kol., 2007). Tato práce přináší do dané
problematiky nové poznatky, možnost fytoremediace s využitím geneticky modifikovaných rostlin,
které ve svém genomu obsahují geny důležité např. pro degradaci bifenylu, PCB, popř. toluenu a
jiných organických polutantů.
Závěr
Použití geneticky modifikovaných rostlin pro fytoremediace prozatím nebylo realizováno v praxi
v širším měřítku, přesto je však známo několik úspěšných příkladů, které prokázaly vyšší účinnost
akumulace anorganických látek, degradace organických látek nebo i vyšší rezistenci nových
transgenních rostlinných druhů k různým polutantům, a některé z nich jsou již uváděny do životního
prostředí.
Poděkování: Tato práce byla podporována granty MSMT 1M06030, ME-09024-BIOAROM, MSM
6046137305 a EU grantem Minotaurus FP7 KBBE-2010-4-265946.
Literatura:
Arshad M., Saleem M., Hussain S. 2007. Perspectives of bacterial ACC deaminase in
phytoremediation. Trends Biotechnol. 25, pp. 356-362.
Barret C., Cobb E., McNicol R., Lyon G. 1997. A risk assessment study of plant genetic
transformation using Agrobacterium and implications for analysis of transgenic plants. Plant Cell
Tissue Organ. Cult. 47, pp. 135-144.
Beranova K., Kochankova L., Macek T., Mackova M. 2007. Rhizoremediation for decontamination of
long-term PCB contaminated soil with focus on microbial diversity. J. Biotechnol. 131, pp. 243.
Cunningham S. D., Ow D. W. 1996. Promises and prospects of phytoremediation. Plant Physiol. 110,
pp. 715–719.
Doty S. L., Shang T. Q., Wilson A. M., Tangen J., Westergreen A. D., Newman L. A., Strand S. E.,
Gordon M. P. 2000. Enhanced metabolism of halogenated hydrocarbons in transgenic plants
containing mammalian cytochrome P450 2E1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, pp. 6287-6291.
Dudkova V., Demnerova K., Bedard D. L. 2009. Microbial dechlorination of polychlorinated
biphenyls. FEBS J. 276, pp. 178.
Frančová K., Macek T., Demnerová K., Macková M. 2001. Transgenní rostliny – potenciální nástroj
pro dekontaminaci polutantů životního prostředí. Chem. Listy 95, pp. 630-637.
French C. E., Rosser S. J., Davies G. J., Nicklin S., Bruce N. C. 1999. Biodegradation of explosives by
transgenic plants expressing pentaerythriol tetranitranitrate reductase. Plant Physiol. 17, pp. 491-494.
Grichko V. P., Filby B., Glick B. R. 2000. Increased ability of transgenic plants expressing the
bacterial enzyme ACC deaminase to accumulate Cd, Co, Cu, Ni, Pb, and Zn. J. Biotechnol. 81, pp. 4553.
Guo X. X., Zhao H., Shi D. J., Xu J., Xu X. D., Ru B. G. 1998. Expression of mouse MT-1 cDNA in
filamentous cyanobacterium to enhance its metal-resistance. Acta Bot. Sin. 40, pp. 320–324.
Hannink N. K., Subramanian M., Rosser S. J., Basran A., Murray J. A. H., Shanks J. V., Bruce N. C.
2007. Enhanced transformation of TNT by tobacco plants expressing a bacterial nitroreductase. Int. J.
Phytoremediat. 9, pp. 385-401.
Hein P., Powlowski J., Barriault D., Hurtubise Y., Ahmad D., Sylvestre M. 1998. Biphenyl-associated
meta-cleavage dioxygenases from Comamonas testosteroni B-356. Can. J. Microbiol. 44, pp. 42-49.
Chaney R. L., Malik M., Li Y. M., Brown S. L., Brewer E. P., Angle J. S., Baker A. J. M. 1997.
Phytoremediation of soil metals. Curr. Opin. Biotechnol. 8, pp. 279-284.
Inui H., Kodama T., Ohkawa Y., Ohkawa H. 2000. Herbicide metabolism and cross-tolerance in
transgenic potato plants co-expressing human CYP1A1, CYP2B6 and CYP2C19. Pestic. Biochem.
Physiol. 66, pp. 116-129.
Kawahigashi H., Hirose S., Hayashi E., Ohkawa H., Ohkawa Y. 2002. Phytotoxicity and metabolism
of ethofumesate in transgenic rice plants expressing the human CYP2B6 gene. Pestic. Biochem.
Physiol. 74, pp. 139-147.
Kawahigashi H., Hirose S., Inui H., Ohkawa H., Ohkawa Y. 2005. Enhanced herbicide cross-tolerance
in transgenic rice plants co-expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19. Plant Sci. 168, pp.
773-781.
Leigh M. B., Prouzova P., Mackova M., Macek T., Nagle D. P., Fletcher J. S. 2006. Polychlorinated
biphenyl (PCB)-degrading bacteria associated with trees in a PCB-contaminated site. Appl. Environ.
Microbiol. 72, pp. 2331-2342.
Lovecka P., Zlamalikova J., Demnerova K., Mackova M., Kochankova L. 2007. Bacterial and plant
systems as bioremediation and ecotoxicity models. J. Biotechnol. 131, pp. 129.
Ma M., Tsang W. K., Kwan K. M. F., Lau P. S., Wong Y. S. 1997. Preliminary studies of the
identification and expression of metallothionein-like gene in Festuca rubra. Acta Bot. Sin. 39, pp.
1078-1081.
Macek T., Kotrba P., Svatos A., Novakova M., Demnerova K., Mackova M. 2008. Novel roles for
genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol 26, pp. 146-152.
Mackova M., Prouzova P., Stursa P., Ryslava E., Uhlik O., Beranova K., Rezek J., Kurzawova V.,
Demnerova K., Macek T. 2009. Phyto/rhizoremediation studies using long-term PCB-contaminated
soil. Environ. Sci. Pollut. Res. 16, pp. 817-829.
Nie L., Shah S., Rashid A., Burd G. I., George Dixon D., Glick B. R. 2002. Phytoremediation of
arsenate contaminated soil by transgenic canola and the plant growth-promoting bacterium
Enterobacter cloacae CAL2. Plant Physiol. Biochem. 40, pp. 355-361.
Novakova M., Mackova M., Chrastilova Z., Viktorova J., Szekeres M., Demnerova K., Macek T.
2009. Cloning of the bacterial bphC gene into Nicotiana tabacum to improve the efficiency of PCB
phytoremediation. Biotechnol. Bioeng. 102, pp. 29-37.
Novakova M., Mackova M., Antosova Z., Viktorova J., Szekeres M., Demnerova K., Macek T. 2010.
Cloning the bacterial bphC gene into Nicotiana tabacum to improve the efficiency of
phytoremediation of polychlorinated biphenyls, Author`s view. Bio. Bugs 1, pp. 419-423.
Rezek J., Macek T., Mackova M., Triska J. 2007. Plant metabolites of polychlorinated biphenyls in
hairy root culture of black nightshade Solanum nigrum SNC-9O. Chemosphere 69, pp. 1221-1227.
Shimizu M., Kimura T., Koyama T., Suzuki K., Ogawa N., Miyashita K., Sakka K., Ohmiya K. 2002.
Molecular breeding of transgenic rice plants expressing a bacterial chlorocatechol dioxygenase gene.
Appl. Environ. Microbiol. 68, pp. 4061-4066.
Song L. Y., Shi D. J., Ni Y., Luo N., Shao N., Yu M. M., Ru B. G. 2001. The integration and
expression of ββ mutant gene of human liver metallothionein in Synechocystis sp. PCC 6803 by
homology recombination. Acta Bot. Sin. 43, pp. 399–404.
Stursa P., Uhlik O., Kurzawova V., Kochankova L., Macek T., Mackova M. 2009. Rhizosphere
bacteria and their role in degradation of PCB. FEBS J. 276, pp. 184.
Tang C. F., Liu Y. G., Zeng G. M., Li X., Xu W. H., Li Ch. F, Yuan X. Z. 2005. Effects of exogenous
spermidine on antioxidant system responses of Typha latifolia L. under Cd2+ stress. J. Int. Plant Biol.
47, pp. 428–434.
Trbolova L., Dudkova V., Mackova M., Macek T. 2009. Secondary metabolites of plants and their
contribution to bacterial degradation of xenobiotics. FEBS J. 276, pp. 293.
Uhlík O. 2009. Přístupy k analýze diversity bakterií metabolizujících bifenyl v reálné kontaminované
půdě. Disertační práce, VŠCHT Praha.
Uhlik O., Jecna K., Mackova M., Vlcek C., Hroudova M., Demnerova K., Paces V., Macek T. 2009.
Biphenyl-metabolizing bacteria in the rhizosphere of horseradish and bulk soil contaminated by
polychlorinated biphenyls as revealed by stable isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 75, pp.
6471-6477.
Vrchotova B., Mackova M., Macek T. 2009. Transformation of chlorobenzoic acids by plant-bacteria
associations. FEBS J. 276, pp. 295.
Zhang R. Q., Tang Ch. F., Wen S. Z., Liu Y. G., Li K. L. 2006. Advances in research on genetically
engineered plants for metal resistance. J. Int. Plant Biol. 48, pp. 1257-1265.
Zlamalikova J., Demnerova K., Mackova M., Hajslova J., Pulkrabova J., Hradkova P., Napravnikova
M., Macek T., Stiborova H. 2009. Plant uptake of hexabromocyclododecane (HBCD). FEBS J. 276,
pp. 296.