Izolace inhibitorů P-glykoproteinu z Schisandra chinensis

Izolace inhibitorů P-glykoproteinu
z Schisandra chinensis
J. Slanina1, M. Čarnecká1, A. Zemánková1, O. Peš1, O.
Vymazal2, G. Páchniková2, I. Slaninová2
Biochemický ústav a 2Biologický ústav,
Lékařská fakulta, Masarykova univerzita
1
Schisandra chinensis
• liána z čeledi Schisandraceae
• původem z východní a JV Asie
• v tradiční čínské medicíně tonikum a
antitusikum
Dibenzo[a,c]cyklooktadienové
lignany
H3CO
• vznikajíMeO
oxidační dimerizací
2 fenylpropanových jednotek
H 3 CO
H
CO
H3 CO
MeO
3
H
CO
H33CO
H
H33CO
CO
H 3CO
CO
H
CH3
CH3
• Lignany rostlin čeledi
Schisandraceae
MeO
MeO
• Rod Schisandra a Kadsura
MeO
3
H 3 CO
H
3CO
deoxyschizandrin
MeO
(+)-deoxyschizandrin
Biosyntéza lignanů S. chinensis
HO
MeO
MeO
MeO
MeO
HO
pregomisin
MeO
O
HO
O
HO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
(-)-gomisin N
MeO
HO
(-)-gomisin J
MeO
HO
(+)-gomisin J
(+)-deoxyschizandrin
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
OH
MeO
O
O
(-)--schizandrin
MeO
(+)-schizandrin
Dibenzocyklooktadienové lignany
• Enanatiomerně čisté (?)
• Směs obou enantiomerů (?)
MeO
HO
HO
MeO
MeO
MeO
OH
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
HO
(+)-schizandrin
(-)-gomisin J
• racemat např. (±)-γ-schizandrin (?)
O
O
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
O
MeO
-schizandrin
O
(-)--schizandrin
HO
(+)-gomisin J
Lignany S. chinensis
• Schisandrin B je inhibitorem P-glykoproteinu
Qiangrong P, Tao W., Quinghua L., Xun H.: Biochem. Biophys. Res. Commun.
335, 406 (2005)
O
O
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
CH3
CH3
Izolace of lignanů z semen S. chinensis
semena (354 g)
petrolether, Soxhlet, 48 hod.
zbytek
petrolether. extrakt (117 g)
methanol (20x)
zbytek
methanolový extrakt (47 g)
kolonová chromatografie, silikagel
Semi-preparativní HPLC, silikagel C18
J.S.2
Semipreparativní HPLC lignanů
•
Stacionární fáze: Separon SGX C18 7 µm, 250 mm x 8 mm (Tessek Praha)
•
Mobilní fáze: 63% CH3OH
•
Průtok:
2,5 ml/min
•
Vzorek:
50 mg rozpuštěn v 2 ml 50 % CH3OH
•
Detekce:
UV 254 nm
[V]
10
Schizandrin
8
Gomisin A
Voltage
6
4
2
Tigloylgomisin H
0
0
10
20
30
Time
40
50
[min.]
Snímek 8
J.S.2
změnil jsem, vyměnit CH3OH místo MeOH, přidat animaci
Slanina; 10.2.2009
Lignany S. chinensis
Akumulace doxorubicinu v COR-L23/R
O
MeO
O
O
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
(+)-deoxyschizandrin
*
*
MeO
MeO
MeO
MeO
150
HO
O
HO
MeO
-schizandrin
(-)-gomisin J
(-)-gomisin N
*
%
A c c u m u la tio n
of
D o x o ru b ic in
100
50
0
VE R A
DEO
GSCH
GON
GOJ
AG H
TGN
Slaninová et al.: Toxicology in Vitro 23, 2009, 1047
Vliv struktury lignanů na akumulaci doxorubicinu
v rezistentních buňkách plicního karcinomu CORL23/R
MeO
MeO
O
O
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
OH
MeO
MeO
MeO
MeO
(+)-schizandrin
OH
MeO
(+)-gomisin A
O
MeO
(+)-deoxyschizandrin
O
O
O
O
O
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
MeO
rac- -schizandrin
O
MeO
(-)-gomisin N
O
(-)-wuweizisu C
Chirální HPLC (±)γ-schizandrinu
• Stacionární fáze: Chiralcel OD (50 x 4,6 mm, 10 µm, Daicel)
cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)
• Mobilní fáze:
heptan - propan-2-ol - 99:1
• Průtok:
0,5 ml/min
Detekce:
254 nm
[V]
0,25
Voltage
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
2
4
6
Time
8
[min.]
UV detekce (254 nm)
CD detekce (254 nm)
mobilní fáze: heptan:propan-2-ol 98:2, průtok 0,5 ml/min, 254 nm
1… R-(+)-γ-schizandrin
2… S-(-)-γ-schizandrin
Vliv propan-2-olu na retenci γ-schizandrinu
R e te n t io n tim e
( m in )
40
A
30
( + ) - g a m m a - s c h iz a n d r in
20
( - ) - g a m m a - s c h iz a n d r in
10
0
0
1
2
3
4
% p r o p a n - 2 - o l ( v /v )
5
Vliv propan-2-olu na rozlišení
enantiomerů γ-schizandrinu
R e s o lu t io n
B
S e le c t iv ity
4
6
5
4
3
2
2
0
1
0
1
2
3
4
% p r o p a n - 2 - o l ( v /v )
5
S e le c tiv ity (  )
R e s o lu tio n
(R )
6
Prep. chiralní HPLC (±)-γ-schizandrinu
• Stacionární fáze: Chiralcel OD (50 x 10 mm, 10 µm, Daicel)
• Mobilní fáze:
heptan - propan-2-ol – 99,75 : 0,25
• Průtok:
1,0 ml/min
• Vzorek:
2 mg rac-γ-schizandrinu v 2 ml heptanu
Detekce:
254 nm
[V]
R(+)-γ-schizandrin
2,0
Voltage
1,5
S(-)-γ-schizandrin
1,0
0,5
0,0
0
5
10
Time
15
[min.]
Chirální HPLC gomisinu J
Stacionární fáze:
Mobilní fáze:
Průtok:
mV
75
UV detekce
50
A
Chiralcel OD (50 x 4,6 mm, 10 µm, Daicel)
heptan - propan-2-ol – 98 : 2
0,5 ml/min
15a
2
OH
25
H3CO
1
0
-25
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Seconds
CH3
H3CO
H
H3CO
CH
H
H3CO
1
mV
50
A
OH
15b
CD detekce
25
2
0
-25
0
100
200
300
400
500
Seconds
600
700
800
(-)-gomisin J
OH
Chirální HPLC gomisinu J
Stacionární fáze:
10 µm, Daicel)
Chiralcel OD (50 x 4,6 mm,
H3CO
CH3
H3CO
H
H3CO
CH3
H
H3CO
OH
(-)-gomisin J
[m V ]
100
Mobilní fáze:
Voltage
80
heptan - IPA – 98 : 2
60
40
2
4
6
8
10
12
14
[ m in . ]
T im e
[m V ]
Mobilní fáze:
heptan–IPA-TFA – 98 : 2 : 0,1
Voltage
60
40
20
0
2
4
6
8
T im e
10
12
14
[ m in . ]
Semi-preparativní chirální HPLC gomisinu J
Chiralcel OD (50 x 4,6 mm, 10 µm, Daicel)
[m V ]
180
Voltage
heptan - IPA – 98 : 2
R=0,692
160
140
120
100
70
80
90
100
110
[ m in . ]
T im e
[m V ]
0
heptan- IPA-TFA – 98 : 2 : 0,1
Voltage
-20
R=0,899
-40
-60
-80
-100
60
70
80
90
100
110
[ m in . ]
T im e
[m V ]
60
Voltage
heptan - IPA – 98 : 2
R=1,145 !
40
20
0
promytí
CH3COOH
-2 0
60
70
80
90
100
110
[ m in . ]
T im e
[m V ]
60
R=0,676
40
Voltage
heptan - IPA – 98 : 2
20
0
-2 0
-4 0
promytí
TFA
-6 0
60
70
80
90
100
110
[ m in . ]
T im e
[m V ]
R=1,038
100
Voltage
heptan - IPA – 98 : 2
50
0
60
70
80
90
100
110
Chirální HPLC „rac-(±)-deoxyschizandrinu“
Stacionární fáze:
H3CO
H3CO
O
C
3
H
Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm, 5 µm,
Phenomenex)
Mobilní fáze: heptan - propan-2-ol – 75 : 25
Syntéza (-)-deoxyschizandrinu z (-)-gomisinu J
Průtok:
0,2 ml/min
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
(-)-deoxyschizandrin
(+)-deoxyschizandrin
[m V ]
MeO
200
CH3I
H3CO
H3CO
MeO
Voltage
MeO
150
H3CO
MeO
100
H3CO
HO
(-)-gomisin J
50
H3CO
O
C
3
250
H
HO
(-)-deoxyschizandrin
0
0
5
10
15
T im e
20
[m in .]
Izolace lignanů řízená podle akumulace
doxorubicinu v rezistentních buňkách
HL-60/MDR
Buňky:
HL-60/MDR rezistentní k doxorubicinu,
exprese P-glykoproteinu (ABCB1)
Testované extrakty: extrakty S. chinensis (c = 10 – 100 mg /l)
Pozitivní kontrola:
verapamil (c = 10 mg /l)
Akumulace doxorubicinu: preinkubace extraktů - 15 min
inkubace s doxorubicinem 60 min
průtoková cytometrie
Extrakce rostlinného materiálu
methanolem pomocí extraktu fexIKA
Rostlinný
materiál
Schisandra chinensis
semena
Schisandra chinensis
dřevo
Cynara cardunculus
listy
navážka
(g)
Extrakt
(mg)
Extrakt/
Akumulace
navážka doxorubicinu
(%)
(%)
1,119
239
21,3
161,4
1,152
195
17,0
155,5
1,068
361
33,8
118,9
Frakcionace methanolových extraktů pomocí SupelcleanTM
LC-18 SPE 1g (Supelco)
Vzorkek: methanolový extrakt semen a (S) a dřeva (D) z 500 mg rostlin. materiálu
Semena
eluce
frakce (mg)
akumulace
SPE frakce
(4 ml)
S1
25% CH3OH
9,0
103,6
S2
S3
40% CH3OH
8,2
91,3
100% CH3OH
39,0
188,1
S4
100% AcN
9,9
118,4
D1
25% CH3OH
28,0
122,8
D2
40% CH3OH
26,3
121,7
D3
100% CH3OH
33,8
203,8
D4
100% AcN
2,3
155,5
doxorubicinu (%)
Semi-preparativní separace CH3OH extraktu semen
Vzorek: 2,7 mg S3 (methanolový extrakt ze semen S. chinensis)
Kolona: Phenomenex Synergi MAX-RP (250 x 10 mm), mobilní fáze: 0-10 min.:
50-75% CH3OH, 10-30 min.: 75-95% CH3OH, 30-40 min.: 95100% CH3OH, průtok 2 ml/min, UV 254 nm.
Schizandrin – pík 1, gomisin J – pík 2, gomisin A – pík 3, deoxyschizandrin –
pík 4, γ-schizandrin – pík 5, gomisin N – pík 6, wuweizisu C – pík 7
350
Akumulace doxorubicinu
300
250
% akumulace
200
150
100
50
0
frakce
Porovnání frakcí
Akumulace doxo
Legenda:
1
2
3
[V]
směs 8 standardů lignanů
frakce „18“ - z 1 g semen
193 %
frakce ADS (938 mg) - z 354 g semen 189 %
4
2011-09-30 02 fr. 18 izolace Schisandra Anežka 1 - 10 ug v 1ml 5004etOH
2011-10-21 ADS frakce izolace Schisandra velká
2011-10-21 02 standard 8 lignanu- zbytek
5
60
8
20
7
6
Voltage
40
0
0
5
10
Time (min.)
15
20
Separace frakce ADS
Vzorek: 300 mg frakce ADS
Stacionární fáze: 20 g Separon SGX C18 (Tessek Praha)
Fr.
E6 – 80 % methanol
E7 – 90 % methanol
E8 a E9 – 100 % methanol
Semi-prep. HPLC 5,0 mg fr. ADS – E7 (90% methanol)
A k u m u la c e d o x o r u b ic in u
400%
350%
300%
% k o n tr o l y
250%
200%
150%
100%
50%
0%
DMSO
V era
E7 -2
E7 -3
E7 -4
E7 -5
E7 -6
E7 -7
F rakce A D S - E 7-x
E7 -8
E7 -9
E7 -1 0
E7 -1 1
E7 -1 2
O
+ H+
ESI-MS pík E7-5
O
O
O
O
M + H+ = 507
C30H3407+
O
O
Intens. 1.
x104
O
O
C30H35O7+
m/z: 507.23
H O
O
O
507.23779
O
6
+MS, 0.2-0.3min #13-#16, -Spectral Bkgrnd
+K - 1.00667
+Na - 1.00872
507.23
C23H30O6
m/z: 402.20
4
+NH4 - 1.00765
O+
C
2
331.28377
C7H5O+
m/z: 105.03
313.27404
524.26451
359.31527
566.31107
376.34228
397.16438
0
x104 1.
+MS2(507.23779), 0.2-0.3min #14-#17
105.03395
105.03
3
2
1
0
100
200
300
400
500
600
m/z
O
+ H+
H O
ESI-MS pík E7-6
O
O
O
O
H O
O
O
H+
M+
= 485
C28H3707+
O
O
O
C28H37O7+
m/z: 485.25
O
H
H2C
C23H30O6
m/z: 402.20
C5H6O
m/z: 82.04
O+
O
+ H+
O
H
H
C5H7O+
m/z: 83.05
Intens. 1.
x105
1.50
O
H2C
O
O
O
+MS, 0.3-0.3min #16-#20,
-Spectral Bkgrnd
O
485.25261
C23H31O6+
m/z: 403.21
1.25
1.00
484.24249
0.75
+Na - 1.00884
+NH4 - 1.00714
0.50
0.25
397.16277
0.00
600 1.
83
340.16645
500
544.32612
986.52234
+MS2(485.25262), 35-35eV, 0.3-0.4min #17-#21
403
403.20927
302.11352
400
56.05742
300
200
100
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
m/z
Závěry
• Příprava 3 párů optických izomerů lignanů
• Semena i dřevo S. chinensis obsahuje inhibitory Pglykoproteinu
• P-gp inhibitory jsou ve frakci eluované z SPE
kolonky 100% methanolem („lignanová frakce“)
• Některé frakce z semi-preparativní HPLC
methanolového extraktu semen akumulují
doxorubicin uvnitř buněk HL60/P-gp účinněji než
deoxyschizandrin nebo verapamil
• 2 acylderiváty DBCO „deoxyschizandrinového typu“
Poděkování:
RNDr. Otakar Humpa
– Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta, MU
– Měření NMR spekter
Ing. Ondřej Julínek
Ústav analytické chemie VŠCHT
- Měřeni optické rotace lignanů
Děkuji za pozornost