Selektovatelné a signální geny - Biologické centrum AV ČR, vvi

Selektovatelné a signální geny - Biologické centrum AV ČR, vvi

Selektovatelné a signální geny
Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
BC AV ČR, v.v.i. a PřF JU České Budějovice
Selektovatelné transgeny
 účinnost procesu transformace je nízká
 v laboratoři či skleníku jejich přítomnost nečiní
problém, avšak v polních podmínkách jsou
neakceptovatelné
 jsou selektovatelné geny v transgenních rostlinách
problémem?
- pokud sledujeme hledisko (bio)bezpečnosti,
ve většině případů nikoliv
- z hlediska přijatelnosti pro veřejnost ANO
 vyvíjejí se systémy, které – obecně řečeno –
minimalizují velikost transgenní DNA, aniž by to
mělo vliv na funkci vnášených gen ů:
Selektovatelné transgeny
(i) Selektovatelné geny nejsou vůbec do genomu
regenerované rostliny vnášeny (T-DNA s morforegulačním
genem, např ipt, který je v transpozonu; vektorový systém
MAT – multi-autotransformation vector – gen ipt není v
transpozonu, ale uvnitř specifické sekvence, která je
rozeznávána rekombinázou z kvasinky).
Selektovatelné transgeny
Selektovatelné transgeny
(ii)Selektovatelné geny jsou při transformaci do
genomu vneseny, ale po identifikaci transgenních
rostlin jsou z nich eliminovány místně specifickou
rekombinací, transpozicí, segregací (po
kotransformaci) nebo homologní rekombinací.
V současnosti jsou známy 4 místně specifické
rekombinační systémy, u kterých bylo prokázáno,
že mohou zprostředkovávat tuto reakci i u rostlin:
Selektovatelné transgeny
Selektovatelné transgeny
 vývoj systémů založených na zcela jiných selektovatelných
genech, jež jsou přijatelnější, neboť se nejedná o geny
rezistence vůči antibiotikům či herbicidům:
A) Pozitivní selekční systémy
i) manóza-6-fosfát-isomeráza (manA)
ii) D-xylóza-ketol-isomeráza (xylA)
iii) ß-glukuronidáza (gusA)
B) Negativní selekční systémy
i) UDP-glukóza:galaktóza-1-fosfát-uridyl-transferáza (galT)
ii) 2-deoxyglukóza-6-fosfát-fosfatáza (DOGR 1)
iii) tryptofandekarboxyláza (tdc)
iv) ferredoxin-like protein (pflp)
v) threonindeamináza (ilvA)
vi) oxidáza D-aminokyselin (DAAO, dao 1)
vii) D-serin amoniumlyáza (D-serin deamináza, dsdA)
Selektovatelné transgeny
 Pozitivní selekce – systém, kdy transgenní buňky
získávají při regeneraci a růstu výhodu díky
vznikajícímu metabolizovatelnému produktu,
zatímco netransgenní buňky strádají, ale nehynou.
 Negativní selekce – transgenní buňky jsou schopny
na selekčním médiu přežívat díky detoxifikaci
selekčního faktoru na dále nemetabolizovatelný
produkt, zatímco netransgenní buňky hynou.
Selektovatelné transgeny
 manóza-6-fosfát-isomeráza (manA)
- selekční látkou je manóza, kterou většina rostlinných
druhů není schopna metabolizovat
- endogenní hexokinázou fosforylována na manóza-6-fosfát,
který není dále metabolizován a hromadí se v buňce
- díky tomu dochází k silné růstové inhibici
- enzym manóza-6-fosfát-isomeráza je schopen přeměňovat
manóza-6-fosfát na metabolizovatelný fruktóza-6-fosfát,
který vstupuje do glykolytické dráhy
- enzym se obecně vyskytuje u baktérií, kvasinek i savců
(vč. člověka)
- pro transformaci byl využit gen manA z E. coli
- dosud úspěšné transformace: maniok, kukuřice, rýže,
cukrovka, pšenice, Arabidopsis, pomerančovník, pšenice
tvrdá, konopí, Pennisetum glaucum (bajra), papája,
čirok, psineček výběžkatý, mandloň, cibule, okurka,
čínské zelí, rajče, brambor, salát…
Selektovatelné transgeny
 ß-glukuronidáza (gusA)
- selekční látkou je benzyladenin-N-3-glukuronid, který je ßglukuronidázou přeměňován na růstový hormon
benzyladenin
- ten stimuluje regeneraci prýtů a růst transgenních buněk,
zatímco netransgenní buňky se dále nevyvíjejí
- jako selekční látku lze také použít kyselinu cellobiuronovou
(CbA), protože tato kyselina je tvořena glukózou a
kyselinou glukuronovou, mezi nimiž je glykosidická
vazba; po jejím rozštěpení β-glukuronidázou se uvolňuje
glukóza sloužící pro transformované buňky jako jediný
zdroj energie, zatímco netransformované buňky
nedokáží tento zdroj energie využít a strádají
Selektovatelné transgeny
 2-deoxyglukóza-6-fosfát-fosfatáza (DOGR 1)
Selekční látkou je 2-deoxyglukóza, která je normálně v
cytosolu přeměnována na 2-deoxyglukóza-6-fosfát. Ten
funguje jako kompetitor glukóza-6-fosfátu a má tedy na
buněčný metabolismus toxický efekt vedoucí nakonec k
buněčné smrti.
Vnesením kvasinkového genu pro 2-deoxyglukóza-6-fosfátfosfatázu do rostlin tabáku a bramboru byly získány
rostliny rezistentní k 2-deoxyglukóze (Kunze et al. 2001)
s tím, že u obou druhů byla účinnost transformace
srovnatelná se systémem založeným na kanamycinu.
Selektovatelné transgeny
 tryptofandekarboxyláza (tdc)
Selekční látkou je toxický analog tryptofanu 4metyltryptofan, který je uvedeným enzymem
přeměňován na netoxický 4-metyltryptamin.
Gen pro tryptofandekarboxylázu byl získán z okrasné rostliny
Catharanthus roseus (barvínkovec růžový) a byl použit k
úspěšné transformaci tabáku (Goddijn et al. 1993).
 oxidáza D-aminokyselin (DAAO, dao1)
Erikson et al. 2004 popsali u A. thaliana použití
selektovatelného genu dao1 kódujícího oxidázu Daminokyselin (DAAO, EC 1.4.3.3, oxidoreduktáza).
Selekce je založena na toxicitě některých D-aminokyselin –
pro rostliny jsou toxické např. D-alanin a D-serin, po
metabolizaci pomocí DAAO (tj. oxidativní deaminací) se
však změní na netoxické látky.
Transformační účinnost byla 2,12 % pro D-alanin, 1,67 %
pro D-serin a 2,37 % pro kanamycin.
Selektovatelné transgeny
Selekce při transformaci ptDNA
(i) C. reinhardtii: k transformaci využívány nefotosyntetizující
kmeny nesoucí mutaci v jednom z chloroplastových genů
podílejících se na fotosyntéze. Vnášeny byl funkční kopie
stejných genů, což vedlo u transformantů k obnovení
fotosyntézy a umožnilo tak jejich selekci (Boynton et al.,
Science, 240: 1534-1538, 1988).
(ii) Použití bodových mutací v genech pro ribosomální RNA
nebo ribosomální proteiny plastidů, které zajišťovaly
resistenci k antibiotikům spektinomycinu, streptomycinu a
erytromycinu (Newman et al., Genetics, 126: 875-888,
1990). Tuto selekci se podařilo realizovat i u vyšších rostlin
(Svab et al., PNAS, 87: 8526-8530, 1990), nicméně
úspěšnost transformace byla velmi nízká.
Selekce při transformaci ptDNA
(iii) Frekvenci transformace se podařilo významně zvýšit až
použitím genu aadA kódujícího enzym adenosyl-3‘-adenyl
transferasu. Tento enzym z E. coli inaktivuje některá
antibiotika jako spektinomycin nebo streptomycin (Svab et
al., PNAS, 90: 913-917, 1993). aadA je v současnosti při
transformaci plastidů nejdůležitějším selekčním genem.
(iv) Gen nptII byl využit při úspěšné selekci plastidových
transformantů tabáku (Carrer et al., MGG, 241: 49-56,
1993), gen aphA-6 z Acinetobacter baumannii (Bateman &
Purton, Mol. Gen. Genet., 263: 404-410, 2000) při
transformaci C. reinhardtii.
(v) Využít tolerance k herbicidům (atrazin, fosfinotricin), jejichž
mechanismem působení je inhibice plastidově specifických
metabolických drah, se u vyšších rostlin nepodařilo.
Selekce při transformaci ptDNA
(vi) Daniell et al. (Curr. Genet., 39: 109-116, 2001) použili jako
selekční marker gen ze špenátu kódující betainaldehyd
dehydrogenasu (BADH). Tento enzym je přítomný jen
v chloroplastech několika druhů adaptovaných
k zasoleným a suchým půdám.
Selekce je založena na konverzi toxického betainaldehydu
(BA) tímto enzymem na netoxický betainglycin.
Transformační účinnost při této selekci byl asi 25x vyšší než
při použití selekčního systému tvořeného genem aadA a
spektinomycinem a navíc byl celý proces transformace
daleko rychlejší.
Nicméně dosud v jiných laboratořích nepotvrzeno!
Selekce při transformaci ptDNA
(vii) Kombinace vizuálního a selektovatelného markeru (Klaus
et al. , Plant J. 35: 811-822, 2003) – k rychlé identifikaci
transplastomických segmentů na regenerované rostlině
použili pigment deficientní tabák, kde knokautovaný gen byl
nahrazen genem aadA; transformační vektor pak obsahuje
standardní „pigmentový“ gen spolu s dalším selektovatelným
genem.
Signální transgeny
Signální (reportérový) gen je takový gen, jehož
biochemický produkt je možné snadno detekovat a
kvantitativně stanovovat.
 Používány k zjišťování stupně exprese transgenů s
různými promotory a strukturou, v různých
genotypech, v různých pletivech a za různých
podmínek.
 Vždy chimérické, tj. obsahují regulační sekvence
pro projev v rostlinném genomu, zatímco kódující
sekvence bývá bakteriální či živočišná.
Signální transgeny
(i) -galaktozidáza
- kódována bakteriálním genem lacZ z E. coli
- u transgenního tabáku a slunečnice použito ke
kvantitativnímu měření aktivity enzymu i k
histochemickému stanovení
- od r. 1984 u rostlin nepoužito
(ii) -glukuronidáza
- kódována genem uidA (gusA) z E. coli
- nejrozšířenější rostlinný signální transgen
- fluorescenční měření aktivity se substrátem 4-metylumbelliferylglukuronid (MUG), který se mění na produkt,
jenž po ozáření dlouhovlnným UV (365 nm) emituje
záření o vlnové délce 570 a 590 nm
- histochemická lokalizace pomocí substrátu 5-bromo-4chloro-3-indolylglukuronidu (X-Gluc); ten je oxidativně
hydrolyzován na modrou, ve vodě nerozpustnou
krystalickou sloučeninu (nedifuzní)
Signální transgeny
- difuzní je však meziprodukt této reakce, takže lokalizace
modrého zbarvení nemusí úplně přesně odpovídat místu
exprese genu gusA
- byla proto vyvinuta modifikovaná metoda, kde substrátem
je sudanIV--D-glukuronid; činností -glukuronidázy
dochází k odštěpení nerozpustného sudanového barviva,
takže nedochází k žádné difuzi a tím ani k artefaktům
Signální transgeny
- gen původně bez intronu byl upraven vložením intronu, což
vede k expresi jen v rostlinné buňce a nikoliv v A.
tumefaciens, který může ještě v transformovaných
tkáních v raných fázích přetrvávat
- momentálně jsou na trhu substráty, které dávají jinak
zbarvené produkty - magenta (purpurová) a salmon
(lososová), nebo substrát poskytující fluorescentní
produkt (meziprodukt je ale ve všech případech difuzní)
(iii) luciferáza
- využívají se tyto geny
a) luc ze světlušky Photinus pyralis
Signální transgeny
b) lux z bakterie Vibrio harvei
c) Rluc z korálu Renilla reniformis
d) lucRD (červená luminiscence), lucGR99, lucGR68
(zelená luminiscence) z kovaříka Pyrophorus sp.
Signální transgeny
- enzym katalyzuje na ATP a O2 závislou
dekarboxylaci substrátu (luciferin pro LUC) za
vzniku viditelného záření, které lze měřit
luminometrem, CCD kamerou apod.
Signální transgeny
Signální transgeny
- systém je starší více než 15 let, ale moc se u rostlin
nerozšířil
- je sice vysoce citlivý, ale špatně reprodukovatelný,
problémy jsou vyvolávány špatným průnikem substrátu
do rostlinného pletiva, někdy snad i nedostatečnou
dostupností kyslíku a ATP
(iv) zeleně fluoreskující protein (GFP)
- gen pro tento protein izolován z medúzy Aequorea victoria;
GFP se zde vyskytuje s proteinem aequorinem, který v
přítomnosti Ca2+ vydává modré světlo a GFP ho poté
přeměňuje na zelené
Signální transgeny
- GFP (27 kDa, 238 AA) emituje zelené světlo (507 nm) při
ozáření UV (360-400 nm, část UVA záření) nebo modrým
(440-480) světlem
- zachovává si svou aktivitu i při C- nebo N-koncových fúzích
s jiným proteinem → lokalizace buněčných proteinů
- k jeho výhodám patří vysoká odolnost vůči nepříznivým
hodnotám pH či působení denaturačních látek a značná
termostabilita (až do 65 °C)
- původní gen se v rostlinných buňkách exprimoval slabě (v
sekvenci byl 84 bp úsek intronového charakteru –
kryptický intron) → in vitro resyntéza tohoto úseku →
zvýšení stability mRNA a tím i exprese (mGFP4 395/509
nm) → další zvýšení mutagenezí in situ s kodonovou
optimalizací pro člověka (!)
Signální transgeny
- další varianty až 100 x vyšší fluorescence ve srovnání s
původním proteinem a s vyšší teplotní stabilitou (37 °C)
- další mutanty přinesly změnu emitovaného světla (BlueFP,
CyanFP, YellowFP)
Signální transgeny
Signální transgeny
- FP z jiných mořských organismů byly již klonovány a po
následné optimalizaci pro expresi v rostlinách budou
moci být rovněž používány pro selekci transformantů
(Renilla reniformis nebo riftové korály rodu Discosoma –
DsRedFP s červenooranžovou fluorescencí, 558/583 nm)
Signální transgeny
(v) fytoensyntáza
- gen z Erwinia herbicola
- jeho produkt mění biosyntézu karotenoidů v plastidech
(fytoen je prekurzor lykopenu, který se tak začne v
chloroplastech hromadit, takže generované transgenní
kalusy jsou oranžové)
- popsáno v r. 1997
(vi) oxalátoxidáza (OxO)
- vyskytuje se u obilovin, ne však u dvouděložných rostlin
- pšeničný gen OxO může být použit jako signální gen pro
dvouděložné a některé jednoděložné
- levné substráty (kys. šťavelová, 4-chloro-1-naftol),
umožňují rychlou histochemickou lokalizaci enzymové
aktivity, jakož i kvantitavní stanovení
- poprvé popsáno v r. 2004
Signální transgeny
Signální transgeny
(vii) lichenáza
- gen licB z Clostridium thermocellum
- aktivita enzymu může být snadno detekovatelná
kvantitativně i kvalitativně jednoduchými a citlivými
metodami
- popsáno v r. 1997