il costellos

Hmotnostní spektrometrie
Petr Man
[email protected]
Unikátní vlastnosti hmotnostní
spektrometrie
Specifita
Rychlost
Jednoduchá interpretace dat
Citlivost
Čísla k zapamatování
(1 mol ~ 6.023 x 1023 molekul)
molekul
molů
10-9
1 zrnko soli
~ 1 ug ~ 20 nmol
1015
1-10 pmol pro CBB
1 pmol pro Edmanovo odb.
100 fmol pro stříbrem
barvené
gely
1012
10-15
2 fmol: jedna kopie v 109 buněk
109
10-17
10 amol: ICR FTMS
106
10 zmol: Iontová past
(300-1000 iontů)
103
10-12
10-21
Hmotnostní spektrometr
Normální tlak
Vložení
vzorku
Snížený tlak
Ionizační
technika
Hmotnostní
analyzátor
Detektor
Počítač
• Měříme pseudomolekulární ionty v plynné
fázi (M-H+, M+H+, M+Na+, atd.)
• Jak spočítáme M? – nejlépe z
elementárního složení.
http://medlib.med.utah.edu/masspec/mole.htm
• Monoisotopická vs. Průměrná MW
C6H12O6
Mmono = 180.0633; Mavg = 180.1576
C113H171N27O31S1
Mmono = 2434.2354 ; Mavg = 2435.8301
Přítomnost izotopů (13C, 15N, 17O, …)
se projeví na tvaru píku.
13C
je 1.1%, tj. na každých 100 uhlíků je jeden 13C
více uhlíků -> více 13C, to se projeví na tvaru píku
Intenzita druhého izotopu je 1.1xpočetC – získáme % intenzity prvního píku.
Máme ale i další izotopy…
Kouzla s izotopy
Ionizační metody
• EI – Electron Impact
• CI – Chemical Ionization
• APCI / APPI – Atmospheric Pressure –
Chemical Ionization / Photo Ionization
• FD – Field Desorption
• PD – Plasma Desorption
• FAB – Fast Atom Bombardment
• ESI / nanoESI – ElectroSpray
Ionization
• MALDI – Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization
1985 Elektrosprej – J. B. Fenn
1994 – nanoelektrosprej –
M. Mann a M. Wilm
Fenn JB; Mann M; Meng CK; Wong SF; Whitehouse CM: Science 1989, 246, 64.
Ionizace elektrospejem
Rozpouštědlo/Pufr
+
+
ESI Jehla
(5 kV)
+
+
Vstupní Vyhřívaná
otvor
kapilára
(0-50 V)
+ ++
+
+
Iontový
Svazek
Ionizace elektrosprejem
• Velmi měkká ionizace
• Mnohonásobně nabité ionty – 1, 2, 3, …60x
• Malá nebo téměř žádná fragmentace
• proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy,
syntetické polymery ...
• Nekovalentní komplexy (proteinové komplexy,
komplexy protein-ligand, atd.)
• Vhodná pro kvantifikaci
• Vysoká náročnost na čistotu
• Napojitelné na LC
• Spojení s jakýmkoliv analyzátorem
1987 – Desorpce laserem za
přítomnosti matrice
K. Tanaka / M. Karas, F. Hillenkamp
Karas M; Bachmann D; Bahr U; Hillenkamp F: Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53.
Tanaka K; Waki H; Ido Y; Akita S; Yoshida Y; Yoshida T: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.
MALDI Ionizační proces
MALDI Ionizační proces
MALDI matrice
dobrá absorpce za použité vlnové délky
stabilita ve vakuu, netěkavá
přenos protonu
2,5-DHB
vzorek : matrice = 1 : 104-105
mísitelné se vzorkem v tuhé fázi
solventy: MeOH, EtOH, MeCN, H2O, THF, aceton ...
UV-MALDI
337 nm dusíkový laser
355 nm Nd:YAG
266 nm Nd:YAG
193 nm ArF
IR-MALDI
2.94 mm Er:YAG laser
10.6 mm CO2 laser
MALDI matrice
kys. 2,5-dihydroxybenzoová (DHB)
kys. sinapová (SA)
(kys. 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová)
kys. α-kyano-4-hydroxyskořicová (CCA)
kys. ferulová (FA)
(kys. 4-hydroxy-3-methoxyskořicová)
MALDI Ionizační proces
• Měkká ionizace
• Malá nebo žádná fragmentace, jednoduchá interpretace
• Jednonásobně nabité ionty [M+H]+; [M-H]• Analýzy komplexních směsí
• Rychlá a jednoduchá příprava a analýza
• Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy
syntetické polymery ...
• Tolerantní k detergentům, solím…
• Krátké laserové pulsy; t ~ ns
• Spojeno s TOF analyzátorem
Analyzátory
• q, MSQ – quadrupole (Mono Stage Quadrupole)
• TSQ – Triple Stage Quadrupole (QqQ)
• qIT – quadrupole Ion Trap
• LT – Linear Ion Trap
• Sector B/E geometry
• TOF – Time Of Flight
• FT-ICR – Fourier Transform – Ion Cyclotron Resonance
• Hybridní (q-TOF, TOF-TOF, q-FT-ICR, LT-FT-ICR)
Time Of Flight (TOF) Analyzátor
Ekin = ½ mv2
Time Of Flight (TOF) Analyzátor
Time Of Flight
(TOF) analyzátor
• Velmi vysoká transmise iontů
• Teoreticky neomezený hmotnostní rozsah
• Využití chlazených detektorů
• Téměř současná detekce všech iontů:
kompletní spektrum během každého ionizačního pulsu
• Vysoké rozlišení a přesnost
Post-Source Decay (PSD)
Kvadrupólový analyzátor
+
+
-
+
Iontová past
Ionty
Vyhřívaná
kapilára
Iontová
brána
Fokusační
multipóly
Iontová
past
Iontová Past
•
•
•
•
Akumulace iontů
Vysoká citlivost
Schopnost MS/MS a MSn (MS/MS v čase)
Malé rozměry
•
•
•
•
Omezený dynamický rozsah
Nižší rozlišení a přesnost
Omezená fragmentační energie
1/3 pravidlo
Trojnásobný kvadrupól
N2
RF
Fokusace
iontů
Prekursorové
ionty
Q1
Q2
Kolizní cela
Fragmentace
(CAD)
Q3 Detektor
Produktové
ionty
Q-TOF
FT-ICR – Iontově cyklotronová
rezonance s Fourierovou transformací
Pohyb iontů v magnetickém poli - iont s
hmotností m, pohybující se s rychlostí v v
homogenním magnetickém poli se silou B:
F = qv × B
Iont pohybující se po cyklotronové orbitě s frekvencí
danou vztahem:
qB
2πf =
m
Poloměr běžné cely: 1-3 cm
Počáteční poloměr pohybu iontu: 0.01 - 0.1 mm
Běžná síla magnetického pole: 1-12 Tesla
Pohyb iontů v magnetickém poli
FTMS cela
Trapping Plates, +1.0 V
Detekce
B
Excitace
+
Excitace a detekce iontů
r=
EoTexc.
2B
Signál ∝ Nions
Signál ∝ r
Eo
Působením rezonančního dipolárního pole jsou ionty „přinuceny“
pohybovat se po cyklotronových drahách s větším poloměrem pohybu.
Finální r nezávisí na m/z.
Fourierova transformace
(Iontově Cyklotronová Resonance)
Detekce
qB
f =
2π m
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Koherentní cyklotronový pohyb indukuje
„prodový obraz“, který je amplifikován
a detekován.
Přítomnost iontů s různými m/z se projeví
Jako superpozice sinusoidalních signálů na
Detektoru.
Fourierova transformace a rozlišení
FT
Rozlišení
• Jednotkové – rozeznáme m/z 100 od 101
– kvadrupóly a iontové pasti
• m/∆m – kde bereme ∆m bereme buď v 10%
nebo v 50% výšky píku
• Př. - rozlišení 50000 znamená, že odlišíme
dvě látky, lišící se o 1/50000 MW –
1296.6775 a 1296.7034
Přesnost
Absolutní
• Da – Dalton - 0.1 – 0.0001
• Th – Thompson – 0.1 – 0.0001
Relativní (mění se podle m/z
• ppm – parts per million – 100 – 0.1
1000.0000
• %
Iontová past
100-1000 ppm
TOF
FT-ICR
10-100 ppm
0.1 – 1 ppm
Hmotnostní spektrometrie v analýze
biomolekul
• Kontrola kvality/čistoty
• Určení MW
• Identifikace
• Sekvenování
• Charakterizace modifikací
• Studium nekovalentních komplexů
• Analýza směsí
• Kvatifikace
• Studium 3D struktury s nízkým rozlišením
Určení MW – MALDI
Určení MW – ESI
R
NH3+
S
T
R
S
S
R NH3+
+
NH3+
+ NH3
R NH3
V
A
A
R
NH3+ A R NH3+
Relativní intensita
G
R
S
T
G
R
S
S
R NH3+
NH3+
NH3+
R
V
A
A
R
A R
NH3+
S
G
S R
S
+
NH3
R
A
A
R
A R
R
T
R
m/z
V
Určení MW – ESI
Dekonvoluce…
Výpočet MW proteinu z m/z sousedních píků
M – MW proteinu
z – nábojový stav
Intensita
X = (M+z)/z
Y = (M+z+1)/(z+1)
X
Nábojový stav (z) píku X:
zx= (Y-1)/(X-Y)
Y
MW:
M = (X*zx)-zx = (Y*zy)-zy
m/z
Myoglobin: výpočet MW
X = 998.25
Y = 942.82
zx = (Y-1)/(X-Y) = (942.82-1)/(998.25-942.82) ≈ 17
zx = 17, zy = 18
M = (X*zx) – zx = 998.25*17-17 = 16952.91
Teoretická MW = 16951.52
Neznámá molekula
Í
N
T
N
A
T
DIS
I
V
K
E
U
O
S
)J
4
E
4
N
(
!
nu
!
i
!
e
t
o
ER
r
p
M
Y
L
vy
a1101.8
O
t
P
Xs=
E
é Y = 1057.8
J
v
o
j
O
T
bo
á
O
n
T
z
=
(Y-1)/(X-Y) = (1057.8-1)/(1101.8-1057.8) ≈
é
x
n
z
24
Rů
zx = 24, zy = 25
M = (X*zx) – zx = 1101.8*24-24 = 26419.2
M = (Y*zy) – zy = 1057.8*25-25 = 26420
M = (662.1*34) - 34 = 22477.4
M = (1762.1*9) - 9 = 15849.9
Identifikace proteinů
Protein na gelu nebo roztoku
Štěpení proteinu
Peptidové mapování/
Peptidový fingerprinting
Identifikace proteinu - princip
Proteinové štěpení
•
•
•
•
•
•
•
Trypsin
Chymotrypsin
AspN
GluC
ArgC
LysC
CNBr
K/RY/W/K/F-D
E-, E/DRKM-
\-P
\-P
\-P
\-P
\-P
Důležitá je přesnost…
Čím vyšší přesnost měření, tím méně peptidů
potřebujeme pro bezchybnou identifikaci
1000.0000
Iontová past
100-1000 ppm
TOF
10-100 ppm FT-ICR
0.1 – 1 ppm
□ groEL protein
*
ATP synthase
Peptidové mapování
¾MOWSE – MRC/HGMP
¾Pro-Found – Proteometrics, Rockefeller University
¾MASCOT – Matrix Science
¾PepIdent, MultiIdent – SWISS-PROT
¾PepSEARCH – EMBL ~ PepSea – Protana
¾MS-Fit – Protein Prospector,UCSF
¾pepMAPPER – UMIST
Identifikace proteinu
Protein na gelu nebo v roztoku
Štěpení proteinu
Peptidové mapování/
Peptidový fingerprinting
Bez výsledku
Peptidové mikrosekvenování
(PSD, MS/MS)
Peptidové sekvenování
Fragmentace peptidu
b1
b2
b3
R1
R3
R4
R2
NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2H
N-konec
C-konec
y3
y2
y1
Fragmentace peptidu
S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH+ = 1410.6
b-ions+
88.1
185.2
256.3
403.5
518.5
605.6
718.8
850.0
921.1
1050.2
1151.3
1264.4
y-ions+
S
PAFDSIMAETLK
SP
AFDSIMAETLK
SPA
FDSIMAETLK
SPAF
DSIMAETLK
SPAFD
SIMAETLK
SPAFDS
IMAETLK
SPAFDSI
MAETLK
SPAFDSIM
AETLK
SPAFDSIMA
ETLK
SPAFDSIMAE
TLK
SPAFDSIMAET
LK
SPAFDSIMAETL
K
1323.6
1226.4
1155.4
1008.2
893.1
806.0
692.3
561.7
490.6
361.5
260.4
147.2
Další typy fragmentových iontů
C-konec
x3
y3
z3
R1 O
H2N
C
H
N-konec
y2
R2 O
C
a1
x2
b1
N
C
H
H
c1
C
z2
x1
y1
z1
R3 O
N
C
H
H
a2 b2 c2
C
a3
b3
R4
N
C
H
H
c3
COOH
… a ještě další typy iontů …
R1 O
+
R2
a2
H H
R1 O
R2
+
H2N C C N C C O
H
b2
H H
R1 O
c2 H
R2 O
H
+
R3 O
+
y2 H
R3 O
R4
+
z2 H
H2N C C N C
H
H
N-koncové: a, b, c, d
C-koncové: x, y, z, v, w
d2
H H
O
R4
H+
HN C C N C COOH
H
C C N C COOH
H
R1 O
R4
H3N C C N C COOH
H
H2N C C N C C NH3
H
R4
O C N C C N C COOH
H
H
H H
x2
H2N C C N C
H
R3 O
+
+
H
CHR'
H
v2
CHR' O
C
H
H H
R4
C N C COOH
w2
H H
H+
Nomenklatura fragmentových iontů
peptidů
Ion type
Ion mass
Ion type
Ion mass
a
[N]+[M]-CO
d
a-partial side chain
a*
a-NH3
v
y-complete side chain
ao
a-H2O
w
z-partial side chain
a++
(a+H)/2
x
[C]+[M]+CO
b
[N]+[M]
y
[C]+[M]+H2
b*
b-NH3
y*
y-NH3
bo
b-H2O
yo
y-H2O
b++
(b+H)/2
y++
(y+H)/2
c
[N]+[M]+NH3
z
[C]+[M]-NH
N
C
M
hmotnost N-koncové skupiny
hmotnost C-koncové skupiny
hmotnost však AK zbytků
Jak spočítat hmotnost iontu?
• b-ionty
1 + B1 + B2 + B3 + B4 + . . . .
• y-ionty
1 + 18 + Y1 + Y2 + Y3 + Y4 + . . . .
• a-ionty
b – 28 (CO)
• immoniové ionty
AK zbytek – 27
• MW
Σ(AK zbytek) + 18
Přehled aminokyselin v číslech
AK
G
A
S
P
V
T
C
L
I
N
D
Q
K
E
M
H
F
R
Y
W
Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys
Leu
Ile
Asn
Asp
Gln
Lys
Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Trp
Hmotnost
57.02
71.08
87.03
97.05
99.07
101.05
103.01
113.08
113.08
114.04
115.03
128.06
128.09
129.04
131.04
137.06
147.07
156.10
163.06
186.08
Boční řetězec
1
15
31
41
43
45
47
57
57
58
59
72
72
73
75
81
91
100
107
130
Immoniové ionty
30
44
60
70
72
74
76
86(72)
86(72)
87(70)
88
101(84, 129)
101(129, 112, 84, 70)
102
104(61)
110(166, 138, 123, 121, 82)
120(91)
129(112, 100, 87, 73, 70, 59)
136
159
Pravidla pro čtení sekvence
1.
? Nábojový stav, hmotnost prekurzoru
2.
? C- nebo N-koncová AK – na základě štěpení
3.
? Komplementární ionty – nikdy nekombinovat různé série !!!
y + b – 1 = [M+H]+
4.
? a- / b-iontové páry (dif. 28a.m.u.)
5.
? Ztráty H2O/ NH3/ CH3SOH (dif. 18 / 17 / 64 a.m.u.)
6.
? Vícenásobně nabité ionty + následné neutrální ztráty
7.
? Prolin
1069
y8
175
y1
W S V Q I Y F E D R
a1
159
•
•
•
•
•
b2
274
b-ionty
1 + B1 + B2 + B3 + B4 + . . . .
y-ionty
1 + 18 + Y1 + Y2 + Y3 + Y4 + . . . .
a-ionty
b – 28 (CO)
Immoniové ionty
AK zbytek – 27
MW
Σ(AK zbytek) + 18
Hmotnost
[M+H]+
[M+2H]2+
[M+3H]3+
[M+Na]+
1341.6
1342.6
671.8
448.2
1364.6
m/z 699.62
tryptic digest (-K/-R)
[M+H]+ = 1398.24
ends with -K
AAAAAAAAAAAAAAGAAGK
A
A
A
A
KG
A
A
6A
A
A A
A
A
A
A
G
A
A
G
A
A
K
A
G
A
A
A
2A
A
2A
[M+2H]2+
SSLPPLPGPDK
y82+
y8 y7
y5
y8
y5
y7
y3
GTPGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEK
y15
y26
y7
y263+
[M+3H]3+
y182+
y202+
y162+
y7
y152+
y212+
y222+
y232+
y172+
y192+
y252+
y262+
Jak rozbíjet peptidy (a jiné molekuly…)
•
•
•
•
•
•
CID – Collision Induced Dissociation
CAD – Collisionally Activated Dissociation
PSD – Post-Source Decay
ISD/ISF – In-Source Decay/Fragmentation
ECD – Electron Capture Dissociation
IRMPD – Infrared Multi-Photon Dissociation
• Další – EI, FAB, atd.
Interpretace MS/MS Spekter
¾MASCOT MS/MS SEARCH - Matrix Science
¾MS/MS SONAR - Proteometrics, Rockefeller University
¾PepFrag – Proteometrics, Rockefeller University
¾MS Seq, MS Tag - Protein Prospector,UCSF
¾SEQUEST – Scripps, ThermoFinnigan
MASCOT – MS/MS
MASCOT – MS/MS výsledek
Skóre
Report
„Error tolerant
search“ report
Sequence Tagging
Input information:
¾short sequence (e.g.3 AA)
¾exact peptide MW
¾fragment ion type
m/z1-X-Y-Z-m/z2
[M+H]+
716.4-N-Q-Q-1086.6
[M+H]+ = 1475.7
y-ions
search
gi|254622| (S43646) Cytokeratin 2
…..161 VNQSLLQPLN VKVDPEIQNV KAQEREQIKT
LNNKFASFID KVRFLEQQNQ VLQTKWELLQ
QMNVGTRPIN LEPIFQGYID SLKRYLDGLT 250…..
PepSea
PROTANA
Sequence
Tagging
...SEARCH…
Identifikace proteinů
Protein na gelu nebo v roztoku
Identifikace proteinu
Štěpení proteinu
Peptidové mapování/
Peptidový fingerprinting
Bez výsledku
Peptidové mikrosekvenování
(PSD, MS/MS)
Bez výsledku
Oligonukleotidy
Klonování
Sekvenování DNA
NEBO
„de novo“ sekvenování
Strategie peptidového sekvenování
¾ Zefektivnění fragmentace
¾ Preferenční tvorba jedné iontové série
¾ Odlišení iontových sérií
¾ „de novo” sekvenování
¾ Derivatizace: Chemically Assisted Fragmentation CAF
¾ H218O značení
¾ Esterifikace (EtOH: 28 Da / COOH skupinu)
¾ Ladder Sequencing
Chemically Assisted Fragmentation
¾ Modifikace lysinu (guanidylace)
¾ CAF reagens (NHS-ester se sulfonovou skupinou)
¾ negativně-nabité N-koncové ionty
¾ Spektra obsahují především y-ionty
¾ Reakce: 1-2 min v 50 mM NH4HCO3/MeCN (1:1) při lab.
teplotě těsně před analýzou
MW = 184 Da
N-konec
∆m = 184 Da
Chemically Assisted Fragmentation
[M+H]+
-184 Da
Značení pomocí
18O
Štěpení ve směsi H2O:H218O (1:1)
18OH
H
+
trypsin
999.5
H2O
999.5 1001.5
H218O
normalní H2O
TQDFTDQ
značaná H218O
Q
D
T
F
D
Q
T
Esterifikace
» Esterifikace směsí alkohol/acetyl chlorid
» modifikace Glu, Asp, C-konce
» COOH skupina změněna na COOCxHy
» ∆m – ethanol - 28 Da na každou COOH skupinu v
peptidu
Ethylesterifikace
Ethylesterifikace
FTQDFTDQSVK
Alkylace
• Cys – zlepšuje detekeci peptidů s Cys, brání
tvorbě disulfidicky vázaných dipeptidů
• 1.krok – redukce S-S na SH pomocí DTT, TCEP,
ME. Za zvýšené teploty (65°C).
• 2.krok – reakce s alkylačním činidlem. IAA, VP,
AA, BrEA. Za normální teploty, v temnu a nejlépe
pod dusíkem.
• Při použití BrEA – Cys se mění na analog Lys – lze
štěpit v daném místě pomocí Trypsinu nebo LysC.
• Alkylace má význam i při kvantifikaci (ICAT, aj.)
alkylace Cys během elektroforézy
2+
y20
DSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQR
MW + 71Da ??
DSLL PVSAYCDMETDGGGWTVFQR
AA
„Ladder Sequencing“
¾
¾
¾
¾
¾
¾
z N- nebo C-konce
Chemická nebo enzymatická degradace
Edmanova chemie (PITC)
Karboxypeptidasy (Y, P, B)
Aminopeptidasy
Karboxypeptidasa Y
Čistý peptid
Částečná oxidace methioninu – další pomoc při
čtení sekvence
YATFMESLR
Částečná oxidace methioninu – další pomoc při
čtení sekvence
YATFMoxESLR
Differenční proteomika – identifikace
proteinů
pH 3.0
250
kDa
MW
10
kDa
non-linear IPG
pH 10.0
Proteiny ovlivněné terapií
1
Protein Spot No. 6
2
6
Protein Disulfide
Isomerase P55
No. 1 & 2: Calreticulin
3
4
5
No. 3, 4 & 5: ER p57 protein
No. 6: Protein Disulfide Isomerase P55
malate dehydrogenase
Bottom up vs. Top down
identifikace proteinů
• Štěpení proteinu/směsi
• MS, MS/MS (na úrovni
peptidů)
• LC-MS(/MS)
• DTB prohledávání
na bázi PMF, MS/MS
•
•
•
•
•
Pre-frakcionace
Purifikace v plynné fázi
Určení přesné MW
MS/MS proteinu
DTB prohledávání pomocí MW
proteinu a sekvenčního „tagu“
• Zachována informace o PTM
TopDown
http://kelleher.scs.uiuc.edu/
Shotgun proteomics –
Analýza proteinových směsí
•Bez gelů - 1D nebo 2D – ztráta informace o PTM
•Komplexní směsi (organely, celé buňky,…)
•HPLC – 1D – RP C18
• 2D – SCX/SAX + RP C18
•3D – GF + SCX/SAX + RP C18
•2D or 3D + afinitní purifikace
•data dependentní analýza
•píkové parkování
•“frakcionace v plynné fázi”
Full MS
Mass range(350-1800)
Scan 1479
Full MS/MS (CID)
Scan 1480
Precursor 667.7
Data-Dependent MS & Dynamic Exclusion
1
100
735.7
Relative Abundance
90
80
70
60
1469.9
2
50
40
30
490.9
20
10
0
3
971.4
5
588.5
400
500
600
700
800
903.0
900
4
1070.7
1213.7
1353.8
1500.6
1666.7 1786.0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
m/z
1486 - 88 AIIIFVPVPQLK (RPS7)
1478 - 80 NLQNLLILTAIK
1468 - 72 SVDPTLALSVYLR
1470 SVNESLNNLFITEEDYQALR
1450 - 52 TTGFGMIYDSLDYAK (RPS24)
1418 - 20 LLEPVLLLGK (RPS16)
1414 - 22 TDITYPAGFM*DVISIDK (RPS4)
1412 LTDQLPLIIVCDR
1410 WLLLTGISAQQNR
„Gas-phase Fractionation“
100
Relative Abundance
90
1
735.7
1
2
3
80
70
1
60
1469.9
50
40
2
30
20
10
0
1
490.9
2
588.5
400
500
2
971.4
600
700
800
903.0
900
1070.7
1213.7
1353.8
1500.6
1666.7 1786.0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
m/z
Kvatifikace pomocí MS
• ESI, (MALDI)
• Interní standart – stejné podmínky ionizace
• Izotopické značení
– ICAT – Isotope Coded Affinity Tags – značí jen některé AK,
zjednodušuje komplexitu směsi, izotopický efekt H/D
– PhIAT – Phosphoprotein Isotope Coded Affinity Tags – kvantifikace Pproteinů
– D3/H3 acrylamid – značí jen Cys, nezjednodušuje komplexitu, menší
izotopický efekt
– D3/H3 esterifikace – značí C-konec, D, E, nezjednodušuje komplexitu,
malý izotopický efekt
– SILAC – Stable Isotope Labelling – přídavek L/I (C12/13, N14/15),
žádný izotopický efekt, mnoho různých peptidů je značeno, komplexita
směsi zůstává
– AQUA – Absolute Quantification of Abundance
Isotope Coded Affinity Tag (ICAT) reagens
O
N
XX
O
N
S
Biotin
tag
XX
O
XX
O
O
O
XX N
Linker (těžký nebo
lehký)
I
Thiol
reaktivní
skupina
100
Relative Magnitude
N
d0- or d8-ICAT
(X= H nebo D)
LDQWLCEK
d0
d8
1520 1525
50
0
800
1200
m/z 1600
1530 1535 1540
2000
2400
Kvatifikace a identifikace pomocí ICAT
ICAT-em
značené
cysteiny
Směs 2
y
n
ra ra
l
b
o
s
m jád
o
e
t
y
m
c
Případná frakcionace
Směs 1
100
Light
0
550
100
Smíchat a
štěpit
560
Heavy
570
m/z
580
NH2-EACDPLR-COOH
Afinitní
separace
0
200
400
600
m/z
800
Kvantifikace a
identifikace proteinů
ICAT
vs .
in vitro
značení
Stav 1
SILAC
in vivo
značení
Stav 2
znační
Sklízení buněk
Stav 1
Sklízení buněk
Stav 2
značení
Stav 2
Stav 1
1+2
Smíchání buněk
Přečištění
1+2
Smíchání proteinů
Přečištění
Štěpení trypsinem
a analýza LC-MS/MS
Štěpení trypsin a
Analýza LC-MS/MS
AQUA
Absolute Quantification of Abundance
Gerber SA, PNAS 2003, 100:6940
Nutná znalost toho, co známe.
Peptid vytipován na základě
předchozích pokusů
Vhodné pro “lovení” málo
abundantních proteinů (SRM mode)
Výběr vhodného peptidu:
Ne M, W, H
Ne KK, KR, RR
nebo i
KXR, KXK, KXXK
Vhodná velikost –
Nábojový stav
Funkční proteomika – Analýza komplexů aneb kdo s kým..
Nativní elektroforéza
S40 Ribosome subunit
kDa
667
Proteasome S26
440
230
Clathrin
ATP synth. F1
140
67
MARKER
Calreticulin
RNK16
KIDNEY
Monitorování místa zásahu enzymu
gliadin fragment VSFQQPQQQYPSSQ
tTG enzym
Q ⇔ E ∆1 Da
0 min
VSFQQPQQEYPSSQ
+
30 min
VSFEQPQQEYPSSQ
+
++
3 hrs
PostTranslační Modifikace
• Disulfidické můstky (CysCys)
• Glykosylace
• Fosforylace
• Acylace
•
•
•
•
•
Oxidace
Acetylace
Zkrácení
Ztráta N-konc.Met
Glu -> pyro-Glu
Disulfidické můstky
A - určení zda jsou nebo nejsou přítomné – diferenční
alkylace
B – určení kolik Cys je volných a kolik vázaných
1. denaturace, alkylace činidlem I
(u menších proteinů lze rovnou měřit MS)
2. redukce a alkylace činidlem II
3. štěpení a MS, LC-MS/MS – určení
C – přímá identifikace disulfidů - štěpení + LC-MS (FTICR) – hledání disulfidicky spojených peptidů podle
přesné hmotnosti
D – izolace disulfidicky spojených peptidů a jejich
identifikace MS popřípadě Edman. oddouráváním
Diferenční alkylace – celý protein
Disulfidické můstky
štěpnení pepsinem nebo chymotrypsinem
½ redukována, ½ nativní
diferenční HPLC (RP, IXC) – vytipování
frakcí
MS analýza, +/- redukční činidlo
MS/MS pro určení sekvence peptidů
Disulfidické můstky
+ DTT
redukce S-S vazby
Disulfidické můstky
PSD
Disulfidické můstky
Disulfidické můstky
Y L D C G H G G F
N Y G G N G G S W C A P Y K T
M1 + M2 +H+ - 2H (z Cys) = [M1-S-S-M2+H]+
(967.4 + 1573.7) + 1 - 2 = 2540.1
Glykosylace
• Mnoho důležitých funkcí: stabilizace struktury, dobré
poskládání, ochrana před degradací, interakce ligandreceptor, targeting, modulace aktivity
• N-glykosylace
na sekvenci: NXT/S/C – v β-strukturách nebo
smyčkách
sacharid: větvený, 3 typy: mannosový, komplexní,
hybridní
• O-glykosylace
nemá klasický motiv
S, T, ale také hydroxyPro, Lys, atd.
sacharid: cokoliv od monosacharidu pro dlouhé,
případně mírně větvené struktury
N-glykosylace
• Určení zda protein je nebo
není glykosylován
a - podle mobility na
gelu+deglykosylace
b - lektin-blot – určuje
terminální sacharidy
c - přímo v MS
d - glykoproteinové barvení
b)
a)
TMSF
PNGase F
c)
1
2
3
4
5
6
–
–
–
–
–
–
ConA
LCA
PNA
SBA
WGA
UEA
d)
•
•
•
Oxidace kys. Jodistou
Přidání Schiffova reagens (kys. fuchsinsiřičitá)
Odbarvení pozadí
Alternativy s fluorescencí nebo biotinylací
Použitelné i pro histologii
N-glykosylace
1.
2.
3.
1.
2.
3.
Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity
Nalezení míst glykosylace
Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa
a) uvolnění glykanu(-ů) –
enzymaticky – PNGasa F, Endo H, Endo F1-3, postupné
odštěpování pomocí exoglykosidas, Pronasa
chemicky – hydrazinolýza, alkalické štěpení, TMSF – (pouze
deglykosyluje – ničí sacharid)
b) charakterizace glykanů – NMR, MS, MS/MS,
permethylace+MS/MS, exoglykosidasy+MS
a) Edmanovo odbourávání – nejlépe glykopeptidy peptidy po
EndoH
b) deglykosylace PNGasouF v H216O a H218O (+ štěpení
AspN) – PNGasa F mění Asn na Asp (vzniká zásahové místo
pro AspN)
Štěpení proteinu – izolace glykopeptidů a opakovaní postupu
na jednotlivých glykopeptidech
Glycan MS/MS – nomenclature
Domon-Costello (1998)
Glycosylation: PSD-MALDI MS
Deglykosylace PNGasouF v H216O a H218O
Asn -> Asp
16O -> 18O
+1 a.m.u.
+2 a.m.u.
Posun proti hmotnosti původní sekvence
+ 3 a.m.u.
Jak to lze urychlit?
- přímá analýza glykopeptidů
• Štěpení různými proteázami a LC-MS/MS
(iontová past, q-tof, q-FT-ICR) nebo LC-MS
(FT-ICR)
• Jak identifikovat glykopeptidy
a) hledáme v MS záznamu diference
odpovídající sacharidům (např. 162, 81, 54
pro Hexosu)
b) použijeme speciální nastavení a pomocí ISF
generujeme charakteristické ionty v oblasti
malých m/z (163, 204, 274, 292, 366)
c) pomocí SW hledáme glykopeptidy podle
velice přesných m/z (FT-ICR)
Glycopeptide: ESI MS/MS
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Infrared Multiphoton Dissociation (IRMPD)
• CO2 laserový paprsek
• Vibrační excitace funkčních skupin
OH, COOH, NH2…
• Fragmentace peptidové páteře: b- a y-iontové
series
• Určení / ověření sekvence
• Za mírnějších podmínek pouze ztráta labilních
skupin - PTM
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Electron Capture Dissociation (ECD)
• Záchyt „studeného“ elektronu (E ≤ 0.1 eV) preferenčně na
S-S můstcích a vazbě N-Cα
• Neutralizace H+; [M+2H]+. Vodíkem nabohacený radikálový
iont
• Štěpení vazby N-Cα; extensivní fragmentace
• c- a z-iontové série; b- a y-ionty chybí
• Prefenční štěpení peptidové vazby, jsou zachovány labilní
skupiny modifikací
• „Horké“ ECD (3-13 eV); sekundární fragmentace – z ionty
tvoří ionty w
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
Kombinace IRMPD & ECD
• Komplementární techniky pro řešení
peptidové/proteinové sekvence a lokalizaci a identifikaci
PTMs
• Může být provedeno během jednoho experimentu
• Analýza glykopeptidů, fosfopeptidů, lokalizace γkarboxyglutamové kys., rozlišení Ile/Leu…
Fosforylace
Signalizace, aktivace,…
S, T, Y,
H
Ztráta (P) skupiny: -98, -80
- Směrovaná MS analýza (neutrální ztráta, precursor ion
scanning, negativní mód)
Nabohacení – protilátky, IMAC
Působení fosfatázy / alkalií + diferenční mapování
„Vychytávání“ fosfopeptidů:
eliminace, adice afinitní skupiny
2D P-peptidové mapování (elektroforéza/TLC)
Fosforylace
A
4 3 .3 0
100
90
3 2 .8 2
Relative Abundance
80
70
60
3 7 .3 5
50
40
2 6 .6 5
30
2 8 .0 1
3 5 .9 3
3 0 .0 3
20
4 2 .4 2
3 9 .3 1
10
3 4 .1 1
2 8 .9 8
4 4 .3 3
4 1 .1 3
0
B
2 9 .9 6
100
90
49 Da neutrální ztráta
Relative Abundance
80
Možné fosfopeptidy
70
60
50
40
30
2 6 .1 2
20
3 5 .9 1
10
0
2 7 .7 1
2 4 .9 0
25
26
27
28
29
3 2 .9 0
3 1 .0 1
2 8 .8 6
30
31
32
33
3 4 .2 7
34
35
3 7 .3 8
36
T im e (m in)
37
38
3 9 .0 9 4 0 .3 34 1 .2 6
39
40
41
4 2 .4 5
42
43
4 3 .8 7 4 4 .9 4
44
45
Fosforylace
GVVTNGLDLSPADEK
*
Loss
Ztráta
of phosphate
fosfátu (m/z749)
(m/z749)
Parent
Rodičovský
ion position
iont (m/z
(m/z798)
798)
IMAC – Immobilized Metal Ion
Affinity Chromatography
• IDA (iminodiacetic acid)
NTA (nitrilo-triacetic acid)
• Iont kovu – Ga3+, Fe3+
• Nespecifická vazba –
esterifikace
Působení alkalického prostředí
P-peptidy
P-peptidy
po působení alkálií
Mol. Cell. Proteom. 2002, 1:186-196
“vychytání” fosfopeptidů
•Oxidace Cys
•Eliminace
•Adice ethanedithiolu
•Biotinylace
•Afinitní purifikace
•MS, MS/MS
•POUZE PRO pS, pT !!!
Nat. Biotech. 2001, 19:379-382
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
RP-HPLC tryptického/chymotryptického digestu
220 nm
450 nm
flavopeptid
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu
PSD
[M+H]+
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
PSD MALDI-MS
H
a3-NH3-H2O
a3-NH3
b3-H2O
S-T-H-W
[M+H]+
b3 y2
H
W
S T
y1
a2
b2
a4
a3 y3
b4
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu
PSD
[M+H]+
[f+2H]+
348
[j+2H]+
136
h+
250
438
Struktura
flavopeptidu
785
[d+2H]+
428
O
H
N
O
HN
4
N
4a
5a
6
2
O
7
CH3
?
9
N
10a
1
N
8
9a
CH3
H
OH
H
OH
CH2
5
HN
1
NH2
f
O
6
N
O
O P O P O
HO
438
d
His
N
3
2
OH
Thr
4
CH2
H
5
Trp
OH
2
CH2
5
HO
h
N
5
4
O
4
3
N
N
8
1
2
OH
j
Ser
QDPTDVGEAFANVEWSVAELKR 2461.2 did not fit + 17Da bigger
Gln
O
NH2
C
C
H2
C
H2
O
H
C
C
NH2
N
H
R
(111)D PTDVGEAFANVEWSVAELKR
NH3
H2C
H
C
H2C
NH
O
C
N
H
C
O
pyro-Glu
R
128-17=111
pyro-Glu !!!
Určování 3D struktur pomocí FT-ICR MS – MS3D
- proteiny jejichž str. není řešitelná krystalografií nebo
NMR (MW > 30kDa, flexibilní domény, membránové
proteiny, proteiny s PTMs,…)
- Surface accessibility – povrchové značení a reaktivita
AK – jedna reaktivní skupina
O
N
O C CH3
O
O
- Intramolekulární zesíťovací činidla (cross-linkers) – dvě
a více reaktivních skupin, odděleny raménkem o různé
délce – tzv. molekulární pravítka
O
O
O
N
O
O
C
11.4 Å
DSS
O
N
O
O
O
O
C
N
O
O
O
O
O
C
O
C
7.5 Å
DSG
O
N
O
N
O
O
OH
O
C
C
OH
O
5.8 Å
DST
O
N
O