Helicobacter pylori

INFEKČNÍ SÉROLOGIE
Bakteriologie
IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAV Y
K DIAGNOSTICE INFEKCE
HELICOBACTER PYLORI
Helicobacter pylori
ELISA a IMUNOBLOT soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek
třídy IgA, IgG a IgM v lidském séru nebo plazmě
Úvod
Helicobacter pylori řadíme do rodu Helicobacter. Morfologicky se jedná o gramnegativní, aerobní mikroaerofilní tyčky. Jako patogen
se uplatňuje při infekcích žaludeční sliznice, a to zejména v oblasti antra a duodena. Je původcem chronické gastritidy typu B, na
jejímž podkladě se může později rozvinout vředová choroba. U tohoto onemocnění je H. pylori prokazován takřka ve 100% případů.
Infekce H. pylori je často provázena dyspeptickými potížemi. Aktivní chronická gastritida může přejít ve formu atrofickou s rizikem vzniku
žaludečního karcinomu.
Faktory patogenity H. pylori vycházejí jednak ze samotné morfologické struktury bakteriální buňky (spirální tvar, bičíky) a dále ze
schopnosti produkce extracelulárních enzymů a cytotoxinů (např. ureáza, kataláza, proteázy, VacA, CagA).
Vyskytuje se řada patogenních a fakultativně patogenních kmenů. Jejich virulence se liší jednak zastoupením výše zmíněných faktorů,
tak i jejich množstvím. Na patogenezi onemocnění se podílí i odpověď hostitele. Rezistentní kmeny se izolují hlavně od neúspěšně
léčených osob.
Diagnostika onemocnění
Metody k detekci lze rozdělit na invazivní a neinvazivní. K nejužívanějším invazivním metodám patří histologické a cytologické vyšetření
z bioptického vzorku žaludeční sliznice a rychlý ureázový test. K neinvazivním metodám patří dechový test a sérologické metody (stanovení
protilátek třídy IgA, IgG, IgM). Neinvazivní testy jsou vhodné pro sledování efektivity terapie, vyhledávání infekce a reinfekce. Eradikace
mikroba je následována poklesem hladiny protilátek. Vysoce specifické a citlivé metody molekulární biologie (PCR) se provádějí pouze
na specializovaných pracovištích.
Diagnostický význam jednotlivých tříd protilátek
IgM
Jsou zvýšeny zejména v akutní fázi onemocnění, nevyskytují se však u všech nemocných.
IgA
Protilátky jsou přítomny nejen v akutní fázi
onemocnění, ale i při chronické infekci žaludeční sliznice spolu s protilátkami třídy
IgG. Jejich zvýšení je popsáno také u pacientů s rizikem karcinomu žaludku.
IgG
Přítomnost potvrzuje kontakt s H. pylori,
není však indikátorem aktivity infekce. Sérokonverze nastává cca 2 měsíce po primoinfekci.
ELISA
Použití souprav
Pracovní postup
Vyhledávací test k průkazu specifických IgA, IgG a IgM
protilátek v lidském séru nebo plazmě
Krok č.
Semikvantitativní výsledky lze použít ke kontrole úspěšnosti
terapie
Diagnostika fáze onemocnění
Princip testu
Soupravy jsou založeny na sendvičovém typu ELISA metody.
Kroky testu
1
Ředění vzorků
2
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 100 µl
3
Inkubace 30 min. při 37 °C
4
Odsátí a promytí jamek 5 krát
5
Dávkování Konjugátu 100 μl
6
Inkubace 30 min. při 37 °C
7
Odsátí a promytí jamek 5 krát
8
Dávkování substrátu (TMB-Complete) 100 μl
9
Inkubace 15 min. při 37 °C
séra/plazmy (1+100)
včetně blanku
včetně blanku
Sandwich ELISA
HRP
HRP
HRP
Anti-Hu IgA
Anti-Hu IgM
Anti-Hu IgG
IgG
IgM
IgA
Ag
Ag
včetně blanku
10
Dávkování Zastavovacího roztoku 100 μl
11
Fotometrické měření při 450 nm
včetně blanku
Ag
Uživatelský komfort
Mikrotitrační destička
Komponenty v pracovním ředění
Barevně odlišené reagencie
Antigeny
Zaměnitelnost komponent
Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami
Klinicky signifikantní kmen H. pylori s vysokým obsahem proteinů
CagA (120 kDa) a VacA (87 kDa)
CUT-OFF kontrola a kalibrátory
Semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-IP)
nebo kvantitativní vyhodnocení výsledků (U/ml)
Výhody souprav
Charakteristiky souprav
ELISA
Diagnostická Diagnostická
citlivost
specifita
EIA Helicobacter MONO IgA
98,7 %
98,8 %
EIA Helicobacter MONO IgG
98,9 %
98,8 %
Vysoká diagnostická účinnost
Dobrá reprodukovatelnost
Vysoká dynamika testů
Identický pracovní postup
Celková doba vyšetření 1,5 hodiny
Možnost kvantitativního stanovení
EIA Helicobacter MONO IgM
97,5 %
97,4 %
Vhodné pro otevřené automatické systémy
Možnost nezávislé verifikace (CKS)
Komplexní zákaznický servis
IMUNOBLOT
Použití souprav
Konfirmační test k průkazu protilátek proti H. pylori
Antigeny
Princip testu
Elektroforeticky separované antigeny H. pylori jsou přeneseny na
nitrocelulózovou membránu.
P
E
Po přidání substrátu vzniká
reakcí s enzymem
nerozpustný barevný produkt
Faktory patogenity:
CagA - cytotoxický protein
(Cytotoxin Associated
Genproduct)
- Mw = 120 kDa
- anti-CagA protilátky dlouhodobé přetrvávání
Cut-off line
Start
120 kDa, Cag A
87 kDa, Vac A
VacA - vakuolizační cytotoxin
- Mw = 87 kDa
Enzymem konjugovaná sekundární
protilátka se váže na primární protilátku
Specifická primární protilátka
se váže na protein
Specifický protein antigenu
Ag
Průkaz protilátek proti antigenu CagA
Blokátor
Nespecifický
protein antigenu
Ag
Strip
Anti-Hu IgG (IgA): AP-labeled anti-human IgG (IgA) antibody
CagA a VacA jsou exprimovány asi
u 40 – 60% kmenů H. pylori.
Vysoce specifické antigeny:
Vnější membránové proteiny
19 kDa, 33 kDa
Protein 26 kDa
Malé ureázové podjednotky
ureA = 30 kDa
protein 29 kDa
33 kDa
30 kDa
29 kDa
26 kDa
19 kDa
17 kDa
Charakteristiky souprav
Uživatelský komfort
Komponenty v pracovním ředění
Barevně odlišené reagencie
Zaměnitelnost komponent
Immunoblot
Diagnostická
citlivost
Diagnostická
specifita
BLOT Helicobacter pylori IgA
96,2 %
97,5 %
BLOT Helicobacter pylori IgG
98,5 %
98,9 %
Negativní a Pozitivní kontrola
Kontrolní linie na stripu
Možnost softwarového vyhodnocení
Pracovní postup
Kroky testu
1
Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml
2
Smáčení stripů 10 min. při lab. teplotě
3
Odsátí
4
Ředění vzorků
5
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml
6
Inkubace 60 min. při lab. teplotě
7
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku
3 krát 1,5 ml po 5 min.
8
Dávkování Konjugátu 1,5 ml
Vysoká diagnostická účinnost
Vhodné pro automatické systémy
třepačka
Komplexní zákaznický servis
séra/plazmy (40 µl+1,5 ml)
třepačka
Klinická data
Korelace výsledků mezi rychlým ureázovým testem, EIA
a Imunoblotem (TestLine)
Inkubace 60 min. při lab. teplotě
třepačka
10
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku
3 krát 1,5 ml po 5 min.
11
Dávkování substrátu (BCIP/NBT) 1,5 ml
12
Inkubace 10 min. při lab. teplotě
13
Odsátí a promytí v destilované vodě
2 krát 2 ml po 5 min.
11
Nalepení a vyhodnocení stripů
třepačka
třepačka
třepačka
UREASAtest
EIA Helicobacter
MONO
BLOT
Helicobacter
pylori
negativní (n=38)
negativní (32)
negativní (38)
pozitivní (n=29)
pozitivní (29)
pozitivní (29)
negativní (n=35)
negativní (32)
negativní (34)
pozitivní (n=30)
pozitivní (30)
pozitivní (30)
negativní (n=23)
negativní (21)
negativní (23)
pozitivní (n=20)
pozitivní (9)
pozitivní (20)
IgA
třepačka
IgG
9
Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků
IgM
Krok č.
Výhody souprav
INFEKČNÍ SÉROLOGIE
Objednací údaje
ELISA
IMUNOBLOT
Kód
Název soupravy
HMA096
EIA Helicobacter MONO IgA
HMG096
Počet testů
Kód
Název soupravy
Počet testů
96
HpAB16
BLOT Helicobacter pylori IgA
16
EIA Helicobacter MONO IgG
96
HpGB16
BLOT Helicobacter pylori IgG
16
HMM096
EIA Helicobacter MONO IgM
96
SwIm03
Immunoblot Software
xxxTLN
CKS negativní
(dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
xxxTLP
CKS pozitivní
(dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
1 ks
Kontakt
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o.
Křižíkova 68
612 00 Brno, Česká republika
Tel.: +420 549 121 205 (237, 238)
Fax: +420 541 243 390
E-mail: [email protected]
www.testlinecd.cz
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO
9001:2008 a ISO 13485:2003.