Full text

DNA-BASED STABLE ISOTOPE PROBING FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA
ACTIVELY METABOLIZING XENOBIOTICS
IDENTIFIKACE BAKTERIÍ AKTIVNĚ METABOLIZUJÍCÍCH XENOBIOTIKA
S VYUŢITÍM 13C-ZNAČENÝCH SUBSTRÁTŮ
Ondřej Uhlík 1, 2), Čestmír Vlček 3), Kateřina Ječná 1), Petr Štursa 1), Mary Beth Leigh 4),
Martina Macková 1), Tomáš Macek 1, 2)
1) VŠCHT Praha, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, 16628 Praha 6,
e-mail: [email protected]
2) ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Flemingovo nám. 2, 166 10 Praha 6
3) ÚMG AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4
4) Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 902 Koyukuk Dr., Fairbanks,
AK 99775-7000,USA
Abstract:
The study deals with analyses of bacteria which metabolize environmental contaminants using stable
isotope probing of DNA and subsequent analyses of labeled DNA.
Keywords:
SIP, 16S rRNA genes, bioremediation, xenobiotics, heavy DNA
Abstrakt
Fytoremediace a rhizoremediace stojí v současnosti v popředí zájmu jakožto efektivní a k přírodě
šetrné techniky odstraňování polutantů z životního prostředí. Doposud byla izolována a charakterizována
celá řada kultur schopných v laboratorních podmínkách degradovat různá xenobiotika. Tyto mikroby
však nemusí daný polutant metabolizovat ve svém přirozeném prostředí, kde jsou vystaveny celé řadě
vlivů, mimo jiné existenci konkurenčních mikroorganismů soutěžících o zdroje živin a energie, a proto
se v současné době výzkum soustředí na mikroorganismy aktivně metabolizující xenobiotika. Jejich
identifikaci umožňuje metoda značení DNA stabilními isotopy. Princip této techniky spočívá v přidání
13
C-značeného substrátu nebo jeho analogu ke studovanému vzorku; mikroby využívající takovýto
substrát jako zdroj uhlíku během replikace zabudovávají isotopy 13C do své DNA, kterou lze po
izolaci z přírodní matrice rovnovážnou centrifugací oddělit od DNA mikrobů, které se na degradaci
13
C-substrátu nepodílejí. Získaný metagenom aktivních mikrobiálních populací je dále využíván pro
sekvenční analýzu zajišťující taxonomické zařazení populací i analýzu funkčních genů. Těmito
postupy byly charakterizovány bakteriální populace metabolizující bifenyl v půdě kontaminované
polychlorovanými bifenyly a v rhizosféře křenu selského rostoucího v této půdě. Výsledky ukazují, že
aktivní část mikrobiálních populací metabolizujících bifenyl se ve většině případů neshoduje s
bakteriálními rody, jejichž zástupce se podařilo izolovat v čistých kulturách ze studovaných vzorků.
Úvod
Aerobní degradace xenobiotik byla v poslední době předmětem celé řady výzkumů. Základním cílem
směřujícím k optimalizaci bioremediačního procesu se stala identifikace bakterií a genů přímo se
účastnících degradačního procesu [1]. Kultivačními postupy sice lze izolovat z přírodních matric
bakterie, které jsou schopné metabolizovat příslušné xenobiotikum, ale tyto techniky mají dvě velké
nevýhody – jednak méně než procento bakterií lze kultivovat a tyto techniky tak zcela neodrážejí
mikrobiální diversitu, a jednak i pokud je daný izolát schopen v laboratorních podmínkách
xenobiotikum metabolizovat, neznamená to, že ve svém přirozeném prostředí, kde je vystaven celé
řadě vlivů, této schopnosti využívá [2]. Naproti tomu molekulární techniky založené na analýze DNA
sice umožňují sledovat mikrobiální diversitu, ale obecně neodhalují vztah mezi identitou mikrobů a
jejich funkcí. Metoda, která spojuje výhody a eliminuje nevýhody technik zmíněných výše, využívá
značení stabilními isotopy (stable isotope probing, SIP) [3]. Jedná se o postup nezávislý na kultivaci,
jehož hlavní předností je umožnění identifikace bakterií a genů zodpovědných za procesy probíhající
v životním prostředí, v našem případě tedy metabolizace xenobiotika. V prvním kroku je přírodní
matrice obohacena o sloučeninu značenou isotopy uhlíku 13C, jejíž metabolismus je předmětem zájmu,
a následné inkubaci. Mikroorganismy, které využívají substrát jako zdroj uhlíku inkorporují 13C do
biomasy. Následná analýza buněčných komponent, které poskytují fylogenetickou informaci, např.
mastné kyseliny odvozené od polárních lipidů [4], DNA [5] nebo RNA [6], odhalí organismy, které se
na metabolismu substrátu podílejí.
Předmětem této studie bylo s využitím inkorporace isotopů 13C do DNA identifikovat bakterie
podílející se na metabolismu bifenylu, jakožto strukturního analogu polychlorovaných bifenylů (PCB),
perzistentních organických polutantů, jimiž je kontaminována celá řada lokalit na celém světě, a
přispět tak hlubšímu porozumění degradace bifenylu v půdě. Výchozím materiálem byla dlouhodobě
kontaminovaná půda (koncentrace PCB 153 mg/kg suché půdy) a rhizosféra křenu selského,
pěstovaného v této půdě po dobu šesti měsíců.
Experimentální práce
Předpěstované rostliny křenu selského (Armoracia rusticana) byly přesazeny do kontaminované půdy
v květináčích a ve stabilních podmínkách ve skleníku byly pěstovány 6 měsíců. Za tuto dobu byly
květináče zcela prokořeněny a tak celý jejich obsah byl sklizen jakožto rhizosféra křenu selského.
Spolu s nevegetovanou půdou byla tato půda uchována v chladničce do započetí samotného
experimentu.
Prvním krokem byla aktivace obou půd – inkubace 10% suspenze homogenizovaných půd 0.05%
roztoku kvasničného extraktu s přídavkem 50 g neznačeného bifenylu v celkovém objemu 50 ml
roztoku minerálních solí. Po 5 dnech inkubace při teplotě 28 °C bylo přidáno 2,5 mg 13C-bifenylu a
následovala další inkubace. Jednotlivé paralely byly sklízeny postupně v časových intervalech počínaje
momentem před přidáním 13C-bifenylu (kontrola). Suspenze půd byla odstředěna (2 500 g, 30 min.)
a DNA byla izolována z pelety pomocí komerční soupravy PowerMax™ Soil DNA Isolation Kit
(MoBio Laboratiories Inc.). Po závěrečné eluci bylo ke vzorku přidáno 0,2 ml 5M NaCl a 10,4 ml
ethanolu a po 12hodinové inkubaci při -20 °C a přídavku 20 g glykogenu (Roche) byla DNA
odstředěna (13 000 g, 10 min) a resuspendována ve 20 l TE pufru. Koncentrace DNA byla
stanovována spektrofotometricky při 260 a 280 nm s využitím přístroje Bio-Rad Smart Spec Plus a roztoky
DNA byly naředěny tak, aby výsledná koncentrace DNA v roztoku byla 0,6 g/ l.
Rovnovážná centrifugace byla prováděna v 3,3 ml OptiSeal kyvetách (Beckman), které byly naplněny
roztokem trifluoracetátu cesného (hustota 1,6 g/ml, Amersham) s 3 g vzorku DNA. Rovnovážná
centrifugace byla prováděna na přístroji OptimaTM TL Ultracentrifuge (Beckman) při otáčkách
odpovídajících 145 000 g 70 hodin. Gradient byl následně frakcionován s využitím aparatury Fraction
recovery system (Beckman) a Syringe pump (Harvard Apparatus 11plus) do 80 l frakcí. DNA byla
z těchto frakcí získána zpět srážením isopropanolem s přídavkem 20 g glykogenu a rozpuštěním
v 50 l TE pufru. Distribuce DNA v jednotlivých frakcích byla stanovena pomocí kvantitativní
polymerasové řetězové reakce s primery cílenými na geny 16S rRNA za účelem lokalizace 13C-DNA.
Frakce, které takto značenou DNA obsahovaly, byly smíchány dohromady a dále analyzovány jako
‘těžká’ DNA.
Diversita mikrobiální populace asimilující bifenyl byla v jednotlivých časových bodech stanovena
pomocí analýzy různorodosti délek koncových restrikčních fragmentů (terminal-restriction fragment
length polymorphism, T-RFLP) amplikonů genů 16S rRNA získaných štěpením restrikční
endonukleasou HhaI a identifikace jednotlivých bakterií byla prováděna klonováním a sekvenční
analýzou amplikonů genů 16S rRNA. Spolu s analýzou genů 16S rRNA byla prováděna i analýza
genů kódujících bifenyl-dioxygenasu v 13C-DNA získané po třech dnech inkubace půd s 13Cbifenylem.
Výsledky a diskuse
Postupné ukončování inkubace vzorků půd s 13C-bifenylem probíhalo 1, 3 a 7 dní po zahájení pokusu.
Takovéto uspořádání experimentu umožní sledovat nejrychleji metabolizující bakterie, ale zároveň i
pomaleji rostoucí bakterie, případně bakterie využívající 13C-značené produkty metabolismu
primárních zužitkovatelů 13C-bifenylu. Kvantitativní polymerasová řetězová reakce jednoznačně
dokázala přítomnost těžké DNA ve vzorcích po 3- a 7denní inkubaci. Jako ‘těžká’ DNA ve vzorcích
po 1denní inkubaci byla označena DNA vyskytující se ve stejných frakcích, ve kterých byla 13C-DNA
lokalizována ve vzorcích po 3- a 7denní inkubaci. T-RFLP profily ‘těžké’ DNA po 1denní inkubaci
ovšem vykazovaly rozdíly oproti kontrolnímu profilu, který sloužil k detekci kontaminující DNA
(spojení frakcí získaných před přidáním 13C-bifenylu, ve kterých po 3- a 7denní inkubaci byla
lokalizována 13C-DNA). Jak v případě ‘těžké’ DNA získané z bakterií nevegetované půdy, tak bakterií
rhizosféry křenu selského po 1denní inkubaci s 13C-bifenylem bylo možné identifikovat jeden
terminální fragment, potažmo bakterii metabolizující 13C-bifenyl, který dominoval i po 3denní
inkubaci a v případě DNA získané z rhizosféry křenu selského i po 7denní inkubaci.
Genová knihovna amplikonů genů 16S rRNA sestrojená z 13C-DNA získané po 1- a 3denní inkubaci
odhalila, že bakterie rodu Paenibacillus dominují metabolismu bifenylu v nevegetované půdě a
bakterie rodu Hydrogenophaga v rhizosféře křenu selského. Zástupci rodu Hydrogenophaga byli
rovněž identifikováni v 13C-DNA získané po 3denní inkubaci nevegetované půdy a po 7denní inkubaci
už převažovali nad rodem Paenibacillus a dominovali i po 7denní inkubaci rhizosféry křene selského,
kde byly rovněž identifikovány bakterie rodu Achromobacter. In silico digesce sekvencí získaných
klonů enzymem HhaI umožnila identifikaci jednotlivých terminálních fragmentů v T-RFLP profilech.
Diskuse
Námi identifikované bakterie dominující metabolismu bifenylu v nevegetované půdě a rhizosféře
křenu selského se liší, což potvrzuje fakt, že přítomnost rostlin selektivně podporuje určitý druh
mikroflóry. Z metabolicky aktivních bakterií Hydrogenophaga sp., Paenibacillus sp. a Achromobacter
sp. se pouze zástupce rodu Achromobacter podařilo z rhizosféry křenu selského získat i kultivačními
technikami. Vedle Achromobacter sp. se jimi podařilo izolovat bifenyl metabolizující bakterie
identifikované jako Rhodococcus sp., Arthrobacter sp., Sinorhizobium sp. nebo Gordonia sp. [7,8],
které se v genových knihovnách amplikonů genů 16S rRNA sestrojených z jednotlivých 13C-DNA
nevyskytovaly.
Výsledky této studie dokazují, že bakterie, které se podaří izolovat v laboratorních podmínkách a u kterých
se v laboratoři potvrdí schopnost degradovat bifenyl (a/nebo PCB), nemusejí nutně tyto schopnosti
uplatňovat ve svém přirozeném prostředí. Zároveň naše výsledky potvrzují nezastupitelnou úlohu
techniky založené na inkorporaci stabilních isotopů 13C do DNA metabolicky aktivních bakterií
jakožto nástroje umožňujícího najít souvislost mezi metabolickým dějem probíhajícím v životním
prostředí a původci takovéhoto děje, což je velice důležité pro případnou optimalizaci
bioremediačních postupů.
Poděkování
Tato práce byla sponzorována grantem MŠMT NPVII 2B08031, vnitřním grantem VŠCHT
320080023 a výzkumnými záměry MSM 6046137305 a Z 40550506.
Pouţitá literatura
[1] LEIGH, M.B., PELLIZARI, V.H., UHLÍK, O., SUTKA, R., RODRIGUES, J., OSTROM, N.E., ZHOU, J., TIEDJE, J.M.
(2007): Biphenyl-utilizing bacteria and their functional genes in a pine root zone contaminated with
polychlorinated biphenyls (PCBs). The ISME Journal 1: 134-148
[2] UHLÍK, O., JEČNÁ, K., MACKOVÁ, M., LEIGH, M.B., DEMNEROVÁ, K., MACEK, T. (2008): Využití značení
stabilními isotopy pro detekci mikroorganismů aktivních při degradaci xenobiotik. Chemické Listy 102:
474-479
[3] UHLÍK, O., JEČNÁ, K., LEIGH, M.B., MACKOVÁ, M., MACEK, T. (2008): DNA-based stable isotope probing:
a link between community structure and function. The Science of the Total Environment,
doi:10.1016/j.scitotenv.2008.05.012. V tisku
[4] BOSCHKER, H.T.S., NOLD, S.C., WELLSBURY, P., BOS, D., DE GRAAF, W., PEL, R., PARKES, R.J.,
CAPPENBERG, T.E. (1998): Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by
13
C-labelling of biomarkers. Nature 392: 801-805
[5] RADAJEWSKI, S., INESON, P., PAREKH, N.R., MURRELL, J.C. (2000): Stable-isotope probing as a tool in
microbial ecology. Nature 403: 646-649
[6] MANEFIELD, M., WHITELEY, A.S., GRIFFITHS, R.I., BAILEY, M.J. (2002): RNA stable isotope probing, a
novel means of linking microbial community function to phylogeny. Applied and Environmental
Microbiology 68: 5367-5373
[7] UHLÍK, O., ŠANDA, M., FRANČOVÁ, K., MACKOVÁ, M., MACEK, T. (2007): Characterization of bacteria in
real soil contaminated with persistent halogenated compounds. 4th Symposium on Biosorption and
Bioremediation, Prague, Czech Republic, 26.-30.8.2007. V knize: MACKOVÁ, M., MACEK, T.,
DEMNEROVÁ, K., PAZLAR, V., NOVÁKOVÁ, M., editoři (2007): Proceedings of the 4th Symposium on
Biosorption and Bioremediation, s. 179-182
[8] UHLÍK, O., HOLEČKOVÁ, M., MACKOVÁ, M., KAMLAR, M., MACEK, T. (2007): Horseradish root zone
microbial community analysis in soil contaminated with persistent halogenated aromatics. II International
Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology, Seville, Spain, 28.11.-1.12.2007.
Book of Abstracts, s. 99