práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

Komentáře

Transkript

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem
Kolektiv
Lékařská chemie, biochemie a
molekulární biologie
Praktická cvičení I
Univerzita Karlova v Praze
1. lékařská fakulta
Ústav biochemie a experimentální onkologie
Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, Dr.Sc.
Autorský kolektiv:
Editor: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc.
MUDr. Jana Stříbrná, CSc.
RNDr. Eva Bubnová, CSc.
RNDr. Alena Buděšínská, CSc.
Doc. MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD.
MUDr. Michal Zikán, PhD.
MUDr. Petr Bušek, PhD.
Mgr. Lucie Šromová
2
OBSAH
Úvod
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
První pomoc v laboratoři
Pomůcky pro praktická cvičení
Práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem
Stanovení koncentrace chloridu ţelezitého
Základní chemické pojmy a zákony
Roztoky - sloţení, ředění, osmolarita
pH, pufry
Stanovení acidity ţaludeční šťávy
Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a
kyseliny octové
Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny
5
6
9
10
11
14
16
17
19
20
Výpočet pH kyselin, zásad a pufrů
Stechiometrické výpočty, iontový zápis chemických rovnic, iontové rovnice
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků
a jejich sloučenin
Důkaz vybraných kationtů
Důkaz vybraných anionů
Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny
Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných
organických sloučenin
Oxidace primárních alkoholů
Rozpustnost organických kyselin a jejich solí
Tvorba komplexních sloučenin
Močovina
Aminokyseliny
Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě
Barevné reakce aminokyselin
Reversibilní redox systém cystein-cystin
Bílkoviny I
Biuretová reakce
Emulgační schopnost bílkovin
Irreversibilní sráţení bílkovin
Důkaz některých sloţek bílkovin
Dialýza
Bílkoviny II
Elektroforéza bílkovin
Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru
Stanovení koncentrace albuminu v seru
Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu v séru
26
29
24
25
31
33
37
39
42
43
46
48
49
50
51
54
58
59
60
62
63
65
66
68
69
72
74
76
3
Enzymy
Důkaz substrátove specifity glykosidas
Stanovení Michaelisovy konstanty
Nukleové kyseliny I
Izolace genetického materiálu
Nukleové kyseliny II
Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin
Nukleové kyseliny III
Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR
a restrikčního štěpení a real-time PCR
78
80
81
88
89
91
92
95
107
4
ÚVOD
Předkládaná skripta pro výuku praktických cvičení z lékařské chemie, molekulární
biologie a biochemie vycházejí z textu publikovaného v roce 2004. Od té doby došlo k řadě
různých změn a tak bylo nutno texty upravit pro stávající potřeby. V důsledku inovace ve
výuce uvedených oborů byla některá čistě teoretická témata vypuštěna, zejména ta, která
budou probírána na seminářích. Naopak jiné kapitoly byly doplněny. Snaţili jsme se klást
důraz na klinický význam a uplatnění určitých úloh s cílem zvýšení zájmu studentů o obor.
Zdá se, ţe studentům 1. aţ 3 ročníků chybí informace o důleţitosti laboratorních oborů
komplementu, kde je nezastupitelná role laboratorně vzdělaného lékaře se základními
praktickými návyky. Jejich osvojení je v podstatě propedeutikou pro ostatní laboratorní obory.
V molekulárně biologickém oddílu jsme u průkazu genových polymorfismů ApoE
prokazovaných PCR a restrikčním štěpením spolu s gelovou elektroforézou, které v současné
době v rutinní diagnostice ustupují do pozadí, doplnili moderní přístup průkazu
polymorfismů pomocí real-time PCR se specifickou hybridizační FRET sondou. Studenti
pracují s vlastním biologickým materiálem získaným bukáním stěrem a mohou tak porovnat
náročnost obou přístupů.
Praktická cvičení umoţňují studentům jednak procvičit teoretické vědomosti, ale i
aplikovat teoretické poznatky do praxe.
V úvodních kapitolách se studenti seznámí s pouţíváním odměrných zařízení,
automatickými pipetami a dávkovači, dále se základním přístrojovým vybavením jako jsou
spektrofotometry, elektroforetická zařízení. Současně se také seznámí s pouţíváním
základních přístrojů POCT - Point of Care Testing, coţ znamená provádění měření a testů
in vitro v místě péče o pacienta diagnostickými přístroji s jednoduchým ovládáním. Měření a
testy provádějí často pracovníci bez specializovaného laboratorního vzdělání na klinických
odděleních jako součást péče o pacienta, ale jsou kontrolovány lékařem - klinickým
biochemikem.
POCT zahrnuje pouţívání techniky u lůţka pacienta včetně přenosných analyzátorů,
v praktických a odborných ambulancích (primární péče) nebo techniky vlastněné pacientem
(např. sebetestování diabetiků). Analytické postupy, které vyuţívají přístroje a zařízení
POCT, jsou pouţívány také při analýze patologických součástí moče nebo důkazu toxických
látek v séru, slinách i v moči.
Dále jsou zařazeny úlohy, které umoţňují provést vyšetření séra a moče simulovaného
pacienta a tím snadněji pochopit biochemické podklady závaţných onemocnění. Byla
zvolena témata týkající se zdravotních problémů velké části populace (např. diabetes
mellitus, infarkt myokardu, aterosklerosa).
Studentům doporučujeme, aby si před praktickým cvičením pečlivě prostudovali
příslušný text cvičení a znalosti doplnili navazujícím textem z učebnice.
Praktická cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie budou
publikována v elektronické formě, coţ studentovi umoţní vytisknout příslušnou kapitolu,
respektive úlohu, a pracovat s nimi jako s pracovními listy.
Závěrem dovolte vyslovit přání, aby praktická výuka i tyto texty, včetně seminářů, vám
pomohly nejen ve studiu biochemie, ale i k získáni laboratorní zručnosti a zájmu o obor se
stále narůstajícím významem nejen ve vědě, ale i ve všech oblastech klinické medicíny.
Nezapomínejte, ţe se sniţují počty lékařů vedoucích laboratorní oddělení a mnozí z vás je
budou muset nahradit. Uvědomte si také, ţe v postgraduálním studiu se základní informace
jiţ získávají obtíţněji.
V Praze 2013
Autoři
5
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
1. V laboratoři se pracuje v předepsaném pracovním ochranném oděvu: bílý laboratorní
plášť by měl být celý zapnutý. Dlouhé vlasy je nutno mít sepnuté. V případě potřeby se
doporučuje pouţívat další ochranné pomůcky: gumové rukavice, brýle, ochranný štít nebo
roušku.
2. Při práci s biologickým materiálem (krev, sérum, plazma, moč) je nutno vţdy pouţívat
gumové rukavice.
3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit. Před odchodem z laboratoře je nutno vţdy si
umýt ruce mýdlem.
4. Při práci musí být zachován klid a udrţována maximální čistota. Pracuje se s maximální
pozorností a rozmyslem.
5. Kaţdá kádinka,zkumavka,láhev na pracovním stole musí být čitelně a srozumitelně
popsána ( obsah - signatura).
6. S pevnými chemikáliemi se nikdy nemanipuluje rukou, neodsypávají se do dlaně apod.
Pouţívá se čistých laboratorních lţiček nebo špachtlí. V případě znečištění chemickou
látkou se ruce ihned opláchnou a umyjí mýdlem a vodou.
7. Malé zátky se při práci přidrţují v ruce a neodkládají se na pracovní stůl. Zátky větších
lahví je nutno poloţit tak, aby obsah lahve na nich ulpělý nekontaminoval pracovní
plochu. Láhve a jiné obaly je po odebrání potřebného mnoţství chemikálie třeba ihned
uzavřít.
8. Reagenční roztoky se odlévají z reagenčních lahví na straně odvrácené od signatury tak,
aby se nepoškodil štítek na lahvi. Nečitelný nápis a s tím spojená případná záměna můţe
mít nebezpečné následky.
9. Pipetování jedovatých, leptavých, dráţdivých a potenciálně infekčních (biologických)
kapalin je nutno provádět bezpečnostními pipetami nebo pomocí balonku. Nikdy ne
přímo ústy!
10. Při manipulacích s látkami ve zkumavkách a jiných nádobách musí ústí nádoby vţdy
směřovat od vlastní osoby i od jiných pracovníků.
11. Tekutiny ve zkumavce při zahřívání na otevřeném ohni se zahřívají opatrně a pomalu od
hladiny ke dnu. Zkumavkou se přitom pohybuje, aby se obsah rovnoměrně prohříval a
nedošlo k náhlému varu a vystříknutí vroucí kapaliny.
12. Pachy látek se nezjišťují přímým přičicháváním; výpary se přivanou mávnutím dlaně.
Chemikálie se nikdy nesmí ochutnávat!
13. Koncentrované kyseliny, zvláště kyselina sírová, se ředí vléváním kyseliny do vody.
Kyselina se přilévá tenkým proudem, po částech a za stálého promíchávání roztoku
skleněnou tyčinkou. Obrácený postup, tj. přilévání vody do kyseliny je nepřípustný.
14. Při rozpouštění pevného hydroxidu sodného nebo draselného se sype hydroxid po
malých částech za stálého míchání do vody; vţdy se vyčká, aţ je předchozí podíl
rozpuštěn.Pokud se roztok více ohřívá, ochladí se nádoba vodou ve větší nádobě.
6
15. Rozlité koncentrované kyseliny se nejprve ředí opatrně vodou a pak neutralizují
zředěným roztokem sody nebo alkalického hydroxidu. Rozlité roztoky louhů se ředí
vodou. Kontaminované plochy se pak omyjí vodou. Tyto operace se provádějí
v ochranných rukavicích. Drobné kapky kyselin, louhů a jiných nebezpečných látek se
nasají do filtračního papíru a potřísněné místo se pak omyje vodou.
16. Roztoky chemikálií se vylévají do odpadu jen za současného ředění nadbytkem vody
z vodovodu.
17. Je třeba se vyhnout vdechnutí i minimálních kvant chemických látek. Některé látky, např.
kyanovodík, sirovodík, chlor, fosgen aj. mohou usmrtit uţ po jediném nadechnutí. Jiné,
např. rtuť, benzen, tetrachlormethan a 2-naftylamin, mohou způsobit těţká poškození
zdraví aţ po delší době. Pro moţnost infekce je třeba dbát úzkostlivé čistoty při práci
s biologickým materiálem.
18. S látkami dráţdivými, páchnoucími a jedovatými, např. s chlorem, fosgenem,
chloroformem, tetrachlormethanem, sirouhlíkem aj., a s látkami snadno vznětlivými, např.
s petroletherem, diethyletherem, benzinem, sirouhlíkem, benzenem, acetonem aj. se musí
pracovat v dobře odsávané a zapojené digestoři. Při práci s hořlavinami se dbá na to, aby
nemohlo dojít ke vznícení par od otevřeného ohně, tj. zejména od blízkých kahanů, ale i
elektrických spotřebičů. V jedné digestoři nelze např. pracovat s hořlavým rozpouštědlem
a zahřívat cokoli plynovým kahanem. Nebezpečným zdrojem par mohou být i
chromatografické vany. Nebezpečnou věcí je postřik chromatogramů, kdy vzniká jemný
aerosol činidla; detekci lze provádět jen v dobře odsávané digestoři nebo odsávaném boxu.
Také ţíhání, spalování a mineralizace látek se provádějí v digestoři.
19. Při rozlití hořlaviny se ihned zhasnou kahany a vypojí elektrické spotřebiče. Při rozlití
velkého mnoţství hořlavin se ihned zhasnou všechny hořáky a vypnou elektrické
spotřebiče v místnosti, intenzivně se vyvětrá a nezapínají se ţádné elektrické spotřebiče,
ani světlo. Nejvyšší přípustné mnoţství hořlavin v laboratoři je stanoveno předpisy. Je
třeba mít na paměti, ţe hoří všechny organické látky, které obsahují méně neţ 70 %
halogenu.
20. Při nasazování hadiček na skleněné trubice a zasunování skleněných trubiček, kohoutů a
teploměrů do zátek se postupuje opatrně a bez násilí, nejlépe v ochranných rukavicích
nebo rukou chráněnou čistou utěrkou; sklo se drţí u otvoru, do něhoţ se vsunuje. Vsunutí
skleněných předmětů do otvorů v pryţi se usnadní jejich potřením glycerolem.
21. Chemické sklo a skleněné součásti chemických aparatur je třeba před prací prohlédnout;
i nepatrná prasklina můţe mít velmi váţné následky. Poškozené sklo je třeba ihned
vyřadit, dát do opravy nebo uloţit do zvláštní nádoby na skleněný odpad. Poškozené sklo
nesmí přijít do umývárny s ostatním sklem. Střepy skla i drobné střípky na stolech je
nutno opatrně a pečlivě odstranit.
22. Při zahřívání, např. destilaci kapalin s teplotou varu pod 100 C, se uţívají elektricky
vyhřívané vodní lázně, elektricky vyhřívaná topná hnízda a infrazářiče. Pokud k ohřevu
slouţí zahřívané olejové lázně, nesmí do oleje vniknout voda.
23. Utajenému varu, např. při destilaci, lze zabránit varnými kaménky nebo skleněnými
kuličkami, vloţenými do nádoby před začátkem zahřívání. Při podezření na utajený var se
vypne zdroj tepla a kapalina se nechá bez otřesů zchladnout.
24. Tenkostěnné nádoby s plochým dnem nesmějí být vakuovány, hrozí exploze. Pro
vakuovou destilaci se pouţívají výlučně silnostěnné baňky s kulatým nebo oblým dnem.
7
25. Ramena odstředivek musí být stejnoměrně zatíţena. Odstředivky musí být během
centrifugace uzavřeny, víko nesmí být otevřeno, dokud přístroj není opět v klidu. Většina
centrifug je chráněna proti předčasnému otevření pojistkou.
8
První pomoc v laboratoři
1. Vnikne-li chemická látka do úst, je třeba zamezit jejímu spolknutí; vyplivne se a ústa
vyplachují vodou. Při poţití jedovaté látky nebo roztoku se ústa opakovaně vypláchnou
vodou, po vypití asi půl litru tekutiny se vyvolá zvracení (dráţdění hrdla prstem) a
vyhledá se lékařská pomoc.
2. Při poleptání kůţe kyselinami a louhy se postiţené místo ihned dostatečně opláchne
proudem studené vody. Při větším potřísnění se pak vyhledá lékařská pomoc. Zvlášť
nebezpečná poleptání způsobují kyselina fluorovodíková, kyselina dusičná, kyselina
sírová, alkalické hydroxidy, peroxid vodíku a fenol.
3. Zasaţené oko se ihned vypláchne proudem studené vody, přiloţí se sterilní obvaz a ihned
se vyhledá lékařská pomoc.
4. Při popálení ohněm nebo horkými předměty je třeba postiţená místa ihned ochladit
ledovou vodou nebo přikládáním igelitových sáčků s vodou a ledem (ne samotný led).
Části oděvu stmelené s popáleninami se zásadně neodstraňují. Při opaření je nutno co
nejrychleji stáhnout nasáklý oděv, popálené plochy se kryjí jen sterilním obvazem (ţádné
masti nebo zásypy). Při těţších popáleninách nebo popálení většího rozsahu je třeba
vyhledat lékařskou pomoc.
5. Při úrazu elektrickým proudem, je-li postiţený pod napětím, je nutno nejprve přerušit
přívod proudu nebo postiţeného vyprostit tak, ţe je zachránce dostatečně izolován od
země suchou dřevěnou, gumovou nebo skleněnou podloţkou. Zabezpečí se dýchání,
srdeční činnost a přivolá se lékařská pomoc.
6. Při vzniku řezných ran, např. laboratorním sklem, se krvácející rána omyje proudem vody,
případně desinfikuje. K dezinfekci menších ran je moţno pouţít Ajatin, Famosept,
Septonex nebo roztok manganistanu draselného. Rána se přelepí rychloobvazem nebo
ováţe. Jsou-li v ráně cizí tělesa, např. střepiny skla, musí je vyjmout lékař. Při
rozsáhlejším krvácení se přiloţí kompresní obvaz a vyhledá lékařské ošetření.
7. Před zahájením praktik jsou studenti povinni se seznámit s teorií pouţívané laboratorní
metody a s postupem práce daného experimentu. Před začátkem kaţdé úlohy je třeba se
předem zamyslet nad moţnými pracovními riziky.
PŘI JAKÉKOLI POCHYBNOSTI NEBO PODEZŘENÍ NA RIZIKO
NEBEZPEČÍ SE NIKDY NEROZPAKUJTE DOTÁZAT ASISTENTA.
9
Pomůcky na praktika
1. Identifikační karta studenta
2. Přezutí
3. Bílý laboratorní plášť
4. Lihový popisovač na sklo
5. Návody na prakt. cvičení
6. Psací potřeby
7. Kalkulačka
8. Zámeček na skříňku v šatně
9. Rukavice nesterilní
10. Protokolový sešit
10
PRÁCE S AUTOMATICKÝMI PIPETAMI A SPEKTROFOTOMETREM
Práce s automatickými pipetami
Klíčová slova: převod – mililitry,mikrolitry, látková koncentrace, komplexní sloučeniny,
spektrofotometrie, transmitance, absorbance, molární absorpční koeficient, měřený vzorek,
standardní vzorek, slepý vzorek.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
roztok thiokyanatanu draselného 1 mol/l
roztok chloridu ţelezitého 400 µmol/l
standardní roztok chloridu ţelezitého 200 µmol/l
roztok kyseliny sírové 1 mol/l !ŢÍRAVINA!
Pokyny pro práci s automatickými pipetami:
1. Před pipetováním nasaďte na pipetu špičku, jejíţ barva obvykle odpovídá barvě tlačítka
pístu.
2. PIPETU DRŢTE VŢDY ŠPIČKOU DOLŮ!!!
3. Při pipetování stlačte píst k první zaráţce, ponořte pipetu do roztoku a pomalým
uvolňováním stlačeného pístu nasajte kapalinu (pozor na vzduchové bubliny).
Pomalým stlačením pístu k druhé zaráţce vypusťte obsah špičky (špička nesmí být
ponořena do kapaliny) do zkumavky.. Špička se při tom dotýká stěny zkumavky.
4. Pro pipetování nového roztoku pouţijte vţdy novou špičku.
5. Pipety odkládejte svisle do stojánku a nepokládejte je na pracovní desku stolu.
Nastavení zvoleného objemu:
1. Podle poţadovaného objemu roztoku zvolte pipetu s vhodným rozsahem uvedeným na
barevném tlačítku pístu pipety!
2. Poţadovaný objem nastavte na stupnici pipety otáčením šroubu.
11
Příklady:
rozsah pipety 200/1000 (údaj na barevném pístu):
nejmenší objem 200 µ1
největší objem 1 000 µl
1
0
0
1000 µl
0
6
6
660 µl
0
2
0
200 µl
160 µl
0
2
0
20 µl
160 µl
0
2
0
2 µl
rozsah pipety 20/200 (údaj na barevném pístu):
nejmenší objem 20 µl
největší objem 200 µl
2
0
0
200 µl
1
6
0
rozsah pipety 2/20 (údaj na barevném pístu):
nejmenší objem 2 µl
největší objem 20 µl
2
0
0
20 µl
1
6
0
Spektrofotometrie:
Závislost absorbance roztoku na koncentraci rozpuštěné látky podle LambertovaBeerova zákona umoţňuje stanovit neznámou koncentraci látky z naměřené hodnoty
absorbance příslušného roztoku:
A = –log T= ·c·l
A = absorbance při zvolené vlnové délce
T = transmitace při zvolené vlnové délce
= molární absorbční koeficient při zvolené vlnové délce
c = látková koncentrace měřeného roztoku (mol/l)
l = tloušťka měřené vrstvy = 1 cm
12
Hodnotu koncentrace lze získat těmito způsoby:
a)
b)
c)
d)
výpočtem z Lambertova-Beerova zákona, známe-li molární absorbční koeficient
odečtením z kalibračního grafu
výpočtem pomocí kalibračního faktoru
změřením absorbance standardního roztoku o známé koncentraci, absorbance
roztoku vzorku a následným výpočtem ze vztahu:
Ast/Avz = cst/c
Ast = absorbance standardu
Avz = absorbance vzorku
cst = látková koncentrace standardu
cvz = látková koncentrace vzorku
Pokyny pro práci se spektrofotometrem Spekol 11:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Přístroj zapněte 5 min. před měřením.
Na spektrofotometru nastavte poţadovanou vlnovou délku.
Kyvety uchopte vţdy za matné stěny.
Minimální objem měřeného roztoku je na kyvetě vyznačen ryskou, maximální objem
roztoku by měl dosahovat 0,5 cm pod horní okraj.
Kyvetu se slepým vzorkem vloţte do jezdce měřícího nástavce přístroje tak, aby paprsek
světla procházel průhlednými stěnami kyvety. Jezdcem pohybujte pomalu a opatrně.
Přístroj vynulujte tlačítkem R.
Roztok měřeného vzorku nalijte do druhé kyvety a změřte jeho absorbanci.
Roztok změřeného vzorku vylijte do kádinky na odpad. Zbytek kapaliny odstraňte
postavením kyvety na buničinu dnem vzhůru.
Před měřením dalšího vzorku přístroj znovu vynulujte na slepý vzorek.
Po ukončení měření obě kyvety několikrát vypláchněte destilovanou vodou a postavte
na buničinu dnem vzhůru.
13
ÚLOHA 1.
Stanovení koncentrace roztoku chloridu železitého
Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace Fe3+ se vyuţívá intenzívně červeně
zbarveného komplexu [Fe(SCN)]2+, který vzniká reakcí Fe3+ s thiokyanatanovými anionty v
kyselém prostředí (viz. Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků,
(úloha 1.3.).
Sloţení zadaných vzorků:
vzorek
Fe3+ 400 µmol/l (µl)
destilovaná voda (µl)
A
B
C
D
250
750
750
250
200
800
800
200
slepý
vzorek
–
1000
Pracovní postup:
– Kaţdý student připravuje jeden ze vzorků A – D podle zadání.
– Připravte a očíslujte sedm zkumavek.
– Do zkumavek 1 – 3 připravte vţdy 1 ml zadaného vzorku. Tímto způsobem připravíte
tři identické vzorky (triplet).
– Do zkumavek 4 – 6 napipetujte vţdy 1000 µl standardního roztoku chloridu
ţelezitého 200 µmol/l .
– Do sedmé zkumavky připravte slepý vzorek (1000 µl destilované vody).
– Do všech sedmi zkumavek odměřte dávkovačem 0,5 ml roztoku kyseliny sírové
(1 mol/l), protřepejte a přidejte 0,5 ml roztoku thiokyanatanu draselného (celkový
objem v kaţdé zkumavce bude 2 ml). Obsah zkumavek dobře promíchejte.
– Po 10 min změřte absorbanci vzorku (Avz) i standardu (Ast) při 530 nm proti slepému
vzorku.
– Naměřené hodnoty zaznamenejte do tabulky 1. a 2.
14
Tabulka 1.
vzorek:
standard
vzorek
absorbance
průměr
– Z průměrné hodnoty absorbance vzorku a z průměrné hodnoty absorbance standardu
vypočítejte koncentraci Fe3+ (exp.).
– Ze zadaného sloţení vzorku (A-D) spočítejte teoretickou koncentraci a porovnejte obě
hodnoty.
– Všechny údaje zapište do tabulky 2.
Tabulka 2.
vzorek
Fe3+ (µl)
voda (µl)
průměr Ast průměr Avz
cFe3+
(µmol/l)
teoret.
cFe3+
(µmol/l)
exp.
Poznámky:
15
ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY
Klíčová slova: relativní atomová hmotnost (Ar), relativní molekulová hmotnost (Mr),
Avogadrova konstanta (NA), látkové mnoţství (n, mol), molární hmotnost (M, g/mol),
molární objem (Vm, dm3/mol), hmotnostní zlomek prvku ve sloučenině (w).
Příklady na procvičování:
1. Jakou molární hmotnost má: a) oxid uhličitý, b) ethanol, c) glukosa, d) alanin?
2. Jaké látkové mnoţství představuje: a) 90 g vody, b) 6 g kyseliny octové, c) 2,9 g
chloridu sodného, d) 4,86 g hydrogenuhličitanu vápenatého?
3. Jaký je za normálních podmínek objem: a) 7 g dusíku, b) 2,2 g oxidu uhličitého ?
4. Jakou hmotnost má za normálních podmínek: a) 1 l amoniaku, b) 10 l kyslíku ?
5. Kolik molů Fe2+ obsahuje 77,5 g jodidu ţeleznatého ?
6. Kolik mmolů Na+ obsahuje 0,67 g oxalátu sodného?
7. Kolik % dusíku obsahuje močovina ?
8. Kolik g dusíku vyloučil pacient za den, kdyţ v celkovém objemu moči bylo nalezeno
500 mmol močoviny ?
9. Bílkoviny obsahují v průměru 16 % dusíku. Kolik g bílkovin musíme podat pacientovi,
kdyţ mu potřebujeme dodat 5 g dusíku?
10. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní při dekarboxylaci 25,5 mg kyseliny acetoctové?
Dodatky:
Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S = 32, Fe=56, Cl = 35, I = 127
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
a) 44 g/mol, b) 46 g/mgl, c) 180 g/mol, d) 89 g/mol
a) 5 mol, b) 0,1 mol, c) 0,05 mol, d) 0,03 mol
a) 5,61, b) 1,121
a) 0,76 g, b) 14,28 g
0,25 mol
10 mmol
46 %
14 g
31,25 g
5,6 ml
Poznámky:
16
ROZTOKY - SLOŽENÍ, ŘEDĚNÍ, OSMOLARITA
Klíčová slova: koncentrace látková = molární (mol/l roztoku), koncentrace hmotnostní
(g/l roztoku, g/100 ml roztoku = g %), směšovací rovnice, kříţové pravidlo, osmotický tlak,
osmolarita (látková koncentrace osmoticky aktivních částic), izotonické roztoky.
Příklady k procvičovaní:
1. Vypočítejte látkovou koncentraci roztoků o tomto sloţení:
a) 17,4 g chloridu sodného / 300 ml,
b) 2,49 mg jodidu draselného / 15 ml
c) 385 mg chloridu vápenatého / 0,007 l
d) 4.2 g hydrogenuhličitanu sodného / 20 ml
e) 4,5 g glukosy / 2.5 l
2. Kolik g kyseliny šťavelové bude obsaţeno ve 250 ml roztoku o látkové koncentraci 0,1
mol/l?
3. Roztok glycinu má látkovou koncentraci 3 mmol/l. Kolik mg glycinu bude rozpuštěno v
0,1 1 tohoto roztoku?
4. Kolik g chloridu sodného musíte naváţit pro přípravu 350 m1 fyziologického roztoku
chloridu sodného (c = l50 mmol/l)?
5. Kolik mmol Fe2+ bude obsaţeno v 10 ml roztoku jodidu ţeleznatého o látkové
koncentraci 0,5 mol/l?
6. V jakém objemu roztoku chloridu vápenatého o látkové koncentraci 0.1 mol/l budou
obsaţeny 4 mmol chloridových iontů?
7. Kolik mmol hořečnatých kationtů bude obsaţeno ve 100 ml roztoku chloridu
hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l?
8. Kolik mmol chloridových ionty bude obsaţeno ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého
o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l?
9. Koncentrace draselných iontů v infúzi nesmí přesáhnout 40 mmol/l. Kolik m1 roztoku
chloridu draselného o hmotnostní koncentrace 148 g/1 smíme dát do jedné infúzní láhve
o objemu 300 ml?
10. Kolik vody musíme přidat ke 2 ml roztoku, chceme-li jej zředit
a) 2x, b) 3x, c) 5x, d) 10x, e) 20x?
11. Kolik ml vody musíme přidat k 10 ml 8% (g/100 ml) roztoku glukosy, aby výsledný
roztok byl 2%?
12. K 5 ml roztoku močoviny o látkové koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká
bude látková koncentrace výsledného roztoku?
13. K 5 m1 roztoku chloridu vápenatého o koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká
bude hmotnostní koncentrace výsledného roztoku?
14. Kolikrát musíme zředit roztok chloridu draselného o látkové koncentraci 0,24 mmol/l,
kdyţ výsledný roztok má mít hmotnostní koncentraci 5,92 mg/l?
15. Jakou osmolaritu má roztok o látkové koncentraci 0,15 mol/l?
a) chloridu sodného,
b) chloridu hořečnatého
c) hydrogenfosforečnanu sodného
d) glukosy
e) močoviny
17
16. Které z uvedených roztoků jsou izotonické s fyziologickým roztokem chloridu sodného
(c = 150 mmol/l)?
a) glukosy c = 300 mmol/l
b) chloridu vápenatého c = 50 mmol/l
c) chloridu draselného c = 300 mmol/l
d) dihydrogenfosforečnanu sodného c = 0,15 mol/l
17. Kolik ml vody musíme přidat ke 100 ml roztoku, ve kterém je rozpuštěno 14,2 g
hydrogentosforečnanu sodného, abychom získali roztok izotonický s fyziologickým
roztokem chloridu sodného?
18. Jakou osmolaritu má roztok připravený smícháním 100 ml roztoku chloridu sodného
o hmotnostní koncentraci 5,8 g/l a l00 ml roztoku chloridu vápenatého o hmotnostní
koncentraci 11 g/l?
Dodatky:
Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S=32, Fe = 56, Cl = 35, I = 127
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
a) 1 mol/l, b) 0,001 mol/l, c) 0,5 mol/l. d) 2,5 mol/l, e) 0,01 mol/l
2,25 g
22,5 mg
3,045 g
5 mmol
20 ml
1 mmol
2 mmol
6 ml
a) 2 ml, b) 4 ml, c) 8 ml, d) 18 ml, e) 38 ml
30 ml
0,002 mol/l
0,22 g/l
3x
a) 0,3 mol/l, b) 0,45 mol/l, c) 0,45 mol/l, d) 0,15 mol/l, e) 0,15 mol/l
a) ano, b) ne, c) ne, d) ano
900 ml 1
8. 0,25 mol/l
Poznámky:
18
pH, PUFRY
Klíčová slova: Hendersonova - Hasselbalchova rovnice, pH pufru, funkce pufru, koncentrace
pufru, kapacita pufru, aktuální a titrační acidita.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
roztok kyseliny octové 1 mol/l
roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l
roztok hydroxidu sodného 1 mol/l
fenolová červeň (0,1 g se rozpustí v 60ml ethanolu a doplní do 100ml destil.vodou)
vzorky ţaludečních šťáv
19
ÚLOHA 1.
Využití titrační kvantitativní analýzy v medicině. Stanovení acidity žaludeční
šťávy
Stanovení acidity ţaludeční šťávy stále patří k základním gastroenterologickým
vyšetřovacím biochemickým reakcím. V současné době se můţe provádět v kombinaci
s gastroskopií. Kvantitativní metodou stanovení acidity je titrace 0,1 mol/l NaOH, tzv.
acidimetrie.
Ţaludeční šťáva je čirá bezbarvá kapalina, někdy vazká od přimíšeného hlenu. Má
charakteristický zápach a silně kyselou reakci, pocházející od volné kyseliny chlorovodíkové
(HCl). pH ţaludeční šťávy se pohybuje v rozmezí 0,8 – 1,5, coţ odpovídá HCl o koncentraci
140 – 150 mmol/l. Spolknutá potrava ji pufruje na pH 1,8 – 4, které je optimální pro působení
pepsinů a ţaludeční acidorezistentní lipasy. Hustota šťávy kolísá mezi 1,001 - 1,010 g/ml.
Sekrece ţaludeční šťávy je regulována neurohumorálně. Produkce se pohybuje v rozmezí 1
000 – 3 000 m1/24 hod.
Ţaludeční sekret je produkován třemi typy buněk ţaludeční sliznice. Hlavni buňky
tvoří pepsinogeny, vedlejší, mucinózní buňky produkují hlen a krycí buňky vylučují H+, K+,
Cl . Poslední typ buněk vylučuje HCl o koncentraci 143 mmol/l. Kyselina chlorovodíková je
v kontaktu se slizničním povrchem zčásti neutralizována alkalickým mucinem, který
obsahuje NaHCO3.
Kyselost a mnoţství ţaludeční šťávy jsou určeny především počtem buněk, které se
sekrečního děje účastní. Významným faktorem je hladina peptidového hormonu gastrinu,
produkovaného buňkami ţaludeční sliznice. Pro posouzení patologických změn ţaludeční
sliznice má proto značný význam stanovení tzv. výdeje kyseliny chlorovodíkové (tj. součinu
látkové koncentrace HC1 a mnoţství ţaludeční šťávy) měřené v určitém časovém intervalu.
Tento ukazatel je měřen jednak v klidových bazálních podmínkách a jednak po stimulaci
(provokaci) ţaludeční sekrece k maximálním moţným hodnotám. Ke stimulaci slouţí podání
histaminu nebo syntetického hormonu pentagastrinu.
Odběr ţaludeční šťávy:
Pacient přichází na vyšetření ráno po nočním 12 hod lačnění a nekouří. V klinické praxi
se ţaludeční šťáva získává tenkou nasogastrickou sondou, která se zavádí do nejniţšího místa
ţaludeční dutiny. Pacient při polykání sondy sedí nebo můţe leţet na levém boku, poloha
konce sondy se kontroluje skiakopicky rentgenem. Injekční stříkačkou o objemu 20 ml se
20
odebere všechen lačný ţaludeční obsah, který se nehodnotí, a pak se tímto způsobem ve
2minutových intervalech pod lehkým tlakem odčerpává ţaludeční šťáva po dobu celého
odběru.
Při dvouhodinovém odběru se získává za bazálních klidových podmínek za dobu
60 minut frakce B. Pak je podkoţně injikován pentagastrin 6 µg/kg váhy) a za další hodinu
jsou získány v l5minutových intervalech frakce S1 aţ S4.
Princip:
Odměrnou analýzou (titrací hydroxidem sodným), acidimetrií se stanoví koncentrace
HC1 a vyhodnotí se výdej HC1.
Pracovní ·postup:
- Nejdříve je nutno si všimnout zápachu, barvy a konzistence. Zelená nebo ţlutá barva
ukazuje příměs ţluči, červená nebo tmavá příměs krve. Ţaludeční obsah s příměsi ţluči,
ve které bývá přítomen také pankreatický sekret, nelze kvantitativně na výdej HC1
hodnotit (pankreatická šťáva obsahuje hydrogenkarbonát).
- Ve válci (objem 100 ml) se změří objem frakcí.
- Do titrační baňky (objem 100 ml) se pipetou přesně odměří 5,0 ml frakce, přidají se 3
kapky fenolové červeně a titruje se NaOH o koncentraci 0,1 mol/l. (Jeho faktor se stanoví
pomocí kaliumhydrogenftalátu 0,1 mol/l nebo kyseliny šťavelové 0,1 mol/l a indikátoru
fenolftaleinu). Bod ekvivalence se při titraci ţaludeční šťávy projeví přechodem ze ţluté
do červené barvy. Pokud se červené zbarvení objeví hned po přidání indikátoru (před
titrací), spotřebu NaOH hodnotíme jako nulovou.
21
Vyhodnocení:
- Vypočítejte koncentraci HCl v jednotlivých frakcích podle vzorce (B, S1-S4):
mmol HCl v 1 l šťávy = a x 20, kde a = spotřeba 0,1 mol/l NaOH vyjádřená v ml (zdůvodněte
výpočet).
- Objem frakcí a koncentrací HCl vyneste do grafu, jehoţ souřadnice jsou na obr. 37.
- Vypočítejte bazální sekreci (výdej, odbyt) HCl. Vynásobte objem a koncentraci HCl frakce
B. Součin dělený 1000 představuje bazální výdej HCl v mmolech za 60 minut (normální
hodnota je 1,5 aţ 4 mmol/60 min).
- Vynásobte objem e koncentraci HCl ve frakci 1 aţ 4
a součet těchto součinů dělte 1000. Hodnota
představuje tzv. vrcholový výdej kyseliny (peak acid
out-put, PAO).
- Vypočítejte maximální sekreci HCl (maximal acid
out-put, MAO).
V klinické praxi se provádí takto:
z frakcí 1 aţ 4 se vyberou ty dvě sousední frakce, ve
kterých bylo docíleno nejvyššího výdeje (tj. součinu
koncentrace HCl v mmol/l a objemu frakce v ml
děleného 1000). Oba výdeje se sečtou a násobí dvěma.
(Zdůvodněte výpočet.)
Normální hodnoty maximální i vrcholové sekrece HCl
Obr. 1. Titrace HCl v ţaludeční
šťávě - bazální sekrece a
sekrece po stimulaci
pentagastrinem
jsou mezi 10 aţ 23 mmol/60 min.
- Vyhodnoťte zjištěné údaje o vašem pacientovi.
Bazální výdej vyšší neţ 15 mmol/hod je diagnosticky významný při podezření na
Zollingerův-Ellisonův syndrom (soubor příznaků způsobený nádorem ostrůvků pankreatu
nebo hyperplasií gastrinových buněk v antru).
Pacienti s duodenálním vředem mívají hodnoty maximální sekrece vyšší. Naopak při
bazální achlorhydrii (nepřítomnost HCl v ţaludeční šťávě) a stimulované sekreci niţší neţ
15 mmol/hod u muţů a 10 mmol/hod u ţen je tato diagnóza málo pravděpodobná.
Achlorhydrie při maximálním stimulačním testu ukazuje na zánik krycích buněk, tj. na
difúzní poškození ţaludeční sliznice (atrofická gastritis). Průkaz achlorhydrie při
22
rentgenologicky prokázaném defektu ţaludeční sliznice vede k naléhavéu podezření na
zhoubný nádor (karcinom ţaludku) a je nutné provést endoskopické vyšetření s biopsií.
Normální hodnoty výdeje HCl:
BAO (Basal Acid Output) = bazální výdej HCl na lačno 1 - 5 mmol/hod
MAO (Maximal Acid Output) = celková ţaludeční sekrece po stimulaci během
60 min 13 - 25 mmol/hod
PAO (Peak Acid Output) = součet hodnot dvou po sobě jdoucích 15 minutových
frakcí s nejvyšší sekrecí HCl, násobený 2 (přepočet na
1 hodinu) 0 - 34 mmol/hod.
Hodnocení patologických hodnot:
BAO:
PAO:
1 - 5 mmol/hod normál, ţaludeční vřed moţný
5 - 15 mmol/hod duodenální vřed
>20 mmol/hod
podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
atrofie ţaludeční sliznice (chronická atrofická gastritis,
perniciózní anémie)
5 - 40 mmol/hod normál, ţaludeční vřed moţný
>40 mmol/hod podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
BAO/PAO:
0 mmol/hod
<0,20 mmol/hod
>0,60 mmol/hod
normál, ţaludeční vřed moţný
gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
23
ÚLOHA 2.
Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a
kyseliny octové
Acetátový pufr je tvořen slabou kyselinou octovou (pKA = 4,75) a její silnou
konjugovanou bází, tj. acetátovým aniontem. Podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice je
pH pufru závislé na poměru látkových koncentrací obou sloţek konjugovaného páru.
Příslušné hodnoty poměru [Aˉ]/[HA] získáte různým přídavkem roztoku hydroxidu sodného
k roztoku kyseliny octové.
Pracovní postup:
Do kádinek napipetujte roztoky kyseliny octové 1 mol/l, hydroxidu sodného 1 mol/l a
destilovanou vodu podle tabulky 1.
Tabulka 1.
kádinka
[Aˉ]/[HA]
CH3COOH 1 mol/l (ml)
NaOH 1 mol/l (ml)
destilovaná voda (ml)
1
1:3
10
2,5
7,5
2
1:1
10
5
5
ZACHOVAT
3
3:1
10
7,5
2,5
pH naměřené
pH vypočtené
[pufr] (mol/l)
Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou.
pH-metrem změřte pH připravených pufrů.
Naměřené hodnoty porovnejte s vypočítanými hodnotami pH.
Vypočítejte látkovou koncentraci připravených pufrů.
Výsledky zapište do tabulky 1.
!POZOR! Pufr připravený v kádince 2 (poměr sloţek 1:1) budete pouţívat v dalších
úlohách.
Poznámky:
24
ÚLOHA 3.
Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny
Při přidání malého mnoţství silné kyseliny se pH pufru změní jenom málo, díky
rezervě, kterou v acetátovém pufru představují acetátové anionty.
Pracovní postup:
Do kádinek napipetujte připravený acetátový pufr (poměr sloţek 1:1), destilovanou
vodu a z byrety přidejte roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l podle tabulky 3.
Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte pH.
Porovnejte naměřenou hodnotu pH s hodnotou vypočítanou.
Zjistěte, o kolik jednotek se změnilo pH po přidání kyseliny k acetátovému pufru a k
destilované vodě.
Výsledky zapište do tabulky 3.
Tabulka 3.
kádinka
acetátový pufr (ml)
1
5
destílovaná voda (ml)
HCl 0,1 mol/l (ml)
2
5
5
5
pH naměřené
rozdíl pH (naměřených)
pH vypočítané
rozdíl pH (vypočítaných).
Poznámky:
25
VÝPOČET pH KYSELIN, ZÁSAD A PUFRŮ
Klíčová slova: disociace silných kyselin a zásad, disociace slabých kyselin a zásad, disociace
solí, iontový součin vody, disociační konstanty kyselin a zásad, konjugovaný pár, amfolyty,
isoelekrický bod, pufr, koncentrace pufru, pufrační kapacita, pH, pOH, pKw, pKA, pKB, pI,
Henderson-Hasselbalchova rovnice.
Příklady k procvičování:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Vypočítejte pH vodných roztoků následujících kyselin:
a) kyselina octová c =2,5 mmol/l,
b) kyselina octová c =0,025 mol/l
c) kyselina uhličtá c = 1,2 mmol/l
d) kyselina mravenčí c = 44 mmol/l
e) fenol c = 0,7 mol/l
Vypočítejte pH vodných roztoků následujících bází:
a) amoniak c = 5.10-4 mol/l,
b) amoniak c = 50 mmol/l
c) anilin c = 0,01 mol/l
d) acetátový anion c = 100 mmol/l
Vypočítejte látkovou koncentraci hydroxoniových iontů ve vodném roztoku kyseliny
octové o pH = 2,87.
Vypočítejte látkovou koncentraci kyseliny kyanovodíkové ve vodném roztoku
o pH = 5,2.
Jakou hodnotu pKA má kyselina mléčná, kdyţ její vodný roztok o látkové koncentraci
10 mmol/l má pH = 2,93?
Jaká je látková koncentrace hydroxidových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové
o látkové koncentraci 0,025 mol/l?
Jaká je látková koncentrace hydroxoniových iontů ve vodném roztoku pyridinu
o látkové koncentraci 100 mmol/l?
Vypočítejte pH vodného roztoku dusičnanu amonného o látkové koncentraci 0,05
mol/l.
Jaká je látková koncentrace kyanidu draselného ve vodném roztoku o pH = 11,35?
Jaké pH bude mít roztok kyseliny mléčné, který získáte tak, ţe 20x zředíte 10 ml
vodného roztoku kyseliny mléčné o látkové koncentraci 100 mmo/l? Kolik ml vody
přidáte?
Vypočítejte pH roztoku, který obsahuje 25 mmol kyseliny octové a 0,075 mol octanu
sodného.
V jakém poměru byly smíchány sloţky acetátového pufru, kdyţ hodnota jeho pH je
5,00?
Vypočítejte pH roztoku, který vznikne smícháním 500 ml roztoku dihydrogencitrátu
sodného a 250 ml roztoku kyseliny citrónové stejné látkové koncentrace.
Vypočítejte pH fosforečnanového pufru, který byl připraven smícháním 100 m1
roztoku hydrogenfosforečnanu draselného (c = 0,05 mol/l) a l00 ml roztoku
dihydrogenfosforečnanu sodného (c = 0,025 mol/l). Jaká je látková koncentrace tohoto
pufru?
Kolik g dihydrogencitrátu draselného pouţijete pro přípravu 100 ml roztoku, který
smícháním se 100 ml roztoku kyseliny citrónové o látkové koncentraci 0,1 mol/l
poskytne pufr o pH = 1,94?. Jaká bude látková koncentrace tohoto pufru po přidání
800 ml vody? Jaké pH bude mít takto získaný roztok?
26
16. Jaká bude látková koncentrace roztoku hydrogenfosforečnanu sodného a látková
koncentrace roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného, kdyţ smícháním 500 ml obou
roztoků získáme pufr o pH = 7,12, jehoţ osmolarita je stejná jako osmolarita
fyziologického roztoku chloridu sodného (c = 150 µmol/l)?
17. Jaké pH bude mít roztok připravený smícháním 150 ml roztoku kyseliny octové
o látkové koncentraci c = 0,2 mol/l a 100 ml roztoku hydroxidu sodného o hmotnostní
koncentraci 8 g/l?
18. O kolik jednotek se změní pH acetátového pufru (c = 0,4 mol/l, poměr látkových
koncentrací acetátu a kyseliny octové je 4:1), jestliţe k 50 m1 pufru přidáte 10 m1
roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 0,4 mol/l)? O kolik jednotek se změní pH, jestliţe
totéţ mnoţství roztoku kyseliny chlorovodíkové přidáte k 50 ml vody?
19. Kolik ml roztoku NaOH o látkové koncentraci 0,2 mol/l musíte přidat k 500 ml
fosforečnanového pufru (c = 180 mmol/l) o pH = 7,42, aby se jeho pH změnilo o 0,4?
Jaká bude koncentrace vzniklého pufru? O kolik jednotek se změní pH, jestliţe totéţ
mnoţství roztoku NaOH přidáte k 500 ml vody?
Dodatky:
Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127
Hodnoty pKA (25 °C) vybraných kyselin:
H2CO3 = 6,52,
NH = 9.25
C6H5OH = 9,89
HCOOH = 3,75
H2PO =7,12
HCN = 9,40
CH3COOH = 4,75
HPO = 12,32
k. citrónová = 2,94
Hodnoty pKB (25° C) vybraných bází:
NH3 = 4,75
C6H5NH2 = 9,38
CH3COOˉ = 9.25
C5H5N = 8,82
HPO = 6,88
CNˉ = 4 ,60
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
a) 3,68, b) 3,18, c) 4,72, d) 2,55, e) 5,45
a) 9,97, b) 10.97, c) 8,31, d) 8,87
0,00135 mol/l
0,1 mol/l
3,86
1,5.10-11 mol/l
8,13.10-10 mol/l
5,28
0,2 mol/l
pH = 3,08, 190 ml
5,23
1,78
3,24
pH = 7,42, 0,0375 mol/l
0,23 g, 0,011 mol/l, pH =1,94
120 mmol/l
5,05
27
18. o 0,42 jednotek (pH1 = 5,35, pH2 = 4,93), o 5,83 jednotek (pH = 1,17)
19. 75 m1, 0,157 mol/l, o 5,41 jednotek
Poznámky:
28
STECHIOMETRICKÉ VÝPOČTY, IONTOVÝ ZÁPIS CHEMICKÝCH
ROVNIC, IONTOVÉ ROVNICE
Klíčová slova: stechiometrie, iontový zápis, iontová rovnice, součin rozpustnosti,
disociace solí, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách.
Chemická rovnice:
Iontový zápis:
Iontová rovnice:
AgNO3 + NaCl
Ag+ +NO + Na+ + Clˉ
Ag+ + Clˉ
AgCl + NaNO3
AgCl + Na+ + NO
AgCl
Příklady na procvičování (chemické rovnice vyjadřujte iontovým zápisem):
1. Smrtelná dávka kyanidu draselného pro člověka je 200 mg. Kolik m1 kyanovodíku se
uvolní z tohoto mnoţství působením kyseliny chlorovodíkové v ţaludku?
2. Kolik mg oxalátu amonného potřebujete k vysráţení Ca2+ z 2 ml roztoku o látkové
koncentraci Ca2+ c=0.01 mol/l?
3. Maximální hodnota přípustné koncentrace dusitanů ve vodě je v České republice 0,1
mg/l. Kolik mmolů kyseliny dusité se uvolní z 0,1 mg dusitanu sodného reakcí s
kyselinou chlorovodíkovou?
4. Jakou hmotnostní koncentraci má roztok jodidu ţeleznatého, kdyţ při titraci 10 ml
tohoto roztoku bylo spotřebováno 5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o látkové
koncentraci c=0,4 mol/l?
5. Při titraci 10 ml acetátového pufru o pH 5,75 bylo spotřebováno 40 ml kyseliny
chlorovodíkové (c = 0,25 mol/l). Jaká sloţka pufru se touto titrací stanoví? Jaká je její
koncentrace? Jaká je koncentrace pufru?
6. Koncentrace roztoku hydrogenuhličitanu se stanovuje zpětnou titrací nezreagované
kyseliny chlorovodíkové přidané v nadbytku. Jaká bude teoretická spotřeba roztoku
hydroxidu sodného (c = 0,4 g/l) pouţitého při zpětné titraci nezreagované kyseliny
chloorovodikové, kdyţ k 1 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného (c = 24 mmol/l
bylo přidáno 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 10 mmol)?
7. Vypočítejte o kolik jednotek se změní pH roztoku z původní hodnoty pH = 3, kdyţ
bylo do tohoto roztoku přidáno takové mnoţství amoniaku, ţe koncentrace vzniklého
NH 4 byla 0,0009 mol/l.
8. Kolik mmolů vápenatých kationtů se uvolní ze 64 mg oxalátu vápenatého po přidání
20 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,1 mol/l)?
9. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní z 84 mg hydrogenuhličitanu sodného reakcí
s 500 ml kyseliny chlorovodíkové o pH = 2?
10. Tableta Superpyrinu obsahuje 400 mg acetylsalicylátu hlinitého. Vypočítejte, kolik
mmolů kationtů hlinitých se uvolní v ţaludku při podání tří tablet Superpyrinu.
11. Jakou osmolaritu bude mít roztok, který vznikne smícháním 10 ml roztoku rhodanidu
(thiokyanátu) draselného o osmolaritě 200 mmol osmoticky aktivních částic/l a 10 ml
29
roztoku chloridu ţelezitého o osmolaritě 400 mmol osmoticky aktivních částic/l?
Jedním z produktů je chlorid thiokyanátoţelezitý.
12. K 100 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l
přidáte 25 ml roztoku hydroxidu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l.
Vypočítejte hodnoty následujících veličin ve výsledném roztoku:
a) látková koncentrace dihydrogenfosforečnanu sodného
b) látková koncentrace hydrogenfosforečnanu sodného
c) látková koncentrace kationtů sodných
d) osmolarita
e) pH
Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Al = 27 Na = 23 K = 39 Mg = 24
I = 127
Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
68,9 ml
2,48 mg
0,0015 mmol
31 g/l
acetát, 1 mol/l, 1,1 mol/l
2,6 ml
1 jednotku
0,5 mmol
22,4 ml
2,13 mmol
250 mosmol/l
0,06 mol/l, 0,02 mol/l, 0,1 mol/l, 0,18 osmol/l, 6,64
Poznámky:
30
VLASTNOSTI A REAKCE BIOLOGICKY A TOXIKOLOGICKY
VÝZNAMNÝCH PRVKŮ A JEJICH SLOUČENIN
Klíčová slova: periodický systém, toxicita prvků a jejich sloučenin, disociace, kationty,
anionty, oxidační číslo, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách a zásadách,
součin rozpustnosti, iontový zápis, iontová rovnice, názvosloví, kvalitativní analýza,
skupinová činidla.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
zředěná kyselina chlorovodíková 1:1
nasycený vodný roztok sulfanu !JED!
nasycený vodný roztok sulfidu amonného
roztok uhličitanu amonného 1 mol/l)
roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l
roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/l !JED!
zředěná kyselina dusičná 1:1
zředěná kyselina sírová 1:1
koncentrovaný vodný roztok amoniaku
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŢÍRAVINA!
roztok chromanu draselného 0,25 mol/l
roztok jodidu draselného 0,5 mol/l
roztok chloridu amonného 1 mol/l
roztok ferrikyanidu draselného 0,01 mol/l
roztok thiokyanatanu draselného 0,3 mol/l
roztok hydrogenfosforečnanu sodného 0,3 mol/l
roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve
100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/1)
roztok difenylaminu v kyselině sírové 0,06 mol/l
roztoky vzorků obsahující zkoumané kationty
roztoky vzorků obsahující zkoumané anionty
roztoky vzorků neznámých sloučenin
31
Kvalitativní analýza:
Uvedený postup kvalitativní analýzy je vhodný pro poznání vlastností biologicky a
toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin. Zahrnuje pouze reakce, které jsou
potřebné k důkazu vybraných kationtů a aniontů.
Vybrané kationty:
Ag+, Pb2+, Hg 22 , Hg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+, K+, NH 4
Vybrané anionty:
HCO 3 , CO 32 , PO 34 , Cl‾, I‾, SO 24 , NO 3
Kationty a anionty jsou rozděleny do skupin podle reakce s vhodně zvolenou látkou skupinovým činidlem. Toto činidlo tvoří sraţeniny vţdy jen s ionty příslušné skupiny.
Jednotlivé kationty a anionty ve skupinách se pak dokazují speciálními reakcemi.
Základní pravidla pro rozpustnost solí ve vodě:
Rozpustné sole:
a) obsahují anionty NO 3 , Cl‾ (mimo Ag+, Pb2+, Hg 22 ), SO 24 (mimo Ba2+, Pb2+).
b) obsahuji kationty Na+, K+, NH 4 .
Nerozpustné sole:
obsahuji anionty S2‾, CO 32 , HPO 24 a PO 34 (mimo Na+, K+, NH 4 ).
Sloučeniny obsahující hydrogenanionty jsou rozpustnější.
Sole slabých kyselin jsou rozpustné v roztocích silnějších kyselin, uvolní se původní slabá
kyselina.
Sole slabých bází jsou rozpustné v roztocích silnějších bází, uvolní se původní slabá báze.
POZOR! Pro jednotlivé reakce pouţívejte maximálně 1 ml roztoku vzorků i činidel. Protoţe
jde pouze o kvalitativní reakce, není třeba objemy roztoků odměřovat!
32
ÚLOHA 1.
Důkaz vybraných kationtů
K uvedeným reakcím pouţijte připravené roztoky, které obsahují příslušný kation. Ke
kaţdé reakci pouţijte nový roztok vzorku.
1.1. Kationty: Ag+, Pb2+, Hg 22
Skupinové činidlo je zředěná HCl. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné.
Také sulfidy těchto kationtů jsou nerozpustné ve vodě a nerozpouštějí se ani ve zředěných
silných kyselinách, protoţe jejich součiny rozpustnosti jsou extrémně nízké:
AgCl = 1,8.10-10
PbCl2 = 1,7.10-5
Hg2Cl2 = 1,3.10-18
Ks:
Ag2S = 2,5.10-50
PbS = 2,5.10-27
Hg2S ~ 10-45
Ag2CrO4 = 1,1.10-12
Pracovní postup:
Ag+:
Ag+ + HCl
2 Ag+ + K2CrO4
AgCl + H+
bílá sraţenina rozpustná v NH3
[Ag(NH3)2]+
Ag2CrO4 + 2 K+
červenohnědá sraţenina
Pb2+:
Pb2+ + 2 HCl
Pb2+ + K2CrO4
PbCl2 + 2 H+
bílá sraţenina rozpustná v horké vodě
PbCrO4 + 2 K+
ţlutá sraţenina
Hg 22 :
Hg 22 + 2 HCl
Hg2Cl2 + 2 H+
bílá sraţenina, reakcí s NH3 černá vyloučeným Hg2O
33
1.2. Kationty: Hg2+, Cu2+
Skupinové činidlo je H2S. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě rozpustné. Sulfidy jsou
nerozpustné ve vodě i ve zředěných silných kyselinách, protoţe součiny rozpustnosti těchto
sulfidů mají extrémně nízké hodnoty:
CuS = 8,5.10‾45
Ks:
HgS = 1,6.10‾52:
Pracovní postup:
POZOR! Před přidáváním roztoku H2S vzorek okyselte několika kapkami zředěné HCl.
Hg2+:
Hg2+ + H2S
HgS + 2 H+
černá sraţenina nerozpustná v kyselinách
Hg2+ + 2 KI
HgI2 + 2 K+
oranţovočervená sraţenina
rozpustná v přebytku KI
K2[HgI4]
Cu2+:
Cu2+ + H2S
CuS + 2 H+
hnědočerná sraţenina nerozpustná v kyselinách
Cu2+ + 2 NaOH
Cu(OH)2 + 2 Na+
bleděmodrá sraţenina
[Cu(NH3)4]2+
rozpustná
v
NH3
1.3. Kationty: Zn2+, Fe2+, Fe3+
Skupinovým činidlem je (NH4)2S. Vzniklé sulfidy jsou ve vodě nerozpustné, ve
zředěných silných kyselinách jsou však rozpustné, protoţe hodnoty jejich součinů
rozpustnosti jsou vyšší:
ZnS = 6,9.10‾26
Ks:
FeS = 3,7.10‾19
Pracovní postup:
POZOR! Před reakcí s (NH4)2S zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku. V případě
kyselé reakce vzorek neutralizujte roztokem NH3 a průběţně kontrolujte pH (pH nesmí být
alkalické). K neutrálnímu roztoku vzorku přidejte 1 ml roztoku NH4Cl.
Zn2+:
Zn2+ + (NH4)2S
ZnS + 2 NH 4
bílá sraţenina rozpustná v kyselinách
34
Fe2+:
Fe2+ + (NH4)2S
FeS + 2 NH 4
černá sraţenina rozpustná v kyselinách
Fe2+ + 2 NaOH
Fe(OH)2 + 2 Na+
bílá sraţenina, barví se modrozeleně a
hnědne oxidací na Fe(OH)3
Fe2+ + K3[Fe(CN)6]
"berlínská modř"
2 Fe3+ + 3 (NH4)2S
2 FeS + S + 6 NH 4
černá sraţenina rozpustná v kyselinách
Fe3+ + 3 NaOH
Fe(OH)3 + 3 Na+
hnědá sraţenina
Fe3+ + KCNS
[Fe(CNS)]2+ + K+
červený komplex
Fe3+:
1.4. Kationty: Ca2+, Ba2+
Skupinovým činidlem je (NH4)2CO3. Uhličitany těchto kationtů jsou ve vodě
nerozpustné, ale rozpouštějí se ve zředěných roztocích silných kyselin. Sulfidy jsou ve vodě
rozpustné.
Tyto prvky mají schopnost jiţ v nepatrném mnoţství barvit nesvítivý plamen, jsou-li do
něj vneseny ve formě těkavých sloučenin. Na tomto principu je zaloţena plamenová
fotometrie, umoţňující rychlé stanovení některých prvků.
Pracovní postup:
POZOR! Před reakcí s (NH4)3CO3 zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku.
V případě kyselé reakce vzorek neutralizujte roztokem NH3 a průběţně kontrolujte pH (pH
nesmí být alkalické). K neutrálnímu roztoku vzorku přidejte 1 ml roztoku NH4Cl.
Reakce v plameni:
– Do zkumavky odlijte malé mnoţství zředěné HCl, ponořte do ní platinový drátek a
vyţíhejte jej v nesvítivém plameni. Tento postup několikrát zopakujte, aby samotný
drátek plamen nebarvil.
– Po ochlazení namočte drátek do zkoušeného roztoku, vneste jej do plamene a
pozorujte jeho zbarvení.
Ca2+:
Kation vápenatý barví plamen oranţově.
Ca2+ + (NH4)2CO3
CaCO3 + 2 NH 4
bílá sraţenina rozpustná v zředěných kyselinách
Ca2+ + Na2HPO4
CaHPO4 + 2 Na+
bílá sraţenina rozpustná v zředěných kyselinách
35
Ba2+:
Kation barnatý barvi plamen světle zeleně.
Ba2+ + (NH4)2CO3
BaCO3 + 2 NH 4
bílá sraţenina rozpustná v zředěných kyselinách
Ba2+ + H2SO4
BaSO4 + 2H+
bílá sraţenina nerozpustná v zředěných kyselinách
1.5. Kationty: Mg2+, Na+, K+, NH 4
Pro tyto kationty není ţádné skupinové činidlo, jednotlivé kationty se dokazují
specifickými reakcemi.
Pracovní postup:
Mg2+:
K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte nejprve 1 ml roztoku NH4Cl, aby se nesráţel
hydroxid hořečnatý.
Mg2+ + Na2HPO4 + NH3
MgNH4PO4 + 2 Na+
bílá sraţenina
Na+:
Kation sodný barví plamen ţlutě.
K+:
Katíon draselný barví plamen fialově (zbarveni je výraznější při pozorování přes
kobaltové sklo).
NH 4 :
NH 4 + NaOH
NH3 + Na+ + H2O
navlhčený universální indikátorový papírek zmodrá
(papírek drţte pouze nad zkumavkou)
Poznámky:
36
ÚLOHA 2.
Důkaz vybraných aniontů
K uvedeným reakcím pouţijte připravené roztoky, které obsahují příslušný anion.
Reakce jednotlivých aniontů porovnejte s analogickými reakcemi pouţívanými pro důkaz
kationtů v úloze 1.
2.1. Anionty: HCO 3 , CO 32 , PO 34
Skupinovým činidlem je Ba(NO3)2, který poskytuje s uvedenými anionty sraţeniny,
rozpustné ve zředěných silných kyselinách.
Pracovní postup:
HCO 3 :
Roztok reaguje slabě alkalicky, pKB(HCO 3 ) = 7,48.
2 HCO 3 + Ba(NO3)2
Ba(HCO3)2 + 2NO 3
nestálý, přechází na BaCO3
bílá sraţenina rozpustná ve zředěných kyselinách
(uniká CO2)
CO 32 :
Roztok reaguje alkalicky, pKB(CO 32 ) = 3,6.
CO 32 + Ba(NO3)2
BaCO3 + 2 NO 3
bílá sraţenina rozpustná ve zředěných kyselinách
(uniká CO2)
2 PO 34 + 3 Ba(NO3)2
Ba3(PO4)2 + 6 NO 3
bílá sraţenina rozpustná ve zředěných kyselinách
PO 34 + (NH4)2MoO4
po zahřátí vznikne ţlutá sraţenina fosfomolybdenanu
amonného
PO 34
37
2.2. Anionty: Cl‾, I‾
Anionty této skupiny tvoří sraţeninu s AgNO3, vzniklá sraţenina je nerozpustná
ve zředěných kyselinách.
Pracovní postup:
Cl‾:
Cl‾ + AgNO3
I‾ + AgNO3
AgCl + NO 3
bílá sraţenina rozpustná v NH3
nerozpustná ve zředěných kyselinách
[Ag(NH3)2]+
AgI + NO 3
ţlutá sraţenina nerozpustná v NH3 a nerozpustná ve
zředěných kyselinách
2.3. Anion SO 24 :
Tento anion tvoří sraţeninu s Ba(NO3)2, vzniklá sraţenina je nerozpustná ve
zředěných kyselinách.
Pracovní postup:
SO 24 :
SO 24 + Ba(NO3)2
BaSO4 + 2 NO 3
bílá sraţenina nerozpustná ve zředěných kyselinách
2.4. Anion NO 3
Tento anion netvoří sraţeninu ani s Ba(NO3)2 ani s AgNO 3 .
Pracovní postup:
NO 3 :
K několika kapkám roztoku vzorku přidejte několik kapek roztoku difenylaminu
v kyselině sírové. Objeví se tmavěmodré zbarvení.
Poznámky:
38
ÚLOHA 3.
Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny.
V roztoku neznámé anorganické sloučeniny dokaţte kation a anion. Podle postupu
uvedeného v úloze 3.1. a 3.2. nejdříve zjistěte, do jaké skupiny kationtů nebo aniontů patří
ionty analyzované sloučeniny. Příslušný kation a anion potom dokaţte speciálními reakcemi
uvedenými v úloze 1. a 2. (pouţijte vţdy nový roztok vzorku!). Nezapomeňte na zjištění
pH analyzovaného roztoku - tato informace vám pomůţe při identifikaci neznámé
sloučeniny!
3.1. Analýza kationtů - zařazení do skupiny
Pracovní postup:
1 ml vzorku + HCl
sraţenina
Hg 22 , Pb2+, Ag+
roztok
Hg2+, Cu2+
Zn2+, Fe2+, Fe3+
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
+ H2S v nadbytku
sraţenina
Hg2+, Cu2+
roztok
Zn2+, Fe2+, Fe3+
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
39
1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3
+ NH4Cl + (NH4)2S
sraţenina
Zn2+, Fe2+, Fe3+
roztok
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3
+ NH4Cl + (NH4)2CO3
sraţenina
Ca2+, Ba2+
roztok
Mg2+, Na+, K+, NH 4
– Po zařazení kationtu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi
uvedenými v úloze 1.
40
3.2. Analýza aniontů - zařazení do skupiny
Pracovní postup:
1 ml vzorku + Ba(NO3)2
sraţenina
roztok
PO 34 HCO 3 , CO3‾, SO 24
Cl‾. I‾, NO 3
+ HNO3
+ AgNO3
sraţenina
roztok
PO 34
SO 24
sraţenina
roztok
C1‾, I‾
NO 3
únik CO2
– Po zařazeni aniontu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými
v úloze 2.
– Výsledek analýzy vzorku neznámé sloučeniny zapište do tabulky:
vzorek č.
pH
vzorec
název
Poznámky:
41
VLASTNOSTI A REAKCE FUNKČNÍCH SKUPIN BIOCHEMICKY
VÝZNAMNÝCH ORGANICKÝCH SLOUČENIN
Klíčová slova: hydroxysloučeniny, oxosloučeniny, alkoholy, aldehydy, ketony, oxidace
alkoholů, adiční reakce oxoskupiny, kyseliny, báze, fenoly, aminy, karboxylové kyseliny, soli,
estery, amidy, komplexní sloučeniny.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
methanol !JED!
ethanol
4% roztok formaldehydu
kyselina salicylová
kyselina šťavelová
70% roztok fenolu
močovina
dichroman draselný
koncentrovaná kyselina sírová !ŢÍRAVINA!
Schiffovo činidlo (roztok fialového barviva fuchsinu odbarveného hydrogensiřičitanem
sodným)
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŢÍRAVINA!
koncentrovaný roztok amoniaku
zředěná kyselina chlorovodíková 1:1
roztok chloridu vápenatého 0,1 mol/l
roztok chloridu ţelezitého 0,05 mol/l
roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l
42
ÚLOHA 1.
Oxidace alkoholů a aldehydů
Primární alkoholy se oxidují na karbonylové sloučeniny – aldehydy. V praxi se této
reakce vyuţívalo např. při detekci ethanolu v dechu (oranţový dichroman draselný
v prostředí kyseliny sírové se v přítomnosti alkoholu redukuje na zelený síran chromitý,
zatímco ethanol se oxiduje na acetaldehyd). K průkazu aldehydů lze dále pouţít tzv.
Schiffova činidla (úloha 1.). Toto činidlo poskytuje reakcí s aldehydy barevnou sloučeninu
za vzniku tzv. Schiffovy báze (aldiminu) (úloha 5.).
Aldehydová skupina je přítomna v celém spektru biologicky významných
organických molekul (sacharidy). K jejímu funkčnímu průkazu se pouţívá zpravidla tzv.
Fehlingovy zkoušky. Vinan měďnatý v alkalickém roztoku reaguje s aldehydem za vzniku
příslušné kyseliny, oxidu měďného a vinanu sodného (úloha 1.2.). Fehlingovo činidlo se
připravuje vţdy těsně před pouţitím smícháním roztoků Fehling I (síran měďnatý) a Fehling
II (hydroxid sodný a vínan sodnodraselný) v poměru 1:1.
43
1.1. Reakce aldehydů se Schiffovým činidlem
Pracovní postup:
– Reakci proveďte s methylalkoholem i ethylalkoholem.
– Do zkumavky dejte malé mnoţství dichromanu draselného a velice opatrně přidejte
plastikovým kapátkem 5 kapek koncentrované kyseliny sírové.
– Přilijte 1 ml alkoholu a opatrně promíchejte,
– Zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni.
– Na ústřiţek filtračního papíru kápněte 1 kapku Schiffova činidla.
– Nad ústím zkumavky přidrţujte filtrační papír se Schiffovým činidlem, které se
vznikajícím aldehydem barví červenofialově.
– Zapište chemickými rovnicemi oxidaci methanolu a ethanolu:
a)
b)
Poznámky:
44
1.2. Příprava a redukce Fehlingova činidla
.
Kyselina vinná, alifatická hydroxykyselina, tvoří velmi snadno komplexy s ionty kovů.
Nerozpustný hydroxid mědnatý přejde po přidání kyseliny vinné do roztoku, protoţe
vznikající komplexní sloučenina zabrání reakci Cu2+ s hydroxidovými anionty.
Komplexně vázaný Cu2+ se snadno redukuje na Cu+, který jiţ komplexní ion netvoří.
Aldehydy, které se velmi snadno oxidují, vyredukují z tohoto roztoku nerozpustný červený
oxid měďný. Tato reakce je principem tzv. Fehlingova činidla.
Pracovní postup:
– V jedné zkumavce si připravte asi 2 ml vodného roztoku kyseliny vinné.
– Ve druhé zkumavce smíchejte 1 ml síranu měďnatého s 1 ml roztoku hydroxidu
sodného. Vznikne modrá sraţenina hydroxidu mědnatého.
– Potom přikapávejte roztok kyseliny vinné, dokud se sraţenina nerozpustí.
Pozn. Vzhledem k nestabilitě vzniklého komplexu se Fehlingovo činidlo připravuje krátce
před použitím a to smícháním roztoků Fehling I (roztok síranu měďnatého 70g/l) a Fehling II
(250g hydroxidu sodného a 350g vinanu sodnodraselného v 1 litru vody) v poměru 1:1 a
důsledně se směs protřepe.
– Přidejte 2 kapky formaldehydu a krátce zahřejte ve vroucí vodní lázni.
– V přítomnosti aldehydu dojde k vyredukování červeného oxidu měďného.
Poznámky:
45
ÚLOHA 2.
Rozpustnost organických kyselin a jejich solí
2.1. Kyselina salicylová
Kyselina salicylová (prekurzor pro výrobu kys. acetylsalicylové) je špatně rozpustná
ve vodě, zatímco její sodná sůl se ve vodě rozpouští poměrně dobře.
Pracovní postup:
– Do zkumavky dejte několik krystalů kyseliny salicylové, přidejte asi 1 ml vody a
protřepejte. Část látky zůstane nerozpuštěna.
– Přidejte asi 2 ml roztoku hydroxidu sodného. Vzniklá sodná sůl je ve vodě rozpustná.
– Reakci zapište formou iontového zápisu:
Poznámky:
46
2.2. Kyselina šťavelová
Ze solí kyseliny šťavelové je významný oxalát vápenatý, který je nerozpustný ve vodě,
ale rozpouští se ve zředěných silných kyselinách. Tvorba nerozpustného oxalátu vápenatého
je příčinou toxicity kyseliny šťavelové. Oxalát (šťavelan) vápenatý se můţe vyskytovat
v moči, kde tvoří snadno močové kameny.
Pracovní postup:
– Ve zkumavce rozpusťte ve vodě několik krystalů kyseliny šťavelové.
– Vzniklý roztok zalkalizujte koncentrovaným roztokem amoniaku (pouţijte
plastikovou pipeptku). Zkontrolujte indikátorovým papírem pH (a).
– Přidávejte po kapkách roztok chloridu vápenatého a pozorujte vznik bílé sraţeniny (b).
– Sraţeninu oxalátu vápenatého rozpusťte přidáním zředěné kyseliny chlorovodíkové,
reakce probíhá kolem pH = 5 (c).
– Všechny tři reakce označené a), b), c), vyjádřete formou iontového zápisu:
a)
b)
c)
Poznámky:
47
ÚLOHA 3.
Tvorba komplexních sloučenin
Reakce s chloridem ţelezitým
Roztoky aromatických hydroxysloučenin poskytují s roztokem chloridu ţelezitého
charakteristické barevné reakce, způsobené tvorbou komplexních sloučenin. Fialově
zbarvený roztok, vzniklý reakcí fenolu s chloridem ţelezitým, se pod názvem Uffelmannovo
činidlo pouţíval k průkazu kyseliny mléčné, patologicky přítomné v ţaludeční šťávě.
Kyselina mléčná, stejně jako některé další alifatické hydroxykyseliny, tvoří snadno komplexy
s ionty kovů. Protoţe vazba Fe3+ s kyselinou mléčnou (chelátový ligand) je pevnější neţ jeho
vazba s fenolem, vytěsní kyselina mléčná fenol z jeho komplexu s chloridem ţelezitým.
Pracovní postup:
– Do zkumavky dejte 1 ml roztoku fenolu a přidejte 1–2 kapky roztoku chloridu
ţelezitého. Roztok se zbarví fialově (Uffelmannovo činidlo).
– Za míchání přikapávejte kyselinu mléčnou (pouţijte plastikové kapátko) do vymizení
fialového zbarvení (komplex kyseliny mléčné s Fe3+ je světle ţlutý).
– Analogicky jako s fenolem proveďte i reakci chloridu ţelezitého s kyselinou
salicylovou, kterou v tomto případě rozpusťte v 1 ml ethanolu. Vznikne
červenofialový roztok komplexní sole.
– Vysvětlete rozdíl ve zbarvení komplexů!
Poznámky:
48
ÚLOHA 4.
Močovina
4.1. Hydrolýza
Močovina (urea), látka velmi dobře rozpustná ve vodě, je diamid kyseliny uhličité. Proto
ji lze, jako jiné amidy, rozštěpit alkalickou hydrolýzou na amoniak a alkalickou sůl původní
kyseliny, v tomto případě uhličitan sodný.
Pracovní postup:
–
–
–
–
Ve zkumavce rozpusťte malé mnoţství močoviny v 1 ml vody.
Přidejte 2 ml roztoku hydroxidu sodného a protřepejte.
Reakční směs zahřívejte ve vroucí vodní lázni několik minut.
Přes ústí zkumavky poloţte navlhčený indikátorový papírek, který se unikajícím
amoniakem zbarví modře.
– Alkalickou hydrolýzu močoviny zapište chemickou rovnicí;
Poznámky:
49
AMINOKYSELINY
Klíčová slova: funkční skupiny kyselé a bazické, izoelektrický bod, tvorba komplexních
sloučenin, nitrace, oxidace, redukce, hydrolýza bílkovin, rozdělovací rovnováhy, adsorpce,
látky polární a nepolární, afinita.
Reagencie:
POZOR! Reagencie ad 1) - 6) jsou určeny pouze pro chromatografii!
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
roztok glycinu 0,005 mol/l (standard)
roztok argininu 0,005 mol/l (standard)
roztok methioninu 0,005 mol/l (standard)
roztok alaninu 0,005 mol/l (standard)
vzorek - směs aminokyselin
vyvíjecí směs: chloroform, methanol, vodný roztok amoniaku 6 mol/l
v poměru 3 : 3 :1
kyselina glutamová
roztok tyrosinu 1,25 mmol/l
roztok tryptofanu 1,25 mmol/l
roztok kaseinu 5 g/l
roztok kyselého hydrolyzátu kaseinu 5 g/1
roztok ţelatiny 5 g/l
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l, !ŢÍRAVINA!
zředěná kyselina chlorovodíková 1:1
roztok ninhydrinu v butanolu 2 g/l
Millonovo činidlo (40 g rtuti v 57 ml koncentrované kyselině dusičné, po zahřátí
zředěno 2 objemy vody), !JED!
koncentrovaná kyselina dusičná, !ŢÍRAVINA!
koncentrovaná kyselina sírová, !ŢÍRAVINA!
Ehrlichovo aldehydové činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/1 v kyselině
chlorovodíkové 200 g/1)
roztok cysteinu 0,008 mol/l v HCl 1 mol/l
roztok cystinu 0,004 mol/l v HCl 1 mol/l
nitroprussid sodný
koncentrovaný vodný roztok amoniaku
nasycený vodný roztok sulfanu
síran amonný
50
ÚLOHA 1.
Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě
Chromatografie je souhrnným označením pro separační metodiky pouţívané k dělení
směsi látek na základě jejich rozdílné afinity ke stacionární a mobilní fázi. Jednotlivé sloţky
směsi rozpuštěné v mobilní (pohyblivé) fázi jsou při průchodu přes stacionární
(zakotvenou) fázi v závislosti na svých fyzikálně-chemických vlastnostech v různé míře
„zbrzděny“ a dochází tak k jejich rozdělení. Mobilní fáze můţe být kapalina či plyn, zatímco
stacionární fáze je pevná látka (např. papír, Al2O3) nebo kapalina na pevném nosiči. Podle
druhu mobilní fáze se chromatografické metody dělí na dva základní typy: kapalinovou a
plynovou chromatografii.
Kapalinová chromatografie (LC; liquid chromatography):
K proudění mobilní fáze dochází za atmosférického tlaku, nízkého tlaku (FPLC; fast
protein liquid chromatography) nebo vysokého tlaku (HPLC; high-performance liquid
chromatography či high-pressure liquid chromatography), přičemţ se vzrůstajícím tlakem
roste rychlost separace směsi látek.
K rozdělení směsi na jednotlivé sloţky dochází podle charakteru stacionární a mobilní
fáze na základě:
1) velikosti separovaných částic (kapalinová vylučovací chromatografie, gelová filtrace).
Tento typ chromatografie je pouţíván k separaci syntetických nebo biologických polymerů
(proteinů, nukleových kyselin, polysacharidů). Stacionární fázi tvoří mikroskopické gelové
kuličky (agarosa, polyakrylamid, dextran) o definované porozitě, umístěné
v chromatografické koloně. Po nalití směsi látek do kolony pronikají do pórů stacionární fáze
pouze molekuly menší neţ je velikost pórů, čímţ se jejich průchod kolonou zdrţí. Frakce
jímané po průchodu kolonou tak obsahují látky s postupně klesající velikostí molekuly, tj.
kolonou nejrychleji prochází velké částice (srovnej s gelovou elektroforézou proteinů či
nukleových kyselin!).
2) náboje částic (iontoměničová či iontová chromatografie). Ionty (kationty, anionty) či
organické sloučeniny nesoucí elektrický náboj (proteiny, aminokyseliny, krátké
oligonukleotidy) jsou děleny na základě interakce s opačně nabitou stacionární fází.
Stacionární fáze je tvořena gelovými kuličkami (agarosa, celulosa) s kovalentně navázanými
funkčními skupinami nesoucími záporný (katex) či kladný (anex) náboj. Navázané sloţky
směsi mohou být následně ze stacionární fáze uvolněny např. promytím kolony roztokem
obsahujícím ionty se shodným nábojem jako izolovaná látka, čímţ dojde k jejímu vytěsnění.
V klinické praxi je ionexová chromatografie uţívána v diagnostice některých vrozených
poruch metabolismu např. k identifikaci aminokyselin.
3) hydrofobicity (chromatografie na reverzní fázi). Tento typ chromatografie slouţí k
izolaci hydrofobních látek nesených hydrofilní mobilní fází. Stacionární fázi tvoří organické
sloučeniny s alifatickým uhlíkovým řetězcem (C4-C18, s délkou řetězce narůstá jejich
hydrofobní charakter). Navázané hydrofobní součásti dělené směsi látek jsou následně
uvolněny promytím kolony organickým rozpouštědlem (methanol, acetonitril).
51
4) vazebné specifity (afinitní chromatografie). K separaci látek ze směsi dochází na
základě vysoce specifické interakce separované látky se stacionární fází. Příkladem této
interakce je např. vazba ligand – receptor, antigen – protilátka či enzym – substrát.
V klinické biochemii a toxikologii je široce uţívána HPLC díky své rychlosti (čas
separace méně neţ 1hodina), vysoké rozlišovací schopnosti, citlivosti (detekce pikomolárních
mnoţství látek) a moţnosti automatizace. Slouţí k detekci a stanovení hladiny např.:
1) léků (antiarytmikum amiodaron, psychofarmaka jako např. alprazolam, amitriptylin,
diazepam, zolpidem atd.)
2) metabolitů hromadících se při vrozených či získaných defektech metabolismu
(katecholaminy, homocystein, porfyriny, puriny, pyrimidiny atd.)
3) vitamínů (koenzym Q10, vitamín E, A či jeho prekurzor beta karoten).
4) glykovaného hemoglobinu (HbA1c, jeden ze základních parametrů pouţívaných
k hodnocení kompenzace pacientů s diabetes mellitus, viz Sacharidy II).
Plynová chromatografie (GC; gas chromatography):
Plynová chromatografie vyuţívá jako mobilní fázi plyn. Skleněná či kovová kolona,
ve které separace probíhá, je umístěna v termostatu. Stacionární fáze je tvořena
mikroskopickou vrstvou kapaliny nebo pevnou látkou a mobilní fáze tzv. nosným plynem
(např. helium nebo dusík). Vzorek (kapalina či plyn) se vstřikuje do nástřikového portu,
v případě kapalného vzorku musí být nástřikový port předehřátý na dostatečně vysokou
teplotu, aby byl vzorek ihned po vstříknutí převeden na plynnou fázi. Nosný plyn unáší
vzorek přes kolonu, kde dochází k dělení jednolitých sloţek na základě jejich fyzikálněchemických vlastností a rozdílné interakce se stacionární fází. Po průchodu kolonou jsou
jednotlivé sloţky vzorku detekovány na detektoru, který je připojen na počítač. Časový
průběh detekovaného signálu představuje chromatogram tvořený souborem vrcholů, z nichţ
v ideálním případě kaţdý odpovídá jedné sloţce směsi. V klinické biochemii a toxikologii je
GC samotná či v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (MS) vyuţívána k detekci a
kvantifikaci ethanolu a řady drog v tělních tekutinách.
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC; thin layer chromatography):
TLC představuje variantu kapalinové chromatografie, kde je stacionární fáze tvořena
tenkou vrstvou adsorbentu (silikagel, oxid hlinitý, celulosa) nanesenou na inertní destičku
(sklo, plastik, hliníková folie). Destička s nanesenými vzorky se umístí do chromatografické
vany s mobilní fází, která vzlíná po povrchu fáze stacionární. Nanesené vzorky se při
průchodu mobilní fáze v ní rozpustí a v závislosti na své polaritě/hydrofobicitě jsou s mobilní
fází unášeny. Pokud je stacionární fáze tvořena polárním silikagelem a mobilní fáze převáţně
nepolárními rozpouštědly, je hydrofobní vzorek unášen dále neţ vzorek polární, který je
poután k silikagelu větší silou. Po ukončení chromatografie jsou separované látky přímo
viditelné, pokud separujeme směs barevných sloučenin, či u fluoreskujících látek po osvícení
desky UV zářením, v ostatních případech lze vizualizovat jednotlivé skvrny postříkáním
destičky vhodným detekčním činidlem. Při separaci směsi aminokyselin je detekce prováděna
pomocí ninhydrinu, který reaguje s volnými aminoskupinami za vzniku tmavě modrého nebo
fialového zabarvení (Ruhemanova violeť). Identifikaci jednotlivých sloţek směsi lze
následně provést stanovením tzv. retenčního faktoru (Rf) a jeho srovnáním s Rf standardních
vzorků. Rf se vypočítá podle vzorce:
Rf = vzdálenost vzorku od startu / vzdálenost čelo start
(Rf =1 mají látky putující s čelem mobilní fáze, Rf =0 látky zůstávající na startu)
TLC je v klinické praxi uţívána k detekci a průkazu některých léčiv a především drog.
52
V této úloze budete pro dělení směsi aminokyselin pouţívat chromatografii na tenké
vrstvě (TLC). Adsorbentem (stacionární fázi) je v tomto případě silikagel na hliníkové folii
(destičky Silufol), mobilní fází je směs rozpouštědel, mající pH blízko pI dělených
aminokyselin. Jednotlivé aminokyseliny ve směsi budete po detekci identifikovat pomocí
standardních vzorků aminokyselin.
Pracovní postup:
a
b
a = vzdálenost středu skvrny od startu
Rf =
b = vzdálenost čela rozpouštědla od startu
1. Arg
2. Gly
3. vzorek (směs AMK)
4. Ala
5. Met
Na kratší straně destičky Silufol obyčejnou tuţkou lehce vyznačte start (asi 2 cm od
okraje destičky) a pět bodů (po stranách destičky ponechte 1 cm), na které budete
nanášet roztoky AMK (viz schéma).
Mikropipetkami naneste na příslušné body roztoky standardních AMK a vzorku
(opatrně, aby nedošlo k porušení tenké vrstvy!).
Destičku vloţte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází. Start musí být
nad hladinou kapaliny.
Vanu dobře přikryjte skleněným víkem.
Kdyţ čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1-2 cm od horního okraje,
chromatogram vyndejte z vany.
Čelo rozpouštědla označte tuţkou a chromatogram sušte nad ploténkou (stupeň 6).
POZOR! Nespálit!
Suchý chromatogram v digestoří detekujte postřikem roztokem ninhydrinu v butanolu
ze vzdálenosti asi 0,5 cm.
Chromatogram zahřívejte asi 3 min nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit!
Skvrny na chromatogramu odpovídající jednotlivým amininokyselinám obtáhněte
tuţkou.
Pomocí vypočítaných hodnot Rf standardů i vzorků idendfikujte jednotlivé AMK.
Vzorek č.: …. obsahoval tyto AMK:
Poznámky:
53
ÚLOHA 2.
Barevné reakce aminokyselin
Tyto reakce se pouţívají k důkazu aminokyselin. Velmi citlivá ninhydrinová reakce je
pro aminokyseliny obecná (s výjimkou prolinu) a vyuţívá se nejen k jejich důkazu (detekce
aminokyselin při chromatografii, viz úloha 1.), ale i k jejich fotometrickému stanovení.
Ostatní reakce jsou specifické pouze pro aminokyseliny určité struktury.
2.1. Ninhydrinová reakce
Kondenzací aminokyselin se dvěma molekulami ninhydrinu (hydrát indantrionu)
vzniká modrofialově zbarvený produkt.
Pracovní postup:
Připravte si vroucí vodní lázeň.
K 1 ml roztoku tyrosinu přidejte 0,5 ml roztoku ninhydrinu v butanolu, promíchejte.
Reakční směs zahřívejte asi 5 min ve vroucí vodní lázni. Po chvíli se objeví v horní
organické vrstvě růţové aţ modrofialové zbarvení.
Tutéţ reakci vyzkoušejte i s kyselým hydrolyzátem kaseinu.
54
Poznámky:
55
Následující reakce 2.2. 2.4, proveďte s tyrosinem, tryptofanem, kyselým
hydrolyzátem kaseinu (indolové jádro je v kyselém prostředí nestabilní!), kaseinem a
ţelatinou. Všechny výsledky provedených reakcí zapište do tabulky 1.
2.2. Reakce s koncentrovanou kyselinou dusičnou
Aromatické aminokyseliny poskytují reakcí s kyselinou dusičnou ţlutě zbarvené
nitrosloučeniny. Tyrosin a tryptofan se za těchto podmínek nitrují zvlášť snadno.
V alkalickém prostředí se zbarvení změní na oranţové, protoţe vznikne alkalická sůl
tautomerní formy nitrosloučeniny. Stejnou reakci poskytují i bílkoviny, obsahující tyto
aminokyseliny s aromatickým jádrem (xanthoproteinová reakce).
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml zkoumaného roztoku a z dávkovače přidejte 0,5 ml
koncentrované kyseliny dusičné.
Zahřívejte ve vroucí vodní lázni (případně vzniklá sraţenina se rozpustí) do vzniku
ţlutého zbarvení.
Zkumavku ochlaďte pod tekoucí vodou.
Opatrně přikapávejte plastikovou pipetkou roztok hydroxidu sodného aţ do vytvoření
oranţového zbarvení.
2.3. Reakce s Millonovým činidlem
Sloučeniny, obsahující v molekule hydroxyskupinu vázanou na aromatické jádro,
poskytují s Millonovým činidlem komplexní rtuťnatou sůl svých nitroderivátů .
Pracovní postup:
K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou 5 kapek Millonova činidla.
Vzniklou bílou sraţeninu zahřívejte ve vroucí vodní lázni do objevení červeného
zbarveni komplexní rtuťnaté soli.
56
2.4. Reakce s Ehrlichovým činidlem
K důkazu tryptofanu se vyuţívá kondenzační reakce indolového jádra s oxoskupinou
aldehydu, obsaţeného v Ehrlichově činidle. Produkty této reakce jsou v kyselém prostředí
fialové zbarveny.
Pracovní postup:
K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou několik kapek Ehrlichova
činidla a protřepejte.
Z dávkovače přidejte pomalu po stěně zkumavky 1 m1 koncentrované kyseliny
sírové. V pozitivním případě vznikne na rozhraní obou vrstev fialový prstenec lépe
viditelný proti bílému pozadí.
Tabulka 1.
AMK
HNO3
Millon
Ehrlich
tyrosin
tryptofan
hydrolyzát kaseinu
kasein
ţelatina
Poznámky:
57
ÚLOHA 3.
Reverzibilní redox systém cystein - cystin
Sloučeniny obsahující -SH skupinu tvoří v alkalickém prostředí s nitroprussidem sodným
(pentakyanonitrosylţelezitan sodný) červenofialově zbarvenou komplexní sloučeninu.
Pracovní postup:
Ve zkumavce si připravte asi 3 ml roztoku nitroprussidu sodného rozpuštěním velmi
malého mnoţství látky ve vodě.
Dále si připravte tři zkumavky.
Do první zkumavky odlijte 1 ml vodného roztoku sulfanu.
Do druhé zkumavky odlijte 1 ml roztoku cysteinu.
Do třetí zkumavky odlijte 1 ml roztoku cystinu.
Do všech třech zkumavek přidejte 1 ml roztoku nitroprussidu sodného.
Za míchání roztok nasyťte síranem amonným.
Roztoky ve všech třech zkumavkách pomalu alkalizujte amoniakem a pozorujte vznik
barevné komplexní sloučeniny.
Asi po 5 min porovnejte zbarvení ve všech třech zkumavkách a výsledky
zaznamenejte do tabulky 2.
Vysvětlete průběh jednotlivých reakcí.
Tabulka 2.
sloučenina
sulfan
cystein
cystin
zbarvení
Poznámky:
58
BÍLKOVINY I
Klíčová slova: biuret, peptidová vazba, koloidní roztok, izoelektrický bod, amfionty,
amfolyty, amfotéry, vliv pH na ionizaci bílkovin, hydrofilní a hydrofobní skupiny, emulgace,
reverzibilní a irreverzibilní sráţení bílkovin.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
roztok kaseinu 10 g/1 ve fyziologickém roztoku
roztok vaječného bílku ve fyziologickém roztoku (1:10)
roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŢÍRAVINA!
slunečnicový olej
roztok octanu olovnatého 0,01 mol/l !JED!
roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l
koncentrovaná kyselina dusičná
roztok Ajatinu zředěný 1:4
roztok kyseliny octové 0,15 mol/l
roztok kyseliny octové 1,5 mol/l
chlorid sodný
fyziologický roztok (roztok chloridu sodného 0,15 mol/l)
krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem (1 : 1)
roztok močoviny 3 mol/l a laktátu lithného 0,2 mol/l
roztok dusičnanu stříbrného 0,06 mol/l
činidlo pro stanovení močoviny (kyselina sírová 0,9 mol/l + 1 tableta
diacetylmonoxinu 0,05 mmol/l do 50 ml vody)
70% roztok fenolu
roztok chloridu ţelezitého 0,05 mol/l
roztok hydrogenuhličitanu sodného 0.4 mol/l
roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/ !JED!
Molischovo činidlo (roztok 1-naftolu v ethanolu 3 g/l)
koncentrovaná kyselina sírová !ŢÍRAVINA!
koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŢÍRAVINA!
roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve
100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/l)
59
ÚLOHA 1.
Biuretová reakce
Biuret je látka vznikající tepelnou kondenzací dvou molekul močoviny za uvolnění
amoniaku a vzniku vazby –CO-NH-.
2 NH2–CO–NH2
NH2–CO–NH–CO–NH2 + NH3
Biuret, stejně jako ostatní sloučeniny, obsahující dvě nebo více peptidových
(amidových) vazeb, tvoří s ionty Cu2+ fialově zbarvenou komplexní sloučeninu (chelát).
Biuretová reakce se pouţívá k průkazu i kvantitativnímu stanovení látek ve kterých
jsou přítomné vazby –CO-NH-, tedy i bílkovin.
V alkalickém prostředí tvoří bílkoviny s měďnatými kationty komplexní sole, které
jsou fialově zbarveny. Volné elektronové páry pro tvorbu komplexu poskytují
elektronegatívní atomy peptidové vazby CO NH . Název reakce je odvozen od biuretu
POZOR! Při nadbytku Cu2+ je fialové zbarvení překryto modrou sraţeninou hydroxidu
mědnatého.
Pracovní postup:
Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok
protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.
Ke kaţdému roztoku bílkoviny přilijte 1 ml roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l.
Do obou zkumavek přidávejte po kapkách roztok síranu měďnatého aţ do vzniku
fialového zbarvení.
60
Poznámky:
61
ÚLOHA 2.
Emulgační schopnost bílkovin
Protoţe bílkoviny obsahují hydrofilní i hydrofobní skupiny, mají emulgační
schopnosti podobně jako jiné tenzidy. Tenzidy, které jsou součástí detergentů, sniţují
povrchové napětí na rozhraní hydrofilní a hydrofobní fáze. Jejich účinkem vzniká poměrně
stabilní emulze tuků ve vodě. Tato vlastnost bílkovin, především albuminu, se uplatňuje při
transportu hydrofobních látek krví (např. mastných kyselin, steroidních hormonů, bilirubínu).
Přirozenou emulzí tuků ve vodě je mléko, v němţ bílkoviny působí jako emulgátor.
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku bílku a 1 kapku slunečnicového oleje. Po
protřepání se vytvoří emulze.
Do druhé zkumavky odlijte 1 ml destilované vody a 1 kapku slunečnicového oleje. Po
protřepání se obě vrstvy opět oddělí.
Poznámky:
62
ÚLOHA 3.
Ireverzibilní srážení bílkovin
Denaturace je změna konformace nativní molekuly bílkoviny, která tím přechází na
méně uspořádanou formu a ztrácí svou biologickou funkci. Denaturačně působí všechny
vlivy, které porušují nekovaletní interakce vytvářející sekundární a terciární strukturu
bílkovin.
Mezi fyzikální vlivy patří především rozptýlení bílkoviny na velkém povrchu (pěněním
roztoků) a zvýšená teplota. Sráţení varem nastává nejrychleji v okolí pI bílkovin. K chemické
denaturaci dochází např. působením silných kyselin, které ruší iontové interakce změnou
náboje, naproti tomu organická rozpouštědla a tenzidy narušují nepolární interakce.
Primárním účinkem všech denaturačních činidel je rozvinutí peptidového řetězce, sníţení
solvatace molekuly a tím i rozpustnosti bílkoviny.
Sráţení bílkovin, při kterém dochází k denaturaci bílkovin, můţe být vyvoláno např. i
ionty těţkých kovů, které s bílkovinami vytvářejí sole nebo komplexní sloučeniny. Díky této
schopnosti se mohou bílkoviny pouţívat jako antidotum při otravách těţkými kovy.
Denaturace bílkovin koncentrovanou kyselinou dusičnou se vyuţívala jako Hellerova
zkouška pro důkaz bílkovin v moči. V současné době se pouţívá reakce s kyselinou
sulfosalicylovou, která je nejcitlivější. Podobný účinek na bílkoviny jako kyselina
sulfosalicylová mají i další silné organické kyseliny např. kyselina trichloroctová nebo
pikrová, které slouţí jako deproteinační činidla.
Denaturaci způsobují i kvartérní alkylamoniové sole, které vytvářejí s negativně
nabitými ionty bílkovin těţce rozpustné soli. Na tomto jevu jsou zaloţeny desinfekční účinky
Ajatinu (kvartérní amoniové sole s alkylem C8 C18 jako substituentem). Podobnou strukturu
a tedy i vlastnosti má i další desinfekční prostředek Septonex. Kationty těchto tenzidů se
adsorbují na buněčné stěny mikrobů, denaturují jejich ţivotné důleţité bílkoviny a tím blokují
transportní funkci membrány mikrobů.
Ajatin, Benzododecinií bromidum:
CH3
R N+ CH2C6H5 Brˉ
R = C8 C18
CH3
63
POZOR! V následujících úlohách pouţívejte jako bílkovinu roztok vaječného bílku.
3.1. Sráţení těţkými kovy
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok octanu
olovnatého dokud nevznikne sraţenina. V nadbytku soli se sraţenina rozpustí.
3.2. Sráţení kyselinami
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a přidejte několik kapek roztoku kyseliny
sulfosalicylové, vytvoří se bílá sraţenina.
Tutéţ reakci proveďte s koncentrovanou kyselinou dusičnou.
3.3. Sráţení Ajatinem
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok Ajatinu, dokud
nevznikne sraţenina.
3.4. Sráţení varem
Pracovní postup:
Do 5 zkumavek odlijte 1 ml bílkoviny a další reagencie dle návodu:
zkumavka 1 pouze bílkovina
zkumavka 2 přidejte kapku kyseliny octové 0,15 mol/l
zkumavka 3 přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l
zkumavka 4 přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l a malé mnoţství
chloridu sodného
zkumavka 5 přidejte několik kapek roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l
Zkumavky povařte ve vodní lázni.
Výsledky zapište do tabulky 1., vznik sraţeniny označte +.
Tabulka 1.
zkumavka
1
2
3
4
5
sraţenina
Poznámky:
64
ÚLOHA 4.
Důkaz některých složek bílkovin
4.1. Důkaz cukerné sloţky Molischovou zkouškou
Mnoho bílkovin (např. řada plazmatických bílkovin) patří mezi glykoproteiny. Jejich
prostetickou skupinu lze dokázat obecnou reakcí pro důkaz sacharidů - Molischovou
zkouškou. Reakce je zaloţena na dehydrataci sacharidů účinkem silných kyselin. Produkty
této dehydratace snadno kondenzuji s fenoly na barevné sloučeniny.
Pracovní postup:
Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku séra, přidejte přibliţně 0,5 ml Molischova činidla,
promíchejte.
Po stěně zkumavky pomalu přidejte z dávkovače 1 ml koncentrované kyseliny sírové,
aby došlo k podvrstvení roztoku. Na styčné ploše obou vrstev se v přítomnosti
sacharidů vytvoří fialový prstenec.
4.2. Důkaz kyseliny fosforečné ve fosfoproteinech
K důkazu lze pouţít reakci s molybdenanem amonným, která je vhodná k důkazu
anorganického fosfátu stejně jako pro důkaz kyseliny fosforečné ve fosfolipidech (viz
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha
2.1. )
Pracovní postup:
Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok
protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.
Ke kaţdé bílkovině přidejte z dávkovače 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové a
protřepejte.
Po 2 min přidejte do kaţdé zkumavky 1 ml roztoku molybdenanu amonného a
zahřívejte na vodní lázni asi 2 min. V přítomnosti fosfoproteinů vznikne ţlutý aţ
oranţový zákal, případně sraţenina. `
Poznámky:
65
ÚLOHA 5
Dialýza
Dialýza je proces, který umoţňuje pomocí polopropustné membrány oddělovat z roztoku
látky nízkomolekulární od látek vysokomolekulárních. Na jejím principu je zaloţena funkce
umělé ledviny, kdy krev protéká soustavou dialyzačních trubic omývaných roztokem o
specifickém sloţení iontů. Je samozřejmé, ţe ionty i ostatní nízkomolekulární látky mohou
membránou procházet oběma směry.
Schéma uspořádání:
Pracovní postup:
POZOR! Pro důkazy pouţívejte vţdy max. 1 ml roztoku!
Připravte si vroucí vodní lázeň pro důkaz dialyzovaných látek a fosforečnanů (viz
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin,
úloha 2.1)
Jeden konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na vnitřní okraj kádinky pro
dialýzu.
Ve zkumavce smíchejte 1 ml séra, 2 ml roztoku močoviny a laktátu, přidejte 9 ml
fyziologického roztoku.
7 ml takto připraveného roztoku vlijte do dialyzační trubice připevněné kolíčkem ke
kádince. Zbytek roztoku pouţijte k důkazu látek přítomných v roztoku před dialýzou.
Druhý konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na protilehlou stranu kádinky.
Do kádinky nalijte roztok hydrogenuhličitanu sodného tak, aby dialyzovaný roztok
byl ponořen ve vodě, dialýzu nechte probíhat 20 min.
Zbývající mnoţství původního roztoku rozdělte do pěti zkumavek.
66
V první zkumavce dokaţte přítomnost chloridových iontů reakcí s roztokem
dusičnanu stříbrného (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných
prvků a jejich sloučenin, úloha 2.2.).
Ve druhé zkumavce dokaţte přítomnost bílkovin reakcí s roztokem kyseliny
sulfosalicylové (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.).
Ve třetí zkumavce dokaţte přítomnost močoviny: k 1 ml roztoku přidejte 2 ml činidla
pro důkaz močoviny a zkumavku zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. Přítomnost
močoviny se projeví vznikem červeného zbarvení. Tato reakce se rovněţ pouţívá i ke
kvantitativnímu stanoveni močoviny v séru.
Ve čtvrté dokaţte, zda jsou přítomny hydrogenuhličitany reakcí s roztokem dusičnanu
barnatého (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a
jejich sloučenin, úloha 2.1.)
V páté zkumavce dokaţte přítomnost laktátu reakcí s Uffelmannovým činidlem:
k 1 ml roztoku fenolu přidejte 1 aţ 2 kapky chloridu ţelezitého (roztok se zbarví
fialově).
Stejnými reakcemi dokaţte přítomnost uvedených látek v dialyzátu i dialyzovaném
roztoku po dialýze.
Výsledky zapište do tabulky I.
Tabulka 1.
roztok
Clˉ
HCO 3
močovina
laktát
bílkoviny
dialyzovaný roztok před
dialýzou
dialyzát
dialyzovaný roztok po
dialýze
Poznámky:
67
BÍLKOVINY II
Klíčová slova: elektroforéza, izoelektrický bod, amfolyty, vliv pH na ionizaci bílkovin,
peptidová vazba, biuretová reakce, krevní plazma, krevní sérum, bílkoviny krevní plazmy,
hypoproteinemie, hyperproteinemie, onkotický tlak, transportní proteiny, reverzibilní a
irreverzibilní sráţení bílkovin, iontová síla.
Reagencie:
1. souprava Hydragel protein, SEBIA:
a) Tris-barbitalový pufr pH 8,5
b) barvící lázeň – roztok amidočerni
c) odbarvovací lázeň – roztok kys. citronové 0,05 g/l
2. standardní lyofilyzované bílkoviny pro ELFO ředěné fyziologickým roztokem dle
komerčního návodu
3. vzorky krevního séra
4. souprava Celkové bílkoviny, BioSystems:
a) biuretové činidlo:
síran mědnatý 0,015 mol/l
hydroxid sodný 1,0 mol/l
Chelaton IIl 0,018 mol/l
b) standardní roztok bílkoviny (koncentrace standardu podle aktuálního zadání)
5. souprava Albumin, Biosystems:
a) pracovní roztok pro stanovení albuminu:
bromkresolová zeleň 0,27 mmol/l
citrátový pufr 0,1 mol/l, pH 4,1
b) standardní roztok albuminu (koncentrace standardu podle aktuálního zadání)
6. krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem 1:1 (pro úlohu č. 4.)
7. nasycený roztok síranu amonného
8. síran amonný
9. roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l
10. souprava QuikRead CRP, Orion diagnostika
68
ÚLOHA 1.
Elektroforéza bílkovin
Elektroforéza je separační metoda umoţňující rozdělit ve stejnosměrném elektrickém
poli směs látek, které mají v roztoku elektrický náboj. Částice látek rozpuštěných v pufru
o určitém pH migrují v nosiči k elektrodě s opačným nábojem. Rozdělení směsi, dané
pohyblivostí částic, závisí na napětí mezi elektrodami, na typu nosiče, na velkosti částice a
jejím náboji závislým na pH pouţitého pufru (při fyziologickém pH existuje většina proteinů
ve formě aniontů). Pomoci připojeného densitometru lze odečíst po obarvení i mnoţství látky
v jednotlivých oddělených frakcích (viz Lipidy III, úloha 7.).
Elektroforéza má široké pouţití nejen ve vědeckém výzkumu, ale je nepostradatelnou
metodou i v klinicko-biochemických laboratořích.
V této úloze budete pouţívat pro elektroforézu bílkovin zařízení SEBIA. Proteiny jsou
děleny na agarosovém gelu v Tris-barbiturátovém pufru o pH 8,5. Elektroforeogram je
barven roztokem amidočerně.
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Úmístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část
s očíslovanými zuby (obr. A).
Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru.
Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem.
Opřete plotnu okrajem o zaráţku v dolní části vyznačeného rámečku – gelem k sobě.
Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem
bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B).
Sniţte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou
v horní poloze.
Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C).
Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat
během 2 min.
Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru.
Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D).
Pomalu sniţte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu.
Po 40 sec. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte.
Gelovou plochu vloţte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené
na gelu – dolní částí gelu na katodickou stranu. Při pouţití komory SEBIA K20 vloţte
plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm).
Připojte dělící komoru ke zdroji proudu.
PODMÍNKY DĚLENÍ
Objem pufru ke kaţdé elektrodě
Celkový objem pufru
Čas dělení
Konstantní napětí
Počáteční proud (na gel)
–
SEBIA K20
150 ml
300 ml
20 min
90 V
12 ± 3 mA
Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu.
69
–
–
–
Gel osušte v sušičce při 80° C asi 10 min.
Usušený gel ponořte do barvícího roztoku amidočerně na 4 min.
Odbarvěte ve 3 po sobě následujících lázních odbarvovacím roztokem (kys.
citronové), dokud není pozadí zcela bezbarvé.
– Odsajte přebytečnou tekutinu z gelu filtračním papírem a vysušte gel při 80° C.
– Vyhodnoťte gel denzitometrem při 570 nm.
70
ELEKTROFORÉZA PLAZMATICKÝCH BILKOVIN
Obr.4. Elektroforéza plazmatických bílkovin
FRAKCE
Albumin
Alfa-1 globuliny
Alfa-2 globuliny
Beta-1 globuliny
Beta-2 globuliny
Gama-globuliny
NORMÁLNÍ HODNOTY
59,4 – 74 %
1,2 – 3,1 %
7,0 – 12,2 %
4,9 – 9,4 %
1,6 – 5,6 %
6,9 – 14,7 %
Poznámky:
71
ÚLOHA 2.
Stanovení koncentrace bílkovin v séru
Krevní plazma obsahuje asi 100 různých proteinů, podle jejich elektroforetických
vlastností jsou obvykle rozdělovány do 5 různých skupin - albumin a 1, 2-, ß- a γglobuliny. Bílkoviny krevní plazmy kromě svých specifických funkcí zajišťují koloidně
osmotický (onkotický) tlak, který má význam pro udrţení normálního objemu krve. Dále se
podílejí na udrţování acidobazické rovnováhy a transportu lipofilních látek a iontů kovů.
Většina plazmatických bílkovin je syntetizována v játrech (mimo imunoglobuliny a
proteohormony). S výjimkou albuminu jsou bílkoviny krevní plazmy glykoproteiny.
Za fyziologického stavu jsou plazmatické proteiny ve vzájemné rovnováze a neustále se
obnovují. Za patologických stavů dochází k porušení této rovnováhy, a tím i ke změnám
jejich koncentrace a vzájemného zastoupení jednotlivých frakcí (dysproteinemie) (viz
úloha 1.). Koncentrace celkových bílkovin je sníţená (hypoproteinemie) při jejich nedostatku
v potravě, nedostatečném vstřebávání nebo syntéze, při jejich zvýšené spotřebě (např.
u dlouhodobých infekčních onemocněních nebo u nádorových procesů) nebo ztrátě (u
nefrotického syndromu, u popálenin, při silném krvácení). Zvýšená koncentrace bílkovin
(hyperproteinemie) bývá např. při dehydrataci nebo paraproteinemii.
Koncentrace celkové bílkoviny se stanovuje v krevním séru, jednou z pouţívaných
metod je biuretová reakce (viz. Bílkoviny I, úloha 1.). Intenzita modrofialového zbarvení
komplexu se stanovuje spektrofotometricky a je přímo úměrná počtu peptidových vazeb.
Jinou moţností je UV spektroskopie, vyuţívající absorbanci peptidové vazby při 280 nm.
Pracovní postup:
Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1., malé objemy pipetujte ke dnu
zkumavky!
Tabulka 1.
reagencie (ml)
sérum
standardní roztok bílkoviny
destilovaná voda
biuretové činidlo
vzorek
0,02
–
–
1,5
standard
–
0,02
–
1,5
slepý vzorek
–
–
0,02
1,5
Kaţdou zkumavku dobře promíchejte.
Přesně po 12 min změřte absorbanci při 540 nm proti slepému vzorku.
Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2.
Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte
koncentraci celkové bílkoviny (g/l) v určeném séru.
Výsledek zapište do tabulky 2.
72
Tabulka 2.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (g/l)
standard PROT
sérum
Poznámky:
73
ÚLOHA 3
Stanovení koncentrace albuminu v séru
Nejdůleţitějším proteinem v krvi je z kvantitativního pohledu albumin (tvoří 60 % všech
bílkovin krevní plazmy). Fyziologická funkce albuminu spočívá v regulaci plazmatického
objemu, dále plní transportní funkci (přenáší např. mastné kyseliny, lipidy, bilirubin, některé
hormony, vitaminy, ionty kovů, léky i toxické látky). Má i funkci rezervní bílkoviny a při
zátěţi organismu slouţí jako bohatá rezerva aminokyselin, zvláště esenciálních.
Zvýšená koncentrace albuminu v krvi (hyperalbuminemie) bývá obvykle jen sekundární
následek dehydratace. Hypoalbuminemie doprovází mnoho onemocnění (např. infekce,
choroby jater, nefrotický syndrom), biochemickou příčinou je bud' sníţení jeho syntézy nebo
zvýšení jeho odbourávání.
Albumin se řadí mezi tzv. negativní proteiny akutní fáze podobně jako transferrin,
glykoprotein přenášející krevní plazmou ţelezo jako Fe3+. V akutní fázi je jejich koncentrace
v plazmě niţší, protoţe na jejich úkor připadá zvýšená syntéza pozitivních proteinů akutní
fáze (např. C-reaktivní protein).
Ke stanovení albuminu je také vhodné sérum. Běţná metoda vyuţívá reakce albuminu
s bromkresolovou zelení, která tvoří s albuminem, v slabě kyselém prostředí a za přítomnosti
povrchově aktivních látek, barevný komplex vhodný k fotometrování (s globuliny nereaguje).
Pracovní postup:
Stanovení albuminu proveďte ve stejném séru, ve kterém jste stanovovali koncetraci
bílkovin.
Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3., malé objemy pipetujte ke dnu
zkumavky!
74
Tabulka 3.
reagencie (ml)
vzorek
standard
slepý vzorek
sérum
0,01
–
–
standardní roztok albuminu
–
0,01
–
destilovaná voda
–
–
0,01
pracovní roztok
1,0
1,0
1,0
Kaţdou zkumavku dobře promíchejte.
Nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě.
Změřte absorbanci vzorku i standardu při vlnové délce 630 nm proti slepému vzorku.
Naměřené hodnoty zapište do tabulky 4.
Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte
koncentraci albuminu (g/1) v určeném séru.
Výsledek zapište do tabulky 4.
Tabulka 4.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (g/l)
standard ALB
sérum
VYHODNOCENÍ:
Tabulka 5.
vzorek séra č.:
stanovovaná bílkovina
REFERENČNÍ
HODNOTY
celková bílkovina (g/l)
65 - 85
albumin (g/l)
35 - 53
NAMĚŘENÉ HODNOTY
75
ÚLOHA 4.
Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru
C-reaktivní protein (CRP) je markerem akutní fáze zánětu. Normálně je přítomen
v séru zdravých lidí v nízkých koncentracích - méně neţ 6 mg/l. Je produkován játry, jeho
plazmatická koncentrace se zvyšuje jiţ během 6–12 hodin po vypuknutí zánětlivého procesu
a maxima dosahuje za 24–48 hodin. Vzestup koncentrace můţe být aţ 1000x vyšší proti
fyziologické hodnotě. Stanovení CRP pomáhá určit, zda se jedná o infekci bakteriální nebo
virovou a zvolit odpovídající způsob terapie. Zda zánět probíhá a v jaké fázi, určuje
monitorování CRP. Vzhledem k tomu, ţe zánětlivým procesem reaguje náš organismus
prakticky na cokoliv, jsou zvýšené bílkoviny akutní fáze a tedy i CRP poměrně častým
nálezem. K jejich zvýšení dochází u infekcí jakéhokoliv původu, pooperačních stavů,
u nádorových onemocnění i u autoimunitních chorob. Vyšší plazmatická koncentrace CRP
také predikuje riziko infarktu myokardu nebo mozkové mrtvice.
CRP byl objeven v roce 1930 Tilletem a Francisem, kteří zjistili, ţe séra některých akutně
nemocných osob precipitují kapsulární C polysacharid bakterie Streptococcus pneumoniae.
Sérový faktor, způsobující precipitaci, byl později identifikován jako protein a označen jako
C-reaktivní protein. CRP aktivuje klasickou cestu komplementu a má funkci jako opsonin
v leukocytové fagocytóze, stimulaci lymfocytů nebo aktivaci monocytů/makrofágů.
CRP koncentrace v séru se zvyšují a sniţují rychleji neţ sedimentace erytrocytů (FW),
jako odpověď na změny ve stavu pacienta. Přetrvávající zvýšení hladiny CRP v plazmě
indikuje neustávající zánět a obvykle znamená neúspěšnou terapii a špatnou prognózu (např.
u maligních onemocnění, infekce a infarktu myokardu).
Malé zvýšení CRP má predikční hodnotu pro výskyt kardiovaskulárních příhod
u pacientů s koronárním srdečním onemocněním a stejně tak i u osob dosud zdravých.
Ukazuje se, ţe má větší prognostický význam neţ hladina HDL a LDL.
Stanovení koncentrace CRP je zaloţeno na měření tvorby komplexu antigenu a
protilátky. Reakci rozpustného antigenu s odpovídající protilátkou můţeme prokázat vznikem
precipitátu v roztoku, V oblasti nadbytku protilátky je mnoţství komplexu antigen-protilátka
úměrné koncentraci přítomného antigenu. Stupeň zákalu roztoku se kvantitativně měří
pomocí imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie.
Pracovní postup:
Zapněte přístroj – na displeji se objeví NAČTĚTE KARTU a poté PŘIPRAVEN
K MĚŘENÍ
Připravte si kyvetu s pufrem, sejměte ochranný kryt.
Sestavte si kapiláru – vsuňte píst do kapiláry tam, kde je na kapiláře modrý prouţek.
Proveďte odběr krve z prstu, otřete první kapku se stopami desinfekce.
Přiloţte kapiláru a další kapku krve nechte navzlínat po bílou zátku (20 ul), kapiláru
zvenku pečlivě otřete.
Vloţte kapiláru se vzorkem krve do kyvety s pufrem a vytlačte krev pístem.
Uzavřete kyvetu víčkem, které vyndáte z tuby. Pozor zatím nepromáčkněte modrý
střed. Razantně promíchejte obsah kyvety – nepřevracejte kyvetu dnem vzhůru –
obsah kyvety bude červeně čirý.
Vloţte kyvetu do přístroje – na displeji se objeví MĚŘENÍ BLANKU (slepé
zkoušky). Je-li vše v pořádku, asi po 30 s se na displeji objeví PŘIDEJTE
ČINIDLO a VYNDEJTE KYVETU
76
Promáčkněte modrý střed kyvety, která je stále v přístroji. Kyvetu vyndejte z přístroje
a pečlivě promíchejte její obsah převracením dna vzhůru. Na displeji mezitím probíhá
hlášení PROTŘEPEJTE OBSAH KYVETY.
Aţ se na displeji objeví hlášení VLOŢTE KYVETU, neprodleně vloţte kyvetu
s promíchaným obsahem zpět do přístroje.
Na displeji mezitím probíhá hlášení PROBÍHÁ MĚŘENÍ a během dvou minut se na
displeji objeví výsledek koncentrace CRP v jednotkách mg/l.
Poznámky:
77
ENZYMY
Klíčová slova: biokatalýza, aktivita enzymu, holoenzym, apoenzym, koenzym,
substrátová a reakční specifita enzymu, pH-optimum, sacharasa (EC 3.2.1.26), α-amylasa
(EC 3.2.1.1.), iontová síla.
Reagencie:
roztok trypsinu (z Pancreolanu, směs glycerol : voda 1:1)
roztok kaseinu 40 g/1 v uhličitanu sodném 0,01 mol/l
koncentrovaná kyselina dusičná !ŢÍRAVINA!
roztok sacharasy (50 g kvasnic ve 100 ml ethanolu 500 g/1)
roztok α-amylasy (sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu)
roztok škrobu 10 g/l
suspenze celulosy 2,5 g/l
roztok inulinu 2,5 g/1
roztok sacharosy 5 g/l
Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l
Fehlingův roztok II (125 g hydroxidu sodného a 175 g vinanu sodnodraselného v 1 l
vody)
12. Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/l) 50x zředěný
13. souprava ALP (BioSystems):
a) pufr N-methyl-D-glukamin, pH 10,1
b) substrát 4-nitrofenylfosfat 92 mmol/l
c) inhibitor EDTA 30 mmol/l v roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l
14. sérum
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
78
-amylasa
-amylasa ( -1,4-glukan-4-glukan-hydroláza, EC 3.2.1.1) patří mezi glykosidasy.
Glykosidasy náleţí mezi hydrolytické enzymy, které jsou specifické vůči typu glykosidové
vazby (α-glykosidasy nebo - glykosidasy) a sacharidu. Pomalu a nespecificky štěpí také
inulin. Slinná α-amylasa je -glykosidasa a štěpí α-1,4-D-glukosidové vazby v substrátech
obsahujících tři a více D-glukosových zbytků spojených vazbou α-1,4.
V organismu je α-amylasa přítomna ve formě dvou izoenzymů kódovaných dvěma
geny leţícími ve stejném lokusu (1p21). Podílí se na trávení sacharidů štěpením škrobu,
částečně jiţ v ústní dutině (slinná α-amylasa, S-amylasa), především však v duodenu
(pankreatická α-amylasa, P-amylasa). Hladina celkové -amylasy je zvýšena u onemocnění
akutní pankreatitidou, ale i u většiny případů bolestí břicha. Pro diagnostiku pankreatitidy má
vyšší diagnostický přínos stanovení pankreatického izoenzymu (P-amylasy). Protoţe je
molekula α-amylasy relativně malá, přestupuje do moči a můţeme její patologické zvýšení
u akutní pankreatitidy detekovat i v moči. Toto zvýšení přetrvává déle a nastupuje později
neţ zvýšení hladiny v séru. S-amylasa je zvýšena u onemocnění slinných ţláz.
Sacharasa z kvasnic štěpí β-fruktosidovou vazbu mezi fruktosou a glukosou v sacharose,
která je α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid.
Cílem této úlohy je prokázat přítomnost produktů štěpení slinnou α-amylasou a
sacharasou. Produkty hydrolytické reakce budou mít volné anomerní hydroxylové skupiny, a
tudíţ budou redukovat Fehlingovo činidlo. Polysacharidy můţeme prokázat reakcí
s Lugolovým činidlem (roztok jodu), zatímco produkty enzymatické hydrolýzy tuto reakci
neposkytují.
79
ÚLOHA 1.
Důkaz substrátové specifity glykosidas (sacharasy a α-amylasy)
Pracovní postup:
POZOR! Substráty před pouţitím protřepejte!
– Jako -amylasu pouţijte sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes
gázu.
– Do označených zkumavek připravte směs substrát - enzym podle tabulky 1.
– Nechte 30 min inkubovat při 37° C, potom reakci ukončete vyndáním z vodní lázně.
– S polovičním mnoţstvím inkubační směsi z kaţdé zkumavky proveďte reakci
s Fehlingovým činidlem (poměr činidlo : inkubační směs = 1:1).
–
– Ve zkumavkách, ve kterých byl jako substrát polysacharid, proveďte také reakci s
jodem.
– Stejnou reakci s jodem proveďte i s nativními polysacharidy a porovnejte zbarvení.
– Výsledky zaneste do tabulky 1. pomocí symbolů + a –.
Tabulka 1.
zkumavka
škrob (ml)
1
1
celulosa (ml)
2
3
6
7
1
1
1
0,25
0,25
8
1
sacharosa (ml)
-amylasa (ml)
Fehlingova reakce
reakce s jodem
5
1
1
inulin (ml)
sacharasa (ml)
4
0,25
1
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Poznámky:
80
ÚLOHA 2.
Stanovení Michaelisovy konstanty (Km) pro enzym alkalická
fosfatasa
Michaelisova konstanta s určitou dávkou zjednodušení odráţí afinitu enzymu
k substrátu. Čím je její hodnota niţší, tím vyšší je afinita k příslušnému substrátu. Číselně tato
hodnota odpovídá koncentraci substrátu, při které je rychlost reakce rovna polovině rychlosti
maximální (limitní). Pro určení Km se měří počáteční rychlost enzymové reakce při nejméně
pěti různých koncentracích substrátu, leţících v rozmezí alespoň jednoho řádu zvolené
koncentrační oblasti, všechny ostatní faktory (pH, teplota a mnoţství enzymu) musí být
konstantní. Ze získaných hodnot sestrojíme graf závislosti počáteční rychlosti reakce na
koncentraci substrátu (saturační křivka podle Michaelise a Mentenové).
Graf 1. Závislost A na [S].
Jelikoţ z tohoto grafu se Km nedá přímo přesně odečíst, vyneseme do grafu i reciproké
hodnoty koncentrace substrátu a rychlosti (linearizace podle Lineweavera a Burka). V místě
kde nám graf protne osu x získáme hodnotu -1/Km.
81
Graf 2. Závislost 1/A na 1/[S].
Enzym reagující s různými substráty má pro jednotlivé substráty různou hodnotu K m.
Např. Km alkoholdehydrogenasy pro ethanol je menší neţ pro methanol. Tento rozdíl se
vyuţívá při léčbě otravy methanolem. Také izoenzymy, katalyzující reakci s jedním
substrátem, se mohou lišit hodnotou Km. Glukokinasa, fosforylující glukosu v jaterních
buňkách, má Km asi 10 mmol/l, kdeţto hexokinasa, která je přítomná ve všech buňkách, má
Km pro glukosu asi 0,1 mmol/1. Tuto skutečnost vyuţívá organismus jako jednu z moţností
regulace metabolismu glukosy.
Alkalická fosfatasa (ALP) v lidském organismu
Alkalická fosfatasa odštěpuje fosfátové skupiny (zbytky kyseliny fosforečné) především
z molekul proteinů a nukleových kyselin. Enzym má pH optimum v alkalické oblasti. ALP se
vyznačuje velkou tkáňovou nespecifitou a vyskytuje se téměř ve všech tkáních těla ve formě
izoenzymů a enzymových izoforem, například v játrech, ledvinách, kostech, střevě a placentě.
Isoenzymy ALP jsou kódováné 4 geny: ALP-L (L,B,K), ALP-I, ALP-P, ALP-PL
(GALP). Tentýţ gen můţe produkovat izoformy, které se liší stupněm glykace a sacharidovou
strukturou.
1. Tkáňově nespecifická alkalická fosfatasa (TNAP), ALP-L/B/K nebo také jaterní
zahrnuje 3 základní izoformy lišící se glykací: játra L (L1,2), kost (B), ledvina (K)
L (liver) - je částečně inaktivována (30 %) při 56°C/10 min
B (bone) – je úplně inaktivována při 65°C/10 min
2. Intestinální alkalická fosfatasa, ALP-I (I1-3), vyskytuje se ve 3 izoformách a je tvořena
vě střevu. Není glykosylovaná a je inhibována L‑fenylalaninem.
3. Placentární alkalická fosfatasa se vyskytuje ve 2 izoformách:
a) ALP-P (P1) tvořená v placentě. Je glykosylovaná a termostabilní
Zvýšeně je exprimována na konci 3. trimestru
82
b) Pseudoplacentární alklalická fosfatasa, (Placenta Like Alkaline Phosphatase –
PLAP, ALP-PL, ALP-P2) je glykosylovanou dimérní izoformou ALP-P,
produkovánou především v germinálních buňkách – GALP (germinal alkaline
phosphatase) a embryonální tkáni. Vyskytuje se také v testis, thymu a určitých
nádorech z germinálních buněk, např. seminom, embryonální karcinom
Tabulka č. 3 ukazuje základní charakteristiky izoenzymů a izoforem ALP:
Tabulka 3. Vliv teploty a inhibitorů na izoenzymy AP:
Izoenzym AP
Teplota
PLAP/GCAP
stabilní ještě při 70°C
IAP
Kostní izoforma TNAP
stabilní ještě při 56°C
labilní při 55°C
Jaterní izoforma TNAP
Ledvinová izoforma TNAP
Specifické inhibitory
neuramidáza, deoxycholát sodný,
L-fenylalanin
L-fenylalanin. L-tryptofan
L-homarginin.
při 55°C stabilnější neţ
neuramidáza, deoxycholát
kostní izoforma
sodný
labilní jiţ při 45°C
Příslušné izoenzymy a isoformy alkalické fosfatasy ukazuje obrázek č. 1.
Obrázek č. 1. Genová lokalizace, isoenzymy a izoformy alkalické fosfatasy
83
ALP-L (jaterní) se učastní transportních procesů přes membránu a je vázána v
cytoplasmatické membráně hepatocytů přivrácené do ţlučových cest.
ALP-B (kostní) je součástí membrány osteoblastů, účastní tvorby kostní architektuy a podílí
se na zabudovávání Ca2+.
ALP-K (ledvinová, kidney) je lokalizovaná vo membráně ledvinových tubulárních buněk
ALP-I (střevní) se podílí na přenosu mastných kyselin a absorpci Ca2+.
Normální zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě):
ALP-L (L1,2)
– 30 - 50 %
ALP-B
– 60 - 70 %
ALP-K
– normálně se v séru nevyskytuje
ALP-I (I1-3)
– <20 %
ALP-P (P1,2)
– objevuje se v těhotenství
Aktivita ALP v séru se zvyšuje v důsledku mnoha patologických stavů a pro správnou
diagnostiku je nutné odlišit tkáň, ze které detekovaný enzym pochází. Zvýšení jaterní ALP je
charakteristické pro obstrukci ţlučových cest. Důvodem této obstrukce je nejčastěji ţlučový
kámen nebo zhoubný nádor bránící volnému odtoku ţluči. Aktivita kostní ALP se zvyšuje
v důsledku některých kostních chorob (osteomalacie, Pagetova choroba, osteblastické
sarkomy). ALP je fyziologicky je vyšší u dětí a mění se s věkěm.
Patologické změny v zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě):
ALP-L – cholestáza, zánět ţlučových cest (cholecystitis a cholangoitis), hepatopatie,
nádory – zejména hepatom
ALP-B – osteosarkom (osteoblastický), osteopatie, systémové choroby, některé nádory;
terapie osteoporózy
ALP-I – diabetes mellitus, nádory střeva, jaterní cirhosa, renální insuficience
ALP-P – epiteliální karcinom ovaria, ţaludku, pankreatu, sarkomy
Při stanovení Km alkalické fosfatasy se sleduje počáteční rychlost štěpení různých
koncentrací substrátu (4-nitrofenylfosfátu) konstantním mnoţstvím enzymu. Přírůstek
produktu reakce 4- nitrofenolu je úměrný rychlosti enzymové reakce.
84
Pracovní postup:
Do 6 označených zkumavek „eppendorf“ nařeďte substrát dle tabulky 3.
Napipetujte do zkumavky č. 1 0,6 ml neředěného substrátu.
Do "eppendorfek" 2 - 6 napipetujte 0,3 ml destilované vody.
Z "eppendorfky" č. 1 odpipetujte 0,3 ml základního roztoku substrátu do
"eppendorfky" č. 2 a promíchejte.
– Od "eppendorfky" č. 2 postupujte při ředění substrátu analogicky vţdy odpipetujte
0,3 ml roztoku z předcházející "eppendorfky" do následující a dobře promíchejte.
–
–
–
–
Tabulka 3.
zkumavka č.
4-nitrofenylfosfát
1
2
3
4
5
6
substrát
ředění 1
ředění 2
ředění 3
ředění 4
ředění 5
substrát
ml
0,6
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
destil. voda
ml
–
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
c mmol/l
92
46
23
11,5
5,75
2,88
– Do 7 nových skleněných zkumavek napipetujte 1 ml pufru - do zkumavky č. 1 6
přidejte 0,02 ml séra.
– Zkumavky 1 - 7 inkubujte ve vodní lázni 5 min při 37 C.
– Z kaţdé "eppendorfky" 1 – 6 odpipetujte 0,2 ml substrátu do skleněných zkumavek.
Zkumavky nevyndávejte z vodní lázně!
– Dodrţujte 30 sec interval mezi přidáním do jednotlivých zkumavek.
– Do zkumavky č. 7 (slepá zkouška) napipetujte 0,2 ml neředěného substrátu
(92 mmol/l).
– Zkumavky inkubujte 15 min při 37° C.
– V 30 sec intervalech vyndávejte zkumavky z vodní lázně a do kaţdé zkumavky
přidejte 0,5 ml roztoku inhibitoru.
– Do zkumavky č. 7 ( slepá zkouška ) napipetujte 0,02 ml séra.
– Do 30 min změřte absorbanci při 420 nm proti slepé zkoušce výsledky zapište do
tabulky č. 4.
85
Tabulka č 4.
zkumavka č.
1
2
3
4
5
6
[Sr]
15,00
7,50
3,77
1,88
0,94
0,47
A
1/[S]
1/A
[Sr] je výsledná koncentrace substrátu v reakční směsi, tj. koncentrace připravených
zásobních roztoků substrátu vynásobená 0,164 (0,2/1,22).
– Na milimetrový papír sestrojte ze získaných hodnot (S], A, 1/[S] a 1/A dva grafy a
určete hodnotu Km jako látkovou koncentraci 4-nitrofenolu.
Závislost A na [S] (exp.):
Hodnotu Km odečtěte na ose x jako souřadnici průsečíku spojnic odpovídajících
hodnot A a [S].
86
Závislost 1/A na 1/[S] (exp.):
Hodnotu –1/Km zjistěte z úseku na ose x, který vytíná přímka proloţená
experimentálními body.
Výsledky zapište do tabulky 5 a porovnejte získané hodnoty Km.
Tabulka 5.
graf
Km (mmol/l)
1
2
Poznámky:
87
NUKLEOVÉ KYSELINY I
Klíčová slova: biopolyméry, DNA, RNA, nukleoproteiny, vysolování.
Reagencie:
1. Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega:
a) Cell Lysis Solution
b) Nuclei Lysis Solution
c) Protein Precipitation Solution
2. isopropanol
3. 70% ethanol
4. redestilovaná voda (ddH2O)
88
ÚLOHA 1.
Izolace genetického materiálu
Prvním krokem molekulárně-biologických analýz je izolace genetického materiálu –
DNA a RNA. Práce s genetickým materiálem přináší některé zvláštní aspekty. Detekcí
dědičných, charakteristik genetického materiálu konkrétního jedince se získávají velmi citlivá
osobní data, se kterými je nutné zacházet náleţitým způsobem. Na rozdíl od většiny
biochemických vyšetřeni, která jsou dynamickým obrazem aktuálního dění v těle vyšetřované
osoby, vyšetření genetického materiálu přináší informace o neměnných charakteristikách
jedince, nebo i celých rodin.
Izolace DNA
Izolaci genomové DNA lze provést z libovolného materiálu obsahujícího jaderné buňky.
Nejčastěji je genomová DNA izolována z periferní nesráţlivé krve, kde se nachází
v leukocytech. Při izolaci DNA z tkání je nejprve nezbytné rozrušit tkáň na jednotlivé buňky
(tento krok odpadá při izolaci DNA z krve / kostní dřené nebo buněčné suspenze), lyzovat
cytoplazmatickou a jadernou membránu buněk a uvolnit DNA z nukleoproteinových
komplexů. DNA se následně z roztoku vysráţí pomocí isopropanolu nebo ethanolu. Sraţená
DNA se po vysušení rozpustí v redestilované vodě.
Pro izolaci genomové DNA pouţijeme Wizard® Genomic DNA Purification Kit firmy
Promega).
Izolace probíhá ve čtyřech krocích:
1. lýza erythrocytů pomocí Cell Lysis Solutio
2. lýza leukocytů a jejich jader pomocí Nuclei Lysis Solution
3. precipitace proteinů účinkem Protein Precípitation Solution
4. vysráţení DNA isopropanolem
Práce s genetickým materiálem klade vysoké nároky na přesnost a čistotu laboratorních
postupů. Základem většiny analýz nukleových kyselin je amplifikace cílového úseku
DNA/cDNA. Amplifikace znamená zmnoţení cílové sekvence v řádech 105 107. Z tohoto
důvodu je nezbytné zachovávat přísně sterilní podmínky (práce v rukavicích, sterilní roztoky,
sterilní zkumavky, špičky), aby analyzovaný genetický materiál nebyl kontaminován
cizorodou DNA (např. jiným vzorkem), nebo DNA z "vnějšího prostředí".
89
Izolace DNA z bukální sliznice
Dnes se pro molekulárně genetické vyšetření stále častěji pouţívá stěru z bukální
sliznice, který je zcela neínvazivní a je snadno proveditelný i neodborníkem. Pro izolaci se
pouţívají výše uvedené reagenční systémy.
Pracovní postup:
Vzorky bukální sliznice získejte stěrem buněk bukálni sliznice krouţivým pohybem
pomocí speciální stěrky Před odběrem si vypláchněte ústa vodou. Doporučená doba
mezi odběrem a posledním příjmem potravy je nejméně 10 min.
Stěrku vloţte do 2 ml zkumavky s 300 µl Nuclei Lysis Solution a 10 µl Proteinasy K,
ulomte horní část stěrky.
Zkumavku protřepejte na vortexu a inkubujte 15 min při 65° C.
Centrifugujte 1 minutu při 13 000 ot./min (maximální rychlost).
Supernatant odpipetujte do nové 1,5 ml zkumavky, roztok je viskózní.
Připipetujte 100 µl Protein Precipitation Solutíon a ihned intenzívně zvortexujte 20 s.
Centrifugujte 3 minuty maximální rychlostí.
Opatrně odpipetujte supernatant obsahující DNA do čisté eppendorfky. Pelet se
zkumavkou vyhoďte.
K supernatantu přidejte 300 µl isopropanolu a zkumavku opatrně obracejte, dokud
neuvidíte formující se sraţeninu DNA.
Centrifugujte 4 min maximální rychlostí.
Na dně je viditelný pelet DNA. Supernatant opatrné slijte do odpadní kádinky tak,
abyste nevylili pelet a osušte ústí eppendorfky na filtračním papíru.
K peletu připipetujte 300 µl 70% ethanolu. Eppendorfku několikrát jemně převraťte
pro omytí peletu.
Centrifugujte 1 min maximální rychlostí.
Supernatant opatrně slijte do odpadní kádinky. Osušte opatrně vnitřek eppendortky
filtračním papírem srolovaným pomocí pinzety do ruličky tak, abyste se nedotkli
peletu.
Otevřenou eppendorfku otočte dnem vzhůru a nechte stát na stole, dokud se neodpaří
zbytky ethanolu (cca 10 minut). K peletu DNA připipetujte 40 µl redestilované H2O.
Zkumavku uzavřete a jemně zvortexujte
Opatřete zkumavku přiděleným číslem a odevzdejte praktikovému asistentovi.
Izolovaná DNA se uchovává při 4° C pro další analýzy.
Poznámky:
90
NUKLEOVÉ KYSELINY II
Klíčová slova: nukleové kyseliny, DNA, integrita, spektrofotometrie absorpční maximum,
gelová elektroforéza.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř , 0,25% xylencyanol , 30% glycerol)
TAE pufr ( Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l)
2,5% agarosový gel v 1 x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)
redestilovaná H2O (ddH2O)
91
ÚLOHA 1.
Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin
Pro další analýzy je nutné určit koncentraci izolované nukleové kyseliny a ověřit její
čistotu a kvalitu - integritu (neporušenost).
Koncentrace nukleových kyselin se určuje spektrofotometricky. Nukleové kyseliny
absorbují v důsledku přítomnosti dusíkatých bází v ultrafialové oblasti spektra s absorpčním
maximem při 260 nm. Pro určení koncentrace vycházíme z toho, ţe při měření v 1 cm kyvetě
je optická denzita:
1 OD260 nm dsDNA = 50 µg ml-1
1 OD260 nm RNA = 40 µg ml-1
1 OD260 nm ssDNA = 33 µg ml-1
Vzhledem k tomu, ţe izolované nukleové kyseliny mohou být často kontaminovány
proteiny, které dosahují absorpčních maxim při 280 nm, provádíme při stanovení koncentrace
nukleových kyselin i vyhodnocení poměru OD260 nm/280 nm. Tento poměr by u čistého roztoku
DNA měl dosahovat hodnot kolem 1,8.
K ověření integrity nukleové kyseliny slouţí gelová elektroforéza. Elektroforézu lze
provádět v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Výběr gelové matrice záleţí na délce
analyzované nukleové kyseliny. Pro běţné analýzy DNA pouţíváme agarosový gel, který je
schopen separovat DNA fragmenty od 100 bp do 20 kbp. Pro fragmenty kolem 100 bp a
kratší a pro analýzy proteinů pouţíváme gely zaloţené na bázi akrylamidu.
Určení velikostí analyzované DNA/RNA se provádí porovnáním s velikostním
standardem DNA/RNA o známé délce fragmentů. Pro vizualizaci dvouřetězcových
nukleových kyselin se uţívá eihidiumbromid - interkalační činidlo, které se vmezeřuje mezi
planárně orientované báze DNA/RNA spojené vodíkovými můstky (obr. 5.).
Po prosvětlení gelu UV světlem emituje ethidiumbromid viditelné jasně oranţové světlo
v místech jeho vysoké koncentrace, tedy v místech, kde se nachází DNA.
Obr. 5. Vizualizace nukleových kyselin pomocí ethidiumbromidu.
Pro vizualizaci dvouřetězcové i jednořetězcové DNA nebo RNA v agarosových i
polyakrylamidových gelech lze místo mutagenního ethidiumbromidu pouţít fluorescenčního
barviva GelRed , které má navíc i vyšší citlivost.
92
1.1. Měření koncentrace DNA
Pracovní postup:
1.1.1. Měření na spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)
– Zvedněte „vzorkové rameno“ přístroje a pipetou (0 – 2 µl) naneste na dolní měřící
plošku 1 µl vzorku DNA (viz obr.)
Přiklopte „vzorkové rameno“ a na obrazovce počítače odečtěte koncentraci vzorku
DNA a poměr její čistoty 260/280 nm.
Před dalším měřením obě měřící plošky otřete čtverečkem buničiny.
1.1.2. 1.1.1. Měření na spektrofotometru Jenway Genova
Zkumavku se vzorkem DNA krátce promíchejte na vortexu a zcentrifugujte.
Do sterilní označené 0,5 ml eppendorfky napipetujte 190 µl redestilovné H2O a
přidejte 10 µl DNA.
Promíchejte na vortexu a zcentrifugujte při 13 000 ot/min.
Do spektrofotometrické 100 µl mikrokyvety odměřte 100 µl roztoku DNA a změřte
OD260 nm a OD280 nm. Výsledek zapište do tabulky 1.
Z mikrokyvety odsajte pipetou zpět 100 µl roztoku DNA.
Vypočítejte koncentraci DNA podle vzorce:
cDNA µg/ml] = OD260 nm x 50 x ředění
Vyhodnoťte čistotu DNA pomocí poměru OD260 nm/280 nm.
93
Tabulka 1.
vzorek č.
OD260 nm
OD280 nm
µg/ml
OD260 nm/280 nm
1.2. Kontrola integrity DNA elektroforézou v agarosovém gelu
Vzorek smíchaný s vzorkovým pufrem se nanáší do jamek v agarosovém gelu
umístěného v elektroforetické vaně obsahující lx TAE pufr. Vzorkový pufr obsahuje glycerol,
který je zde proto, aby při pipetování vzorku klesal vlivem zvýšené hustoty roztok
analyzované DNA na dno jamky. Barevná komponenta ve vzorkovém pufru je směs dvou
barev – bromfenolové modři a xylencyanolu a slouţí pro vizuální kontrolu migrace molekul
v průběhu elektroforézy. Bromfenolová modř se pohybuje stejnou rychlostí jako dsDNA
o velikosti 300 bp, kdeţto xylencyanol jako dsDNA dlouhá 4 kb. Pohyb molekul DNA v gelu
ve stejnosměrném elektrickém poli (7 V/cm délky gelu) závisí nepřímo na logaritmu délky
DNA fragmentů.
Pracovní postup:
Do označené 0,2 ml eppendorfky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 3 µl
vaší DNA.
Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte při 13 000 ot/min.
Naneste celý objem vzorku (6 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve
vaně s 1 x TAE pufrem.
Zaznamenejte si číslo jamky (zleva) s vaším vzorkem DNA.
Připojte elektroforetickou vanu na zdroj el. proudu (cca 100 V).
Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu.
Vyjměte gel a zkontrolujte jej pod UV světlem.
Poznámky:
94
NUKLEOVÉ KYSELINY III
Klíčová slova. genetický kód, polymerasová řetězová reakce - PCR, RT-PCR, real-time PCR,
polymorfismus, bodové mutace, apolipoprotein E, restrikční enzymy, rekogniční místo,
restrikční fragmenty, palindrom, fragmenty s kohezními a tupými konci, izoschizomery,
gelová elektroforéza, ethidiumbromid.
Reagencie:
1. mastermix [obsahuje 1 U Faststart Taq DNA Polymerase (Roche), 2,5 µl 10x PCR
buffer, 2,5 µl 50x dTP (2,5 mM kaţdého]
2. restrikční mix (APOE) : 10x restrikční pufr s MgCl2, bovinní sérový albumin
v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy HhaI),
3. restrikční mix (BRCA I): 10x restrikční pufr s MgCl2, bovinní sérový albumin
v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy Ddel),
4. vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol)
5. TAE pufr (Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l)
6. 2,5% agarosový gel v 1x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)
95
PCR – polymerasová řetězová reakce
Podstatou PCR je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků
dvouřetězcové DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé
řetězce DNA tak, ţe jejich 3´OH-konce směřují proti sobě. Jako primery se obvykle pouţívají
dva uměle připravené krátké oligonukleotidy o délce 16 - 30 bází, odvozené z koncových
sekvencí DNA určených k amplifikaci. Podmínkou pro jejich syntézu je znalost sekvence
studované nukleové kyseliny. Primery ohraničující amplifikovanou oblast, slouţí jako
iniciátory polymerační reakce a jsou DNA polymerasou prodluţovány ve směru 5´ 3´.
Provedení vlastní PCR trvá přibliţně 2 hodiny a kompletní analýza prováděná například pro
diagnostické účely obvykle nepřesáhne 48 hodin.
Podle typu výchozího templátu rozeznáváme dvě varianty polymerasové řetězové
reakce: DNA-PCR a RNA-PCR (reverzní PCR, RT-PCR). Obě metody nacházejí široké
uplatnění ve výzkumu i v klinické diagnostice.
DNA-PCR
DNA-PCR je určena pro selektivní amplifikaci vybraných úseků DNA in vitro.
Principem metody je amplifikace cílových úseků DNA vymezených primery
mnohonásobným opakováním cyklů PCR (Tab. 1.). Kaţdý cyklus tvoří 3 periody:
1. tepelná denaturace cílové DNA
2. vazba primerů hybridizací ("annealing") s jednořetězcovýmitempláty
3. extenze (elongace) primerů pomocí termostabilní DNA-polymerasy.
Tabulka 1.
PERIODA
REAKČNÍ PODMÍNKY
teplota
čas
1. CYKLUS
1. ÚVODNÍ DENATURACE
94 - 96°C
2. VAZBA PRIMERŮ (annealing)
50 - 65°C
3. EXTENZE – POLYMERACE
72°C
2. - 40. CYKLUS
1. DENATURACE
94 - 96°C
2. VAZBA PRIMERŮ (annealing)
50 - 65°C
3. EXTENZE – POLYMERACE
72°C
POSLEDNÍ CYKLUS
1. DENATURACE
94 - 96°C
2. VAZBA PRIMERŮ (annealing)
50 - 65°C
3. EXTENZE – POLYMRACE
72°C
4. OCHLAZENÍ
5°C
3 - 10 min
30 - 60 sec
30 - 60 sec
25 - 35 sec
30 - 60 sec
30 - 60 sec
25 - 35 sec
30 - 60 sec
3 - 10 min
dle potřeby
První cyklus PCR má vţdy prodlouţenou denaturační fázi a poslední cyklus fázi
polymerační. Účelem je účinná aktivace termostabilní polymerasy a terminální elongace
produktu PCR.
Původně se pouţívala jako polymerační enzym termolabilní DNA-polymerasa I
z E. coli, která se však inaktivuje vysokou teplotou (94°C) v denaturační periodě. Enzym se
96
proto musel znovu přidávat v kaţdém cyklu. Problém odstranilo zavedení termostabilní
DNA-polymerasy, Taq DNA-polymerasy, izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus.
Enzym je aktivní při teplotách 37 - 80°C, má také 5´ 3´ exonukleasovou aktivitu, postrádá
však 3´ 5´ exonukleasovou aktivitu. Polymerační rychlost je 2 - 4 kbp/min.V současné době
se pouţívají rekombinantní enzymy.
Cílový úsek molekuly DNA je po tepelné denaturaci vymezen dvěma
oligonukleotidovými primery, které hybridizují s komplementárními sekvencemi na okrajích
studovaného segmentu (jeden je komplementární k "+" vláknu a druhý k "-" vláknu DNA).
Primery nesmí obsahovat vzájemně komplementární úseky a jim odpovídající sekvence se
musí v analyzované DNA vyskytovat pouze v jediné kopii. Ideální primery by měly mít
přibliţně shodné zastoupení pyrimidinových a purinových bází .
Koncentrace primerů a teplotní podmínky pro jejich nasednutí (annealing) na templát se
pohybují v rozmezí 50 - 65° C (podle zastoupení nukleotidů v primeru). Teplotní optimum
pro prodluţování (elongaci primerů se v závislosti na nukleotidovém sloţení templátu
obvykle pohybuje mezi 70° - 75° C. K prodluţování primeru dochází jiţ během jeho asociace
s templátem, coţ je důleţité pro stabilizaci vznikajícího hybridu. Primery musí být vzhledem
ke koncentraci amplifikované DNA přítomny v reakční směsi v nadbytku.
Obr. 1. První 3 cykly klasické PCR.
Jelikoţ produkty kaţdého cyklu PCR slouţí zároveň jako templáty pro následující cykly,
narůstá kaţdým opakováním počet kopií amplifikované oblasti exponenciálně (2n). Po třetím
cyklu jsou produkovány převáţně řetězce, jejichţ délka odpovídá úseku DNA ohraničenému
97
primery. Většinou postačuje 30 - 35 cyklů, během nichţ se můţe specifická sekvence
amplifikovat teoreticky aţ 1011krát
Automatické opakování jednotlivých cyklů umoţňují speciální programovatelné a
procesorem řízené termostaty, tzv. PCR-termocyklery (obr.2), ve kterých lze dosáhnout
přesně definovaných změn inkubačních teplot během krátkých intervalů (s rychlostí změny
přibliţně 1°C/sec). Délka amplifikovaných úseků činí většinou několik desítek, set bází aţ 10
kb, za speciálních podmínek lze dosáhnout aţ 47 kb. Současně se vzorky provádí tzv.
negativní kontrola (kompletní reakční směs bez templátu).
Amplifikované úseky DNA se nejčastěji analyzují elektroforeticky v agarosovém gelu a
zviditelňuje se ethidiumbromidem nebo fluorescenčním barvivem GelRed . K průkazu
bodových mutací v produktu PCR slouţí elektroforéza v gradientu denaturující látky a
sekvenování.
Obr. 2. MJ Research PTC-100 Thermal Cycler
RNA-PCR (RT-PCR)
Techniku PCR lze rovněţ pouţít při analýzách RNA-molekul, zejména při studiu
expresní aktivity genu a průkazu RNA virů, např. viru hepatitidy C (HCV, VHC).
Reverzní transkriptasová PCR se můţe provádět dvěma způsoby:
1. Dvoukroková RT-PCR
a) Dvouzkumavková, dvoukroková RT-PCR
b) Jednozkumavková, dvoukroková RT-PCR
2. Jednokroková, jednozkumavková RT PCR
Pro RT-PCR se pouţívají reverzní transkriptasy viru ptačí myeloblastosy (Avian
myeloblastosis virus - AMV) nebo Moloneyové viru myší leukemie (např. Moloney murine
leukemia virus - M-MLV).
Při dvojkrokové, dvouzkumavkové RT-PCR (obr. 3) se pouţívají dva polymerační
systémy, jeden s reverzní transkriptasou v jedné zkumavce a druhým je klasická PCR
s termostabilní DNA-polymerasou ve druhé. V první zkmavce se pomocí reverzní
transkriptasy nasyntetizuje jednovláknová komplementární DNA (cDNA) při pouţití oligodT nebo random hexanukleotidů jako primerů. Druhým krokem v další zkumavce, po přidání
ekvivalentního mnoţství cDNA z předchozí reverzní reakce a dvou sekvenčně specifických
primerů, je amplifikace cDNA klasickou PCR.
Jednokroková RT PCR se provádí v jednom systému obsahujícím oba enzymy, reverzní
98
transkriptasu i termostabilní DNA polymerasu. Reakce se provádí nejprve při teplotě 55° C a
je syntetizováná cDNA, potom nastupuje klasická PCR. Schéma RT PCR ukazuje obr. 3.
Obr. 3. Schéma RT PCR
Uplatnění PCR v klinické diagnostice
PCR umoţňuje přímo identifikovat v infikovaném biologickém materiálu přítomnost
velmi malých mnoţství DNA virových nebo bakteriálních patogenů. Proto nachází široké
uplatnění v rychlé mikrobiologické a virologické diagnostice u řady infekčních onemocnění,
zejména těch, jejichţ původci se obtíţně nebo zdlouhavě kultivují (chlamydie, mykobakterie,
Treponema pallidum, legionelly, virů hepatitidy B a C, lidského papilomového viru HPV,
HIV atd.).
PCR a následná analýza amplifikovaných sekvencí jsou důleţité při identifikaci osob v
kriminalistice, při potvrzování rodičovství v paternitních sporech a při typizaci biologického
materiálu (DNA-fingerprinting). Výhodou je potřeba minimálního mnoţství biologického
materiálu (postačující je jediný vlas, kapka krve, spermatu, potu či slin atd.).
Vzhledem k vysoké stabilitě DNA lze amplifikaci a analýzu provádět i ve vzorcích,
jejichţ stáří můţe dosahovat tisíců let (antropologické, paleoantropologicé i paleozoologické
studie).
V onkologii slouţí PCR k detekci mutací některých genů, u nichţ se předpokládá vztah
k maligní transformaci buňky. Detekcí tzv. minimálního rezidua nádorové choroby prokázat
přetrvávání nádorové choroby po provedené terapii.
U hematologických maligních onemocnění se PCR a RNA-PCR uplatňuje zejména při
zjišťování chromosomových translokací (např. translokace mezi chromosomy 9 a 22 u
chronické myeloidní leukemie - Philadelphský chromosom).
Širokého uplatnění dosáhla PCR v prenatální diagnostice dědičných onemocnění, kde
poskytuje přímou informaci o eventuálním postiţení plodu. Významně časově zkrátila
detekci bodových mutací, které jsou častou příčinou těchto chorob. Materiálem pro izolaci
DNA jsou buňky amniové tekutiny nebo choriových klků a cirkulující fetální DNA
v maternální krvi.
Pomocí PCR lze také z minimálního počtu buněk amplifikovat sekvence DNA
99
specifické pro pohlaví plodu. Markerem chromosomu Y je repetitivní sekvence Hae 3,4.
Přehled vyuţití PCR v základním výzkumu i klinické diagnostice ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3.
Základní výzkum
Aplikovaný
genetický výzkum
Klinické disciplíny
Ostatní
izolace genů nebo
jejich částí
Detekce mutací v
genech
detekce patogenních
bakterií, virů, prvoků archeologie
a hub
sekvenace lidského
genomu
studium
polymorfismu genů
typizace patogenních kriminalistika
mikroorganismů
(identifikace jedince)
mutageneze in vitro,
modifikace konců
populační genetika
DNA
analýza klonů
z genových
knihoven
příprava značených
sond
identifikace
onkogenů
soudnictví (určení
otcovství)
typizace nádorů
diagnostika
dědičných
metabolických
chorob
stanovení pohlaví
prenatální
diagnostika
dědičných chorob
Převzato z Jan Šmarda a kolektiv, Metody molekulární biologie.
100
Real-time PCR (R-T PCR)
Základem real-time PCR je klasická PCR se 2 primery, ale
s fluorescenční sondou, coţ umoţňuje kontinuálně monitorovat
přírůstky amplikonů během kaţdého cyklu (u klasického PCR
se detekuje aţ finální produkt). Amplifikace a detekce produktu
se provádí buď ve skleněných či polykarbonátových kapilárách,
mikrozkumavkách nebo mikrodestičkách s 96 – 384 jamkami
ve speciálních termocyklerech, které umoţňují snímat a
kvantifikovat fluorescenci v kaţdém cyklu.
Obr. 3. Lightcycler 2.0
Real-time PCR umoţňuje kvantifikovat DNA nebo pomocí RT-PCR RNA. Základní
podmínkou je přítomnost fluorescenční sondy, která se váţe na syntetizované amplikony a
úroveň detekované fluorescence pak odráţí mnoţství vytvořené nukleové kyseliny. Data jsou
sbírána během celého PCR procesu ve speciálních "termocyklerech" s optikou umoţňující
excitaci sondy a následnou detekci fluorescence v kaţdém kapiláře nebo jamce a
vyhodnocení speciálním softwarem. Základní schéma excitace a detekce fluorescence je na
obr. 3. Základní schéma Lightcycleru 2.0® Roche, včetně optické detekční jednotky je na obr.
4.
Obr. 3. Základní schéma excitace a detekce fluorescence. Excitační laserový paprsek
prochází vzorkem s fluorescenční sondou a emituje fluorescenční světlo, které je
snímáno a vyhodnocováno fluorometrickým analyzátorem.
101
Obr. 4. Funkční schéma Lightcycleru 2.0 Roche. Levá část ukazuje vzduchový
termocykler s kapiláramy se vzorkem a pravá část optickou měřící jednotku.
Fluorescenční sondy pouţívané v real-time PCR se dělí do dvou základních skupin:
1. nespecifické - barviva vázající se nespecificky na dvouvláknovou strukturu DNA jako
je SYBR® Green nebo LC Green (Obr. 5A);
2. specifické - oligonukleotidové sondy, které hybridizují s amplikonem PCR. Fungují
na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním
barvivem (fluorofor - F nebo R) a zhášečem (quencher - Q):
a) TaqMan , neboli duální hydrolyzující sondy (Obr. 5B) – v tomto případě nárůst
fluorescenční aktivity je způsoben zvýšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po
rozštěpení navázané sondy polymerasou
102
Obr. 5. Nespecifická sonda SYBR Green (A). Specifická hydrolyzující sonda Taqman (B)
b) Hybridizační FRET sondy Roche (obr. 6 A, B, C) – se sestávají ze dvou různě
značených sond. Jedna je značená na 5´-konci excitačním barvivem a druhá
emitorovým, fluorescenčním barvivem. Fluorescence nastává po dokonalém a
těsném nasednutí obou sond barvivy proti sobě. Fluorescence se snímá při teplotě
nasednutí primerů (annealingu). Tento typ sondy umoţňuje prokazovat
polymorfismy na základě změny Tm.
Obr. 6 A. Diagram dvou značených B. Fluorescence emitovaná ve FRET
sond uţívaných ve FRET systému. systemu. Oligo 1 je donorová
Oligo 1 je donorová molekula a
molekula a Oligo 2 je receptor.
Oligo 2 je receptor.
C. Oligo 1 a 2 jsou dostatečně těsné,
aby přenesly světelnou energii
k akceptorové molekule, která
potom fluoreskuje.
103
c) Molekular Beacons neboli molekulární majáky (obr. 7) obsahují vlásenkovou,
komplementární strukturu a smyčku tvořenou sondou. Na 3´-konci vázán reporter
(fluorogen), případně přes tzv. bloker, a na 5´-konci zhášeč.
Obr. 7. Molekulární majáková sonda (molecular beacon probe).
Ve vlásenkové formě, nevázané na cílové sekvencce amplikonů je sonda
fluorescenčně neaktivní, při denaturaci dojde k rozvolnění vlásenkové struktury. Při
reasociační teplotě (annealingu) dojde k hybridizaci sondy smyčkou s amplikony,
dokonalému oddálení reportéru a zhášeče a emisi fluorescence.
d) Škorpionové primer-sondy (Scorpion probe) jsou bifunkční molekuly, ve kterých
je primer kovalentně vázán k sondě (obr. 8). Molekuly také obsahují fluorofor a
zhášeč. V nepřítomnosti cílu, zhášeč téměř úplně absorbuje fluorescenci
emitovanou fluoroforem. Během škorpionové PCR ve fázi annealingu
v přítomnosti cílové molekuly se separují fluorofor a zhášeč, coţ vede k vzestupu
fluorescenční emise. Fluorescence pak můţe být detekovaná a měřená v reakční
zkumavce. Na rozdíl od TaqManu, FRET hybridizačních sond a molekulárních
majáků, reakce škorpionové primer-sondy, je reakce vedoucí ke tvorbě signálu
monomolekulární, vzhledem k tomu, ţe sonda je kovalentně spojena s primerem.
104
Obr. 8. Funkce škorpion primer-sondy.
Po jednom cyklu PCR se kompletuje extenze primeru sondy a nově syntetizovaná
cílová oblast se připojí k témuţ řetězci jako sonda. Při následujícím druhém cyklu,
denaturace a annealing, hybridizují sonda a cíl na elongovaném primeru.
Denaturace vlásenkové smyčky vyţaduje méně energie, neţ tvorba nové duplexní
DNA. Následně, vlásenková struktura hybridizuje k části nově tvořeného produktu
PCR, coţ vede k separaci fluoroforu od zhášeče a vzniku emise světla.
Vyuţití real-time PCR
Real-time PCR na rozdíl od klasické PCR má daleko širší vyuţití:
detekce a identifikace patogenů (bakterií, hub, virů i parazitů – např. detekce a
kvantifikace cirkulující DNA Plazmodia falciparum.)
kvantifikace bakteriální a virové náloţe
diferenciální genová exprese pomocí reverzní real-time PCR, zejména
v onkologii při zjišťování exprese genů asociovaných s nádorovým
onemocněním
monitorování minimální nádorové choroby, jak na úrovni DNA cirkulujících
nádorových buněk, tak na úrovni exprimované RNA
monitorování efektivity léčby
105
SNP genotypizace, resp. zjišťování mutací (např. zjišťování polymorfismu
ApoE, FVL – Lydenské mutace faktoru V, faktoru I – protrombinu,
methylentetrahydrofolátreduktasy 677 a 1298
methylace DNA
validace RNA pro DNA čipy
detekce nepříznivého výsledku transplantace
analýza genetických chorob – cystické fibrosy, fenylketonurie, thalassemie,
hemofilie, srpkovité anemie a favismu
neinvazivní prenatální diagnostika analysou fetální DNA v mateřské plazmě.
detekce potravinových a environmentálních patogenů
forenzní studie – identifikace jedince, zjišťování paternity (otcovství)
106
ÚLOHA 1.
Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR
s restrikčním štěpením a real-time PCR
Pro detekci známých polymorfismů a bodových mutací se často vyuţívá amplifikace
studovaného úseku DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) s následnou restrikční
analýzou, tj. rozštěpení fragmentu zkoumaného genu enzymem – restrikční endonukleázou,
který má schopnost rozeznat a rozštěpit specifickou sekvenci DNA. Protoţe restrikční
analýza je volena tak, aby restrikční reakce zasahovala místo polymorfní sekvence, změna
této sekvence vede k vytvoření nebo naopak k zániku restrikčního místa. Produkty restrikční
reakce jsou následně separovány na agarosovém (případně polyakrylamidovém) gelu.
Vizualizace se provádí obarvením DNA fragmentů ethidiumbromidem.
Cílem praktického cvičení je genotypizace genu APOE u pacientů s hyperlipidémií
a/nebo hypercholesterolémií a obezitou nebo detekce specifické mutace genu BRCA 1.
1.1.
Analýza alel genu APOE
Gen APOE je lokalizován na 19 chromosomu (19q13.2). Protein ApoE
(apolipoprotein E) je exprimován v řadě tkání. Je součástí lipoproteinových komplexů
remnantních částic chylomiker, HDL, IDL a LDL. ApoE je důleţitou součástí pro receptory
remnantních částic a HDL v jaterních buňkách. V remnantních částicích chylomiker a IDL
resp. LDL se objevuje ApoE sekundárně; během intravazální interakce těchto lipoproteinů
s částicemi HDL.
V exonu 3 genu APOE se nacházejí polymorfní lokusy, které vytvářejí tři alely,
označované jako ε2, ε3 a ε4 (tabulka 1). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou
nukleotidu 3932 (kodon 130) a/nebo nukleotidu 4070 (kodon 176). V obou případech se
jedná o záměnu C za T na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To
znamená, ţe se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cystein (C) nebo triplet
CGC, kodující arginin (R).
Tabulka 1.
Alela
ε2
ε3
ε4
Aminokyselina 130
TGC (C)
TGC (C)
CGC (R)
Aminokyselina 176
TGC (C)
CGC (R)
CGC (R)
V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací
jednotlivých alel. Nejčastější je výskyt homozygotní alely ε3. Tato alela znamená expresi
plně funkčního proteinu ApoE. Vzhledem k tomu, ţe záměna C za T vede ke změně tripletu
kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze
předpokládat, ţe jednotlivé sekvenční varianty genu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad
na strukturní a funkční charakteristiky výsledného proteinu ApoE, který se podílí na
107
rozpoznání remnantních chylomiker a LDL částic jejich receptory (záměna Cys za Arg je
záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu).
U normálních osob jsou zbytky chylomiker a LDL částice rychle odstraňovány
z cirkulace receptorem zprostředkovanou endocytózou především v hepatocytech. Při
onemocnění familiální dysbetalipoproteinemii nebo hypolipoproteinémii typu III se
setkáváme se zvýšenou plazmatickou hladinou cholesterolu a triacylglycerolů, která je
důsledkem poruchy clearance remnantních chylomiker a LDL na základě defektu
apolipoproteinu E. Akumulace lipoproteinových komplexů v cirkulaci způsobuje vznik
xantomů a předčasné aterosklerózy koronárních a/nebo periferních tepen se všemi závaţnými
klinickými důsledky (angina pectoris, akutní infarkt myokardu, apod) v mladém věku.
Většina pacientů s familiální dysbetalipoproteinemií jsou homozygoti ε2/ ε2. Osoby s alelou
ε4 jsou ohroţeny zvýšeným rizikem vzniku Alzheimerovy choroby (nejčastější forma
demence v dospělé populaci; progresivní neurodegenerativní onemocnění CNS).
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
JOURNAL
MEDLINE
PUBMED
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
HUMAPOE4
5515 bp
DNA
linear
PRI 09-NOV-1994
Human apolipoprotein E (epsilon-4 allele) gene, complete cds.
M10065 J03053 J03054
Alu repeat; allelic variation; apolipoprotein; apolipoprotein E;
lipoprotein; repeat region; very low density lipoprotein.
Homo sapiens (human)
Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
1 (bases 1 to 5515)
Das,H.K., McPherson,J., Bruns,G.A., Karathanasis,S.K. and
Breslow,J.L.
Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the
human apolipoprotein E gene
J. Biol. Chem. 260 (10), 6240-6247 (1985)
85207610
3922972
ggaacttgat
agacgagatt
gcttcaagcc
ttcacatgtg
aaaacccagg
ccctcccatc
gacagtctcc
ccgcctcccg
cgcccgccac
tggccaggct
tgctgggatt
cccctagccc
ttacattcat
ctccacattc
cgaggtgtcc
tccttcctcc
gggctgccca
ggacaagtct
ccaggagccg
gagctgggac
ggcttgggga
ctgggcagca
gatgtaagcc
gtccccagtg
ccgtcgattg
taactgtgag
agatggaacc
atggaatttt
ttaaataggg
gctcagagag
cacgccctgg
ctggaaacca
gggagggggc
tcccatttgc
ccacttctgt
ctcttgctga
ggttcaagcg
cacgcctggc
ggtctcaaac
acaggcgtga
tactttcttt
ccaggcacag
cccttccacg
tcccttcctg
ctctgccctg
gcccgcccta
gggatccttg
gtgagaagcg
cctgggaagc
gaggaggagc
gagacgaccc
atagcaggac
tcctcagatc
gagaacttta
gttggagctt
ggcggtgggg
ctatggaggc
aatgggttgg
gacaagtcat
caatttgact
caatacctgt
tcctgtgctc
aaagcctcga
ccagccgcct
ggctggagtg
attctcctgc
taacttttgt
tcctgacctt
gctaccgccc
ctgggatcca
gaaaggacag
cttggccccc
gggactgtgg
ctgtgcctgg
tccctggggg
agtcctactc
cagtcggggg
cctggcctcc
gggggtgagg
gacccgctag
tccacgagtt
tccataactg
aaatgaggac
agaatgtgaa
agggggtggg
cgacctgggg
gggcggcttg
ttgcccaagg
ccagaatcct
ggcagccagg
aaggtcacaa
cttttagcag
agccccactt
cagtggcgag
ctcagcctcc
atttttagta
aagtgattcg
ccagcccctc
ggagtccaga
ggtcaggaaa
agaatggagg
ggggtggtca
ggcaggggga
agggggcggg
agccccagcg
cacggggatg
aggtagtctc
caagcagcag
aaggtggggt
gtcactatca
gggagccagg
tgaattagct
gggagaatga
gggatggaat
atggggagat
gtaaatgtgc
tcacacagct
aaccttaacc
gggaggtgct
ccaaagagga
gtgcatcata
tctttttttt
atctcggctc
caagtagcta
gagatggggt
cccactgtgg
ccatcccact
tccccagccc
ggaggactct
agggtgtctg
aaagacctct
gaacagccca
acagggggag
gaggtgaagg
agctcagggg
aggagagcta
gggactggac
ggggagagca
ttatcgagca
ggcagcgaca
cataaatgga
ggaatgcgag
ttgaaccccg
aagagaagac
tgggattagg
ggcaactggc
cagaagcacg
ggaatctcat
agctgtgatt
ctgttcccac
ctttttttga
actgtaacct
ggattacagg
ttcaccatgt
cctcccaaag
tctgtccagc
cctctccaga
gggcggcagc
tattactggg
atgccccacc
cctcgtgact
ccctataatt
acgtccttcc
cctctagaaa
ctcggggtcg
ctgggaaggg
gctggactgg
cctactgggt
cggtagctag
acacggcgct
actgggactg
ggagaggaag
caggagggag
ctgttgcaga
108
1741 taatgcaaca aggcttggaa ggctaacctg gggtgaggcc gggttggggg cgctgggggt
1801 gggaggagtc ctcactggcg gttgattgac agtttctcct tccccagact ggccaatcac
1
M K V L
W A A
L L V
T F L A
G
1861 aggcaggaag ATGAAGGTTC TGTGGGCTGC GTTGCTGGTC ACATTCCTGG CAGgtatggg
tccgtccttc TACTTCCAAG ACACCCGACG CAACGACCAG TGTAAGGACC GTCcataccc
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
ggcggggctt
ccccattcag
gaacagcgat
agttgttttg
ctgtcgccca
ggtccacgcc
cacacccgac
ctggtctgga
ttacaggcgt
gatagtgaat
cctgcctggg
cctgtaatcc
acaccagcct
gcatggtgcc
gagcccagaa
gacagagcaa
ccctcaccct
taggtagcta
gctcggttcc
acagaccctg
ttgacgctct
ttgttgttgt
ggctggagtg
attctcctgc
taactttttt
actcctgacc
gagccaccgc
accagacacg
gcacacaagg
cagcactttg
gggcaacata
acacacctgt
ggtcaaggtt
gaccctgttt
gcccaccatg
gatgcctgga
ccccgctcct
ggccccctct
ctgggcctcg
ttgttgttgt
cagtggcggg
ctcagcctcc
gtattttcag
tcaggtgatc
acctggctgg
gggcagctgt
acactcaata
ggaggccaag
gtgagaccct
gctctcagct
gcagtgaacc
ataaatacat
gctccaaaga
cggggtcaga
ccccctctca
tctgaggctt
gtttccccca
tgttttgttt
atctcggctc
caagtagctg
tagagacggg
tgcccgtttc
gagttagagg
gatctttatt
catgcttttc
gtgggaggat
gtctctacta
actcaggagg
atgttcaggc
aatgctttcc
agcatttgtg
aggaccctga
tcctcacctc
ctgtgctgct
tccttgagat
ttttgagatg
actgcaagct
ggactacagg
gtttcaccat
gatctcccaa
tttctaatgc
ctccatcacc
cgctgggccg
cacttgagcc
aaaatacaaa
ctgaggcagg
cgctgcactc
aagtgattaa
gagcaccttc
cccgaccttg
aacctcctgg
tcctggctct
aggagttaga
aagtctcgct
ccgcctccca
cacatgccac
gttggccagg
agtgctggga
attgcaggca
cccacacagc
gtggctcacc
caggagttca
aattagccag
aggatcgctt
cagcctgggt
accgactccc
tgtgtgcccc
aacttgttcc
16
C
Q A K
V E Q A
V E T
E P E
P E L R
3001 acacagGATG CCAGGCCAAG GTGGAGCAAG CGGTGGAGAC AGAGCCGGAG CCCGAGCTGC
tgtgtcCTAC GGTCCGGTTC CACCTCGTTC GCCACCTCTG TCTCGGCCTC GGGCTCGACG
34
Q Q T
E W Q
S G Q R
W E L
A L G
R F W D
3061 GCCAGCAGAC CGAGTGGCAG AGCGGCCAGC GCTGGGAACT GGCACTGGGT CGCTTTTGGG
CGGTCGTCTG GCTCACCGTC TCGCCGGTCG CGACCCTTGA CCGTGACCCA GCGAAAACCC
54
Y L R
W V Q
T L S E
Q V Q
E E L
L S S Q
3121 ATTACCTGCG CTGGGTGCAG ACACTGTCTG AGCAGGTGCA GGAGGAGCTG CTCAGCTCCC
TAATGGACGC GACCCACGTC TGTGACAGAC TCGTCCACGT CCTCCTCGAC GAGTCGAGGG
74
V T Q
E L R
3181 AGGTCACCCA GGAACTGAGg tgagtgtccc catcctggcc cttgaccctc ctggtgggcg
TCCAGTGGGT CCTTGACTCc actcacaggg gtaggaccgg gaactgggag gaccacccgc
3241
3301
3361
3421
3481
3541
3601
3661
3721
gctatacctc
ggtctctgct
attctctctc
ctggctctgt
ctgtgttgcc
ccaaagtgct
tctgcctctg
tgccccgttc
tcccagccct
agggtcggga
cccaggtcca
ggttctagct
tcagctttgt
ctctgtcctt
caggctggtc
gggattagag
ccctctgcat
cttctctccc
tctcccccgc
agagggggcg
ggtttcattc
tcctcttccc
ctctctctct
ccctagctct
ttgaacttct
gcatgagcac
ctgctctctg
tcttgggtct
ctccccactg
gaggggtgac
tgcccctgtc
atttctgact
tcccttctga
tttatataga
gggctcaagc
cttgcccggc
catctgtctc
ctctggctca
tgcgacaccc
acgctgtggg
gctaagtctt
cctggcttta
ctcagtctct
gacagagaga
gatcctcccg
ctcctagctc
tgtctccttc
tccccatctc
tcccgccctc
agggcgggag
ggggggcctg
gctctctgga
cacactcgtc
tggggtctca
cctcggcctc
cttcttcgtc
tctcggcctc
gcccgcccca
tcggccgcag
agccggcgtc
80 A L M
D E T M
K E L
K A Y
K S E L
E E Q
3781 GGCGCTGATG GACGAGACCA TGAAGGAGTT GAAGGCCTAC AAATCGGAAC TGGAGGAACA
CCGCGACTAC CTGCTCTGGT ACTTCCTCAA CTTCCGGATG TTTAGCCTTG ACCTCCTTGT
100 L T P
V A E E
T R A
R L S
K E L Q
A A Q
3841 ACTGACCCCG GTGGCGGAGG AGACGCGGGC ACGGCTGTCC AAGGAGCTGC AGGCGGCGCA
TGACTGGGGC CACCGCCTCC TCTGCGCCCG TGCCGACAGG TTCCTCGACG TCCGCCGCGT
109
120 A R L
G A D M
E D V
R G R
L V Q Y R G E
3901 GGCCCGGCTG GGCGCGGACA TGGAGGACGT GCGCGGCCGC CTGGTGCAGT ACCGCGGCGA
CCGGGCCGAC CCGCGCCTGT ACCTCCTGCA CGCGCCGGCG GACCACGTCA TGGCGCCGCT
140 V Q A
M L G Q
S T E
E L R
V R L A
S H L
3961 GGTGCAGGCC ATGCTCGGCC AGAGCACCGA GGAGCTGCGG GTGCGCCTCG CCTCCCACCT
CCACGTCCGG TACGAGCCGG TCTCGTGGCT CCTCGACGCC CACGCGGAGC GGAGGGTGGA
160 R K L
R K R L
L R D
A D D
L Q K R
L A V
4021 GCGCAAGCTG CGTAAGCGGC TCCTCCGCGA TGCCGATGAC CTGCAGAAGC GCCTGGCAGT
CGCGTTCGAC GCATTCGCCG AGGAGGCGCT ACGGCTACTG GACGTCTTCG CGGACCGTCA
180 Y Q A
G A R E
G A E
R G L
S A I R
E R L
4081 GTACCAGGCC GGGGCCCGCG AGGGCGCCGA GCGCGGCCTC AGCGCCATCC GCGAGCGCCT
CATGGTCCGG CCCCGGGCGC TCCCGCGGCT CGCGCCGGAG TCGCGGTAGG CGCTCGCGGA
200 G P L
V E Q G
R V R
A A T
V G S L
A G Q
4141 GGGGCCCCTG GTGGAACAGG GCCGCGTGCG GGCCGCCACT GTGGGCTCCC TGGCCGGCCA
CCCCGGGGAC CACCTTGTCC CGGCGCACGC CCGGCGGTGA CACCCGAGGG ACCGGCCGGT
220 P L Q
E R A Q
A W G
E R L
R A R M
E E M
4201 GCCGCTACAG GAGCGGGCCC AGGCCTGGGG CGAGCGGCTG CGCGCGCGGA TGGAGGAGAT
CGGCGATGTC CTCGCCCGGG TCCGGACCCC GCTCGCCGAC GCGCGCGCCT ACCTCCTCTA
240 G S R
T R D R
L D E
V K E
Q V A E
V R A
4261 GGGCAGCCGG ACCCGCGACC GCCTGGACGA GGTGAAGGAG CAGGTGGCGG AGGTGCGCGC
CCCGTCGGCC TGGGCGCTGG CGGACCTGCT CCACTTCCTC GTCCACCGCC TCCACGCGCG
260 K L E
E Q A Q
Q I R
L Q A
E A F Q
A R L
4321 CAAGCTGGAG GAGCAGGCCC AGCAGATACG CCTGCAGGCC GAGGCCTTCC AGGCCCGCCT
GTTCGACCTC CTCGTCCGGG TCGTCTATGC GGACGTCCGG CTCCGGAAGG TCCGGGCGGA
280 K S W
F E P L
V E D
M Q R
Q W A G
L V E
4381 CAAGAGCTGG TTCGAGCCCC TGGTGGAAGA CATGCAGCGC CAGTGGGCCG GGCTGGTGGA
GTTCTCGACC AAGCTCGGGG ACCACCTTCT GTACGTCGCG GTCACCCGGC CCGACCACCT
300
4441
4501
4561
4621
4681
4741
4801
4861
4921
4981
5041
5101
5161
5221
5281
5341
5401
5461
K V Q
GAAGGTGCAG
gccgaagcct
gcagcgggag
agattcacca
ctcagtttct
gtgtctgtgt
cacccaggct
caagcgattc
tttttgtatt
tgaccaagtg
tgcccggcct
cgccatcaca
cctcagcctt
ggtggtgtgt
ctcaagcgat
cacccagctt
tcaaacccct
catgggctcc
A A V G
GCTGCCGTGG
gcagccatgc
accctgtccc
agtttcacgc
ctttctgccc
gtatctttct
agagtgcagt
tgctgcctca
tttagtagag
atccacccgc
ctgcccctct
gctcactgca
tccagtagct
gtggagatgg
actcccacct
tttattatta
ggctcaagag
gagcggcctg
T S A
GCACCAGCGC
gaccccacgc
cgccccagcc
atctgctggc
acatactgcc
ctctgccctt
ggcacgatct
gtagctggga
acgagctttc
cggcctccca
ttctttttta
gcctccacct
gagactacag
ggtctggctt
tggcctcctg
tttgtagaga
atcctccgcc
cccaacttaa
A P V P
CGCCCCTGTG
caccccgtgc
gtcctcctgg
ctccccctgt
acacaattct
tttttttttt
tggctcactg
ttacaggctc
accatgttgg
aagtgctgag
gggggcaggg
cctggactca
gcgcatacca
tgttggccag
agtagctgag
caaggtctca
atcggcctcc
taatattgtt
S D N
CCCAGCGACA
ctcctgcctc
ggtggaccct
gatttcctct
cagccccctc
tagacggagt
caacctctgc
acaccaccac
ccaggcaggt
attacaggcc
aaaggtctca
agtgataagt
ctaggattaa
gctgatgtgg
actactggct
atatgttgcc
caaagtgctg
cctagagttg
H *
ATCACTGAac
cgcgcagcct
agtttaataa
aagccccagc
ctctccatct
ctggctctgt
ctcttgggtt
acccggctaa
ctcaaactcc
tgagccacca
ccctgtcacc
gatcctcccg
tttggggggg
aattcctggg
agcaccacca
caggctagtc
ggattccagg
cactc
110
Vysvětlivky:
Kódující sekvence s exony je vyznačena jako dsDNA
Sekvence aminokyselin je vyznačena nad kódující sekvencí v jednopísmenkovém
kódu.
Sekvence signálního peptidu (AA 1 – 18) je označena kurzívou.
Sekvence primerů jsou označeny podtrženě a kurzívou
Rekogniční místa HhaI jsou vyznačena v tmavých rámečcích (šedě – nepolymorfní
místa, černě – místa moţných polymorfismů CGC->TGC (C->R)
Sekvenci genů naleznete na stránkách serveru NCBI (National Center for
Biotechnology
Information)
v databázi
nukleotidů
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi
1.1.1. PCR amplifikace fragmentu exonu 3 genu APOE
Pracovní postup:
– Sterilní 0,2 ml PCR zkumavku si na víčko označte uvedeným způsobem: např. A10; A
je amplifikace APOE, 10 je číslo vaší DNA.
– Do zkumavky napipetujte reakční směs dle tabulky 1: mastermix, 15 pmol kaţdého ze
dvou primerů, 200 ng vaší DNA a doplňte ddH20 na celkový objem 20 l.
Tabulka 1.
reakční směs
mastermix*
primer 1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3' (5 M)
primer 2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3' (5 M)
DNA ( ____ mg/ml)
ddH20 ad 20 l
konečný objem
( l)
10
2
2
20
– Reakční směs zvortexujte a krátce zcentrifugujte.
– Zkumavku vloţte do bloku cykleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program
“apo-E”
111
1.1.2. Elektroforéza PCR produktu
Pracovní postup:
– Označte sterilní 0,2 ml eppendorfku, na víčko dle instrukcí (např. AR10; AR je
restrikce APOE, 10 je číslo vaší DNA)
– Do zkumavky napipetujte 3 l modrého vzorkového pufru a 6 l vašeho PCR produktu.
Zvortexujte a krátce zcentrifugujte.
– Naneste celý objem vzorku (9 l) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně
s pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva).
– Po nanesení všech vzorků připojte vanu na zdroj stejnosměrného proudu (7V/cm).
– Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu.
– Vyjměte gel a proveďte vyhodnocení po skupinách pod UV světlem.
1.1.3. Restrikční analýza PCR APOE
Pracovní postup:
– Označte 0,2ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní
6 l restrikční směsi a 6 l svého PCR produktu.
– Zvortexujte a krátce centrifugujte.
– Umístěte zkumavku do bloku cycleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program
“restrikce”. Inkubujte 2 hod při 37°C.
1.1.4. Elektroforéza restrikční reakce produktu PCR APOE
Pracovní postup:
– Označte 0,2 ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní
3 l modrého vzorkového pufru a 6 l neštěpeného PCR produktu.
– Do zkumavky s restrikční reakcí (12 l) přidejte 3 l nanášecího pufru.
– Obě zkumavky protřepejte na vortexu a krátce centrifugujte.
– Naneste celý objem vzorků (9 l a 15 l) na dno dvou sousedních jamek v agarosovém
gelu umístěném ve vaně s pufrem (1. jamka – neštěpený PCR produkt; 2. jamka –
produkt po restrikci).
– Zaznamenejte čísla jamek (zleva) a vašich vzorků.
– Po nanesení všech vzorků aplikujte stejnosměrný proud (7V/cm).
– Elektroforézu ukončete po 40 minutách.
– Vyjměte gel a vyhodnoťte jej po skupinách pod UV světlem.
112
1.1.5. Detekce alel genu ApoE pomocí real-time PCR
Další moţností detekce alel genu ApoE, mnohem rychlejší a elegantnější, je real-time
PCR. V našem případě budeme pouţívat systém Lightcycler s fluorescenčními FRET
hybridizujícími sondami a analýzou Tm, která nám umoţní odečet polymorfismů.
Reagencie: ApoE ToolSet™ pro LightCycler™ Genes-4U
(ApoE E2/E3/E4, kodony 112 Cys/Arg a 158 Cys/Arg)
1. Obsah testovací soupravy
Lahvička
1, Červené víčko
Označení
OligoTool
2, Zelené víčko
Kontrola
(Control)
3, Modré víčko
Rozpouštědlo
(Solvent)
4, Ţluté víčko
DMSO
Pozor dráţdivé !
Můţe se absorbovat
kůţí !
Obsah
– lyofilizované
oligonukleotidy
pro PCR
– obsahuje detekci
mutace a kotvící
sondu, primery
– lyofilizovaná
ApoE E2/E4 HET
DNA
– k rozpuštění
OligoTool /
Control
– - PCR přísada pro
oblasti bohaté na
GC (GC rich)
Mnoţství
ApoE-16
Pro 16 testů
Rozpuštěno: 50 μl
Rozpuštěno: 20 μl
1000 μl rozpouštědla
100 μl DMSO
Kontrola:E2 / E4 heterozygtní kontrolní DNA, lyofilizovaná (= Cys112Arg / Cys158Arg
kombinovaný heterozygot
113
Pracovní postup:
Připravte si tři sterilní 0,2 ml zkumavky, jednu označte na víčko písmenem A a
číslem vaší DNA, druhou zkumavku, pro vzorek kontrolní pozitivní DNA, označte
ACP, třetí zkumavku pro negativní kontrolu, označte ACN.
Napipetujte do zkumavek reakční směs dle tabulky:
Činidlo
OligoTool ApoE-16,
rozpuštěný
Rozpouštědlo ApoE-16
MgCl2 25 mM
DMSO (ţluté víčko)
Master Hybridization
Probes 10x
Celková reakční směs
Kontrolní ApoE E2/E4
HET–16
Rozpouštědlo ApoE-16
Vaše DNA
CELKOVÝ OBJEM
Kontrola
pozitivní
μl
Kontrola
negativní
μl
Vzorek
μl
1,4
1,4
1,4
4,0
0,6
(koneč. 2,5 mM)
1,0
4,0
0,6
(koneč. 2,5 mM)
1,0
4,0
0,6
(koneč. 2,5 mM)
1,0
1,0
1,0
1,0
8,0
8,0
8,0
2,0
2,0
10,0
10,0
2,0
10,0
Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte zkumavky při 13 000ot/min.
Přepipetujte obsah zkumavek do kapilár a kapiláry umístěte do karuselu Lightcycleru.
Aktivujte příslušný program
Denaturace
Programová data cyklu
Cykly
Analytický mód
Teplotní cíle
Cílová teplota (°C)
Inkubační doba (s)
Temperature Transition Rate (°/s)
Sekundární cílová teplota (°C)
Velikost kroku (°C)
Krok zdrţení (cycly)
Akviziční mod
Hodnota
1
Ţádný
Segment 1
95
60
20
0
0
0
Ţádný
114
Amplifikace
Programová data cyklu
Cykly
Analytický mód
Teplotní cíle
Cílová teplota (°C)
Inkubační doba (s)
Temperature Transition Rate (°/s)
Sekundární cílová teplota (°C)
Velikost kroku (°C)
Krok zdrţení (cycly)
Akviziční mód
Segment 1
95
5
20
0
0
0
Ţádný
Hodnota
60
None
Segment 2
58
10
20
0
0
0
Single
Segment 1
95
30
20
0
0
0
Ţádný
Hodnota
1
Křivky tání
Segment 2
Segment 3
40
85
30
0
20
0,2
0
0
0
0
0
0
Ţádný
Kontinuální
Segment 3
72
15
3
0
0
0
Ţádný
Analýza křivky tání
Programová data cyklu
Cykly
Analytický mod
Teplotní cíle
Cílová teplota (°C)
Inkubační doba (s)
Temperature Transition Rate (°/s)
Sekundární cílová teplota (°C)
Velikost kroku (°C)
Krok zdrţení (cykly)
Akviziční mód
Chlazení
Programová data cyklu
Cykly
Analytický mód
Teplotní cíle
Cílová teplota (°C)
Inkubační doba (s)
Temperature Transition Rate (°/s)
Sekundární cílová teplota (°C)
Velikost kroku (°C)
Krok zdrţení (cykly)
Akviziční mód
Hodnota
1
Ţádný
Segment 1
40
30
20
0
0
0
Ţádný
LC programová verze a mód fluorescenčního zobrazení
Vyvinuto s LC programovou verzí 3.5 s automatickou kontrolou nárůstu.
Pro odečet pouţijte F2 a F3 s kompenzací barvy – color compensatiom (povinné !).
115
Typické výsledky a vyhodnocení
Uţití programu křivky tání k zjišťování genotypu vzorků lidské genomové DNA.
Vrcholy křivky tání umoţňuje diskriminace mezi moţnými genotypy kodónu 112 a 158
polymorfismy v genu ApoE. Obr. 1 ukazuje typický výsledek získaný s ApoE ToolSet™ pro
LightCycler™ :
Obr. 1: Analýza křivky tání genotypů kodónů 112 a 158 genu ApoE.
MODRÁ: Homozygoti Arg112Arg (vlevo) a Arg158Arg (vpravo)
ZELENÁ: Oddělený heterozygot Cys112Arg / Cys158Arg = ApoE E2 / E4 HET kontrola
obsaţená v soupravě ToolSet.
ČERVENÁ: Homozygoti Cys112Cys (vlevo) a Cys158Cys (vpravo)
ČERNÁ: Ţádná kontrolní DNA.
Podmínky: Kompenzace barvy (Color Compensation).
Pro konverzi křivky tání kodónu 112 / 158 do ApoE genotypů, pouţít následující
tabulku:
Tabulka 1: Konverze křivky tání kodónu 112 / kodonu 158 je výsledkem genotypu
ApoE
ANO: vrchol pozorovaný v indikované Tm
ne: ţádný vrchol není v indikované Tm
Genotyp
E2/E2
(Cys/Cys)
E3/E3
(Cys/Arg)
E4/E4
(Arg/Arg)
E2/E3
E2/E4
E3/E4
Kodón 112 (LCRed 640, F2)
Tm
Tm
54 – 56° C
62 – 64° C
Kodón 158 (LCRed 705, F3)
Tm
Tm
59 – 61° C
66 – 68° C
ANO
ne
ANO
ne
ANO
ne
ne
ANO
ne
ANO
ne
ANO
ANO
ANO
ANO
ne
ANO
ANO
ANO
ANO
ne
ANO
ANO
ANO
Genotyp
E2/E2
(Cys/Cys)
E3/E3
(Cys/Arg)
E4/E4
(Arg/Arg)
E2/E3
E2/E4
E3/E4
Poznámka : Hodnoty pro odpovídající teploty tání se mohou lišit o +/- 2,5° C mezi různými experimenty.
T mezi vrcholy tání pro různé genotypy se mohou lišit o +/- 0.5° C.
116
Další možnost určení
sestavy
Kombinováním výsledků Analýzy křivky tání ve fluorescenčním alelové
kanálu 2 (F2) a fluorescenčním kanálu 3 (F3) může být určena alelová
sestava analyzovaných vzorků.
Genotyp kodónu 112
Genotyp kodónu 158
Alelová sestava
TGC
TGC
E2 / E2
TGC
CGC
E3 / E3
CGC
CGC
E4 / E4
TGC
CGC/TGC
E2 / E3
CGC/TGC
CGC/TGC
E2 / E4
CGC/TGC
CGC
E3 / E4
117
Pouţité zkratky:
agaróza
bp
lineární polysacharid z D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy
base pairs (páry bází)
komplementární jednořetězcová DNA, která vznikne reverzním přepisem
cDNA
mRNA.
ddH2O
redestilovaná sterilní voda
DMSO
dimethylsulfoxid
dNTP’s
dinukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
dsDNA
double-stranded (dvouřetězcová) DNA
EDTA
ethylendiaminotetraoctová kyselina
kbp
kilo base pairs
OD260nm optická densita při 260 nm
pufr TAE pufr z TRIS – acetátu – EDTA
RT
room temperature (laboratorní teplota)
ssDNA
single-stranded (jednořetězcová) DNA
PSM
PCR-mediated site directed mutagenesis
PCR
polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce)
wt
wild type (zdravá alela)
118

Podobné dokumenty

HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20

HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20 DŮLEŽITÉ : Gel musí být perfektně suchý.

Více

Kapitola 20 DNA diagnostika lidských chorob

Kapitola 20 DNA diagnostika lidských chorob  vrátit pozměněný gen zpátky do buněk a o zkoumat jeho funkci, nebo o začlenit ho do genomu rostliny nebo živočicha tak, aby se stal jeho funkční a dědičnou součásti.  Gen je možno z genomu živé ...

Více

otevřít - REMA TIP TOP

otevřít - REMA TIP TOP se zabývá distribucí a aplikací průmyslových materiálů v české republice jiţ od svého vzniku. V průběhu vývoje se podařilo zabezpečit dobrou distribuci především materiálů pro opravy dopravníkových...

Více

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem metody a s postupem práce daného experimentu. Před začátkem každé úlohy je třeba se předem zamyslet nad možnými pracovními riziky.

Více

Manuál Torrent EGFR NGS kit CJ

Manuál Torrent EGFR NGS kit CJ identifikuje jako body s nízkou molekulovou hmotností. Vysoká koncentrace neočekávaných DNA fragmentů může svědčit o nízké účinnosti amplifikace během PCR reakce a může značit kontaminaci kvality v...

Více

Návod k použití - BAG Health Care GmbH

Návod k použití - BAG Health Care GmbH PCR je vysoce citlivá metoda, která by měla být prováděna osobou se zkušeností s prací v molekulárně biologické laboratoři a s typizací krevních skupin. Současné poznatky z transfuzní medicíny a ur...

Více

QIAsymphony DSP DNA Kits: Charakteristika účinnosti

QIAsymphony DSP DNA Kits: Charakteristika účinnosti Vliv inhibičních látek, které mohou být obsaženy v plné krvi, na účinnost protokolu Virus Blood 200 DSP byl testován přidáním následujících látek: hemoglobin (200 g/l) a bílkovin (120 g/l), stávají...

Více

Návod k soupravě

Návod k soupravě IMMUNOQUICK® NoRotAdeno by měl být skladován při teplotě 2°- 30°C. Test je citlivý na vlhkost a teplotu. Test je stabilní do data exspirace, které je vyznačeno na obalu. Kazety musí být až do jejic...

Více