CH - Základy biochemie

Základy biochemie KBC / BCH
Centrální metabolické děje
Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu
CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem
a státním rozpočtem České republiky.
Centrální metabolické děje
• Osnova:
• Cyklus trikarboxylových kyselin a glyoxylátový cyklus.
• Oxidativní fosforylace.
• Tvorba ATP.
• Rozpojovače a inhibitory oxidativní fosforylace.
Cyklus trikarboxylových kyselin (TCA).
Citrátový cyklus, Krebsův cyklus.
•
•
•
•
•
Citrátový cyklus je sled osmi důmyslných reakcí ve kterém dochází v
cyklu k oxidaci acetylové skupiny acetyl CoA na dvě molekuly CO2 a
uvolněná volná energie se ukládá do redukovaných koenzymů NADH a
FADH2. Produktem jednoho cyklu jsou dvě molekuly CO2, tři NADH,
jedna FADH2 a jedna makroergická sloučenina GTP (=ATP).
Sled těchto reakcím byl intenzivně studován mezi léty 1932 až 1937
řadou badatelů na létacích svalech holubů.
V roce 1935 publikoval maďarský vědec Albert Szent-Gyorgyi poznatek,
že respirace se urychlí přidáním malého množství sukcinátu, fumarátu,
malátu nebo oxaloacetátu. Efekt působení těchto látek byl katalytický.
Další, jako Carl Martius a Franz Knoop ukázali, že citrát může být
převeden na α-oxoglutarát.
Hans Krebs, který publikoval inhibici přechodu sukcinátu na fumarát
(sukcinátdehydrogenasa) malonátem, reakce zastavuje celou oxidaci, tak
měl k dispozici sekvenci reakcí: citrát → akonitát → isocitrát → αoxoglutarát → sukcinát → fumarát → malát → oxaloacetát. Citrát musí
být obnovován.
Historie citrátového cyklu
•
•
•
•
•
•
V roce 1937 publikovali Martius a Knoop klíčový poznatek, který
Krebsovi chyběl pro spojení oxidace v citrátovém cyklu s
metabolismem glukosy. Oxaloacetát a pyruvát mohou být převedeny na
citrát za působení peroxidu vodíku.
Pyruvát jako produkt odbourávání glukosy v glykolýze se tak stal
spojovacím článkem mezi metabolismem sacharidů a citrátovým
cyklem.
Krebs již měl zkušenost s cyklickým dějem – v roce 1932 publikoval
spolu Kurtem Henseleitem močovinový (ornithinový) cyklus.
Krebsův první pokus o publikaci citrátového cyklu v Nature byl
neúspěšný. Práce byla přijata do méně prestižního časopisu
Enzymologia.
Krebs, H.A. and Johnson, W.A.: The role of citric acid in intermediate
metabolism in animal tissues. Enzymologia 4, 148 – 156 (1937).
Hans Adolf Krebs (1900 – 1981) obdržel Nobelovu cenu za lékařství a
fyziologii v roce 1953 spolu s Fritzem Albertem Lipmannem.
• Citrátový cyklus je ústřední metabolická dráha vedoucí k zisku
energie ze substrátů jako jsou sacharidy, mastné kyseliny a
aminokyseliny, které se odbourávají na acetyl CoA.
• Citrátový cyklus je lokalizován v matrix mitochondrií.
• Citrátový cyklus je aerobní metabolická dráha.
• Citrátový cyklus je amfibolický. V cyklu dochází ke katabolické
reakci (odbourávání acetyl CoA na CO2). Meziprodukty cyklu se
využívají k syntézám dalších látek – anabolické reakce.
• Sumární rovnice citrátového cyklu:
3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + acetylCoA →
→ 3 NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2
Přehled vstupu substrátů do citrátového cyklu.
Syntéza acetylCoA z pyruvátu – pyruvátdehydrogenasový komplex.
•
Pyruvát je za aerobních podmínek transportován do matrix mitochondrie
transportním proteinem ( pyruvát – H+ symport).
•
Multienzymový komplex pyruvátdehydrogenasy je skupina tří
nekovalentně vázaných enzymů, který katalyzuje na sebe navazující
reakce.
•
Výhodou multienzymového komplexu je:
A) Sled reakcí je urychlován, protože jsou minimální vzdálenosti mezi
enzymy.
B) Přímá návaznost reakcí zamezuje vedlejším reakcím.
C) Reakce na komplexu mohou být koordinovaně kontrolovány.
Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu:
• Pyruvátdehydrogenasa (E1)
• Dihydrolipoyltransacetylasa (E2)
• Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3)
• Např. komplex E. coli je 4 600 kD proteinový komplex.
Mitochondriální komplex je 10 000 kD protein, obsahující 20 E2
trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3 dimerů.
• Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí,
sumárně:
Pyruvát + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH
• Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát
(TPP), Co A, lipoamid, NAD+ a FAD.
Pyruvátdehydrogenasa (E1)
Dekarboxyluje pyruvát za tvorby hydroxyethyl-TPP meziproduktu.
H3C
R1
R2
N
+
C-
S E1
R1
TPP E1
+
-
O
C
C
O
O
Pyruvát
CH3
R2
H3C
H
+
CO2
H
N
O
+
C
C
-
S E1
CH3
Hydroxyethyl-TPP E1
Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je vázána na E2
amidovou vazbou přes ε-aminoskupinu Lys.
Lipoová kyselina
S
S
Lysin
CH2
CH2
CH2
NH
O
CH
CH2
CH2
CH2
C
NH
(CH2)4
CH
C
Lipoamid
O
2H+ + 2eHS
CH2
CH2
HS
CH2
NH
O
CH
CH2
CH2
CH2
C
Dihydrolipoamid
NH
(CH2)4
CH
C
O
Hydroxyethylová skupina je přenesena
na dihydrolipoyltransacetylasu (E2).
Hydroxyethylový karbanion je současně oxidován na acetyl a lipoamid
redukován na disulfid.
H3C
H3C
R1
H
R2
N
O
+
C
C
-
S E1
CH3
H3C
H+
R1
H
R2
N
O
+
C
C
S
S
S
HS
E2
Lipoamid-E2
S E1
R1
H+
R2
N
+
C
-
S E1
TPP E1
+
CH3
O
C
CH3
S
E2
HS
E2
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
E2 poté katalyzuje transesterifikací, při které se acetyl přenese
na CoA za tvorby acetyl-CoA.
O
CoA
O
CoA
SH
C
CH3
S
HS
HS
HS
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
CH3
Acetyl-CoA
S
E2
C
+
E2
Dihydrolipoamid-E2
Regenerace lipoamidu na E2.
Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný FAD.
FAD
S
FAD
HS
+
S
E3 (oxidovaná forma)
SH
HS
E2
S
+
SH
E3 (redukovaná forma)
S
E2
Reoxidace redukovaného E3.
Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby NADH. FAD slouží
spíše jako vodič elektronů !!!
FAD
FADH2
FAD
SH
S
S
SH
S
S
NAD+
E3 (redukovaná forma)
NADH + H+
E3 (oxidovaná forma)
Aktivní místo dihydrolipoamiddehydrogenasy.
Lipoyllysylové raménko E2
S
HC
S
CH2
CH2
H2C
CH2
• Raménko přenáší
meziprodukty reakce mezi
jednotlivými enzymy.
H2C
CH2
140 nm
O
C
NH
H2C
CH2
H2C
CH2
HC
C
O
N
H
Lipoyllysylové raménko
(plně roztažené)
Animated pyruvát dehydrogenasa.
• http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/stude
nt_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html
Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu.
Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu
a tím i respiraci.
-
O
OH
As
OH
+
HS
-
O
HS
S
As
S
R
Arsenitan
R1
As
O
+
2 H2O
+
H2O
R
Dihydrolipoamid
+
Organická
sloučenina arsenu
HS
S
R1
HS
As
S
R
R
Sir Hans Adolf KREBS (1900-1981)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1900 Born in Germany
1918 Began medical school
1923 Graduated from medical school
1925 Graduated with Ph.D. from University of Hamburg
1932 Identification of Urea Cycle
1933 Emigration to the United Kingdom
1937 Identification of Citric Acid Cycle or "Krebs Cycle"
1945 Became a Professor at University of Sheffield
1953 Won the Nobel Prize in Physiology and Medicine
1954 University of Oxford
1958 Knighted
1981 Died in the United Kingdom, Oxford
Citrátový cyklus animated, Voet, Animated fig. Chapt. 16
• http://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/voet/047121
4957/animated_figures/ch16/f16-2.html
Citrátový cyklus. Citrátsynthasa - první reakce.
Tvorba citrátu z acetyl CoA a oxaloacetátu. Asp jako báze.
His 320
His 320
H
H
-
OOC
C
-
OOC
O
H2C
COO
-
+
His 274
N
His 274
H
-
O
H
-
N
H
H2C
COO
Oxaloacetát
1
N
N
O
H2C
Oxaloacetát
+
C
SCoA
O
H2C
SCoA
Acetyl-CoA
O
-
H
O
Asp 375
O
Asp 375
O
Enol forma acetyl CoA jako nukleoefil !!
His 320
N
H
-
OOC
C
N
O
H2C
OOC
COO
+
H
-
-
OOC
Oxaloacetát
2
OH
C
CH2
CH2
O
C
SCoA
Citryl-CoA
N
H
O
His 274
N
Asp 375
O
H
-
O
H2C
H2O
3
SCoA
CoASH
-
OOC
H
His 274
O
-
Asp 375
O
OOC
C
CH2
OH
CH2
Citrát
COO
-
Akonitasa – druhý krok.
Reverzní izomerizace citrátu a isocitrátu přes cis-akonitát.
COO
-
H2O
CH2
HO
C
COO
H
C
H
COO
-
Citrát
-
COO
H2C
H
-
COO
-
COO
H2O
-
CH2
C
H
C
COO
C
HO
C
H
COO
-
cis-Akonitát
COO
-
Isocitrát
-
NAD+ dependentní isocitrátdehydrogenasa
COO
-
CH2
C
C
HO
C
H
C
-
O
Isocitrát
O
-
CH2
O
H
O
COO
H
-
NAD+
NADH + H+
O
COO
C
C
O
C
-
O
O
COO
CH2
O
C
-
H
2+
Mn
Oxalosukcinát
CO2
O
-
CH2
C
H
-
C
O
C
-
O
2+
Mn
H+
O
C
H
C
O
C
O
-
2-Oxoglutarát
2-Oxoglutarátdehydrogenasa
Oxidační dekarboxylace – analogie pyruvátdehydrogenasy.
E2 -dihydrolipoyltranssukcinylasa
COO
-
CoA-SH
CH2
CO2
CH2
C
O
C
COO
-
CH2
CH2
O
O
-
2-Oxoglutarát
C
NAD+
NADH + H+
S
O
CoA
Sukcinyl-CoA
Sukcinyl-CoA synthetasa (sukcinátthiokinasa).
•
•
•
Savčí enzym obvykle katalyzuje tvorbu GTP z GDP a Pi.
U rostlin a bakterií je to ATP z ADP a Pi.
ATP
a
GTP
jsou
energeticky
ekvivalentní,
nukleosiddifosfátkinasa dochází k přechodu:
GTP + ADP
GDP + ATP
díky
enzymu
∆ Go´= O !!
•
Reakce katalyzovaná sukcinyl-CoA synthetasou je další příklad fosforylace
na úrovni substrátu (nezávisí na přítomnosti kyslíku).
•
•
•
•
Reakce probíhá ve třech stupních:
A) Sukcinyl-CoA reaguje s Pi za tvorby sukcinylfosfátu a CoA.
B) Transfer fosfátu z sukcinylfosfátu na His enzymu za uvolnění sukcinátu.
C) Fosfát z enzymu je přenesen na GDP za tvorby GTP.
•
V tomto bodě citrátového cyklu je acetyl kompletně oxidován na dvě CO2,
dva NADH a GTP. Další část cyklu je převod sukcinátu na oxaloacetát.
První fáze sukcinyl-CoA synthetasové reakce.
COO
CH2
CH2
O
C
-
COO
OH
+
S CoA
Sukcinyl-CoA
O
P
O
O
-
1
-
CH2
CH2
-
O
C
O
+
2PO3
Sukcinyl-fosfát
HS CoA
Druhá fáze sukcinyl-CoA synthetasové reakce.
COO
-
CH2
CH2
O
C
O
Enzym
+
2PO3
Sukcinyl-fosfát
N
N
COO
H
2
CH2
O
C
O
Enzym
+
CH2
H+
His
-
-
Sukcinát
N
N
H
+
2-
PO3
3-Fosfo-His
Třetí fáze sukcinyl-CoA synthetasové reakce.
Enzym
Enzym
O
G
O
P
-
O
O
O
GDP
-
P
O
O
-
+
N
N
H
3
+
2PO3
3-Fosfo-His
N
N
H+
His
H
O
+
G
O
P
O
-
O
O
P
O
GTP
-
O
O
-
P
O
O
-
Sukcinátdehydrogenasa
Stereospecifická dehydrogenace sukcinátu na fumarát.
•
•
Enzym je jediným z citrátového cyklu lokalizovaný v mitochondriální
membráně a obsahující kovalentně vázaný FAD, který je redukován na
FADH2.
FAD se obvykle účastní oxidace alkanů za tvorby alkenů. Pro další
katalytický cyklus musí být FADH2 nejdříve reoxidován. Přenos
elektronů je součástí mitochondriálního elektronového transportního
řetězce.
COO
-
H
C
H
H
C
H
COO
-
Sukcinát
H
+
E-FAD
-
OOC
C
C
COO
-
+
H
Fumarát
E-FADH2
Kovalentní vazba FAD na His sukcinátdehydrogenasy.
Enzym
CH2
His
N
N
H2C
H3C
H2C
R
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
CH2
N
N
NH
N
FAD
O
O
Inhibice sukcinátdehydrogenasy substrátovým analogem malonátem
– jeden z Krebsových příspěvků k objasnění citrátového cyklus.
COO
COO
-
CH2
COO
-
CH2
CH2
-
Malonát
COO
-
Sukcinát
Fumarasa (fumaráthydratasa)
Adice vody na dvojnou vazbu za tvorby malátu. Reakce probíhá přes
karbaniontový přechodový stav. Adice OH – předchází adici H+.
H
-
OH
H
-
OOC
C
C
COO
H
Fumarát
OOC
COO
-
C
C
H
-
OH
H+
Karbaniontový
přechodový stav
-
H
H
-
COO
C
OOC
C
H
Malát
OH
-
Malátdehydrogenasa - regenerace oxaloacetátu
•
•
•
Mechhanismus přenosu hydridového aniontu na NAD+ je obdobný jako
u laktátdehydrogenasy.
Malátdehydrogenasová reakce má ∆ Go´= + 29, 7 kJ.mol-1 a proto je
koncentrace oxaloacetátu v rovnováze velmi nízká.
Reakci udržuje odběr oxaloacetátu citrátsynthasou, protože
citrátsynthasová reakce má ∆ Go´= - 31, 5 kJ.mol-1.
H
H
-
COO
C
OOC
C
H
Malát
OH
-
+
H
+
NAD
-
OOC
H
C
C
COO
-
+
O
Oxaloacetát
NADH
+
H+
Regulace citrátového cyklu
•
Oxidace jednoho acetylu v jednom cyklu vede ke tvorbě dvou CO2
(Pozor: to nejsou atomy uhlíku vstupujícího acetyl-CoA) ve 4 x
dvouelektronovém procesu.
•
Dalším ziskem jsou tři molekuly NADH a jedna FADH2 a jedno GTP.
•
Elektrony z redukovaných koenzymů jsou přeneseny do elektronového
transportního řetězce, který vede k redukci O2 na H2O a uvolněná
energie se zachytí jako ATP.
•
Oxidace jednoho NADH vede ke tvorbě tří ATP a oxidace jednoho
FADH2 ke tvorbě dvou ATP.
•
Jeden cyklus vede ke tvorbě 12 ATP!!!
•
Vyjdeme-li z molekuly glukosy, získáme za aerobních podmínek cca 38
ATP!!!
Aerobní zisk ATP z glukosy:
Regulace pyruvátdehydrogenasy
•
Pyruvátdehydrogenasa je jediný savčí systém tvorby acetyl CoA z
pyruvátu.
•
•
•
Dva regulační systémy:
A) Inhibice produkty – NADH a acetyl-CoA.
B) Kovalentní modifikace systémem fosforylace / defosforylace E1.
•
A) Vysoké poměry NADH / NAD+ a acetyl-CoA / CoA udružují enzym E2
v acetylovaném stavu, který nepřijímá hydroxyethylovou skupinu –
zpomalení pyruvátdehydrogenasy.
•
B) U eukaryot produkty jako NADH a acetyl CoA, aktivují
pyruvátdehydrogenasakinasu. Výsledná fosforylace specifického Ser
vede k inaktivaci pyruvátdehydrogenasy. Insulin, signál dostatku
glukosy, aktivuje pyruvátdehydrogenasafosfatasu a tím enzym aktivuje.
Aktivace a deaktivace pyruvátdehydrogenasy
defosforylací a fosforylací.
Pi
E1-OH (aktivní)
Pyruvátdehydrogenasa
fosfatasa
H2O
ATP
Pyruvátdehydrogenasa
kinasa
E1-OPO3
2-
(inaktivní)
ADP
Enzymy kontroly rychlosti citrátového cyklu:
• Změna standardní volné energie (∆ Go´) a fyziologická změna volné
energie (∆ G) reakcí citrátového cyklu.
Reakce Enzym
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1
2
3
4
5
6
7
8
Citrátsynthasa
Akonitasa
Isocitátdehydrogenasa
2-Oxoglutarátdehydrogenasa
multienzymový komplex
Sukcinyl CoAsynthetasa
Sukcinátdehydrogenasa
Fumarasa
Malátdehydrogenasa
∆ Go´
(kJ.mol-1)
- 31, 5
~5
- 21
- 33
∆ G
(kJ.mol-1)
Negativní
~0
Negativní
Negativní
- 2, 1
+ 6, 0
- 3, 4
+ 29, 7
~0
~0
~0
~0
Regulace citrátového cyklu
•
Identifikace rychlost limitujících pochodů CC je obtížná, protože
neznáme přesné koncentrace substrátů a produktů, které se pohybují
mezi matrix a cytosolem.
•
Tři enzymy CC jsou za fyziologických podmínek mimo rovnováhu:
1)
citrátsynthasa
2)
NAD+-dependentní isocitrátdehydrogenasa
3)
2-oxoglutarátdehydrogenasa.
•
V srdečním svalu je průtok metabolitů CC závislý na spotřebě kyslíku.
•
Citrátový cyklus je kontrolován:
A) Dostupností substrátů
B)
Inhibicí produkty.
C)
Kompetitivní zpětnovazebnou inhibicí meziprodukty cyklu.
Regulace citrátového cyklu
• Acetyl CoA a oxaloacetát jako hlavní substráty jsou přítomny v
matrix v nízkých koncentracích, které nesaturují citrátsynthasu.
• Metabolický tok přes citrátsynthasu závisí na dostupnosti
substrátů.
• Koncentrace oxaloacetátu, který je v rovnováze s malátem se
pohybuje v závislosti na [NADH] / [NAD+ ] dle rovnice:
K = [oxaloacetát].[NADH] / [malát].[ NAD+ ]
• Znamená to, že v pracujícím svalu při zvyšující se respiraci klesá
současně [NADH] v mitochondrii. To doprovází vzrůst
[oxaloacetátu], který stimuluje citrátsynthasu.
Další momenty regulace citrátového cyklu:
Pyruvát
Ca2+
Acetyl-CoA
Oxaloacetát
Citrát
Malát
Fumarát
NADH
Isocitrát
Ca2+
ADP
Sukcinát
GTP
Sukcinyl-CoA
2-Oxoglutarát
Ca2+
ATP
Amfibolické funkce citrátového cyklu:
Pyruvát
CO2
Acetyl-CoA
Aminokyseliny Glukosa
Mastné
kyseliny
Cholesterol
Oxaloacetát
Aspartát
Fenylalanin
Tyrosin
Citrát
Malát
Fumarát
Isocitrát
Sukcinát
Sukcinyl-CoA
2-Oxoglutarát
Porfyriny
Isoleucin
Methionin
Valin
Aminokyseliny
Prodloužení řetězce
mastných kyselin
Kataplerotické reakce
- dráhy využívající meziprodukty citrátového cyklu.
• 1. Glukoneogeneze – oxaloacetát k syntéze glukosy. Oxaloacetát
musí být transportován do cytosolu, kde glukoneogeneze probíhá.
Vstupuje tam ve formě malátu nebo aspartátu. Vzhledem k
cyklickému charakteru CC, může být takto využit k syntéze
glukosy každý meziprodukt.
• 2. Biosyntéza mastných kyselin – probíhá v cytosolu. Acetyl CoA
je do cytosolu transportován ve formě citrátu.
• V cytosolu je ATP-citrátlyasa která katalyzuje reakci:
ATP + citrát + CoA → ADP + Pi + oxaloacetát + acetyl CoA.
• 3. Biosyntéza aminokyselin – 2-oxoglutarát přechází na Glu a
oxaloacetát na Asp.
Glutamátdehydrogenasová reakce tvorby glutamátu:
COO
-
COO
-
CH2
CH2
+
CH2
C
O
COO
-
2-Oxoglutarát
NADH
+
H+
+
NH4+
+
CH2
H
+
C
NH3
COO
-
Glutamát
NAD+
+
H2O
Transaminace oxaloacetátu na aspartát:
COO
-
COO
CH2
CH2
CH3
C
O
COO
-
Oxaloacetát
+
H3N
+
C
H
COO
-
Alanin
-
H3N
+
CH3
C
H
COO
-
Aspartát
+
C
O
COO
-
Pyruvát
Anaplerotické reakce
– doplňující meziprodukty citrátového cyklu.
• Nejdůležitější anaplerotickou reakcí je pyruvátkarboxylasová:
Pyruvát + CO2 + ATP + H2O → oxaloacetát + ADP + Pi
• Reakce je také prvním stupněm glukoneogeneze.
• Pyruvátkarboxylasu aktivuje acetyl CoA.
• Další anaplerotickou látkou je sukcinyl-CoA, který se tvoří při
odbourávání mastných kyselin s lichým počtem uhlíků a některých
aminokyselin.
• Dále 2-oxoglutarát a oxaloacetát vznikající reverzibilní
transaminací Glu a Asp.
Anaplerotické reakce citrátového cyklu:
Reverzní citrátový cyklus. Některé bakterie produkující uhlíkaté
stavební jednotky z vody a CO2. Jedna z forem fixace CO2.
Glyoxylátový cyklus
Rostliny, bakterie a plísně obsahují enzymy, které katalyzují
konverzi acetyl-CoA na oxaloacetát.
•
Glyoxylátový cyklus probíhá v glyoxysomech a mitochondriích. Glyoxysomy
jsou na membránu vázané organely, specializované peroxisomy.
•
•
Řada enzymů je společných s citrátovým cyklem.
Navíc: glyoxysomální isocitrátlyasa a malátsynthasa.
•
Výsledkem glyoxylátového cyklu je převod dvou molekul acetyl CoA na
sukcinát, kdežto v citrátovém cyklu se uhlíky acetyl CoA uvolňují jako CO2.
•
Vytvořený sukcinát je transportován do mitochondrie - do CC a převeden
na malát- anaplerotická reakce !!
•
Malát může být převeden na oxaloacetát, nebo transportován do cytosolu
a tam převeden na oxaloacetát jako prekurzor glukosy v glukoneogenezi.
Reakce glyoxylátového cyklu v glyoxysomech:
GLYOXYSOM
COO
-
OOC
C
SCoA
2
C
COO
Akonitasa
Citrátsynthasa
O
OOC
COO -
CH2
Citrát
1
Acetyl-CoA
-
C
-
OH
HSCoA
O
H3C
CH2
CYTOSOL
-
OOC
CH2
CH COO -
CH
Isocitrát OH
COO -
CH2
-
Oxaloacetát
NADH + H+
Malátdehydrogenasa
5
-
OOC
+
NAD
OOC
CH
CH2
COO
-
Malátsynthasa
Malát
H
CH2 COO -
O
+
C
COO -
Glyoxylát
4
HSCoA
Do cytosolu
CH2
Sukcinát
OH
-
3
Isocitrátlyasa
O
H3C
C
SCoA
Acetyl-CoA
Do mitochondrie
Část glyoxylátového cyklu v mitochondrii:
MITOCHONDRIE
-
OOC
CH2
CH2 COO -
Sukcinát
FAD
Sukcinátdehydrogenasa
FADH2
-
OOC
H
C
C
H
COO -
Fumarát
H2O
Fumarasa
OH
-
OOC
CH
CH2
COO -
Malát
Citrátový cyklus
Dráha malátu v cytosolu:
CYTOSOL
OH
-
OOC
CH
O
CH2
COO -
-
OOC
Malát
C
CH2
Oxaloacetát
NAD+
NAD + H+
COO -
GLUKONEOGENEZE
Význam glyoxylátového cyklu.
• Celková reakce glyoxylátového cyklu:
2 Acetyl CoA + 2 NAD+ + FAD →
→ oxaloacetát + 2 CoA + 2 NADH + FADH2 + 2 H+
• Isocitrátlyasa a malátsynthasa existují jen u rostlin a některých
mikroorganismů.
• Umožňují klíčícím rostlinám využívat skladované triacylglyceroly.
• Jedná se o anaplerotickou reakci !! Vnáší oxaloacetát do
citrátového cyklu.
• Patogen, jako Mycobacterium tuberculosis přežívá v plících aniž
by bylo odhaleno imunitním systémem. Využívá glyoxylátový
cyklus. Možnost zásahu - inhibice isocitrátlyasy. Obdobně
kvasinka Candida albicans.
Elektronový transport a oxidativní fosforylace
•
•
•
•
Mitochondrie
Elektronový transport
Oxidativní fosforylace
Kontrolní systém oxidativního metabolismu.
• Moto:
• Odpočívající lidské tělo spotřebuje asi 420 kJ energie za hodinu,
což odpovídá spotřebě 100 W žárovky.
• Energie se získává elektrochemicky v mitochondriích při napětí
0, 2 V (v el. síti 220 V), ale proud odpovídá 500 Amp, což
reprezentuje transmembránový pohyb přibližně 3 x 1021 protonů
za sekundu. Tento pohyb vede k tvorbě ATP.
Mitochondrie
• Mitochondrie jsou místem eukaryotního oxidačního metabolismu.
• Mitochondrie obsahují:
Pyruvátdehydrogenasu, enzymy citrátového cyklu, enzymy
katabolismu mastných kyselin a enzymy, spolu s proteiny,
elektronového transportního řetězce a oxidativní fosforylace.
Mitochondrie
Vnější membrána
Vnitřní membrána
Kristy
Matrix
Mezimembránový prostor
Drsné endoplazmatické retikulum
Mitochondriální transportní systém
• Vnější mitochondriální membrána, stejně jako bakteriální,
obsahuje poriny, proteiny, které dovolují volnou difůzi molekul do
10 kD. Je tedy ekvivalentní s cytosolem.
• Vnitřní membrána, která je hmotnostně složena ze 75 %
z proteinů, volně propouští O2, CO2 a H2O. Jinak obsahuje řadu
transportních proteinů, které kontrolují průchod metabolitů jako
jsou ATP, ADP, pyruvát, Ca2+ a fosfát.
• Redukované ekvivalenty (NADH) se transportují z cytosolu do
mitochondrie,
buď
malát-aspartátovým
člunkem
nebo
glycerol-3-fosfátovým člunkem.
• NADH transportované malát-aspartátovým člunkem poskytuje
po oxidaci jen 2 ATP.
Malát-aspartátový člunek:
-
Cytosol
COO
HO
H
C
Vnitřní
mitochondrionální
membrána
-
Mitochondrie
COO
HO
CH2
CH2
COO-
NAD+
Malát
Malát
Malátdehydrogenasa
COO-
NAD+
Malátdehydrogenasa
NADH + H+
NADH + H+
-
-
COO
COO
O
C
Oxaloacetát
Oxaloacetát
CH2
COO-
Aminokyselina
Aminokyselina
Aspartátaminotransferasa
Aspartátaminotransferasa
α-Ketokyselina
-
COO
+
C
O
C
CH2
COO-
H3N
H
C
α-Ketokyselina
Aspartát
Aspartát
H
H3N
CH2
+
C
CH2
COO-
Glukoneogeneze
-
COO
H
COO-
PEP
PEP
Glycerol-3-fosfátový člunek:
NADH + H+
Cytosolická
glycerol-3-fosfát
dehydrogenasa
CH2OH
O
NAD+
CH2OH
HO
C
2-
H
2-
CH2OPO3
CH2OPO3
Dihydroxyacetonfosfát
Glycerol-3-fosfát
Mitochondrionální
glycerol-3-fosfát
dehydrogenasa
Cytosol
E-FADH2
QH2
Matrix
C
E-FAD
Q
Vnitřní
mitochondriální
membrána
Translokátor ADP – ATP
• Většina v mitochondrii vytvořeného ATP se využívá v cytoplasmě.
• Vnitřní
mitochondriální
membrána
obsahuje
ADP-ATP
translokator transportující ATP do cytosolu a ADP z cytosolu do
mitochondrie.
• Translokator je dimer identických 30 kD podjednotek s jedním
vazebným místem pro ADP i ATP, které vzájemně kompetují.
• Translokátor mění konformaci při vazbě buď ADP nebo ATP.
• Export ATP (4 záporné náboje) proti importu ADP (3 záporné
náboje)
je
elektrogenní
antiport
poháněný
rozdílem
membránového potenciálu.
Konformační změny ADP-ATP translokátoru
Transport fosfátů
• K syntéze ATP z ADP a Pi je nutné transportovat fosfát
z cytosolu do mitochondrie.
• Fosfátový nosič – lze charakterizovat jako elektrochemický Pi-H
symport poháněný rozdílem (∆ pH) (transmembránový protonový
gradient).
• Vytvořený transmembránový protonový gradient nevede pouze
k syntéze ATP, ale také k transportu ADP a Pi.
Elektronový transport. Termodynamika.
• Elektronové nosiče přenášející elektrony z NADH a FADH2 na
kyslík jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně.
• Oxidace NADH je silně exergonická. Měřítkem afinity substrátu
k elektronům je standardní redukční potenciál (ξo´). Čím vyšší
hodnota, tím větší afinita k elektronům.
•
•
•
•
Poloreakce oxidace NADH kyslíkem jsou:
NAD+ + H+ + 2 eNADH
½ O2 + 2 H+ + 2 eH2O
NADH je donor elektronů, O2 akceptor.
ξo´= - 0, 315 V
ξo´= 0, 815 V
• Celková reakce: ½ O2 + NADH + H+ → H2O + NAD+
∆ ξo´= 0, 815 V – (-0, 315 V) = 1, 130 V !!!
• Oxidace NADH poskytuje ∆ Go´ = - 218 kJ.mol-1 volné energie.
• K syntéze jednoho molu ATP z ADP a Pi je třeba 30, 5 kJ.mol-1.
• Energetický rozdíl ∆ Go´ = - 218 kJ.mol-1 nelze přímo převést na
několik ATP.
• Ve vnitřní mitochondriální membráně je soustava tří
proteinových komplexů přes které putují elektrony z NADH ke
kyslíku.
• Celková volná energie je tak rozdělena na tři menší části z nichž
každá se podílí na tvorbě ATP oxidativní fosforylací. Oxidace
NADH poskytne přibližně 3 ATP.
• Termodynamická efektivita za standardních biochemických
podmínek je 42 %. (3 x 30,5 kJ.mol-1 x 100 / 218 kJ.mol-1).
Komplexy sekvence elektronového transportu
•
Komplexy jsou řazeny podle vzrůstajícího redukčního potenciálu.
•
Komplex I: Katalyzuje oxidaci NADH koenzymem Q (CoQ).
NADH + CoQ (oxidovaný) → NAD+ + CoQ (redukovaný)
∆ ξo´= 0, 360 V; ∆ Go´ = - 69, 5 kJ.mol-1
• Komplex III: Katalyzuje oxidaci CoQ (red.) cytochromem c.
CoQ (redukovaný) + 2 cytochrom c (oxidovaný) →
→ CoQ (oxidovaný) + 2 cytochrom c (redukovaný)
∆ ξo´= 0, 190 V; ∆ Go´ = - 36, 7 kJ.mol-1
•
Komplex IV: Katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu c kyslíkem –
terminálním akceptorem elektronů.
2 cytochrom c (red.) + ½ O2 → 2 cytochrom c (oxid.) + H2O
∆ ξo´=0, 580 V; ∆ Go´ = - 112 kJ.mol-1.
Komplex II.
• Komplex II: Katalyzuje oxidaci FADH2 koenzymem Q.
FADH2 + CoQ (oxid.) → FAD + CoQ (red.)
∆ ξo´= 0, 085 V; ∆ Go´ = - 16, 4 kJ.mol-1
• Redoxní reakce neposkytuje dostatečné množství energie pro
tvorbu ATP. Funkcí je, pouze předávat elektrony z FADH2 do
elektronového transportního řetězce.
• Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec:
• Rotenon
– rostlinný toxin používaný indiány na Amazonce
k lovu ryb, také insekticid)
• Amytal
– barbiturát.
• Antimycin
- antibiotikum.
• Proč lze inhibici rotenonem zrušit přídavkem sukcinátu??
Mitochondriální elektronový transport
Komplex I – NADH – koenzym Q oxidoreduktasa
• Komplex I je největší protein v mitochondriální membráně – 43
podjednotek o celkové hmotnosti 900 kD.
• Komplex I obsahuje jednu molekulu FMN a 6 až 7 komplexů
(klastrů) železo-síra.
• Klastry jsou prostetickými skupinami proteinů železo-síra nebo
jinak nehemové proteiny.
• FMN je pevně vázaný na proteiny; zatímco CoQ je, díky svému
hydrofobnímu isoprenoidnímu řetězci, volně pohyblivý v lipidové
dvojvrstvě membrány.
• U savců obsahuje řetězec 10 C5 isoprenoidních jednotek (Q10).
U některých organismů je kratší – 6 nebo 8 jednotek.
Klastry železo-síra. Přechod elektronů mezi Fe2+ a Fe3+.
Cys
Cys
Cys
Cys
Cys
S2-
2-
S
Fe
S2-
[2Fe-2S]
S2-
Fe
Fe
Cys
Cys
Fe
S2-
Fe
S2-
Fe
[4Fe-4S]
Cys
Oxidační stavy
2-
H2C
OPO 3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H
H3C
O
CH2
N
N
O
N
N
H3C
FMN a koenzymu Q (CoQ):
H
H3CO
CH3
CH3
H
H3CO
CH2
O
O
Flavinmnonukleotid (FMN)
(oxidovaná nebo chinonová forma)
N
H3C
N
H
N
N
H
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R
OH
O
Koenzym QH nebo ubisemichinon
(radikálová nebo semichinonová forma)
H
R
H
H3C
N
N
H3C
N
H
H
O
H
H
n
H
FAMNH (radikálová nebo semichinonová forma)
H
CH2
Koenzym Q (CoQ) nebo ubichinon
(oxidovaná nebo chinonová forma)
R
H3C
C
Isoprenoidní jednotky
H
H
CH
OH
N
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R
O
FMNH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
OH
Koenzym QH2 nebo ubichinol
(redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Přenos elektronů a translokace protonů v komplexu I.
• Tok elektronů z NADH na CoQ probíhá stupňovitě mezi redox
centry.
• NADH se účastní vždy jen dvouelektronové výměny. FMN a CoQ
mohou přenášet jak dva, tak jeden elektron a proto tvoří
elektronovou spojku mezi dvouelektronovým NADH a
jednoelektronovými akceptory – cytochromy.
• Při toku elektronů mezi redox centry komplexu I jsou
transportovány čtyři protony z matrix do mezimembránového
prostoru.
Komplex II (sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasa).
• Komplex
II
obsahuje
enzym
citrátového
cyklu
sukcinátdehydrogenasu. Přenáší elektrony z FADH2 na CoQ.
–
• Komlex II obsahuje sukcinátdehydrogenasu s kovalentně
vázaným FAD, několik klastrů Fe-S a jeden cytochrom b560.
• Komplex I a II nejsou v sérii.
• Komplex II přenáší elektrony z sukcinátu na CoQ.
• CoQ je mobilní sběrač elektronů.
• Cytochrom b560 slouží pravděpodobně k odstraňování kyslíkatých
radikálů vznikajících vedlejšími reakcemi.
Cytochromy-hemové transportní proteiny.
Během transportu elektronů alternují mezi Fe2+ a Fe3+.
PROTEIN
CH3
H2C
CH
CH2
CH
HO
1
+
CH
CH2
S
CH
CH3
H3C
CH
Cys
CH3
S
N
4
N
Fe
O
H
3
3
N
8
CH2
CH3
2
H3C
C
Cys
CH
CH2
H3C
N
CH
+
2+
7
+
5
N
CH3
H3C
N
Fe
N
CH2
N
CH
+
2+
N
Fe
N
+
N
H3C
CH3
2+
N
+
H3C
CH3
6
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COO
-
Hem a
COO
-
COO
-
COO
-
Hem b
(Fe-protoporfyrin IX)
COO
-
COO
Hem c
-
CH3
Hemové skupiny redukovaných Fe2+ cytochromů mají charakteristická
absorpční spektra ve viditelné oblasti (Soretovy pásy).
γ
ABSORBANCE
γ
β
Cytochrom a
439
Cytochrom b
429
532
563
Cytochrom c
415
521
550
Cytochrom c1
418
524
554
Cytochrom c
α
β
300
400
α
500
Vlnová délka (nm)
600
600
Komplex III (Koenzym Q – cytochrom c oxidoreduktasa)
• Komplex III (také jako cytochrom bc1) transportuje elektrony
z redukovaného CoQH2 na cytochrom c.
• Obsahuje: Dva cytochromy typu b, jeden c1 a jeden klastr [2Fe-2S],
znám také jako Rieskeho centrum.
• Transport elektronů a pumpování protonů probíhá tzv. Q cyklem.
• CoQH2 podstupuje dva cykly reoxidace za tvorby stabilních
meziproduktů – semichinonů CoQ.
• Existují dvě nezávislá centra pro koenzym Q: Qo vážící CoQH2 (blíže
vnější straně membrány – out) a Qi (blíže vnitřní straně membrány –
inner) vážící semichinon CoQ..
Rekce Q cyklu
• První cyklus:
CoQH2 + cytochrom c1 (Fe3+) →
→ CoQ. + cytochrom c1(Fe2+) + 2 H+ (mezimembránový prostor)
• V druhém cyklu nejdříve další CoQH2 opakuje první cyklus.
CoQH2 + CoQ. + cytochrom c1 (Fe3+) + 2 H+ (z matrix) →
→ CoQ + CoQH2 + cytochrom c1 (Fe2+) + 2 H+ (do mezimembrány)
•
Z každých dvou CoQH2 vstupující do Q cyklu, je jeden regenerován.
• Celková reakce:
CoQH2 + 2 cytochrom c1(Fe3+) + 2H+ (z matrix) →
→ CoQ + 2 cytochrom c1 (Fe2+) + 4 H+ (do mezimembránového prostoru).
•
Elektrony jsou následně přenášeny na cytochrom c, který je transpotuje do
komplexu IV.
První část Q cyklu.
M
E
Z
I
M
E
M
B
R
Á
N
O
V
Ý
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+
P
R
O
S
T
O
R
FeS-protein
QH2
Q
e-
e-
bL
e-
bH
e-
c1
Q
Q
o
PRVNÍ CYKLUS
e-
Q
Q
Q
i
M
A
T
R
I
X
Druhá část Q cyklu
M
E
Z
I
M
E
M
B
R
Á
N
O
V
Ý
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+
FeS-protein
P
R
O
S
T
O
R
QH2
Q
e-
e-
QH2
bL
e-
bH
e-
c1
e-
Q
Q
o
DRUHÝ CYKLUS
Q
Q
i
Q
M
A
+
2H T
R
I
X
Komplex IV (cytochrom c oxidasa)
•
Komplex IV katalyzuje jednoelektronovou oxidaci čtyřech redukovaných
cytochromů c a současnou čtyřelektronovou redukci jedné molekuly O2.
4 Cytochrom c (Fe2+) + 4 H+ + O2 → 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O
•
Komplex IV obsahuje čtyři redoxní centra: cytochrom a, cytochrom a3,
atom mědi značený jako CuB a dvojici atomů mědi označovaných jako CuA
centrum.
Redukce O2 cytochrom c oxidasou je postupný složitý proces.
Cytochrom c oxidasa má dva kanály translokace protonů. Čtyři tzv. chemické
nebo skalární protony jsou odňaty z matrix během redukce kyslíku za tvorby
dvou molekul vody. Proces je spojen s translokací čtyř tzv. pumpovaných
nebo vektorových protonů z matrix do mezimembránového prostoru.
•
•
•
Při reakci komplexu IV je celkově transportováno přes vnitřní
mitochondriální membránu osm protonů.
8 H+(matrix) + O2 + 4 cytochrom c (Fe2+) →
→ 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O + 4 H+ (do mezimembránového prostoru)
Přenosy energie při oxidativní fosforylaci.
Oxidativní fosforylace-ATP synthasa (Komplex V).
Energetické spojení. Volná energie transportu protonů se uplatní při tvorbě ATP.
Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace – Peter Mitchell
(1920-1992), Nobelova cena za Fyziologii a medicínu 1978.
Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen
transfer by a chemiosmotic type of mechanism.
Nature 191, 144-148 (1961).
Volná energie elektronového transportu je realizována pumpováním
H+ z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru za
tvorby elektrochemického H+ gradientu přes membránu.
Elektrochemický gradient je posléze uplatněn při syntéze ATP.
Tato volná energie se nazývá protonmotivní síla.
Naměřený membránový potenciál přes membránu jaterní
mitochondrie je 0, 168 V (v matrix negativní). Naměřené pH v
matrix je o 0, 75 jednotky vyšší než v mezimembránovém prostoru.
∆G pro transport protonů z matrix je 21, 5 kJ.mol-1 – endergonní
proces. Rušení gradientu, syntéza ATP, je proces exergonní!!
ATP synthasa – protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa.
• ATP synthasa je multipodjednotkový transmembránový protein o
celkové molekulové hmotnosti 450 kD.
• ATP synthasa je složena ze dvou funkčních jednotek
(komponent), Fo a F1. (Fo vyslovuj ef ó - o znamená na oligomycin
citlivá komponenta).
• Fo je ve vodě nerozpustný transmembránový protein obsahující
více jak osm různých typů podjednotek.
• F1 je vodě rozpustný periferní membránový protein složený z
pěti typů podjednotek, které lze jednoduše oddělit od Fo
působením močoviny.
• F1 komponenta ATPsynthasy má podjednotkové složení α3β3γδε.
• Rozpuštěná F1 komponenta (oddělená od Fo) hydrolyzuje, ale
nesyntetizuje ATP.
• Fo komponenta je složena z vícečetných podjednotek.
• V E.coli např. existují tři transmembránové komponenty: a, b, a c
- ve formě a1b2c9-12 komplexu.
Model F1Fo-ATPasy z E. coli.
Komplex γε-c12 je rotor a část αβ2−α3β3δ komplex je stator.
Mechanismus rotace F1Fo-ATPasy.
•
Protony z mezimembránového prostoru vstupují do podjednotky c, kde
reagují s podjednotkou a a vystupují ven až se c kruh otočí o jednu otočku
(černá šipka), kdy se podjednotka c znovu setká s podjednotkou a.
Pohyb protonů přes membránu pohání rotaci c kruhu.
Mechanismus vazebné změny – tvorba ATP z ADP a Pi.
•
F1 komponenta má tři reaktivní katalytické protomery (αβ jednotky),
každý ve jiném konformačním stavu.
•
•
•
•
L - váže substrát a produkt slabě (L = loosely)
T - váže pevně (T = tightly)
O - neváže vůbec, je otevřený (O = open)
Uvolněná energie translokací protonů se realizuje přechodem mezi
těmito stavy.
Fosfoanhydridová vazba ATP je syntetizována jen ve stavu T a ATP se
uvolňuje ve stavu O.
•
•
•
•
•
Tři stupně:
ADP a Pi se váží do stavu L.
Průchod protonů mění konformaci L na T.
ATP je syntetizované ve stavu T, druhé ATP se dostává pohybem rotoru
do stavu O a oddisociuje.
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
O
T
AT
P
L
1
L
O
T
AT
P
ADP + Pi
ADP Pi
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
ADP Pi
ENERGIE
ADP Pi
L
2
L
O
AT
P
T
AT
P
O
T
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
ADP Pi
H 2O
ATP
ATP
T
O
AT
P
L
T
3
L
O
F1Fo-ATPasa je točivý stroj.
•
•
•
•
•
•
Model Masamitsu Futai. Sferoid α3β3 z E. coli F1Fo-ATPasy byl upoután
hlavou dolů na skleněnou desku. Šest postupných His zbytků (zvané Histag) bylo mutagenezí navázáno na N-konec α podjednotky, která je
lokalizována na vrcholu α3β3.
His-tag komplet byl uchycen na povrch skleněné desky potažené
křenovou peroxidasou (přilnavá ke sklu) konjugované s Ni2+-nitriloctovou
kyselinou [ Ni2+- N(CH2COOH)3], která váže pevně His-tagy. Část
Fosměřuje nad povrch.
Glu jedné z podjednotek c byl mutagenezí zaměněn za Cys a ten
kovalentně spojen s avidinem. Fluorescenčně značený a biotynylovaný
(na jednom konci) filament svalového proteinu aktinu byl navázán na c
podjednotku přes můstek tvořený straptavidinem (bakteriální protein,
který silně váže biotin ke všem čtyřem vazebným místům).
Takto sestaven se otáčí rotor opačným směrem, pumpuje protony
zevnitř ven na úkor hydrolýzy ATP.
Pozorováno fluorescenčním mikroskopem v roztoku 5 mM MgATP.
Takto bylo prokázáno, že γ podjednotka rotuje po 120o.
F1Fo-ATPasa je točivý stroj
Yoshida&Hisabori Lab.
• http://www.res.titech.ac.jp/~seibutu/main.html
Poměr P/O
• Poměr P/O reprezentuje relaci mezi množstvím syntetizovaného
ATP (P) a množství redukovaného kyslíku (O).
• Tok dvou elektronů přes komplexy I, III a IV vede ke
translokaci 10 protonů. Zpětný tok těchto protonů pře ATPasu
poskytuje 3 ATP.
• Elektrony z FADH2, vynechávají komplex I, vedou ke translokaci
6 protonů, což poskytuje jen 2 ATP.
• U aktivně respirujících mitochondrií nebývá poměr P/O celé
číslo.
• Peter Hikle prověřoval P/O poměry a prokázal, že aktuální
hodnoty jsou blíže číslů 2, 5 a 1, 5 a 1.
Přehled elektronového transportu mitochondrie
-0.4
NAD+ (-0.315 V)
NADH
2eKOMPLEX I
∆ξ°´= 0.360 V
(∆G = -69.5 kJ.mol-1)
-0.2
0
(+0.031 V)
Sukcinát
2e-
Fumarát
∆ξ°´(V)
+0.2
FADH2
ADP + Pi
Rotenon,
amytal
ATP
CoQ (+0.045 V)
KOMPLEX II
KOMPLEX III
∆ξ°´= 0.190 V
(∆G = -36.7 kJ.mol-1)
ADP + Pi
Antimycin A
ATP
Cytochrom c (+0.235 V)
+0.4
+0.6
KOMPLEX IV
∆ξ°´= 0.580 V
(∆G = -112 kJ.mol-1)
ADP + Pi
CNATP
2e+0.8
2 H+ + 1/2 O2
H2O (+0.812 V)
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec
CH3
OCH3
H3CO
H
O
H2C
O
H
O
O
Rotenon
O
CH2
C
N
H
O
NH
-
Kyanid
O
Amytal
O
N
CH2 CH3
CH3
H
CH3
CH2
HN
O
CH
O
CH3
H3C
OH
HN
CHO
Antimycin A
O
O
(CH2)5
O
H3C
CH3
CH2
CH3
Rozpojovače oxidativní fosforylace.
Probíhá respirace – netvoří se ATP.
MATRIX
CYTOSOL
+
Nízká [H+]
Vysoká [H ]
-
OH
O
NO2
+
H
OH
NO2
+
NO2
NO2
2,4-Dinitrofenol
(DNP)
-
O
NO2
Difuze
NO2
+
NO2
2,4-Dinitrofenol
(DNP)
NO2
+
H
Kontrolní mechanismy oxidativní fosforylace.
•
•
•
•
•
Dospělý člověk spotřebuje denně 6 300-7 500 kJ metabolické energie.
To odpovídá volné energii hydrolýzy 200 molů ATP na ADP a Pi.
Celkové množství v těle přítomného ATP je méně než 0, 1 molu !!!
ATP musí být nutně recyklován a jeho produkce regulována, protože se
neprodukuje nikdy více ATP než je potřeba.
Oxidativní fosforylace (od NADH k cytochromu c) je v rovnováze:
½ NADH + cytochrom c (Fe3+) + ADP + Pi → ½ NAD + cytochrom c (Fe2+)
+ ATP ∆ G´ ≅ 0
• Keq = ([NAD+] / [NADH])½.[c2+] / [c3+]. [ATP] /[ADP].[Pi]
•
•
Reakci nelze ovlivnit přídavkem ATP, protože cytochrom c oxidasová
reakce je ireversibilní !!
Reakce se ovlivní dostupností cytochromu c (c2+) a tedy poměry
[NADH] / [NAD+] a [ATP] / [ADP] .[Pi].
Čím vyšší je poměr [NADH] / [NAD+] a nižší [ATP] / [ADP] .[Pi],
tím vyšší je koncentrace cytochromu c a vyšší cytochrom c
oxidasová aktivita.
Úloha – oxidativní forsforylace:
• Představte si, že máte k dispozici aktivně respirující
mitochondrie.
• Jak bude probíhat tvorba ATP v krátkém čase po přidání
Q ? Jak bude probíhat tvorba ATP v delším čase po přidání
Q?
• Jak bude probíhat tvorba ATP v krátkem čase po přidání
QH2 ? Jak bude probíhat tvorba ATP v delším čase po
přidání QH2 ?
Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS)
•
•
•
•
•
•
•
•
Čtyřelektronová redukce kyslíku cytochrom c oxidasou je rychlá a
precizní.
Přesto vznikají kyslíkaté radikály, které reagují s různými buněčnými
součástmi.
Nejznámější je superoxidový radikál: O2 + e- → O2- .
Superoxidový radikál je prekurzorem silnějších oxidačních radikálů jako
jsou protonovaný (hydroxoniový) O2- . → HO2. a hydroxylový radikál
. OH
Antioxidační mechanismus: superoxiddismutasa (SOD) přítomná téměř
ve všech buňkách. Katalyzuje přechod O2- . na peroxid vodíku.
Vytvořený peroxid vodíku je degradován katalasou na vodu a kyslík:
2 H2O2 → 2 H2O + O2 nebo glutathionperoxidasou:
2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O
Dalšími potenciálními antioxidanty jsou rostlinné sloučeniny jako
askorbát (vitamin C) a α-tokoferol (vitamin E). Pravděpodobně chrání
rostliny před oxidačním stresem během fotosyntézy, kdy je H2O
fotolýzou rozkládána na O2, protony a elektrony.