Sborník

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA
V PARAZITOLOGII
Sborník referátů z odborného semináře
2. 4. 2013
Lékařský dům ČSL JEP, Sokolská 31, Praha 2
TAGCCTGTCCAGCCACTT
GGCCTGTCCAGCCACTTC
CTCCTGTCCAGCCACTTC
CCTCTGTCCAGCCACTTA
OBSAH
Karel Janko:
Principy, výhody a limity molekulární diagnostiky ………………………………..... 2
Ivana Zicklerová, Aneta Lojíková, Eva Nohýnková:
Molekulární diagnostika Pneumocystis jirovecii
a PCR diferenciace Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii …………………….. 6
Kateřina Pomajbíková, Milan Jirků, Klára J. Petrželková,
Zuzana Hůzová, David Modrý, Julius Lukeš:
Molekulární detekce malárie ve stolici lidí ………………………………………..... 11
Lenka Plíšková, Zuzana Čermáková, Radka Kutová:
Molekulární diagnostika toxoplazmózy …………………………………………….. 13
Martin Kváč, Bohumil Sak, Dana Květoňová:
Molekulární diagnostika kryptosporidií, mikrosporidií a giardií …………………… 14
Jan Brabec:
Molekulární diagnostika střevních tasemnic ……………………………………….. 21
Jana Petrášová, Miroslav Oborník, Milan Jirků,
Klára.J. Petrželková, Petra Bolechová, Cristina Cuitillas,
Rocio Callejón, Josef Jaroš, Z. Beránková, David Modrý:
Molekulární diagnostika Trichuris spp. …………………………………………….. 25
Hana Vlastníková:
Průkaz Trichomonas vaginalis pomocí Real Time PCR …………………………..
31
Oleg Ditrich:
Parazitologie v éře molekulární diagnostiky ………………………………………... 33
1
Principy, výhody a limity molekulární diagnostiky
Karel Janko
Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR Liběchov
[email protected]
Identifikace druhu parazita, či patogena je jistě klíčová pro zvolení vhodné léčby.
V mnoha případech je taxonomie patogenů známa natolik dobře, že je možno ke
spolehlivé identifikaci dospět za pomocí oka zkušeného parazitologa, který morfologicky
daný taxon určí. Ve většině případů, hlavně jednobuněčných patogenů, však toto není
možné a je potřeba se uchýlit k nějaké vhodné molekulární metodě.
Volba metody závisí na záměru analýzy
V nejjednodušším případě nám jde o získání jistého „otisku“ genetického
materiálu (tzv. genetic fingerprint), který, máme-li to k dispozici, můžeme srovnat
s podobnými údaji z jiných organismů. Tyto metody jsou velice levné a umožňují zjistit
fenetickou podobnost organismů, v zásadě se dnes od nich již upouští, protože mají
relativně malou výpovědní hodnotu a nedovolují dobrý vhled do fylogenetických vztahů
mezi organismy a tím i jejich dobrou taxonomickou determinaci.
Mezi tyto metody patří například klasický multilokus DNA fingerprinting,
kterýžto spočívá v tom, že celková genomická DNA je fragmentována jedním, či více
restrikčními enzymy (jedná se o endonukleázy, které střihnou obě vlákna DNA v místě,
kde se nachází specifický sekvenční motiv). Místa štěpení jsou sekvenčně specifická a
podle délky sekvence rozeznávané použitým enzymem a její struktury je možné vypočítat
pravděpodobnou délku výsledných fragmentů naštípané DNA. Výsledkem je zkumavka
plná různě dlouhých fragmentů DNA. Uvědomíme-li si, že restrikce proběhla jen na
specifických místech, je jasné, že konkrétní vzhled daného restrikčního profilu je
charakteristický pro daný taxon, či dokonce jedince. To proto, že mutační rozdíly v DNA
různých jedinců způsobí, že u některých jedinců se na daném místě enzymu podaří najít
vhodnou sekvenci a “štípne“ tam, u jiných ne a daný fragment pak nevznikne.
Jedná se však většinou o miliony výsledných fragmentů DNA, což je obtížně
vyhodnotitelné. Proto se používají různé metody, pomocí nichž se vizualizují jen některé
fragmenty, z jejichž distribuce pak usuzujeme na typ vzorku a jeho taxonomickou
příslušnost. Klasickou cestou je rozdělit fragmenty elektroforézou podle jejich délky a
2
hybridizovat na ně DNA sondy s charakteristickým motivem (většinou se jedná o nějaký
motiv tandemové repetice, například „TAGATAGATAGA“), které jsou fluorescenčně, či
radioaktivně značeny. Vizualizujeme tak jen ty fragmenty, které na sobě nesou daný
motiv, výsledkem je značně snížená komplexita získaného vzoru, kdy podle složitosti
použité sondy získáme desítky, stovky, či maximálně tisíce fragmentů, rozdělených podle
délky, což už je analyticky vyhodnotitelné asi stejně jako otisk prstu.
Random-amplified polymorphic DNA - RAPD
Dalším způsobem, jak získat „fingerprint“ studovaného taxonu je RAPD metoda,
založená na PCR. Při této metodě používáme krátký primer o délce kolem 10ti nukleotidů
a spoléháme na to, že ve studovaném genomu bude dostatek sekvencí, kde se místa
s komplementárními sekvencemi k našim primerům vyskytují dostatečně blízko sebe, aby,
když na ně nasednou naše primery, mohla proběhnout PCR reakce (většinou by jejich
vzdálenost neměla přesáhnout 1-2 kb). Podle délky zvoleného primeru opět můžeme
předem odhadnout, jak často se v genomu najdou vhodné komplementární sekvence. Po
proběhnutí PCR pak získáme množství amplifikovaných úseků DNA o různých délkách,
jejichž distribuce bude opět specifická prodaný taxon, či jedince. Potíž této metody
spočívá v obtížné reprodukovatelnosti, neboť je těžké dosáhnout účinné stringence
podmínek, aby PCR proběhla opravdu jen na místech se 100 procentní homologií a
zároveň aby se nám množily proporčně stejně dlouhé i krátké fragmenty (uvědomme si,
že i kdyby PCR probíhala jen na zcela homologických místech, pak se preferenčně budou
tvořit jen kratší fragmenty, kde primery nasedly relativně blízko sebe).
Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP
AFLP je sofistikovanou metodou, která zaznamenala velkou slávu v botanice a
z nepochopitelných důvodů nebyla příliš používaná v zoologii. I zde dojde nejprve k
restrikční fragmentaci studované genomické DNA. Poté jsou však na fragmenty ligovány
syntetické oligonukeotidové adaptory o známé sekvenci. Výsledkem je tedy stejně jako
v případě multilokus DNA fingerptintingu směs milionů fragmentů naštípané DNA o
různých délkách, ale na obou koncích každého fragmentu je „přilepen“ krátký nástavec,
jehož sekvencí, na rozdíl od těch fragmentů, známe. Toho využijeme tak, že v následném
kroku provedeme PCR reakci, do níž vložíme primer o sekvenci komplementární
k použitému nástavci, na jeho 3´ konci však má primer přesah o jednu, dvě, nebo tři báze.
PCR tedy může úspěšně proběhnout jen na těch fragmentech, které mají na svých koncích
3
příslušnou jednu, dvě či tři báze. Tím ovšem dojde k amplifikaci jen některých fragmentů
a tím k výrazné redukci komplexity, která je navíc velmi robustní a reprodukovatelná.
Tato metoda tedy umožňuje získat druhově-specifické profily.
Vyhodnocení výsledků
Výsledky všech výše uvedených metod hodnotíme pomocí fenetických postupů,
založených na podobnosti získaných profilů, jako například UPGMA, Neighor Joining a
dalších.
Velkou výhodou těchto postupů je, že informace, kterou získáme, je výrazně
multilokusová, tj. že porovnáváme skutečně celogenomové vzory. Neméně výraznou
nevýhodou však je, že pokud nějaký rozdíl vidíme, nevíme jakého lokusu, či genu se týká
a co přesně onen rozdíl způsobilo (například, je absence daného fragmentu způsobena
bodovou mutací, insercí nebo delecí, a když, tak jak dlouhý byl insert?). Navíc, tyto
metody umožňují jen velmi omezenou možnost srovnání pozorovaných vzorů s dříve
publikovanými daty
Mnohem robustnějším způsobem, jak se dopátrat druhové příslušnosti, je využití
sekvenačních postupů. Zde bylo klasicky využíváno Sangerovo sekvenování, kdy se buď
pomocí klonování, či lokusově specifické PCR izoloval požadovaný úsek DNA
(například konkrétní gen) a ten byl poté osekvenován tak, že na něm proběhla
modifikovaná PCR s jedním primerem, nasedajícím jen na jeden konec studovaného
fragmentu. Tím bylo zajištěno, že se amplifikované molekuly prodlužovaly jen v jednom
směru. Do reakce byly v patřičném poměru přimíchány fluorescenčně modifikované báze,
tzv.terminátory, za něž, pokud byly inkorporovány do reakce, už nebylo možné navázat
další bázi a PCR reakce dané molekuly tím skončila konkrétní barevnou bazí na svém
konci. Poté se provedla elektroforéza, při níž se amplifikované fragmenty rozdělily podle
délky. Protože všechny fragmenty začínají známým primerem a končí značenou bazí,
tímto postupem se ukáže, že např. na 53. Pozici studovaného genu je zeleně svítící báze,
která odpovídá adeninu a tudíž na pozici 53 je písmeno „A“.
Tento postup umožňuje získat detailní sekvenci libovolného genu, která se poté
může srovnat se světovou databází sekvencí a pomocí sofistikovaných fylogenetických
metod založených na metodice maximální věrohodnosti či Bayesiánské statistice pak
můžeme určit příbuznost našeho vzorku ke známým sekvencím, ale například i to, kdy se
studovaný taxon od jiného oddělil a to pomocí konceptu tzv. molekulárních hodin. Pro
4
tento typ analýzy si můžeme vybrat v podstatě jakýkoliv lokus, ale smysl má používat ty,
které byly pokud možno masově studovány, abychom mohli naše data srovnat.
Barcoding
Tato logika vyústila v projekt „barcoding of life“, která využívá toho, že
v klasických dobách se sekvenace zaměřovala hlavně na mitochondriální lokusy, a to
hlavně Cytochrom oxidázu I (CoxI) a 12sRNA geny, pro něž tudíž existuje velké
množství dostupných dat. Osekvenujeme-li náš nový neznámý vzorek na těchto lokusech,
máme obrovskou možnost jej identifikovat do čeledi, rodu, či druhu pomocí srovnání
s touto databází.
Potíží tohoto přístupu však je, že se zaměřuje na jeden, či pár lokusů. Představímeli si, že různé druhy parazitů spolu mohou hybridizovat a že existuje horizontální přenos
genů, je jasné, že tato metodika není samospasitelná. Například, pokud by v extrémním
případě parazit do sebe inkorporoval lidský gen pro CoxI, pak by se nám molekulárně
ukázalo, že v nás žije a parazituje místo giardie nějaký člověk, což asi není to, čeho
chceme dosáhnout při molekulární identifikaci. Proto existuje snaha sekvenovat více
lokusů u každého vzorku, čímž se toto riziko výrazně sníží. Zde se ovšem začínáme
potýkat s výraznějšími cenovými nároky.
Závěr
Na závěr je potřeba uvést, že před pár lety došlo k revoluci v biologii díky zavedení
několika Next-Generatrion-Sequencing (NGS) metod, které umožnily masivní paralelní
sekvenování celých genomů. Vstupní náklady jsou sice mnohonásobně vyšší, než u
klasických Sangerových metod, ale cena za osekvenovanou bázi genomu je několika
řádově nižší. Tyto metody doznávají rychlého vývoje, který vede k tomu, že dnes už
můžeme nejen sekvenovat celé genomy studovaných vzorků, ale například relativně levně
osekvenovat desítky vybraných genů u mnoha vzorků najednou.
Výsledky těchto postupů se opět zpracovávají dostupnými fylogenetickými
metodami.
5
Molekulární diagnostika Pneumocystis jirovecii
a PCR diferenciace Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii
Ivana Zicklerová, Aneta Lojíková, Eva Nohýnková
Oddělení tropické medicíny Nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK v Praze
Molekulárně biologické metody jako polymerázová řetězová reakce (PCR), PCR
v reálném čase (real-time PCR) a další se dostávají v posledních letech do rutinní
diagnostické praxe. Umožňují citlivou, přímou detekci patogenního agens a napomáhají
rychlé a přesné diagnostice.
Na našem pracovišti je PCR rutinně používána jako základní metoda (1) při
průkazu původce pneumocystové pneumonie (Pneumocystis jirovecii) a (2) při druhové
diferenciaci entaméb, jsou-li mikroskopicky ve stolici nalezeny cysty a/nebo trofozoity
forma minuta Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, dále jako jedna z metod průkazu
původců nákaz způsobených volně žijícími amébami a za specifických okolností jako
doplňková metoda diagnostiky malárie. Toto sdělení bude pojednávat o využití PCR při
diagnostice pneumocystózy a při diferenciaci střevních entaméb.
Pneumocystis jirovecii
Pneumocystis jirovecii je endemický, oportunní, kvasinkám příbuzný organismus,
který může u lidí s primárním nebo sekundárním imunodeficitem vyvolat závažné,
v některých případech až život ohrožující onemocnění známé jako pneumocystová
pneumonie (Pcp) (Cushion 1998, Helweg-Larsen et al. 2001).
Vzhledem k vysoké prevalenci protilátek u běžné populace je laboratorní
diagnostika pneumocystové pneumonie založena prakticky pouze na přímém průkazu
původce ve vyšetřovaném materiálu. Od 50. let minulého století se opírá o
mikroskopickou detekci pneumocyst, jeho trofozoitů a/nebo cyst, pomocí barvících
technik, od druhé poloviny 80. let i o metody fluorescenční (rozvoj technologie produkce
monoklonálních protilátek) (Kovacs et al. 2001), v průběhu 90. let se začíná používat
amplifikace DNA specifické pro Pneumocystis pomocí PCR, která je mnohem citlivější
než standardní mikroskopické vyšetření. PCR má význam zejména v rané fázi infekce,
kdy je množství parazitů ve vyšetřovaném vzorku velmi nízké a mikroskopicky téměř
nezachytitelné, při profylaktickém podávání léků osobám se zvýšeným rizikem rozvoje
6
akutní nákazy, a také tehdy, nelze-li vzhledem ke stavu pacienta provést odběr
bronchoalveolární tekutiny (BAT), která je pro mikroskopický záchyt pneumocyst
nejvhodnější. Při vyšetřování sputa (neindukovaného i indukovaného), nasofaryngeálního
aspirátu, výplachu dutiny ústní nebo u pacientů léčených před odběrem empiricky či
užívajících profylakticky léky je detekce nukleové kyseliny mnohem pravděpodobnější
než mikroskopický záchyt parazita.
V naší laboratoři provádíme konvenční jednokrokovou PCR dle původní metodiky
prvně použité Wakefieldovou (Wakefield et al. 1990). K amplifikaci jsou použity primery
detekující fragment mtLSU rRNA o velikosti 346 bp. K vyloučení možné inhibice PCR
reakce používáme jako vnitřní kontrolu průkaz fragmentu genu pro lidský β-globin.
Nejvhodnějším materiálem pro průkaz pneumocystové DNA je bronchoalveolární
tekutina a indukované sputum. Jako výchozí materiál pro izolaci DNA lze použít i
neindukované sputum, nasofaryngeální aspirát, výplach dutiny ústní, případně materiál
získaný z kanyly. Celková DNA je izolována soupravou QIAamp DNA Mini Kit a
QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen).
V období 2002-2012 jsme vyšetřili paralelně mikroskopicky a metodou PCR
materiál od 1818 imunokompromitovaných pacientů s RTG nálezem a klinickým
obrazem svědčícím pro pneumocystovou pneumonii. U 154 (8%) pacientů byla metodou
PCR prokázána nákaza P. jirovecii, z toho u 62 (40%) pacientů byla současně prokázána i
mikroskopicky. Nižší počet mikroskopicky pozitivních nálezů si je možné vysvětlit méně
vhodným typem vyšetřovaného materiálu, jeho množstvím, kvalitou a způsobem odběru,
případně léčbou zahájenou ještě před odběrem materiálu či užíváním specifické profylaxe.
Vzhledem k těmto výsledkům doporučujeme jakýkoliv materiál určený k diagnostice Pcp
vyšetřovat jak mikroskopicky, tak metodou PCR. V jednom případě se nám podařilo
detekovat silnou pozitivní reakci v PCR u mikroskopicky negativního vzorku z výplachu
dutiny ústní. U pacienta byla následně infekce potvrzena ve vzorku bronchoalveolární
tekutiny, který byl pozitivní i mikroskopicky. Nicméně, vzhledem k ojedinělosti tohoto
výsledku, nadále doporučujeme odběr BAT nebo indukovaného sputa jako zlatý standard
pro diagnostiku P. jirovecii. Zcela nevhodným materiálem pro detekci P. jirovecii je krev,
jak jsme opakovaně potvrdili u pacientů s masivní pneumocystovou nákazou, u nichž
byly všechny vzorky krve vyšetřené metodou PCR negativní.
7
Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii
Metoda PCR je rovněž nepostradatelná při průkazu střevní nákazy amébou
Entamoeba histolytica. V lumen tlustého střeva člověka lze nalézt 7 druhů střevních améb
(Entamoeba coli, E. dispar, E. hartmanni, E. histolytica, E. moshkovskii, Endolimax nana
a Iodamoeba bütschlii). Z nich pouze E. histolytica je primárně patogenní. Tento druh
vyvolává střevní nebo mimostřevní amébózu (Anonymous 1997). Diagnostika
neinvazivní amébózy byla až do začátku 90. let minulého století založena na
mikroskopickém nálezu cyst a/nebo trofozoitů forma minuta E. histolytica ve stolici,
často i u asymptomatických osob, a to i přesto, že již v roce 1925 vyslovil francouzský
parazitolog E. Brumpt hypotézu, že lidské střevo kolonizují dva morfologicky identické
druhy améb, které se liší svou patogenitou (Stejskal, Nohýnková 2003). Brumpt popsal
nový druh nepatogenní střevní améby, kterou nazval Entamoeba dispar. Jeho hypotéza
však nebyla přijata. Existence dvou mikroskopicky identických druhů byla potvrzena až
na začátku 90. let 20. století na základě srovnání genomu „patogenních“ a
„nepatogenních“ améb. Rozdíly mezi oběma byly natolik výrazné, že vedly k potvrzení
existence E. dispar jako samostatného druhu, který je pro člověka nepatogenní (Diamond,
Clark 1993). V roce 1991 Clark a Diamond (1991) identifikovali Entamoeba moshkovskii
jako další druh pravděpodobně nepatogenní střevní améby, který je morfologicky
nerozlišitelný od E. histolytica.
V lidské stolici tak lze nalézt 3 morfologicky identické druhy entaméb, které nelze
mikroskopicky identifikovat. Zatím jediným rutinně použitelným způsobem, jak tyto
druhy rozlišit, je právě PCR. Význam diferenciace střevních améb spočívá v tom, že dle
doporučení Světové zdravotnické organizace (WHO) se mají léčit pouze osoby
s prokázanou infekcí E. histolytica. Navíc podávání metronidazolu osobám, které vylučují
nepatogenní E. dispar nebo E. moshkovskii, bývá opakovaně neúspěšné vzhledem k větší
odolnosti těchto druhů k metronidazolu (Anonymous, 1997).
Od roku 2002 do roku 2009 jsme v naší laboratoři metodou multiplex nested PCR
prováděli diferenciaci druhů E. histolytica a E. dispar podle Evangelopoulos et al. (2002),
od roku 2009 provádíme jednokrokovou konvenční PCR podle Hamzah et al. (2006),
která umožňuje rozlišit všechny tři morfologicky identické druhy střevních améb člověka:
E. histolytica, E. dispar a E. moshkovskii. K amplifikaci jsou použity primery detekující
fragmenty genů SSU rRNA: forwardový primer je společný pro rod Entamoeba, reversní
8
primer je druhově specifický. Specifické fragmenty mají velikosti 166 bp pro
E. histolytica, 752 bp pro E. dispar a 580 bp pro E. moshkovskii.
K izolaci DNA se nejčastěji používají nefixované vzorky stolice s mikroskopicky
prokázanými cystami (případně trofozoity forma minuta) E. histolytica/dispar/
moshkovskii uchovávané po dobu izolace v lednici. DNA je izolována pomocí komerční
soupravy QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen).
Metodou jednokrokové PCR jsme v letech 2009-2012 vyšetřili 129 vzorků stolic
od 86 osob s mikroskopickým nálezem E. histolytica/dispar/moshkovskii. Ve stolici čtyř
(5%) pacientů byla prokázána infekce E. histolytica. U většiny osob (92%; 79/86) byla
prokázána nepatogenní E. dispar a u 2 osob (2%) E. moshkovskii. V jednom případě byla
metodou PCR zachycena směsná infekce E. histolytica a E. dispar (1%). Čtyři pacienti
s nákazou E. histolytica cestovali v Asii, a to buď v Indii, která je označována za oblast
s hyperendemickým výskytem amébózy, nebo Papui Nové Guinei. Ze skupiny pacientů
s infekcí E. dispar 30 (38%) osob cestovalo po Asii, z toho 20 pobývalo v Indii, 5 (6%)
osob navštívilo Afriku, 7 (9%) byli cizinci z rozvojových zemí. Autochtonní nákaza byla
prokázána u 11 (14%) osob. Šest (8%) pacientů s nákazou E. dispar bylo HIV pozitivních.
U 20 (25%) lidí nebyla cestovatelská anamnéza dohledána. Dvě infekce E. moshkovskii
byly autochtonní.
Z našich výsledků vyplývá, že i v oblastech s hyperendemickým výskytem
amébózy je u cestovatelů více zastoupena „infekce“ nepatogenní E. dispar a podíl
asymptomatických střevních nákaz E. histolytica mezi cestovateli je velmi nízký.
Podobné výsledky jsou publikovány i v práci Rivera et al. (1998).
PCR diferenciace těchto tří druhů střevních améb má význam nejen
epidemiologický: umožňuje zmapovat podíl patogenních a nepatogenních střevních améb
u asymptomatických nosičů cyst, ale také terapeutický, kdy pacienty s nákazou
nepatogenními E. dispar nebo E. moshkovskii není nutno léčit.
Literatura:
Cushion MT (1998). Pneumocystis carinii. p. 645-683. In: Collier L. (ed.):
Topley & Wilson´s Microbiology and microbial infections, Medical Mycology.
9th Edition. Oxford University Press, Inc., New York
Helweg-Larsen J, Lundgren B, Lundgren JD (2001). Heterogeneity and
compartmentalization of Pneumocystis carinii f. sp. hominis genotypes in autopsy
lungs. J. Clin. Microbiol. 39:3789-3792
9
Kovacs JA, Gill VJ, Meshnick S, Masur H (2001). New insights into trasmission,
diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA 286:
2450-2460
Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM
(1990). Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. The Lancet
336:451-453
Anonymous (1997): Amoebiasis. WHO Weekly Epidemiol. Rec. 14: 97-99
Stejskal F, Nohýnková E (2003): Amébóza. Sanquis 29: 20-24
Diamond LS, Clark CG (1993): A redescription of Entamoeba histolytica Schaudinn,
1903 (Emended Walker, 1911) separating it from Entamoeba dispar Brumpt,
1925. J. Eukaryot. Microbiol. 40: 340-344
Clark CG, Diamond LS (1991): The Laredo strain and other Entamoeba histolytica-like
amoebae are Entamoeba moshkovskii. Mol. Biochem. Parasitol. 46: 11-18
Evangelopoulos A, Spanakos G, Patsoula E, Vakalis N (2002): A nested, multiplex, PCR
assai for the simultaneous detection and differentiation of Entamoeba histolytica
and Entamoeba dispar in reces. Ann. Trop. Med. Parasitol. 94: 233-240
Hamzah Z, Petmitr S, Mungthin M, Leelayoova S, Chavalitshewinkoon-Petmitr P (2006):
Differential Detection of Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, and
Entamoeba moshkovskii by a single-round PCR assay. J. Clin. Microbiol. 44:
3196-3200
Rivera WL, Tachibana H, Kanbara H (1998): Field study on the distribution of
Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in the nothern Philippines as
detected by the polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59: 916-921.
10
Molekulární detekce malárie ve stolici lidí
Kateřina Pomajbíkováa,. Milan Jirkůb,c, Klára J. Petrželková.a,b,d.e, Zuzana Hůzováf,
David Modrý.a,h, Julius Lukeš.b,c
a
Ústav patologické morfologie a parazitologie, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno
Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice
c
Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita, České Budějovice
d
Ústav biologie obratlovců, AV ČR, Brno
e
Zoo Liberec, Liberec
f
Oddělení parazitologie, mykologie a mykobakteriologie, Zdravotní ústav, Praha
h
CEITEC, Brno
b
Malárie je jedním z nejvýznamnějších parazitárních onemocnění. Riziku infekce
je vystavena přibližně polovina světové populace a ročně se jí v endemických oblastech
nakazí více než 500 milionů lidí a téměř milión lidí zemře. Nejcitelněji je nemocí
postižena subsaharská Afrika, ale zasahuje rovněž Asii, Latinskou Ameriku, Blízký
východ a část Evropy. Malárii u člověka způsobují několik druhů prvoka řazeného do
rodu Plasmodium a to P. ovale, P. vivax, P. malariae a P. falciparum. V jihovýchodní
Asii je mnoho případů malárie zapříčiněno pro člověka vysoce patogenním zoonotickým
druhem P. knolewsi pocházejícím z makaka dlouhoocasého.
Vývojový cyklus malárie probíhá ve dvou hostitelích a to v komárech rodu
Anopheles, kde probíhá sexuální část, zatímco asexuální část, během které dochází ke
klinickým atakům, probíhá v erytrocytech člověka. Podle druhu parazita rozeznáváme
několik forem malárie: P. vivax a P. ovale, která způsobují tzv. benigní terciánu, kdy se
záchvaty horečky opakují každých 48 hodin (tj. každý třetí den), P. falciparum
vyvolávající nejnebezpečnější tzv. maligní terciánu, a konečně P. malariae způsobující
tropickou kvartánu, kdy se záchvaty opakují po 72 hodinách (tj. každý čtvrtý den). Na
rozdíl od již zmíněných, asexuální vývoj P. knolewsi trvá pouze 24 hodin, tedy způsobuje
horečky každý den a jeho infekce bývá často fatální.
V dnešní době se pro diagnostiku malárie u lidí ze vzorků krve využívá několika
metod, ať už se jedná o samotné krevní roztěry, detekci v tlusté kapce nebo serologické
rychlotesty založené na principu ELISA, kde stačí k diagnostice pouze kapka krve a
výsledek je znám do několika minut. V neposlední řadě jsou samozřejmě důležité také
molekulární přístupy, jež jsou využívány zejména v diferenciální diagnostice
morfologicky neodlišitelných druhů P. malariae a P. knolewsi. V poslední době se
objevily i možnosti neinvazivní diagnostiky malárie ze vzorků slin a moči.
Přestože byla malárie v popředí zájmu mnoha výzkumníků a významný pokrok
byl zaznamenán obzvlášť v oblasti terapie a prevence, naše znalosti o jejím původu nebo
11
přírodních rezervoárech byly donedávna velmi kusé. Chybějícím článkem byly informace
o diverzitě či epidemiologii malárie u afrických primátů, což bylo zapříčiněno
nedostupností vzorků krve od volně žijících jedinců. Avšak nedávný objev molekulární
diagnostiky plazmodií z trusu hostitele radikálně přispěl k rozšíření našich znalostí o
jejich diverzitě u volně žijících afrických primátů a k objasnění původu nejmalignějšího
druhu malárie, P. falciparum. Tento druh překvapivě pochází buď z goril nížinných, či
z některých ostatních primátů a v současné době se předpokládá, že v minulosti došlo k
mezidruhovému přenosu prekurzoru „falcipara“ a posléze díky migrací lidí k rozšíření P.
falciparum po celé Africe.
V naší studii jsme ověřili spolehlivost detekce P. falciparum v lidské stolici.
K dispozici jsme měli vzorky krve a stolic od pacientů s klinickou malárií z Lwanga
hospital, Buikwe v Ugandě a vzorky od místních lidí pracujících v projektu na ochranu
goril nížinných ve Středoafrické republice, kteří nevykazovali žádné symptomy. Malárie
v krvi i stolici byla diagnostikována pomocí metody PCR a zároveň byly vyšetřeny i
krevní roztěry. Srovnáním všech metod bylo zjištěno, že citlivost PCR ve stolici i krvi
byla poměrně vysoká a srovnatelná. Jako méně spolehlivá se ukázala diagnostika
plazmodií krevními roztěry. P. falciparum bylo překvapivě zaznamenáno i u pěti lidí bez
klinických příznaků, což indikovalo chronickou fázi malárie. Neinvazivní diagnostika
malárie ze stolice může být v humánní medicíně využita zejména v případech, kdy jsou
vzorky krve hůře dostupné (např. u dětí) anebo u HIV pozitivních pacientů, aby se snížil
kontakt ošetřujícího lékaře s krví.
Další literatura:
Jirků M, Pomajbíková K, Petrželková KJ, Hůzová Y, Modrý D, Lukeš J, 2012: Detection
of Plasmodium spp. in human feces. Emerging Infectious Diseases 18: 634-636.
Liu W, Li Y, Learn GH, Rudicell RS, Robertson JD, Keele BF, et al., 2010: Origin of the
human malaria parasite Plasmodium falciparum in gorillas. Nature 467:420–5.
http://dx.doi.org/10.1038/ Nature09442
Prugnolle F, Durand P, Ollomo B, Duval L, Ariey F, Arnathau C, et al., 2011: A fresh
look at the origin of Plasmodium falciparum, the most malignant malaria agent.
PLoS Pathog.;7:e1001283. http:// dx.doi.org/10.1371/journal.ppat.1001283
12
Molekulárně biologická diagnostika toxoplazmózy
Lenka Plíšková1, Zuzana Čermáková 2, Radka Kutová 1
Ústav klinické biochemie a diagnostiky 1, Ústav klinické mikrobiologie 2 , FN Hradec Králové
V České republice patří toxoplazmóza k nejčastěji se vyskytujícím parazitárním
nákazám. Podle výsledků sérologických vyšetření 25 – 40 % naší populace přišlo do
styku s antigeny prvoka Toxoplasma gondii. V laboratorní parazitologické diagnostice se
k potvrzení nebo vyloučení infekce prvokem T. gondii využívají nejčastěji nepřímé
metody, a to průkaz sérových protilátek (reakce vazby komplementu, ELISA testy pro
průkaz markerů akutní infekce ve třídách IgM, IgA, IgE, průkaz protilátek ve třídě IgG),
popřípadě stanovení jejich avidity. Metody přímého průkazu původce založené na infekci
tkáňové kultury nebo vnímavého laboratorního zvířete jsou časově i metodicky náročné a
výsledek získáme až za několik dní či dokonce týdnů. Z těchto důvodů se jako přímý
průkaz nejčastěji využívá průkaz DNA prvoka T. gondii z klinického materiálu, nejčastěji
z plodové vody (eventuálně z fetální krve), nesrážlivé krve (s přídavkem EDTA nebo
citrátu sodného), nitrooční tekutiny, bioptického materiálu, likvoru atd. Průkaz DNA T.
gondii v organismu hostitele je důležitý zejména pro stanovení diagnózy u gravidních žen,
u novorozenců s pozitivní anamnézou, osob po transplantaci kostní dřeně, HIV
pozitivních pacientů, nemocných v průběhu imunosupresivní terapie a podobně.
Pro výběr a návrh primerů, event. sondy se s výhodou vyžívají geny, které se
v genomu T. gondii opakují, např. B1 gen (repetitivní 25 – 50x), TGR1E gen (repetitivní
30 – 35x). Samozřejmostí při provádění tohoto vyšetření je důsledné dodržování kontroly
kvality. Vnitřní kontrola kvality v každém běhu zajišťuje správný průběh amplifikace,
absenci kontaminace a přítomnost/nepřítomnost inhibitorů polymerázy v každém vzorku.
Vzhledem k tomu, že neexistuje mezinárodní standard, který by bylo možné využít pro
zavedení a kontrolu PCR reakce, je pro kontrolu správnosti a citlivosti metody zásadní
účast laboratoře v systému externího hodnocení kvality. Evropská společnost pro kontrolu
kvality (QCMD) doporučila v roce 2003 zavedení kontroly kvality v molekulární
diagnostice toxoplazmózy a od r. 2004 tyto kontrolní cykly probíhají. V roce 2004 se
zúčastnilo 38 laboratoří, v roce 2012 již 98 laboratoří. Kontrolní panel se skládá z 10
vzorků, kvantita se pohybuje v rozmezí přibližně 5 Tg/ml až 100 Tg/ml.
Naše laboratoř začala provádět molekulárně biologickou diagnostiku T. gondii
v roce 2002. Do konce roku 2012 jsme vyšetřili 1546 vzorků biologického materiálu,
z toho pozitivních bylo 45 vzorků, tj. 2,91 %. Nejčastější záchyty byly v plodové vodě a
krvi těhotných žen a v krvi, likvoru, eventuelnš v mozkové tkáni imunosuprimovaných
pacientů.
PharmDr. Lenka Plíšková, MVDr. Zuzana Čermáková, Ph.D, Mgr. Radka Kutová
13
Molekulární diagnostika kryptosporidií, mikrosporidií a
giardií
Martin Kváč, Bohumil Sak, Dana Květoňová
Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Parazitologický ústav, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice
([email protected]; [email protected], [email protected])
Kryptosporidie, mikrosporidie a giardie patří mezi nejčastější původce
parazitárních zoonotických onemocnění člověka. Vzhledem k tomu, že je celá řada
druhů/genotypů kryptosporidií, mikrosporidií a giardií schopna vyvolat infekci člověka a
infekční vývojová stádia všech výše zmíněných druhů parazitů jsou velmi odolná
podmínkám vnějšího prostředí, může být člověk nakažen prostřednictvím různých cest
přenosu.
Role přenosu z hostitele na hostitele nebo z prostředí na hostitele hraje významnou
roli ve sledování cest přenosu a následných preventivních opatřeních. Pouhá
mikroskopická diagnostika není a ani nemůže být ze svého principu schopna pomoci při
řešení otázek epidemiologie infekčních onemocnění. Právě a nejen proto, byly vyvinuty
molekulární metody detekce a diferenciace patogenů, včetně kryptosporidií, mikrosporidií
a giardií. Použitím těchto nástrojů se výrazně zlepšuje naše chápání biologie a
epidemiologie studovaných patogenů a rozšiřují se znalosti o populační diverzitě
jednotlivých druhů patogenů a způsobů jejich šíření v prostředí.
Kryptosporidie
Základní koncept molekulární diagnostiky kryptosporidií je založen na určení
druhu nebo genotypu kryptosporidie a následné subtypizaci. V současné době je známo
více než 100 různých kryptosporidií infikujících všechny třídy obratlovců včetně člověka.
Dle různých pramenů je v současnosti uznáno asi 30 platných druhů rodu
Cryptosporidium, ostatní zástupci rodu jsou označováni jako tzv. genotypy.
Genotypizace
Pro identifikaci kryptosporidií jak v biologických, tak i v environmentálních
vzorcích je nejčastěji používána nested PCR za použití rodově specifických primerů
amplifikujících variabilní úsek genu kódujícího malou ribozomální podjednotku (SSU
rRNA). Využití toho markeru má oproti ostatním (dále) výhodu v tom, že primery
používané pro amplifikaci části SSU jsou vysoce univerzální, to znamená, že zatím dosud
14
všechny popsané druhy a genotypy kryptosporidií je možné amplifikovat pomocí této
sady primerů. Jedinou výjimkou je druh C. felis, u něhož může docházet k problémům
s amplifikací a je nutné použít druhově specifické sekundární primery. Z dalších markerů,
které jsou hojně využívány je gen kódující protein stěny oocysty (COWP,
Cryptosporidium oocyst wall protein), gen kódující actin nebo gen kódující HSP70 (70
kDa heat shock protein). Využití těchto markerů však sebou nese výrazná rizika. Za prvé,
páry primerů nejsou univerzální a nelze jimi amplifikovat všechny známé, ale tedy
pravděpodobně i neznámé druhy a genotypy kryptosporidií. Tento fakt již primárně
diskvalifikuje využití těchto nástrojů v běžné rutinní praxi, kdy je nezbytná vysoká
senzitivita. Například žaludeční kryptosporidie savců a též C. canis či C. felis, jsou velmi
obtížně amplifikovány za použití primerů pro COWP. Při neznalosti této problematiky
pak může být vzorek považován za negativní, přestože při použití jiné metody by byla
pozitivita vzorku potvrzena. Za druhé, fylogeneticky příbuzné a humánně významné
druhy jako je C. parvum, C. hominis nebo C. cuniculus není možné na základě částečné
sekvence pro COWP od sebe odlišit. Navíc, použití actinu či HSP70 pro méně časté
druhy a genotypy sebou nese nutnost úpravy protokolu nebo navržení nových
sekundárních primerů. Dalším problémem je velmi častá nespecifita. Dle našich
dlouholetých zkušeností dochází zejména při použití primerů pro amplifikaci genu pro
actin k nasyntetizování řady nespecifických produktů.
Velmi častým a používaným nástrojem je metoda PCR-RFLP (restriction
fragment length polymorphism), kterou lze z hlediska genotypizace doporučit jen jako
prostředek pro rychlou orientaci a pro snížení nákladů na sekvenování. Použití RFLP
v diagnostické praxi, tak jak je využívána v naší laboratoři, si uvedeme v následujícím
případě. Je získána DNA ze vzorku, jež byl mikroskopickými metodami určen jako
Cryptosporidium spp. pozitivní. Následuje PCR amplifikace části genu SSU rRNA a
elektroforézou je potvrzena pozitivita vzorku. V tuto chvíli máme dvě možnosti. Buď
provést sekvenaci produktu přímo z PCR nebo aplikovat PCR-RFLP. V prvém případě
získáme sekvenci genu a porovnáním s databázemi určíme o jaký druh nebo genotyp
kryptosporidie se jedná. Bohužel sekvence části genu pro malou ribozomální podjednotku
nám neposkytne bližší data o intragenomické variabilitě. Proto je vhodnější využít
nástroje PCR-RFLP s následnou subtypizací (viz dále). Vhodně zvolenými kombinacemi
restrikčních endonukleáz lze velmi spolehlivě odlišit žaludeční a střevní druhy
kryptosporidií. V případě, že restrikční analýza prokáže přítomnost střevních druhů, je
dalším logickým krokem subtypizace, která spolehlivě určí nejen druh/genotyp, ale
15
poskytne i řadu dalších cenných epidemiologických informací. Pro tyto účely se nejčastěji
používá gen kódující 60-kDa glykoprotein (GP60). V případě, že RFLP prokáže
přítomnost žaludečních kryptosporidií přistupujeme k sekvenaci genu pro SSU rRNA.
Může nastat případ, kdy na základě RFLP zjistíme přítomnost střevních druhů
kryptosporidií, a přesto nedojde k pozitivní amplifikaci GP60 (viz dále). V takovémto
případě se opětovně přistupuje k sekvenaci genu pro SSU rRNA.
Subtypizace nebo subgenotypizace
Termínem subtypizace nebo subgenotypizace označujeme popis relativně malých
intragenomických variant v rámci druhu nebo genotypu kryptosporidií. Tento postup se
začal prvně používat u druhů C. parvum a C. hominis na úrovni genu kódující 60-kDa
glykoprotein (GP60). Následně byl rozšířen i na některé ostatní druhy a genotypy. Kromě
GP60 jsou používány i další cílové markery, nicméně jejich použití je jen okrajové a
v současné molekulární epidemiologii nejsou příliš často využívány, proto se jimi
nebudeme podrobně zabývat.
V rámci GP60 byly identifikovány tzv. rodiny glykoproteinů odpovídající vždy
danému druhu či genotypu kryptosporidií. V rámci těchto rodin pak rozlišujeme tzv.
subtypy na základě množství trinukleotidových opakování. Pro C. hominis byla zvolena
římská číslice I, pro C. parvum II, pro C. meleagridis III nebo například pro C. tyzzeri IX.
Dále následuje malé písmeno, které odlišuje jednotlivé klastry subtypových rodin v rámci
druhu/genotypu. Písmeno-číselný kód udávající počet trinukleotidových repeticí A
představuje počet opakování TCA, G počet opakování TCG, T počet opakování TCT a R
počet opakování ACATCA. Příkladem může být C. parvum IIaA5G2R1.
Je nutné mít na paměti, že tento model subtypizace byl primárně vytvořen pro C.
parvum a C. hominis, přestože je v dnešní době možno pomocí tohoto nástroje odlišit 13
různých střevních kryptosporidií. Poznámka: žaludeční kryptosporidie pravděpodobně
nemají GP60 a celá řada střevních druhů a genotypů má tak odlišný gen kódující GP60,
že při použití dosud známých setů primerů pro GP60 nedochází k amplifikaci žádného
fragmentu.
Na základě celé řady studií je dnes známo mnoho o hostitelské specifitě a
patogenitě jednotlivých subtypů kryptosporidií. Tak například C. parvum IIc je jen
výjimečně detekováno u zvířat, přestože je C. parvum obecně považováno za druh
s nejnižší hostitelskou specifitou. Detekce rodiny IIc u pacienta tak ukazuje na šíření
infekce v rámci lidské populace z osoby na osobu, případně lidskou stolicí
16
kontaminovanou vodou a potravou. Naopak identifikace C. parvum IIa ukazuje na skot,
respektive telata, jako nejčastější zdroj tohoto subtypu, a tedy na zoonotické šíření
patogena v populaci.
Smíšené infekce
Smíšené infekce jsou velmi časté, dokonce častější, než se řada odborníků
domnívá.
Zásadním problémem je „Jak identifikovat smíšenou kryptosporidiovou infekci“.
Mikroskopie, respektive morfometrie oocyst není až na jasné případy nápomocna
(smíšená infekce střevních a žaludečních kryptosporidií). Taktéž molekulární metody
nepřinášejí výrazný posun. Obecně totiž platí, že je přednostně amplifikován ten
druh/genotyp kryptosporidie, jenž je ve vzorku více zastoupen. I přestože je hostitel
infikován minimálně dvěma druhy kryptosporidií, následná PCR ve většině případů
prokáže přítomnost pouze jednoho z nich. Pokud by oba druhy byly zastoupeny v poměru
cca 1:1 dojde sice k nasyntetizování obou druhů se stejnou pravděpodobností, nicméně
následné sekvenční analýzy PCR produktů jsou těžko čitelné, a tudíž nevyhodnotitelné.
Proto je nutné provést klonování produktů a jejich následné sekvenování. Jednou
z možností je využití PCR-RFLP, avšak dle našich zkušeností je touto metodou odhaleno
jen nepatrné procento smíšených infekcí. Jako slibná alternativa se ukazuje real-time PCR
s následnou analýzou křivky teploty tání (MCA meeting curve analyse). Tato metoda je
však zatím ve vývoji a v současné době neexistují standardní křivky pro jednotlivé druhy
a genotypy kryptosporidií.
Mikrosporidie
V současné době je známo více než 1200 různých druhů mikrosporidií infikujících
v převážné většině bezobratlé a ryby. V humánní medicíně bylo dosud identifikováno 14
druhů z osmi rodů. U tří nejčastěji diagnostikovaných druhů – Enterocytozoon bieneusi,
Encephalitozoon cuniculi a E. hellem – jsou rozlišovány jednotlivé genotypy na základě
sekvenčních rozdílů.
Detekce
Z důvodu
nedostatečné
záchytnosti
mikrosporidií
v biologických
a
environmentálních vzorcích a nemožné druhové identifikace pomocí standardního
mikroskopického vyšetření jsou pro diagnostiku nejčastěji používány metody molekulární
17
biologie, především nested PCR amplifikující vnitřní přepisovaný mezerník (internal
transcribed spacer, ITS) genu pro malou ribozomální podjednotku (SSU rRNA). Tento
lokus představuje nejčastěji používaný cíl PCR, poněvadž na rozdílech v jeho sekvenci je
založeno rozlišení jednotlivých genotypů v rámci druhu E. bieneusi a rodu
Encephalitozoon. Dosud nebyl navržen multiplex protokol schopný amplifikovat
nejčastější lidské mikrosporidie v rámci jedné PCR reakce, proto jsou rutinně používány
sety druhově specifických primerů v několika oddělených souborech reakcí. V praxi se
nicméně setkáváme s faktem, že používané sety primerů nejsou 100% specifické a že
úspěšná amplifikace produktu PCR zdokumentovaná na agarózovém gelu nemá bez
sekvenace žádnou vypovídací hodnotu.
Genotypizace
Identifikace genotypu mikrosporidie se týká zejména E. bieneusi, kde bylo dosud
popsáno více než 120 genotypů s odlišnou hostitelskou specifitou. Zatímco některé
genotypy byly popsány pouze ze zvířat a jiné pouze z člověka, většina v současné době
známých genotypů patří do skupiny zoonotických, tedy infekčních jak pro člověka, tak i
zvířata. V současnosti jsou genotypy E. bieneusi děleny do pěti hlavních skupin 1-5,
přičemž v první skupině jsou zahrnuty pro člověka specifické nebo zoonotické genotypy
identifikované u lidí, skupina 2 obsahuje genotypy popsané u skotu, genotypy ve skupině
3 byly nalezeny u ondater, skupina 4 je specifická pro mývaly a v páté skupině jsou
řazeny dva nejodlišnější genotypy nalezené u člověka a kosmana. Encephalitozoon
cuniculi je na základě molekulární analýzy rozdělen do čtyř genotypů I-IV, které však
nejsou striktně hostitelsky specifické. Taktéž genotypy 1A, 1C, 1D, 2B, 2C rozlišovány u
E. hellem, nejsou hostitelsky vyhraněné. V rámci druhu E. intestinalis nebyl dosud
popsány žádné genotypy.
Nedílnou součástí diagnostiky mikrosporiií je bezesporu kvantifikace intenzity
infekce v biologických vzorcích. Jak již bylo zmíněno výše, mikroskopické vyšetření není
spolehlivé a spory mikrosporidií nejsou buď identifikovány vůbec, nebo jsou
zaměňovány za obdobně se barvící kvasinky i za použití „specifických“ barvících technik.
Z tohoto důvodu se přímo nabízí metoda qPCR, pro kterou bylo již vyvinuto několik
druhově specifických protokolů založených na amplifikaci části genu pro malou
ribosomální podjednotku. Tento fakt ale činí z qPCR rutinně nepoužitelnou metodu,
protože po klasické PCR amplifikující ITS s následnou sekvenací by následovala qPCR
zaměřená na SSU rRNA, což celý proces prodražuje.
18
Giardie
Molekulární genetické metody jsou nezbytné pro identifikaci a rozlišení
veterinárních a humánních genotypů G. intestinalis. Vzhledem k tomu, že k vylučování
cyst prvoka dochází nepravidelně, je vhodné/nutné získat od každého vyšetřovaného
jedince 3 vzorky stolice popřípadě trusu odebrané s odstupem 24-48 hodin a vyšetření
minimálně třikrát opakovat. Pro molekulární diagnostiku giardií bývá nejčastěji
používána nested PCR a nejčastěji jsou amplifikovány části genů SSU rRNA, β-giardin,
gdh (glutamate dehydrogenase) a tpi (triose phosphate isomerase). Praktické zkušenosti
nám ukazují, že tpi se často obtížně amplifikuje a řada mikroskopicky pozitivních vzorků
vychází falešně negativních. V tomto případě je lépe využít amplifikace části genu SSU
rRNA. Kvantitativní PCR v reálném čase (RT PCR) je metoda umožňující přesnou
kvantifikaci hledané cDNA ve vzorku. V současnosti je asi nejvíce rozšířená metoda
využívající 5-exonukleázové aktivity DNA polymerázy. Klíčovým je zde použití
oligonukleotidu – próby, která se specificky váže na sekvenci mezi oběma primery.
Sonda je na jednom svém konci označena fluorescenční látkou a na druhém konci
zhášečem fluorochromu. Při syntéze komplementárních vláken hydrolyzuje DNA
polymeráza sondu, dojde k uvolnění fluorescenční látky a k nárůstu fluorescence, která je
detekována a zaznamenána v reálném čase. Na základě standardizačních křivek lze přesně
kvantifikovat množství hledané cDNA sekvence ve vzorku.
Studie klinických izolátů genetickými metodami potvrdily, že většina zvířecích
nákaz nemá souvislost s infekcemi člověka. Na základě odlišností některých genů byl
druh G. intestinalis rozdělen do 8 asambláží (assemblage, genotypů) označených A-H.
Označení asambláž pochází z doby, kdy byly giardie děleny do skupin bez přispění
molekulárních metod a z tradice toto označení přetrvává. Typ A zahrnuje 2 podtypy,
označené AI a AII. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) patří mezi
nejstarší a doposud velmi rozšířené techniky v molekulární diagnostice. Ke štěpení DNA
dochází pomocí bakteriálních endonukleáz.. Část amplifikovaného genu tpi lze pomocí
enzymu RsaI rozdělit na podtypy AI a AII. Typ AI je smíšený genotyp blízce příbuzných
lidských a zvířecích izolátů. Typ AII zahrnuje pouze izoláty lidské stejně jako asambláž B.
Asambláže A i B jsou zoonotické. Asambláže C a D jsou nalézány u psů, typ E byl
nalezen u prasat, telat, ovcí a koz, typ F byl nalezen pouze u koček, typ G u potkanů a
19
asambláž H u mořských bezobratlých. Genetická diverzita může mít epidemiologický a
taxonomický význam. Pomocí genové analýzy G. intestinalis byla nalezena souvislost
mezi klinickým průběhem nákazy a genotypem prvoka. Typ AII vyvolává ve většině
případů onemocnění provázené klinickými příznaky (nechutenství, bolesti v podbřišku,
nadýmání, vodnatý průjem až malabsorpce a úbytek hmotnosti), kdežto nákaza typem B
probíhá asymptomaticky.
Závěry
Data získaná na základě genotypizace a a subtypizace jsou velmi cenná, zejména pro
a) identifikaci zdrojů šíření patogenního agens,
b) charakterizaci dynamiky přenosu infekcí v rámci lidské populace a
c) charakterizaci spektra klinických příznaků úzce spjatých s danými druhy,
genotypy nebo subtypy.
Tým Laboratoře veterinární a lékařské protistologie, Parazitologického ústavu,
Biologického Centra AV CŘ, v.v.i je vám k dispozici v jakémkoliv případě nejasností
s interpretací výsledků či metodickými radami.
20
Molekulární diagnostika střevních tasemnic
Jan Brabec
Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Parazitologický ústav, Branišovská 31, 370 05, České Budějovice,
[email protected]
Z hlediska humánní parazitologie můžeme mezi tasemnicemi skupiny Cestoda
nalézt několik pro člověka závažných původců parazitárních onemocnění. V současné
době v rámci všech tasemnic rozeznáváme přibližně 740 rodů, které členíme do 18
hlavních linií, tvořících dohromady celou skupinu Cestoda. Mezi těmito liniemi pouze
dvě (Cyclophyllidea a Diphyllobothriidea) zahrnují parazity člověka, a i z těchto pouze
několik rodů typicky parazituje v jeho střevě. Pro tyto tasemnice je tak člověk
definitivním hostitelem, ve kterém tasemnice dospívá a pohlavně se rozmnožuje. Mezi
nejznámější a zároveň nejvíce rozšířené lidské střevní tasemnice se kterými se setkáváme
i v České republice patří rody Taenia, Hymenolepis (řád Cyclophyllidea) a
Diphyllobothrium (řád Diphyllobothriidea). Všechny tyto rody zahrnují několik desítek
popsaných druhů, z nichž pouze některé jsou považované za typické lidské parazity.
Tradiční a v současné době stále využívanou metodou diagnostiky střevních
tasemnic je mikroskopická detekce jejich vajíček, případně oddělených článků ve stolici.
Vajíčka tasemnic blízce příbuzných druhů (např. v rámci rodu) jsou však morfologicky i
morfometricky velmi podobná, často navzájem zcela nerozlišitelná, což významným
způsobem komplikuje jejich jednoznačné určení do druhu. Ačkoliv střevní nákazy
tasemnicemi neohrožují lidského hostitele významným způsobem na zdraví či na životě a
jsou v zásadě spolehlivě léčitelné jednorázovým podáním antihelmintik, neumožňuje nám
jejich mylná či zcela chybějící druhová diagnostika lépe porozumět jejich životním
cyklům, epidemiologii a aktuální distribuci v prostředí. Molekulární metody založené na
PCR amplifikaci a sekvenování vybraných molekulárních markerů pak představují
citlivou a zároveň jedinou spolehlivou metodu, jak parazity přesně určit do druhů.
Ačkoliv je sekvenování vybraných genů a jejich následná analýza metoda dobře zavedená
a spolehlivá, pro rutinní využití v diagnostických laboratořích je stále relativně
komplikovaná, zbytečně zdlouhavá a finančně náročná. Z těchto důvodů byla pro některé
z výše uvedených rodů tasemnic optimalizována specifická molekulárně biologická
metoda založená na multiplex PCR, nevyžadující vlastní sekvenování, ale poskytující
rychlý a přesný test využitelný pro diferenciální diagnostiku tasemnic v klinické praxi.
21
Diferenciální diagnostika tasemnic rodu Diphyllobothrium (škulovec):
Následující molekulárně diagnostická metoda, založená na multiplex PCR, byla
vyvinuta pro účely jednoznačného rozlišení mezi člověka infikujícími druhy tasemnic
rodu Diphyllobothrium (škulovec), ale analogické multiplex PCR testy byly
optimalizovány a je možné jich využívat i pro diagnostiku dalších lidských parazitů, např.
zástupců rodu Taenia. V případě difylobotrióz, tj. nákaz tasemnicemi rodu
Diphyllobothrium, se u lidí v naprosté většině setkáváme se čtyřmi druhy škulovců: D.
latum, D. dendriticum, D. nihonkaiense a D. pacificum. Životní cykly všech těchto
zástupců jsou komplexní, zahrnují dva mezihostitele, a k nákaze člověka dochází
pozřením syrového či nedostatečně tepelně upraveného rybího masa obsahujícího druhé
larvální stadium parazita, tzv. plerocercoid. Morfologicky se jednotlivé druhy škulovců
liší zejména anatomií hlavičky a genitálního aparátu, tedy těch částí, které obvykle není
možné v případě lidských nákaz získat. Morfologická analýza vajíček obsažených ve
stolici pak umožňuje bezpečně určit parazita pouze do rodu, morfometrické vlastnosti
vajíček jednotlivých druhů se navzájem překrývají a infekční agens tak bývá nejčastěji
určeno jako D. latum či Diphyllobothrum sp. D. latum bylo dlouhodobě považováno za
dominantní druh způsobující lidské nákazy, nicméně recentní molekulárně biologické
testy poukazují na možné výrazné podhodnocení prevalence ostatních druhů rodu
Diphyllobothrium právě z důvodu chybně diagnostikovaných nákaz D. latum. Zároveň se
ukazuje, že obchod s rybami umožnil import škulovců do nepůvodních oblastí jejich
výskytu a díky vzrůstající oblibě konzumace jídel ze syrového rybího masa, např. sushi či
carpaccio, narůstá také výskyt lidských nákaz rybími tasemnicemi i v zemích západní
Evropy či Spojených států amerických.
Multiplex PCR je modifikací polymerázové řetězové reakce, ve které je část
chromozomální DNA amplifikována za pomocí několika různých primerů, které se liší
specificitou a místem nasedání na předem vybraný lokus dané templátové DNA. V
případě multiplex PCR pro diferenciální diagnostiku škulovců byl jako cílová molekula
vybrán mitochondriální gen kódující podjednotku 1 cytochrom oxidázy (cox1), která
mezi zmíněnými zástupci rodu Diphyllobothrium vykazuje dostatečně vysokou variabilitu
a umožňuje tak navrhnout primery nasedající pouze na daný druh. V závislosti na původu
templátové DNA ve zkoumaném vzorku dojde v průběhu PCR k amplifikaci různě
dlouhých úseků cox1, které je možné vizualizovat na agarózové gelové elektroforéze a
dle jejich délky pak určit nositele dané DNA. Na obr. 1 je vyobrazené schéma částí
22
sekvencí genu cox1 zmíněných čtyř druhů škulovců parazitujících u člověka. Schéma
zachycuje místa specifického nasedání forward primerů na jednotlivé druhy škulovců,
reverse primer pak univerzálně nasedá na všechny druhy. Výsledkem multiplex PCR je
tedy v závislosti na templátové DNA produkt o následujících délkách: D. latum 437 bp,
D. dendriticum 318 bp, D. nihonkaiense 1232 bp a D. pacificum 727 bp. Obr. 2 pak
zachycuje zmíněné PCR produkty vizualizovaném na agarózové gelové elektroforéze.
Obr. 1. Relativní pozice nasedání jednotlivých primerů pro diferenciální diagnostiku
tasemnic rodu Diphyllobothrium pomocí multiplex PCR. Znázorněny jsou pouze části
genu cox1, čísla nad sekvencemi udávají celkovou vzdálenost daného úseku od začátku
kódující sekvence v párech bazí. První sekvence náleží druhu D. latum, pod ním je D.
dendriticum, D. nihonkaiense a D. pacificum. Tečky označují nukleotid identický s první
sekvencí D. latum.
Obr. 2. Vizualizace amplifikovaných PCR produktů. (a) D. latum (1 až 24), (b) D.
dendriticum (25 až 41), (c) D. pacificum (42 až 58), (d) D. nihonkaiense (59 až 79). N –
negativní kontrola; MW – velikostní marker 100-bp ladder (Promega).
23
Specifičnost uvedené metodiky byla ověřena na několika dalších dostupných
druzích rodu Diphyllobothrium (D. ursi, D. ditremum a D. hottai). V žádném z těchto
případů nedošlo ke krosreakci s výše uvedenými primery. I když na základě tohoto testu
není možné vyloučit případnou falešně pozitivní krosreakci s dalšími netestovanými
zástupci
škulovců,
které
mohou
náhodně
parazitovat
také
u
člověka,
tato
pravděpodobnost je všeobecně považována za nízkou. Stejně tak není v případě
negativního výsledku možné vyloučit nákazu jedním ze čtyř uvedených lidských
škulovců z důvodu v současné době neznámé variability sekvence DNA v místě nasedání
multiplex primerů u dosud nestudovaných populací těchto parazitů. I když cox1
představuje v současné době u rodu Diphyllobothrium zdaleka nejvíce sekvenovaný gen,
množství jeho známých sekvencí zůstává relativně velmi nízké a výpovědní hodnota
jejich srovnání omezená. V případech negativních výsledků je proto nejlepším řešením
přikročit k osekvenování vybraných molekulárních markerů (např. cox1, 28S rDNA) za
použití univerzálních primerů.
Kritickým faktorem pro úspěšnou PCR amplifikaci jak pro multiplex PCR tak pro
případné sekvenování je však správný způsob fixace a uchovávání vzorků pro izolaci
intaktní DNA. Zde je nutné použít výhradně nedenaturovaný absolutní ethanol, a to jak
pro fixaci vajíček ve stolici, tak pro případné uchovávání nalezených článků či larválních
stádií tasemnic.
Literatura
Gordon, C.A., Gray, D.J., Gobert, G.N., & McManus, D.P. 2011: DNA amplification
approaches for the diagnosis of key parasitic helminth infections of humans.
Molecular and Cellular Probes 25, 143–152.
Jeon, H.-K., Chai, J.-Y., Kong, Y., Waikagul, J., Insisiengmay, B., Rim, H.-J., & Eom,
K.S. 200:. Differential diagnosis of Taenia asiatica using multiplex PCR.
Experimental Parasitology 121, 151–156.
Scholz, T., Garcia, H.H., Kuchta, R., & Wicht, B. 2009: Update on the human broad
tapeworm (genus Diphyllobothrium), including clinical relevance. Clinical
Microbiology Reviews 22, 146–160.
Wicht, B., Yanagida, T., Scholz, T., Ito, A., Jiménez, J.A., & Brabec, J. 2010: Multiplex
PCR for differential identification of broad tapeworms (Cestoda:
Diphyllobothrium) infecting humans. Journal of Clinical Microbiology 48, 3111–
3116.
24
Molekulárna analýza tenkohlavcov rodu Trichuris u ľudí a
ostatných primátov
Jana Petrášová
a,b
, Miroslav Oborníkc, Milan Jirkůc, Klára.J. Petrželkováb,c,d,e, Petra
Bolechováe,f, Cristina Cuitillasg, Rocio Callejóng, Josef Jarošh, Z. Beránkovái, David
Modryb,c,j
a
Department of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical
Sciences, Palackého tř. 1-3, 612 42 Brno, Czech Republic
b
Department of Pathology and Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and
Pharmaceutical Sciences, Brno, Czech Republic
c
Institute of Parasitology, Biology Centre, Academy of Sciences of the Czech Republic & University of
South Bohemia, Faculty of Science, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice, Czech Republic
d
Institute of Vertebrate Biology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Kv ětná 8, 603 65 Brno,
Czech Republic
e
Liberec Zoo, 460 01 Liberec, Czech Republic
f
Department of Husbandry and Ethology of Animals, CULS, Kamýcká 129,165 21 Prague, Czech Republic
g
Department of Microbiology and Parasitology, Faculty of Pharmacy, Sevilla University, Profesor García
González 2, 41012 Sevilla, Spain
h
Department of Histology and Embryology, Masaryk University, Kamenice 3, 625 00 Brno, Czech
Republic
i
BioTest s.r.o., Pod Zámkem 279, 281 25 Konárovice, Czech Republic
j
CEITEC - Central European Institute of Technology, University of Veterinary and Pharmaceutical
Sciences, Brno, Czech Republic
Úvod
Parazitárne infekcie nematódami rodu Trichuris sú popísané u rôznych druhov
cicavcov zahŕňajúcich rády primáty, mäsožravce, párnokopytníky, vačice, bandikuty,
zajacovce a hlodavce (Anderson, 2000). Ľudský tenkohlavec, známy pod názvom
Trichuris trichiura, bol síce pomenovaný Linném (1771) ako Ascaris trichiura, no
infekcie tenkohlavcami boli popísané už v 14tom storočí. Paleoparazitologické štúdie
však ukazujú, že tenkohlavce sprevádzajú ľudstvo o mnoho dlhšie (Fernades et al., 2005;,
Araujo et al., 2008) a spôsobujú vážne ochorenia v trópoch a subtrópoch až do dnes
(Crompton, 1999).
Infekcie spôsobované tenkohlavcami sú však známe aj u ostatných primátov
voľne žijúcich i v zajatí, v Amerike, Afrike, či v Ázii (McGrew et al., 1989; Ashford et al.,
2000; Mul et al., 2007; Teichoreb et al., 2009). Väčšina z týchto nálezov je popisovaných
ako Trichuris trichiura kvôli predpokladanému zoonotickému krížovému prenosu medzi
primátmi a ľuďmi (Munene et al., 1998; Chapman et al., 2006). I keď experimentálne
25
prenosy vajíčok Trichuris trichiura z ľudí na primáty a vice versa (Imada et al., 1980;
Horii and Usui, 1985) dokazujú širšie hostiteľské spektrum, nevylučujú však možnosť
existencie viacerých druhov, ktoré sa môžu líšiť v hostiteľskej špecificite/preferenciách
v prirodzených podmienkach (Poulin and Keeney, 2008).
Práca sa zaoberá úskaliami determinácie tenkohlavcov na molekulárnej úrovni
s využitím jadrovej i mitochondriálnej DNA z rôznych primátov žijúcich v zajatí i vo
voľnej prírode.
Materiál a metodika
Vzorky trusu boli zozbierané od primátov zo zoologických záhrad (Pan
troglodytes, Nomascus gabriellae, Papio anubis, Theropithecus gelada, Macaca silenus,
Chlorocebus sabaeus) a z voľne žijúcich primátov (z Rubondo Island National Park,
Tanzania: Chlorocebus aethiops pygerythrus). Z niektorých primátov v zajatí (Papio
hamadryas, Macaca fascicularis, Colobus guereza) a jedného človeka boli získané aj
dospelé jedince tenkohlavcov.
Trus bol fixovaný paralelne do 10% formalínu (5 gramov) a 96% etanolu (2
gramy). Dospelé jedince boli tiež fixované do 96% etanolu. Trus fixovaný vo formalíne
bol vyšetrený pomocou flotácie (Sheather, 1923) a prípade pozitívneho nálezu (Obr. 1),
boli vajíčka z etanolových vzoriek odsaté pomocou mikrokapiláry používanej pri
embryotransferoch.
DNA zo vzoriek bola izolovaná pomocou fenol-chloroformovej extrakcie
a následne amplifikovaná pomocou PCR, kde sme sa zamerali na 2 jadrové (18S, ITS2)
a 1 mitochondriálny (cox 1) gén. Výsledné PCR produkty boli sekvenované v Macrogen
Inc., Korea a následne použité do fylogenetických analýz, kde stromy boli počítané
pomocou Maximum Likelihood, Maximum Parsimony (MP) a Bayesian Interference (BI)
a požitý bol software PhylML, PAUP 4.b10 a PhyloBayes 3 (Guidon and Gascuel, 2003;
Swofford, 2002; Lartillot et al., 2009).
Výsledky
Fylogenetická analýza jadrových (18S, ITS2) a mitochondriálnych (cox1) génov
z tenkohlavcov preukázala genetickú variabilitu a existenciu dvoch základných linií: (i)
línia Trichuris trichiura zahŕňala väčšinu izolátov z primátov zo zajatia (Pan troglodytes,
Nomascus gabriellae, Papio anubis, Theropithecus gelada, Papio hamadryas, Macaca
26
fascicularis) i z prírody (Chlorocebus aethiops pygerythrus) a tiež izoláty z ľudí; (ii) línia
Trichuris suis sa skladala z dvoch poskupín, kde hlavná bola tvorená izolátmi z prasiat
(podskupina I) a druhá samostatná podskupina, tvorená izolátmi z primátov (Macaca
silenus, Chlorocebus sabaeus, Colobus guereza) a jedného človeka (podskupina II, obr.
2).
Diskusia
Rod Trichuris zahŕňa desiatky druhov a podobne ako väčšina ostatných nematód
boli determinované a popísané na základe morfologických a biometrických charakteristík,
či hostiteľa, v ktorom boli nájdené (Grove, 1990; Robles, 2011). Tento spôsob však
vyžaduje získať dospelé jedince, čo je však u ohrozených druhov, akými sú aj primáty,
pomerne obtiažne. Navyše kvôli nízkej morfologickej variabilite vajíčok je rozlíšenie
jednotlivých druhov u ľudí, primátov, či prasiat nemožné (Obr. 1). Preto sa molekulárna
analýza javí ako ideálne riešenie. V kombinácii s odsávaním vajíčok z féces, je tak možné
získať vzorku bez prímesi DNA ďalších nematód, ktoré infikujú primáty i ľudí pomerne
často (Stepek et al., 2006; Petrašova et al., 2010).
Analýza jadrových aj mitochondriálnych génov ukázala, že u ľudí aj primátov sa
vyskytuje viac druhov tenkohlavcov, pričom Trichuris trichiura evidentne infikuje široké
spektrum hostiteľov. Avšak i izoláty blízko príbuzné k Trichuris suis (podskupina II, obr.
2) pochádzajú i z človeka, čo poukazuje, že i ostatné druhy nebudú vysoko hostiteľsky
špecifické. To samozrejme podporuje predpoklad zoonotického charakteru, a tak stálu
bdelosť pri nálezoch pozitívnych vzoriek u primátov. Problémom však ostáva samotná
determinácia, ktorá s ohľadom na technické prevedenie môže byť nedosiahnuteľná.
Hoci boli pomenované skoro pred 250 rokmi, tenkohlavce z ľudí a primátov stále
získavajú vysokú pozornosť epidemiológov. Evidentná existencia viacerých druhov
u ľudí v kombinácii s celosvetovým
rozšírením a hlavne otáznym
zoonotickým
charakterom „nových“ druhov, vyzýva k ďalším výskumom zameraných na diverzitu
tenkohlavcov v týchto hostiteľoch.
27
Obr. 1 Variabilita vajíčok Trichuris spp. získaných z féces ľudí, ostatných primátov a prasaťa.
Fotografie poriadené pomocou Nomarski interferen čného kontrastu na Olympus AX70, merítko vo
všetkých obrázkoch = 25 µm. 1 – Trichuris trichiura človek; 2 – Trichuris sp. z Macaca fascicularis; 3 –
Trichuris sp. z Chlorocebus aethiops; 4 – Trichuris sp. z Chlorocebus aethiops; 5 – Trichuris suis z prasaťa
domáceho; 6 – Trichuris sp. z Macaca silenus; 7 – Trichuris sp. z Pan troglodytes; 8 – Trichuris sp. z
Chlorocebus sabaeus.
Obr. 2 Fylogenetický strom z ITS2 sekvencií po čítaný v Maximum Likelihood (ML) programe. V rámci
Trichuris suis podskupina I zobrazuje izoláty z prasiat a podskupina II izoláty z človeka a ostatných
primátov. Čísla nad koreňmi vetiev vyjadrujú podporu pre ML pri 1000 replikáciách. Izoláty získané v tejto
štúdii sú zvýraznené boldom.
28
Literatúra
Anderson, R.C. (2000). Nematode parasites of vertebrates. Their development and
transmission. 2nd Edn. CABI Publishing, Wallingford, UK.
Araujo, A., Reinhard, K. and Ferreira, L.F. (2008). Parasite findings in archeological
remains: Diagnosis and interpretation. Quaternary International 180, 17–21.
Ashford, R.W., Reid, G.D.F. and Wrangham, R.W. (2000). Intestinal parasites of the
chimpanzee Pan troglodytes in Kibale Forest, Uganda. Annals of Tropical Medicine
and Parasitology 94, 173–179.
Chapman, C.A., Gillespie, T.R., Speirs, M., Holland, T. and Austad, K. (2006). Life on
the edge: A comparison of primate gastrointestinal parasites from forest edge and
interior groups. American Journal of Primatology 68, 397–409.
Crompton, D.W.T. (1999). How much human helminthiasis is there in the world? The
Journal of Parasitology 85, 397–403
Fernandes, A., Ferreira, L.F., Goncalves, M.L., Bouchet, F., Klein, CH., Iguchi, T., Sianto,
L. and Araujo, A. (2005). Intestinal parasite analysis in organic sediments collected
from a 16th century Belgian archeological site. Cadernos de Saúde Pública 2, 329–332.
Grove, D.I. (1990). A history of human helminthology. CABI Publishing, Wallingford,
UK.
Guindon, S. and Gascuel, O. (2003). A simple, fast, and accurate algorithm to estimate
largae phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology 52, 696–670.
Horii, Y. and Usui, M. (1985). Experimental transmission of Trichuris ova from monkeys
to man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 79, 423.
Imada, I., Horii, Y. and Usui, M. (1986). The experiment of artificial infection to men and
monkeys by eggs of Trichuris trichiura from Japanese monkeys. Japanese Journal of
Parasitology 29, 30.
Lartillot, N., Lepage, T. and Blanquart, S. (2009). PhyloBayes 3: a Bayesian software
package for phylogenetic reconstruction and molecular dating. Bioinformatics 25,
2286–2288.
Linné, C. (1771). Mantissa Plantarum. Generum editionis VI, et Specierum editionis II.
Laurent Salvii, Stockholm.
McGrew, W.C, Tutin, C.E.G., Collins, D.A. and File, S.K. (1989a). Intestinal parasites of
sympatric Pan troglodytes and Papio spp., at two sites – Gombe (Tanzania) and Mt.
Assirik (Senegal). American Journal of Primatology 17, 147–155.
Mul, I.F., Paembonan, W., Singleton, I., Wich, S.A. and van Bolhuis, H.G. (2007).
Intestinal parasites of free-ranging, semicaptive and captive Pongo abelii in Sumatra,
Indonesia. International Journal of Primatology 28, 407–420.
29
Munene, E., Otsyula, M., Mbaabu, D.A., Mutahi, W.T., Muriuki, S.M.K. and Muchemi,
G.M. (1998). Helmith and protozaon gastrointestinal tract parasites in captive and
wild-trapped African non-human primates. Veterinary Parasitology 78, 195–201.
Petrášová, J., Modrý, D., Huffman, M.A., Mapua, M.I., Bobáková, L., Mazoch, V., Singh,
J., Kaur, T. and Petrželková, K.J. (2010). Gastrointestinal parasites of indigenous and
introduced primate species of Rubondo Island National Park, Tanzania. International
Journal of Primatology 31, 920–936.
Poulin, R. and Keeney, D. (2008). Host specificity under molecular and experimental
scrutiny. Trends in Parasitology 24, 24–28.
Robles, M.R. (2011). New Species of Trichuris (Nematoda: Trichuridae) from Akodon
montensis Thomas, 1913, of the Paranaense Forest in Argentina. The Journal of
Parasitology 97, 319–327.
Sheather, A.L. (1923). The detection of intestinal protozoa and mange parasites by a
flotation technique. Journal of Comparative Pathology 36, 266–275.
Stepek, G., Buttle, D.J., Duce, I.R., Behnke, J.M. (2006). Human gastrointestinal
nematode infections: are new control methods required? International Journal of
Experimental Pathology, 87, 325–341.
Swofford, D.L. (2002). PAUP* Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Version 4.
Sinauer Associates, Sunderland, MA.
Teichroeb, J.A., Kutz, S.J., Parkar, U., Thompson, R.C.A. and Sicotte, P. (2009). Ecology
of the gastrointestinal parasites of Colobus vellerosus at Boabeng-Fiema, Ghana:
Possible anthropozoonotic transmission. American Journal of Physical Anthropology
140, 498–507.
30
Průkaz Trichomonas vaginalis pomocí Real Time PCR
Hana Vlastníková
DYNEX
Pro průkaz Trichomonas vaginalis se nejčastěji používají přímé metody jako
mikroskopie a kultivace. Nejjednodušší metodou je nativní preparát vaginálního nebo
uretrálního sekretu. Senzitivita této metody použitelná při přímém mikroskopování se
pohybuje se od 40 % do 70 %, vyšší senzitivitu i specifitu má kultivace trichomonád ve
vhodném médiu, nicméně pro úspěšnou kultivaci je nutné dosáhnout 300-500 organismů
na 1 ml vzorku. V posledních letech se v rutinních laboratořích rozšiřuje používání
přímého průkazu DNA pomocí PCR či Real Time PCR analýz. V případě T. vaginalis
doposud nejde o tolik rozšířený trend, v porovnání s jinými STD, jako například u
DNA Chlamydia trachomatis či Neisseria gonorrhoeae, nicméně pokud laboratoř má
přístrojové vybavení pro tyto metody, nabízí se tak možnost využít komerční soupravy
dostupné na trhu jako další možnost diagnostiky T. vaginalis.
V rámci spolupráce s rutinním klinickými laboratořemi dodává společnost Dynex
ucelené portfolio Real Time PCR souprav pro průkaz sexuálně přenosných nemocí, tedy i
Real Time PCR soupravy pro průkaz Trichomonas vaginalis v klinickém materiálu.
Výhodou poskytovaného řešení je zejména shoda postupů zpracování materiálu
s ostatními STD vyšetřeními. Jedním izolačním kitem lze zpracovat vzorky pro analýzu
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma species, Ureaplasma
species, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis a dalších infekčních agens
vyskytujících se v urogenitálním traktu, tedy i virových patogenů jako např. HPV.
Z jednoho jediného izolátu lze tedy snadno prokazovat řadu různých patogenních
organismů. V případě bakterií a parazitů je další výhodou shoda interních pozitivních
kontrol zakomponovaných v jednotlivých vyšetřeních. Interní pozitivní kontrola, v tomto
případě syntetický plazmid, je přidávána při lyzaci vzorku v počátečních krocích izolace
biologického materiálu a prochází celým procesem zpracování spolu se vzorkem a
umožňuje tak odhalit případnou inhibici PCR či nedokonalou izolaci a zabránit vydání
falešně negativních výsledků. Tato interní kontrola je identická, lze ji prokazovat v rámci
jednoho izolátu pro různá vyšetření, přičemž všechny Real Time PCR souprav jsou
designovány tak, že vlastní prokazovaná patogenní DNA je detekována v jednom kanále,
většinou v 1. kanále FAM. Interní kontrola je pak detekována ve 2. kanále,
prostřednictvím fluorescenční značky Cy3. Toto řešení šetří čas i náklady na izolaci
31
vzorků v provozu laboratoře. Doporučeným materiálem pro výše uvedená vyšetření jsou
zejména urogenitální výtěry, moč, resp. močový sediment, prostatická tekutina a sperma.
Vzorky je doporučeno zpracovat co nejdříve po odběru, nicméně je lze skladovat při +2
až +8°C po 24 hodin, v případě delšího intervalu je doporučeno vzorky zamrazit. Časová
náročnost celé analýzy včetně izolace DNA z materiálu je cca 3h maximálně. V systému
detekce je samozřejmě zahrnut kompletní kontrolní mechanismus: již zmíněná interní
pozitivní kontrola pro kontrolu inhibice a izolace DNA z materiálu, dále negativní
izolační kontrola, odhalující případnou kroskontaminaci mezi vzorky během zpracování
materiálu, negativní kontrola amplifikační, zachycující případnou kontaminaci během
přípravy PCR mastermixu a samozřejmě nezbytná pozitivní kontrola, obsahující DNA T.
vaginalis, pro monitorování průběhu samotné PCR. Navržený kontrolní mechanismus
zajišťuje spolehlivost a validitu získaných dat. Analytická specificita deklarovaná
výrobcem se blíží ke 100 % a je dána specificitou navržených primerů a prób. Specificita
byla prakticky ověřena analýzou skupiny kontrolních vzorků, přičemž nebyla pozorována
žádná zkřížená reaktivita s jinými patogeny. Výrobce deklaruje 100% analytickou
citlivost průkazu DNA T. vaginalis ve vzorcích s koncentrací 500 a více kopií/ml.
Všechny soupravy jsou CE IVD certifikované, kompatibilní s řadou Real Time PCR
cyklerů dostupných na českém trhu.
Literatura:
Caliendo, A.M.; Jordan, J.A.; Green, A.M. ; Ingresoll, J. ; Diclemente, R.J. and Wingood,
G.M. 2005. Real-time PCR improves detection of Trichomonas vaginalis infection
compared with culture using self-collected vaginal swabs. INFECTIOUS
DISISEASES IN OBSTETRICS AND GYNECOLOGY, 13(3): p.145–150
Jordan, J.A.; Lowery, D. and Trucco, M. 2001. TaqMan-Based Detection of Trichomonas
vaginalis DNA from Female Genital Specimens. JOURNAL OF CLINICAL
MICROBIOLOGY, 39(11): p. 3819–3822
Pillay, A.; Radebe, F.; Fehler, G.; Htun, Y. and Ballard, R.C. 2007. Comparison of a
TaqMan-based real-time polymerase chain reaction with conventional tests for the
detection of Trichomonas vaginalis. SEX TRANSM INFECT, 83: p. 126–129.
Sacace. 2010. Manual Trichomonas vaginalis Real-TM, Sacace, Ver.15.10.10,
www.sacace.com, http://www.sacace.com/sexually-transmitted-diseases.htm#s4
Schwebke, J.R.; Hobbs, M. M.; Taylor, S.N.; Sena, A.C.; Catania, M.G.; Weinbaum,
B.S.; Johnson, A.D.; Getman, D.K. and Gaydos, Ch.A. 2011. Molecular Testing
for Trichomonas vaginalis in Women: Results from a Prospective U.S. Clinical
Trial. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, p. 4106–4111
32
Parazitologie v éře molekulární diagnostiky
(Shrnutí a praktická doporučení pro ty, kteří se molekulární diagnostikou běžně
nezabývají, ale někdy ji potřebují)
Oleg Ditrich
Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích
[email protected]
Letos uplyne 30 let od objevu polymerázové řetězové reakce - PCR (Mullis et al.,
1986), počátku jedné z největších revolucí nejen v genetice, ale postupně ve všech
biologických oborech. Když před dvaceti lety Kary Mullis z rukou švédského krále
přejímal Nobelovu cenu za její objev a realizaci, skromně charakterizoval svůj
obdivuhodný nápad a deset let práce na jeho uskutečnění jako souběh náhod, vědecké
naivity a série šťastných omylů. Výsledkem těchto „náhod a omylů“ je současná situace,
kterou bez nadsázky můžeme označit jako éru molekulární biologie: molekulární metody
pronikly do všech biologických oborů a ani v nejmenším nic nenaznačuje, že by byl jejich
bouřlivý rozvoj u konce.
Velmi široké je využití molekulárních metod v oblasti klinické medicíny. Bez
jejich použití se neobejde diagnostika řady neinfekčních onemocnění (genetických,
onkologických,
hematologických)
a
veškerých
onemocnění
infekčních,
včetně
parazitárních. Předchozí (výše uvedené) referáty ilustrují pouze výběr parazitických agens,
k jejichž diagnostice jsou molekulární metody velmi užitečné a v některých případech
dokonce v dnešní době nezbytné.
Bylo by však chybou se domnívat, že molekulární diagnostika je samospasitelná a
že metody, které ji používají, úplně vytlačí a nahradí metody „klasické“. Z mnoha
dobrých důvodů je velmi užitečné molekulární diagnostiku kombinovat se zobrazovacími
metodami, s koprologií, histologií, elektronovou mikroskopií, sérologií apod. Kombinace
více metod jednak velmi snižuje pravděpodobnost chybného výsledku a navíc přináší
nové, velmi užitečné informace.
Kdy je pro parazitologa užitečné molekulární diagnostiku použít?
•
Když je citlivost klasických metod příliš nízká
Týká se to především jednobuněčných původců parazitárních infekcí, jako je např.
Pneumocystis nebo mikrosporidie. U mikrosporidií umožnilo použití molekulárních
33
metod odhalit skutečnost, že některé druhy infikují zcela běžně zdravou populaci a působí
u imunokompetentních jedinců bezpříznakové infekce.
•
Pokud jsou klasické metody časově i metodicky náročné
Příkladem je diagnostika Chagasovy choroby nebo toxoplasmózy, kdy xenodiagnóza
nebo infekce laboratorních zvířat či tkáňové kultury zabere dny i týdny, kdežto
molekulární diagnostika umožní získat výsledek dokonce týž den, kdy je materiál
z pacienta odebrán.
•
V případě, že morfometrické metody nepostačují k druhové determinaci
Tato situace nastává stále častěji. Příkladem jsou třeba kryptosporidie, kdy řada
rozdílných druhů má morfologicky totožné oocysty nebo rozlišení patogenní Entamoeba
histolytica od morfologicky neodlišitelné E. dispar a E. moshkowskii. Dalšími příklady
mohou být diferenciace vajíček tasemnic Taenia solium/T. saginata/T. asiatica nebo
měchovců Ancylostoma duodenale a Necator americanus. Teprve molekulární
diagnostika odhalila, že člověk kromě „svých“ tenkohlavců (Trichuris) a škulovců
(Diphyllobothryum) hostí relativně často i „zvířecí“ druhy těchto rodů. Časté nálezy
prasečí škrkavky Ascaris suum u lidí a její hybridizace s A. lumbricoides vedly k závěru,
že jde o týž druh A. suum je mladším synonymem (Nejsum et al. 2005, Leles et al. 2012).
Precizní druhová determinace může mít důsledky na rozhodnutí o potřebě léčby (améby)
nebo (ve většině ostatních případů) přispívá k odhalení zdrojů infekce a napomáhá
k přerušení epidemiologického cyklu.
•
Pokud je potřeba parazita determinovat přesněji, než do druhu
(genotypizace)
Tento případ nastává především tehdy, vyskytují-li se různé genotypy téhož druhu u
různých hostitelů. I v tomto případě může determinace genotypu přinést cenné informace
pro epidemiologii a pátrání po zdroji infekce. Příkladem jsou genotypy („asambláže“)
giardií, genotypy mikrosporidie Encephalitozoon cuniculi nebo genotypy echinokoků
(Romig et al. 2006, Thompson 2008).
34
•
Při pátrání po parazitech v environmentálních vzorcích
Takzvané environmentální vzorky se obvykle vyznačují nízkou koncentrací parazitů a
navíc v nich může být mikroskopická diagnostika znesnadněna deformací či dokonce
částečnou desintegrací parazitů. V těchto případech je pak využití molekulární
diagnostiky velmi výhodné. Příkladem může být diagnostika parazitů šířených vodou
(Giardia, Cryptosporidium) na vodních filtrech, pátrání po Pneumocystis jirovecii na
vzdušných filtrech, detekce amfizoických améb v biofilmech, sedimentech a půdě nebo
průkaz Cyclospora cayetanensis na drobném ovoci nebo na listech bylin.
•
Při pátrání po parazitech v archeologickém materiálu
Zatímco vajíčka některých helmintů bývají v archeologických materiálech někdy až
překvapivě dobře zachována, cysty a spory jednobuněčných parazitů bývají
desintegrovány ještě ve větší míře, než v environmentálních vzorcích. Ribonukleové
kyseliny jsou však relativně dobře odolné a tak lze v archeologickém materiálu detegovat
i zbytky ribonukleových kyselin (tzv. antient DNA) jednobuněčných parazitů (Myšková
et al. 2013).
•
V případě, že po diagnóze navazuje další výzkum
(fylogeneze, molekulární epidemiologie atd.)
Tady jde především o vzájemnou spolupráci mezi pracovišti diagnostickými a pracovišti
základního výzkumu. Prospěch je oboustranný: diagnostické pracoviště oceňuje potvrzení
a upřesnění svých výsledků, popřípadě informace usnadňující odhalení zdroje infekce
parazitem a laboratoř základního výzkumu zase získává cenný materiál, který je čím dál
tím méně dostupný. Předpokladem je pochopitelně oboustranný respekt a samozřejmě
spoluautorství při publikování výsledků. V případě, že diagnostické pracoviště nemá
příslušnou spolupráci navázanou a dostane se k materiálu, u kterého je naděje, že by
molekulární analýza mohla přinést nové informace, doporučuji napřed se zabývat fixací a
uchováním materiálu a až následně sháněním kontaktů.
•
Když je molekulární analýza levnější
Bude-li pokračovat tempo, kterým se molekulární analýzy zlevňují a cena kvalifikované
lidské práce roste, bude tento případ velmi obecný a vyskytnou se ekonomické tlaky,
jejichž cílem bude molekulární diagnostiku zautomatizovat a vytvořit univerzální
diagnostická centra, která budou se stejnou přístrojovou výbavou diagnostikovat všechny
35
patogeny. Podobný trend jsme viděli (a dosud někdy vidíme) v sérologické diagnostice.
Mělo by to však mít své hranice a vývoj by měl směřovat, jak už bylo zmíněno, ke
kombinaci molekulárních analýz s „klasickými“ metodami. Pomůže to vyhnout se
některým úskalím a rizikům, které jinak hrozí.
Úskalí a rizika molekulární diagnostiky v parazitologii
Výhody molekulární diagnostiky parazitů jsou nesporné a jsou zmíněny jak
v předchozím textu, tak v předchozích referátech. Zaměřme se však i na její nevýhody,
úskalí a rizika:
•
Příliš vysoká citlivost
Citlivost molekulárních metod je o několik řádů vyšší, než metod klasických a navíc stále
ještě roste. V některých případech to může být na škodu: pokud např. PCR odhalí
mikrosporidie ve stolici či moči, není jasné, zda jde o bezpříznakovou infekci nebo již
onemocnění. Mikroskopický nález spor však velmi podporuje druhou možnost.
•
Možnost kontaminace
S vysokou citlivostí souvisí i vysoké riziko kontaminace, mnohem vyšší, než u ostatních
metod. Stačí pro ni jediná buňka nebo i její část. S kontaminací se setkal snad každý, kdo
molekulární diagnostiku používá. Falešně pozitivní výsledek nastává v mnoha případech
kontaminací dosud nevyšetřeného vzorku amplikony při neopatrném pipetování jiného
pozitivního již amplifikovaného vzorku.
•
Nebezpečí falešné pozitivity
Z vysoké citlivosti i z možností kontaminace vyplývá riziko falešně pozitivních výsledků,
se všemi důsledky pro pacienta. Východiskem je kombinace s dalšími metodami a
potvrzení výsledku např. mikroskopicky.
•
Nebezpečí falešné negativity
Občas může dojít k situaci, kdy mikroskopem v materiálu parazita vidíme, ale
molekulární diagnostika vychází negativně. Falešně negativní výsledek může být
zapříčiněn přítomnosti inhibitorů polymerázy (talek, heparin, močovina, složky hnisu).
Falešně
negativní
výsledek
lze
vyloučit
36
souběžnou
amplifikací
syntetického
oligonukleotidu přidaného ke vzorku (interní kontrola). Nedojde-li ani k jeho amplifikaci,
jde o selhání reakce.
•
Nesnadná kvantifikace
Většina v současnosti používaných molekulárních metod neumožňuje kvantifikaci;
přitom ty, které ji umožňují, jsou mnohem náročnější a dražší. Výhoda kvantifikace
vystupuje do popředí např. při diagnostice malárie, nejen pro posouzení klinického stavu
pacienta, ale též např. při in vivo stanovení rezistence malarických plasmodií (nebo,
jinými slovy, při sledování účinnosti terapie podle snižování parazitémie).
•
Molekulární diagnostika neodhalí rozdíl mezi živým a mrtvým parazitem
Mrtví paraziti nebo jejich zbytky mohou ještě poměrně dlouhou dobu cirkulovat
v krevním řečišti nebo zůstávat v jiných tkáních. Molekulární metody je na rozdíl od např.
histologických metod většinou od živých nedovedou rozlišit. Možné důsledky pro terapii
(její zbytečné prodlužování) apod. jsou zřejmé.
•
Vysoká specificita
Tato nesporná výhoda může být i nevýhodou. Pokud je dvojice diagnostických primerů
příliš specifická, může infekce jiným genotypem nebo druhem zůstat nerozpoznána.
Řešením je samozřejmě diagnostikovat ve dvou stupních a v prvním z nich použít takové
primery, které zachytí celu skupinu parazitů (např. mikrosporidie). Jiná agens, která
nejsou cílené skupině příbuzná, nebudou však ani v tomto případě rozpoznána.
Mikroskopické vyšetření naopak odhalí parazity i vzájemně nepříbuzné.
•
Méně komplexní informace
Tato nevýhoda je jednak komplexem tří předešlých úskalí, jednak ještě dalších
skutečností. Na rozdíl např. od histologické diagnostiky nám např. molekulární analýzy
nesdělí nic o reakci hostitele na infekci.
•
Nebezpečí desinterpretace výsledku
Toto riziko vyplývá z každého z výše uvedených úskalí jednotlivě, i z jejich vzájemných
kombinací. Řešením je kontrola diagnózy pomocí jiné metody.
37
Jak omezit riziko kontaminace?
Snižovat možná rizika kontaminace je nutné hned při odběru materiálu. Je vhodné
dbát na čistotu, sterilitu a bezprašnost, používat gumové rukavice, v odůvodněných
případech i roušky. Pro odběr, uchování i zpracování vzorků je výhodné použít
jednorázové plasty. Vzorky je velmi výhodné hned na počátku rozdělit na dvě nebo více
části a usnadnit tak možnost kompletního opakování.
Největší riziko kontaminace však nehrozí při odběru, ale při zpracování materiálu
v laboratoři, zvláště pokud je specializována na určité agens. Nebezpečí spočívá zejména
v kontaminaci zásobních roztoků, nádob a nástrojů. Využívají se různé postupy odhalující
kontaminaci. V podstatě všechny fyzikální, chemické a biologické kroky vedoucí u určení
organismu mají sklon být nějakým způsobem ovlivněny (Petersen a Dahllöf 2005).
Kontaminaci PCR je možné do určité míry předejít opatrným zacházením, UV zářením,
použitím uracil-DNA-glykozylázy nebo třeba gelovou či membránovou filtrací (deWit et
al. 1993). Vzdušné kontaminaci se předchází stavebním oddělením jednotlivých úseků
laboratoře a používáním boxů s bariérou laminárního proudu vzduchu. U real-time PCR
se kyvety pro amplifikaci vůbec neotevírají, ale rovnou vyhazují a tak je zde toto riziko
nepoměrně menší.
Jak omezit riziko inhibice PCR?
Pro správnou interpretaci PCR výsledků je nutné odhalení PCR-inhibitorů, které
mohou zapříčinit falešně negativní výsledky. K tomuto účelu se s úspěchem využívají
interní standardy (mimic DNA) (deWit et al., 1993, Heath et al., 2003) též důsledné
kontroly a možnost opakování.
Fixace a uchovávání vzorků pro izolaci DNA
Lze říci, že každý organismus i materiál může mít svá specifika a že nelze vytvořit
univerzální návod, jak s ním zacházet. Přesto lze doporučit obecné zásady:
DNA pro molekulární diagnostiku se dobře izoluje ze vzorků živých, zmrazených nebo
fixovaných etanolem.
Živé vzorky se většinou špatně uchovávají, dopravují nebo zasílají. Výjimkou
jsou např. oocysty kokcidií nebo kryptosporidií, které lze dlouhodobě uchovávat
v roztoku dvojchromanu draselného, omezujícího množení jiných mikroorganismů.
Donedávna se tvrdilo, že dvojchroman není pro izolaci DNA vhodný a doporučovalo se
38
aspoň jeho důkladné vymytí, ale dnes mnohé laboratoře izolují DNA přímo ze vzorků
uchovaných v tomto roztoku (pověrám se nevyhýbá ani parazitologie.
Zmrazení vzorku je též dobrou volbou, pokud máme promyšleno, jak vzorek
dopravit do cílové laboratoře bez zbytečného (a opakovaného) rozmrazování. Čím nižší
teplota, tím lépe.
Fixace etanolem je používaná nejčastěji – jde v podstatě o odvodnění. Snažíme se,
aby kvůli snadnějšímu pronikání alkoholu byly kousky materiálu dostatečně malé, aby
etanol byl v nadbytku. Měl by mít aspoň 70%, ale čím koncentrovanější a čistší, tím lépe.
Fixace formalínem a dalšími roztoky obsahujícími formaldehyd nebo
glutaraldehyd je pro molekulární diagnostiku v zásadě nevhodná (Shibata 1994). Existuje
sice řada postupů a triků jak DNA izolovat i z formalínových vzorků, či dokonce
z parafínových histologických bločků (Schander a Halanych 2002), ale považují se až za
východisko z nouze a je nutno počítat se skutečností, že DNA může být poškozena.
Závěr
Molekulární diagnostika je pro parazitology velmi efektivní a přínosná a lze
očekávat, že se bude dále zdokonalovat a zlevňovat. Ještě více než jiné diagnostické
metody vyžaduje velmi pečlivou práci, promyšlený systém kontrol a kritický přístup při
interpretaci výsledků. Ideální je kombinace molekulární diagnostiky s dalšími
diagnostickými metodami.
Literatura
Benedík J., Černý J., Votava M., Wechsler J., Horváth R., Dendis M., Grijalva M.,2003:
Molekulární diagnostika infekčních stavů. Časopis lékařů českých, Praha, CLS
JEP, 142: 75-79.
deWit, D., Wootton, M., Allan, B., Steyn, L. 1993: Simple Method for Production of
Internal Control DNA for Mycobacterium tuberculosis Polymerase Chain
Reaction
Assays. J. Clin. Microbiol. 31: 2204-2207.
Heath, G. S., King, D. P., Turner, J. L. E., Wakeley, P. R., Banks, M. 2003. Use of an
39
internal standard in a TaqMan® nested reverse transcription-polymerase chain
reaction for the detection of bovine viral diarrhoea virus. Vet. Microbiol. 96: 357366.
Leles D., Gardner S. L., Reinhard K., Iñiguez A., Araujo A., 2012: Are Ascaris
lumbricoides and Ascaris suum a single species? Parasites & Vectors 5:42
doi:10.1186/1756-3305-5-42
Mariapia V.M. (Ed.). Detection of Bacteria, Viruses, Parasites and Fungi, Springer, 2010
Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H., 1986: Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb
Symp Quant Biol. 51 Pt 1: 263-73.
Myšková E, Ditrich O, Sak B., Kváč M, Cymbalak T: 2013: The detection of ancient
DNA of Encephalitozoon intestinalis (Microsporidia) in archaeological material.
J. Parasitol, submitted.
Nejsum P, Parker ED Jr, Frydenberg J, Roepstorff A, Boes J, Haque R, Astrup I, Prag J,
Skov Sørensen UB, 2005: Ascariasis is a Zoonosis in Denmark..J Clin Microbiol.
43:1142-1148.
Petersen, D. G., Dahllöf, I. , 2005. Improvements for comparative analysis of changes in
diversity of microbial communities using internal standards in PCR-DGGE.
FEMS
Microbiol. Ecol. 53: 339-348.
Romig T, Dinkel A, Mackenstedt U., 2006: The present situation of echinococcosis in
Europe. Parasitol Int. 55 Suppl :S 187-191
Schander C., Halanych KM, 2002: DNA, PCR and formalìnized animal tissue - a short
review and protocols. Org. Dìvers. Evol. 3, 195 – 205.
Shibata, D., 1994: Extraction of DNA from paraffin-embedded tissue for analysis by
polymerase chain reaction: new tricks from an old friend. Human Pathol. 25: 561563.
Thompson RC, 2008: The taxonomy, phylogeny and transmission of Echinococcus. Exp
Parasitol.119: 439-446
40
DYNEX LABORATORIES, s.r.o., Lidická 977, 273 43 Buštěhrad
Tel: 220 303 600, E-mail: [email protected]
www.dynex.cz
•
•
•
•
Dodavatel a výrobce laboratorních přístrojů, diagnostických souprav a
spotřebního materiálu
Kvalitní produkty pro klinické diagnostické laboratoře, akademie a výzkumné
ústavy, pracoviště forenzní genetiky, veterinární a hygienické laboratoře,
fytopatologii, laboratoře testující kvalitu a složení potravin a další
Ucelený sortiment produktů pro Vaši laboratoř včetně odborného zaškolení
obsluhujícího personálu a poradenství
Profesionální zákaznický servis a komplexní řešení diagnostického procesu
v rámci českého a slovenského trhu
Diagnostika
• Mikrobiologie a imunologie (ELISA, imunofluorescence, bloty)
• Molekulární biologie (Real Time PCR i endpoint PCR, hybridizace, RFLP,
izolační soupravy, obecné reagencie a pufry)
• Rapid testy (H.pylori, C. difficile, E.coli EHEC, O157, Campylobacter, Strep A,
chřipka A/B, RSV, adenoviry, rotaviry)
• Testy na drogy ze slin a moče
• Kultivační média
• Imunohematologie
• A další
Přístroje
• Automaty (DSX, DS2, Chorus)
• Fotometry, fluorometry, luminometry, promývačky
• Blotové techniky (DYNABLOT)
• Molekulární biologie (termocyklery, ELFO, drobné přístroje)
• Laminární a biohazardní boxy, digestoře
• Rozplňovací zařízení (Qasar, Dynamic)
• Malé laboratorní přístroje (třepačky, míchadla, inkubátory, centrifugy, lázně)
• Pipety, dávkovače a plastový spotřební materiál
Zkušební a kalibrační laboratoř DYNEX akreditovaná ČIA
• Kalibrace pipet
• Zkoušky laminárních boxů
®
Na základě více než 10-ti let zkušeností s Real-time PCR jsme vyvinuli zcela nový gradientový LightCycler 96, který
splňuje náročné požadavky moderní laboratoře na kvalitu, výkon, design a uživatelsky příjemný SW.

Nejpřesnější real-time PCR instrument na trhu – optická vlákna zaručují přesné snímání ze všech 96-ti
jamek zároveň

Gradientový stříbrný blok umožňuje velmi rychlé cyklování, délka trvání amplifikačního běhu < 40min

Moderní, uživatelsky příjemný SW Vám ušetří čas při analýze dat, SW Vás informuje o ukončení běhu a
naměřená data Vám odešle e-mailem

Dotyková obrazovka Vám umožní spustit běh bez použití externího počítače

Přístroj je velmi tichý, 43dB (A), nebude Vás rušit, ani pokud ho budete mít přímo na Vašem pracovním
stole

Více na www.lightcycler96.com
Máte-li zájem zdarma vyzkoušet LightCycler® 96 ve Vaší laboratoři, kontaktujte nás, prosíme, na adrese [email protected]
SPONZOŘI
KOORDINÁTOR ODBORNÉHO SEMINÁŘE:
Doc. RNDr. Oleg Ditrich, CSc
[email protected]