docOrganická syntéza na pevné fázi (OCH/OSPF)
download 
Stížnost Transkript
Organická syntéza na pevné fázi (OCH/OSPF)
Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Praktické aspekty syntézy na pevné fázi Barbora Lemrová Veronika Fülöpová Olomouc 2015 Recenzenti: RNDr. Marek Zatloukal, Ph.D. doc. RNDr. Miroslav Soural, Ph.D. Skripta vznikla v rámci realizace projektu OP VK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 s názvem „Inovace ve vzdělávání v chemii a biologii s ohledem na aktuální trendy v biomedicinálním výzkumu“. 1. vydání © Barbora Lemrová, Veronika Fülöpová, 2015 © Univerzita Palackého v Olomouci, 2015 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost. ISBN 978-80-244-4536-6 Významná část terapie v současné humánní medicíně je postavena na použití organických sloučenin. Ty mohou být čistě přírodního původu, nebo mohou být strukturně odvozeny od látek přírodních, případně se může naopak jednat o látky zcela syntetické, které se v přírodě nenacházejí. To, zda je látka biologicky aktivní, závisí na její struktuře, přičemž drobná změna může způsobit výrazné zvýšení či snížení dané aktivity. Jednou z možností, jak vztahy mezi strukturou a biologickou aktivitou studovat, je příprava řady různě substituovaných analog příslušného základního skeletu a následné vyhodnocení vlivů strukturních změn na vlastnosti sloučenin. Možnost přípravy těchto analog v krátkém čase samozřejmě celý proces studia potenciálních léčiv značně urychluje. Proto na našem pracovišti vyvíjíme metody syntéz, které mohou sloužit k jednoduché a rychlé přípravě tzv. chemických knihoven, tedy setů látek umožňujících následné řešení vztahů mezi biologickou aktivitou a strukturou. Nejčastější variantou je změna charakteru jednotlivých ligandů na základním skeletu. Mění se např. struktura jednotlivých alifatických skupin, provádí se zavádění a nahrazování různých heteroatomů v základním skeletu, zavádí se různé typy funkčních skupin, mění se velikosti cyklů apod. Mezi základní metody používané pro přípravu chemických knihoven patří klasická syntéza v roztoku a syntéza na pevné fázi, které společně s kombinatoriální chemii přispívají ke zvýšení efektivity syntetického procesu. Skriptum, které se vám dostává do rukou, dle názvu popisuje syntézu na pevné fázi z praktického pohledu a zaměřuje se na konkrétní nejčastější případy, se kterými se studenti mohou setkat v laboratoři. Velký důraz je zejména kladen na pochopení mechanismů reakcí a aplikovatelnost jednotlivých typů pryskyřic/linkerů na reálně publikovaných pracích. Text je určen všem posluchačům kurzu Organická syntéza na pevné fázi a studentům, kteří se začínají věnovat syntéze na pevné fázi v rámci své kvalifikační práce. Autoři 1 Obsah 1 Obsah .......................................................................................................................... - 4 - 2 Princip syntézy na pevné fázi ...................................................................................... - 6 2.1 2.1.1 Přítomnost aktivních míst ............................................................................ - 7 - 2.1.2 Bobtnání pryskyřice ...................................................................................... - 8 - 2.2 4 Kysele štěpitelné linkery ............................................................................... - 9 - 2.2.2 Další typy linkerů ........................................................................................ - 13 - Analýzy meziproduktů a produktů .................................................................... - 15 - 2.3.1 Ninhydrinový test ....................................................................................... - 16 - 2.3.2 Test Bromfenolovou modří ........................................................................ - 16 - 2.3.3 Určení loadingu pryskyřice ......................................................................... - 17 - Instrumentace ........................................................................................................... - 23 3.1 Reakční nádoby .................................................................................................. - 23 - 3.2 Paralelní syntéza ................................................................................................ - 24 - 3.3 Automatická syntéza ......................................................................................... - 27 - Kombinatoriální chemie ............................................................................................ - 29 4.1 Split-and-Pool metoda ....................................................................................... - 30 - 4.2 Reakční nádoby v kombinatoriální syntéze ....................................................... - 31 - 4.2.1 „T-bags“ ...................................................................................................... - 31 - 4.2.2 „Kans“ ......................................................................................................... - 31 - 4.2.3 Kapsle ......................................................................................................... - 32 - 4.2.4 „SynPhase Lucerny“.................................................................................... - 32 - 4.3 5 Linkery.................................................................................................................. - 8 - 2.2.1 2.3 3 Pryskyřice ............................................................................................................. - 6 - Značení reakcí v kombinatoriální chemii ........................................................... - 33 - Mechanismy reakcí ................................................................................................... - 34 5.1 Štěpení imobilizované látky z pryskyřice ........................................................... - 34 - 5.1.1 Štěpení esteru z Wangovy pryskyřice ........................................................ - 34 - 5.1.2 Štěpení karbamátu z Rinkovy pryskyřice .................................................... - 35 - -4- 5.1.3 5.2 Štěpení z aminomethylové pryskyřice s BAL linkerem ............................... - 37 - Acylace HOBt technikou .................................................................................... - 38 - 5.2.1 HOBt acylace za vzniku peptidické vazby ................................................... - 39 - 5.2.2 HOBt acylace za vzniku esterové vazby ...................................................... - 39 - 5.3 Mitsunobu acylace ............................................................................................. - 40 - 5.4 Reduktivní aminace ........................................................................................... - 41 - 5.5 Štěpení Fmoc protektivní skupiny ..................................................................... - 42 - 5.6 Imobilizace aminu pomocí CDI aktivace ............................................................ - 43 - 5.7 Cyklizace za vzniku 3-hydroxy-4(1H)-chinolonu ................................................ - 43 - 6 Výhody a nevýhody syntézy na pevné fázi ............................................................... - 45 - 7 Experimentální část ................................................................................................... - 47 7.1 Kapacita bobtnání polystyrenových pryskyřic ................................................... - 47 - 7.1.1 Srovnání kapacity bobtnání aminomethylové pryskyřice v různých rozpouštědlech.......................................................................................................... - 47 7.1.2 Srovnání kapacity bobtnání různých pryskyřic ........................................... - 48 - 7.2 Imobilizace piperazinu na Wangovu pryskyřici pomocí CDI aktivace ............... - 49 - 7.3 Acylace Wangovy pryskyřice ............................................................................. - 50 - 7.3.1 Acylace Wangovy pryskyřice za vzniku benzotriazolového esteru ............ - 50 - 7.3.2 Acylace Wangovy pryskyřice pomocí Mitsunobu reakce ........................... - 51 - 7.4 Preparativní syntéza 2-substituovaného-3-hydroxy-4(1H)-chinolonu-7karboxamidu ................................................................................................................. - 51 7.5 Imobilizace propylaminu na aminomethylovou pryskyřici s BAL linkerem ....... - 53 - 7.6 Acylační reakce aminomethylové pryskyřice s paralelní detekcí bromfenolovou modří ………………………………………………………………………………………………………………………- 55 7.7 8 Potvrzení loadingu Rinkovy pryskyřice .............................................................. - 56 - Reference .................................................................................................................. - 58 - -5- 2 Princip syntézy na pevné fázi Pojem syntéza na pevné fázi se poprvé objevil v roce 1963, když Robert Bruce Merrifield (1921 – 2006) publikoval novou strategii pro syntézu peptidů1. Nenápadná šestistránková publikace odstartovala obrovský rozvoj této metody nejen v oblasti peptidů, ale i v tradiční organické syntéze malých molekul pro vývoj nových biologicky aktivních látek. Význam tohoto objevu potvrzuje i fakt, že původní Merrifieldův článek byl k dnešnímu datu citován více než 2500 krát. Navíc byla Robertu Bruci Merrifieldovi v roce 1984 udělena Nobelova cena "for his development of methodology for chemical synthesis on a solid matrix“ 2,3. Schéma 1: Příprava peptidů na pevné fázi dle Merrifielda. Princip syntézy na pevné fázi spočívá v použití většinou nerozpustného polymeru s reaktivní funkční skupinou, na kterou je možné pevnou kovalentní vazbou připojit vhodný reaktant neboli výchozí látku. Reakční roztok výchozí látky je přidán k pryskyřici, ta je následně třepána po dobu nutnou pro kvantitativní průběh reakce a ve chvíli, kdy je reakce ukončena, je nerozpustná pryskyřice s ukotvenou výchozí látkou odfiltrována a promyta vhodnými rozpouštědly za odstranění reakčního roztoku. Připojení první výchozí látky se nazývá imobilizace a tento krok je určující pro další průběh syntézy. K takto ukotvené sloučenině může být přidán další reakční roztok s jinými reagenciemi a reakce se opakuje až do ukončení reakční sekvence a získání cílového produktu. Na konci syntézy je konečný produkt odštěpen z pryskyřice za specifických reakčních podmínek daných typem použitého linkeru (viz dále). 2.1 Pryskyřice Pryskyřice (často označována anglickým výrazem resin) je polymerní materiál, který vzniká polymerizací vhodné látky. Pokud je polymer složen pouze z jedné látky, hovoříme -6- o homopolymeru. Nicméně v syntéze na pevné fázi se mnohem častěji používají směsi polymerů, které vznikají polymerizací dvou a více druhů látek, výsledkem je tak bohatě rozvětvený kopolymer. Od roku 1963 byly popsány různé typy polymerů s větší či menší významností. Mezi nejčastěji používané však stále patří kopolymery na bázi styrenu a divinylbenzenu, konkrétně 1-2% divinylbenzenu (často používané značení 1-2% DVB). Zastoupení divinylbenzenu pouhými 1-2% je dostatečné na to, aby byl polymer přiměřeně robustní a odolný vůči různým fyzikálním vlivům, zároveň je stále zachována velmi dobrá kapacita bobtnání (viz dále). Polymer je dodáván ve formě malých kuliček řádově o velikosti 100 µm. Obrázek 1: Strukturní znázorněni kopolymeru styrenu a divinylbenzenu. 2.1.1 Přítomnost aktivních míst Důležitou úlohu hraje přítomnost terminální funkční skupiny, bez které by nebylo možné provést ukotvení výchozí látky. Funkční skupina se buď vnáší na již vzniklý polymer vhodnou reakcí, nebo se využívá druhá a častější metoda založená na polymerizaci již modifikovaných monomerů. V komerčním měřítku jsou dostupné pevné nosiče s různou substitucí. Nejčastěji se však používá Merrifieldova chlormethylová pryskyřice (Schéma 1), Wangova hydroxymethylová pryskyřice, Rinkova amidová pryskyřice nebo aminomethylová polystyrenová pryskyřice. V menším měřítku lze narazit také na Barlosův polymer s 2-chlortritylovou skupinou (Obrázek 4). Množství terminálních skupin (aktivních míst) závisí na typu použitého polymeru a definuje se jako tzv. loading neboli „nabití“ pryskyřice udávaný v mmol na gram pryskyřice. Dostupné jsou polymery s loadingem v rozsahu od 0,5–2 mmol/g. Nejvýhodnější je použití pryskyřice s loadingem okolo 1 mmol/g, kdy dochází ke kompromisu mezi reaktivitou a výtěžkem reakce. Je-li pryskyřice příliš nabitá, znamená to, že aktivní místa jsou velmi blízko u sebe a ze sterických důvodů tak nedochází ke kvantitativnímu průběhu reakce. Na druhou stranu, volba pryskyřice s velmi nízkým loadingem vede k malým výtěžkům (je nutné použít větší množství pryskyřice pro syntézu látky v požadovaném množství). Pryskyřice je dodávána s loadingem deklarovaným výrobcem, přesto je vždy nezbytné po prvním reakčním kroku (imobilizaci výchozí látky) loading výchozí látky aktualizovat dle získaných analytických dat (viz podkapitola 2.3.3 Určení loadingu pryskyřice). -7- 2.1.2 Bobtnání pryskyřice Polystyrenová pryskyřice dle struktury vykazuje značně nepolární charakter. Mezi jednotlivými řetězci styrenu a divinylbenzenu existují póry, do kterých může snadno penetrovat rozpouštědlo, zvětšuje se tím objem polymeru a pryskyřice tzv. bobtná. Díky nepolárnímu charakteru polystyrenová pryskyřice velmi dobře bobtná v nepolárních aprotických rozpouštědlech typu: dichlormethan, dichlorethan, toluen nebo tetrahydrofuran. Poměrně dobře lze bobtnání pozorovat i v některých polárních aprotických rozpouštědlech jako je N,N-dimethylformamid, dimethylsulfoxid, N-methylpyrolidon nebo pyridin. Naopak díky hydrofobní povaze vůbec nedochází k penetraci protických rozpouštědel, jako jsou alkoholy nebo voda. Pryskyřice v těchto rozpouštědlech nebobtná, spíše dochází k jejímu sražení a tedy zmenšení objemu polymeru. Obrázek 2: Ukázka bobtnání polystyrenové pryskyřice v různých rozpouštědlech. a) b) c) d) e) Suchá pryskyřice N,N-Dimethylformamid (DMF) Tetrahydrofuran (THF) Dichlormethan (DCM) Methanol (MeOH) Foto: Mgr. Karel Lemr, Ph.D. Schopnost bobtnání (v anglické literatuře nazývané „swelling capacity“) významně určuje reaktivitu polymeru. Je nutné si uvědomit, že aktivní místa přítomná na pryskyřici jsou dostupná pro reagencie jen v okamžiku, kdy je pryskyřice dostatečně nabobtnalá, tedy polymerní struktura je otevřená. Pokud pryskyřice nebobtná správně, dochází ke skrytí aktivního místa ve sktruktuře pryskyřice a reakce nemůže probíhat kvantitativně. Z tohoto důvodu je vhodné vždy s nákupem nové šarže pryskyřice provést jednoduché, ale velmi účinné otestování polymeru v rozpouštědle s maximální schopností bobtnání. Pokud 1 g suché pryskyřice po přídavku rozpouštědla nezvýší svůj objem minimálně na 7 ml, není pryskyřice zcela vhodná pro organickou syntézu a pravděpodobně budou již popsané a ověřené reakce vykazovat horší výsledky4. 2.2 Linkery V předchozích kapitolách byla nastíněna varianta imobilizace výchozí látky přímo na pryskyřici přes aktivní funkční skupinu polymeru. Je ovšem zřejmé, že při finálním štěpení je nutné odštěpit produkt z pryskyřice za takových podmínek, aby nedošlo k dekompozici žádané molekuly (stabilita cílových produktů se samozřejmě může značně lišit dle charakteru jejich skeletu). Aby bylo možné produkt odštěpit z polymerní matrice -8- bez poškození štěpícím činidlem, je nezbytné mezi pryskyřici a první imobilizovanou látku vsunout tzv. linker. Linker má vždy dvě funkční skupiny, z nichž jedna je použita k vytvoření pevné vazby s aktivní skupinou polymeru. Tato vazba je neštěpitelná za žádných podmínek celé reakční sekvence ani za podmínek, které jsou přímo použity pro odštěpení produktu z pryskyřice. Druhá funkční skupina linkeru slouží k imobilizaci výchozí látky. Vytvořená vazba je taktéž pevná kovalentní, ale za velmi specifických podmínek (v závislosti na skeletu linkeru) ji lze přerušit a uvolnit tak daný meziprodukt či finální sloučeninu z polymeru5. Obrázek 3: Úloha linkeru na pryskyřici. Samotné štěpení probíhá dle struktury linkeru za přesně daných podmínek, jako je použití kyseliny nebo zásady, UV záření, oxidace/redukce a dalších. Linker musí být chemicky stálý, rezistentní vůči všem reakčním podmínkám použitých v reakční sekvenci i vůči podmínkám štěpení. Zároveň však musí umožňovat kvantitativní štěpení meziproduktů či cílové sloučeniny z pryskyřice, aniž by docházelo k nežádoucí strukturní změně finálních látek. Díky použití linkeru se navíc prodlužuje vzdálenost imobilizované látky od pryskyřice, čímž se zvyšuje sterická přístupnost pro reaktanty. Linkery lze obecně dělit dle funkční skupiny, která ve struktuře produktu vzniká po jeho odštěpení z pryskyřice a také podle mechanismu, kterým ke štěpení dochází. Jelikož jsou tyto typy třídění poměrně obsáhlé, dělíme linkery stručně podle použitých podmínek štěpení s detailním zaměřením na kyselé štěpení, které je při syntéze na pevné fázi využíváno nejčastěji (cca 60% všech používaných linkerů). 2.2.1 Kysele štěpitelné linkery V průběhu let byly studovány strukturně různé linkery a řada z nich získala názvy od svých tvůrců. Nicméně v terminologii se velmi často používá přímo název pryskyřice, přestože se jedná o pevný nosič s již navázaným linkerem. Pro názornost uvádíme Wangovu pryskyřici s koncovou hydroxy skupinou6, Rinkovu pryskyřici7 s amino skupinou chráněnou Fmoc protektivní skupinou, aminomethylovou pryskyřici s BAL8 linkerem a Barlosův polymer s 2-chlortritylovým linkerem9 (Obrázek 4). Pro všechny čtyři uvedené linkery se na štěpení používá kyselé prostředí 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu. Obecně platí, že konečná aktivní skupina linkeru se může stát součástí -9- finálních struktur buď ve formě substituentu, nebo jako část hlavního skeletu vytvořeného produktu. Pokud finální látka neobsahuje ve struktuře žádnou část linkeru, hovoříme o tzv. ,,traceless synthesis´´. Obrázek 4: Struktury diskutovaných pryskyřic a linkerů. Wangova pryskyřice, která nese terminální hydroxy skupinu, nabízí 3 různé typy ukotvení na polymeru. Typická je imobilizace karboxylových kyselin přes esterovou vazbu 1(1), 1(2)10, kdy po odštěpení látky z pryskyřice získáme opět koncovou karboxylovou skupinu. Další typ ukotvení spočívá ve formě etheru 1(3)11, následkem štěpení vzniká produkt modifikovaný hydroxy skupinou. Posledním typem je imobilizace přes karbamátovou vazbu 1(4)12. V tomto případě konečný produkt po štěpení obsahuje volnou primární amino skupinu. Variabilní způsob ukotvení se pravidelně užívá při syntéze chemických knihoven pro vnášení rozličných funkčních skupin do základního skeletu. Tato strategie byla také např. použita pro syntézu tetrasubstituovaných purinů 13 (Schéma 2). - 10 - Schéma 2: Přiklad využití Wangovy pryskyřice v diverzifikaci cílových sloučenin. Aplikace Wangovy pryskyřice, kde se atom kyslíku stává součástí nového kruhu, je také možná a byla popsána pro přípravu 6+5 bicyklických systémů s kyslíkatým nukleofilem 1(5) (Schéma 3)14. Schéma 3: Syntéza N-aryl bicyklických derivátů. Rinkova pryskyřice po odstranění Fmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl) chránící skupiny nabízí reaktivní primární amino skupinu, která může být použita pro acylaci vhodných kyselin nebo pro přímou alkylaci/arylaci halogen deriváty. Schéma 4: Syntéza derivátů hydroxychinolonu na Rinkově pryskyřici. - 11 - Rinkova pryskyřice byla v nedávné době použita pro přípravu modifikovaných 3-hydroxy-4(1H)-chinolonů (taktéž nazývané hydroxychinolony). Schéma 4 demonstruje dva různé přístupy syntézy, kdy v prvním případě vznikají hydroxychinolonové deriváty s karboxamidovou substitucí v poloze 7 (2a) a dusíkový atom pryskyřice se stává součástí substituentu15. Druhý přístup popisuje přípravu hydroxychinolonů (2b), kde se po ukončení reakční sekvence amino skupina Rinkovy pryskyřice stává přímo součástí heterocyklu16. Dalším příkladem je linker uváděný pod zkratkou BAL neboli „Backbone Amide Linker“ (4-(4-formyl-3-methoxyfenoxy)butanová kyselina). Aldehydická skupina zde slouží pro imobilizaci primárních aminů pomocí reduktivní aminace. Linker získal svůj název podle účelu, pro který byl vyvinut. Jedná se o přípravu amidů, kde vzniklý sekundární amin může být jednoduše acylován libovolnými kyselinami. Schéma 5: Syntéza bisheterocyklických sloučenin purinu a a benzodiazepinonu na aminomethylové pryskyřici s BAL linkerem. hydroxychinolonu První navázanou výchozí látkou na BAL linkeru je vždy primární amin. Aldehydická skupina tedy zaniká a při následném štěpení dochází k uvolnění sloučeniny s atomem dusíku. Stejně jako v předchozích případech i zde je možné, aby byl imobilizovaný amin pouhým substituentem připravovaných látek, jako tomu bylo např. při syntéze bisheterocyklických sloučenin purinu a hydroxychinolonu (3a), kde je amin substituentem v poloze 6 purinového skeletu17. Jiný model byl aplikován při vývoji metody pro přípravu modifikovaných benzodiazepinonů, kde je sekundární amin součástí sedmi-členného cyklu (3b, Schéma 5)18. Posledním zde uvedeným polymerem je Barlosova pryskyřice s kysele labilním 2-chlortritylovým linkerem. Dobře odstupující chloridový anion na terciárním uhlíku umožňuje atak nukleofilního činidla, které je tak na pryskyřici imobilizováno a může být - 12 - dále modifikováno. Tohoto přístupu bylo např. využito k přípravě látek s trojnou vazbou (4a) přes Mannichovu reakci, kdy byl imobilizovaným nukleofilem piperazin (Schéma 6)19. Schéma 6: Syntéza alkynů na Barlosově pryskyřici s využitím Mannichovy reakce. 2.2.2 Další typy linkerů Kromě kysele labilních linkerů byly vyvinuty i linkery štěpitelné jinými metodami jako jsou bazicky labilní linkery, silylové linkery štěpitelné fluoridovými ionty, UV labilní linkery nebo linkery štěpitelné pomocí redukčních či oxidačních procesů. S ohledem na rozsáhlost dané problematiky představuje tato podkapitola jen hrubý nástin s využitím zajímavých příkladů. Bazicky štěpitelné linkery Bazické štěpení může být použito i u kysele labilních linkerů při imobilizaci přes esterovou vazbu. Jedním z možných způsobů bazického štěpení je tzv. saponifikace (alkalická hydrolýza) benzylesterů, kterou právě v roce 19631 použil Bruce Merrifield pro syntézu peptidových kyselin (Schéma 7). Schéma 7: Saponifikace esteru vázaného na pryskyřici. V průběhu let došlo k vývoji dalších bazicky štěpitelných linkerů a taktéž byly modifikovány reakční podmínky. V roce 1981 představil Atherton a Sheppard 4-hydroxymethylbenzoový linker20, který lze na pryskyřici uchytit např. přes amidickou vazbu. Volná hydroxy skupina umožňuje tvorbu esteru, jehož karbonylová skupina podléhá nukleofilnímu ataku příslušným aminem za vzniku amidu odštěpeného z pryskyřice (Schéma 8). - 13 - Schéma 8: Ukázka štěpení primárním aminem. Mezi mladší metody se řadí např. hydrazinolýza amidového linkeru21 s 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyklohexyliden)ethylovou protektivní skupinou (Dde) aminů popsanou Bycroftem (Schéma 9). Atom linkeru není po odštěpení součástí finálního produktu, ale slouží jako nosič pro přípravu amino derivátů. Uvedený linker byl také úspěšně využit v syntéze oligosacharidů22. Schéma 9: Ukázka štěpení Dde protektivní skupiny vázané na amidovém linkeru. Štěpení fluoridovými ionty Silylové protektivní skupiny jsou užívané v organické syntéze již od 70. let 20. století. Obecně se pro jejich odštěpení volí kyselina nebo sloučenina s fluoridovým aniontem. Protože jsme se již příklady kyselého štěpení zabývali, ve schématu 10 uvádíme silylové linkery s C-Si23-25 (část A) a O-Si26 (část B) vazbou citlivou na působení tetrabutylammonium fluoridu (TBAF). V závislosti na typu vazby tak získáme karboxylovou kyselinu nebo alkohol. Schéma 10: Štěpení produktu ze silylového linkeru pomocí TBAF. Linkery štěpitelné UV zářením Fotolýza představuje mírnější metodu štěpení za neutrálních podmínek. Nicméně je nutné brát v úvahu fakt, že mnoho malých organických molekul také reaguje na záření potřebné k rozštěpení požadované vazby27. Schéma 11 část A popisuje výhodné štěpení - 14 - acetalového kruhu UV zářením za vzniku 2-nitrosohemiacetalu, který podléhá spontánnímu štěpení na aldehyd28. V části B je pak znázorněno štěpení C-S vazby UV zářením29,30. Schéma 11: Příklady UV štěpitelných linkerů. Linkery štěpitelné za podmínek oxidace/redukce Počátkem 20. století byla poprvé popsána syntéza činidla DDQ neboli 2,3-dichlor5,6-dikyano-1,4-benzochinonu31. Tato látka představuje oxidant často používaný pro dehydrogenaci alkoholů a fenolů. V roce 198832 byl DDQ zajímavým způsobem aplikován v syntéze primárních aminů vznikajících následkem oxidativního štěpení C-N vazby (Schéma 12, A). Na druhou stranu lze pro přípravu aminů využít jednoduchého reduktivního štěpení karbamátů pomocí komplexních hydridů. Schéma 12 část B znázorňuje konkrétně formaci terciárního aminu působením tetrahydridohlinitanu lithného na výchozí imobilizovaný karbamát33. Schéma 12: Oxidativní/reduktivní štěpení v syntéze na pevné fázi. 2.3 Analýzy meziproduktů a produktů Přestože existují techniky umožňující přímou analýzu sloučenin imobilizovaných na polymerním nosiči, např. použitím infračervené spektroskopie (IR) nebo nukleární - 15 - magnetické rezonance v pevném stavu (gelová NMR), je analýza meziproduktů a produktů v naprosté většině případů prováděna až po odštěpení látek z pryskyřice použitím konvenčních spektrálních metod. Nejrozšířenější metody jsou založeny na kombinaci kapalinové chromatografie (LC), hmotnostní spektroskopie (LC-MS) a nukleární magnetické rezonanci (NMR). Pro analýzu pomocí LC-MS je vždy odebrán jen malý vzorek pryskyřice (~5mg) a je provedeno štěpení dle příslušného protokolu. Po ukončení štěpení je štěpící směs odstraněna (např. odpařena v proudu dusíku) a vzniklý odparek rozpuštěn v rozpouštědle vhodném pro analýzu. Polymer se zbytkem linkeru se zfiltruje a čistý roztok se použije pro samotnou analýzu. Tento popsaný postup je platný pro standardní situace s použitím Rinkovy, Wangovy nebo aminomethylové pryskyřice. Pro aplikace jiného polymeru nebo pro konkrétní vývoj metod se může protokol lišit. Vedle této invazivní analytické metody jsou popsány i metody neinvazivní, tzv. kolorimetrické, kde je možné změnou barvy určit přítomnost funkčních skupin, aniž by docházelo ke štěpení produktu. Mezi tyto metody se řadí často používané důkazové reakce na přítomnosti amino skupin nazývané Ninhydrinový test a test s Bromfenolovou modří. 2.3.1 Ninhydrinový test Mechanismus Ninhydrinového testu byl poprvé popsán v roce 1978 pro detekci aminokyselin34, nicméně je aplikovatelný také pro jiné sloučeniny, které obsahují primární amino skupinu. Dvě molekuly Ninhydrinu kondenzují s aminem za vzniku modrého či rudého komplexu, taktéž nazývaným Ruhemannův purpur. Schéma 13: Princip použití Ninhydrinového testu pro důkaz amino skupin. 2.3.2 Test Bromfenolovou modří Obdobná důkazová reakce využívá acidobazického činidla bromfenolové modře, která v přítomnosti bazického primárního aminu způsobí deprotonizaci fenolu, změnu v konjugaci dvojných vazeb a následné otevření struktury za vzniku modrého zbarvení 35. - 16 - Schéma 14: Důkazová reakce s bromfenolovou modří pro detekci amino skupin. Test s bromfenolovou modří se používá např. pro důkaz kvantitativního navázání BAL linkeru na aminomethylovou pryskyřici, kdy po acylaci aminu zaniká modré zbarvení pryskyřice. Test lze provést in situ, kdy se přidává bromfenolová modř přímo do reakčního roztoku k pryskyřici, sleduje se změna barvy a tím ukončení reakce, nebo se provádí až po promytí pryskyřice. 2.3.3 Určení loadingu pryskyřice Loading pryskyřice je vždy specifikován výrobcem a je uveden na etiketě lahvičky s polymerem. Nicméně po ukotvení první výchozí látky typicky dochází ke snížení loadingu a to ze dvou příčin. Ze sterických důvodů nemusí docházet ke kvantitativnímu průběhu imobilizace, tedy k pokrytí všech aktivních míst. Poté je konečný výtěžek snížen o tento reakční krok a je nutné zahrnout úspěšnost/neúspěšnost imobilizační reakce do konečného výpočtu. Druhá příčina je určena definicí loadingu, který se uvádí v mmol/g. Pokud však na 1 g pryskyřice navážeme výchozí o látku o určité hmotnosti, zvýší se i celková hmotnost pryskyřice a počet mmol na gram pryskyřice tím logicky klesá (tj. po každém reakčním kroku se loading nepatrně snižuje). Pro konečný výtěžek je ale nejvýznamnější první reakční krok – imobilizace, po které již dochází k úplnému odštěpení každého dalšího meziproduktu/produktu a je možné na LC-MS sledovat kvantitativní průběh konkrétní reakce. Proto loading pryskyřice definujeme pouze po imobilizačním kroku a s touto hodnotou pracujeme až do konce reakční sekvence. Výpočet loadingu se nejčastěji provádí pomocí měření HPLC metodou vnějšího standardu, kde se porovnává plocha píku standardu o přesně známé koncentrací s plochou píku vzorku o neznámé koncentraci. Pro aplikovatelnost této metody je nutné, aby srovnávané látky (standard a vzorek) měly stejnou chromoforní skupinu, která absorbuje záření při totožné vlnové délce. Intenzita absorbce záření a z ní vycházející plochy píku jsou proto porovnatelné. Jako vhodný chromofor se nejčastěji využívá Fmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl) protektivní skupiny, která má specifické absorbční maximum při 300 nm. Typickým příkladem budiž kvantifikace libovolné Fmoc-sloučeniny ukotvené na Wangově pryskyřici. Pro analýzu se používá přesně definované množství vzorku pryskyřice - 17 - (obvykle 10 mg), které je štěpeno standardním způsobem v 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v DCM. Následně po odpaření štěpící směsi se vzniklý odparek rozpustí přesně v 1 ml methanolu, roztok se zfiltruje od zbytku pryskyřice a zanalyzuje pomocí LC-MS. Po proměření stanovovaného vzorku a vnějšího standardu (nejčastěji Fmoc-Ala-OH o koncentraci 0,5 mg/ml) zjistíme plochy píků při vlnové délce 300 nm. Při použití stejné chromoforní skupiny při nižších koncentracích platí přímá závislost plochy píku na koncentraci vzorku vycházející z Lambert-Beerova zákona. Plochy píku vzorku i standardu jsou známé, stejně tak koncentrace a z ní vypovídající látkové množství standardu, je tedy jednoduché odvodit koncentraci/loading vzorku. Plocha standardu (AST) odpovídá látkovému množství obsaženému v roztoku standardu (nST). Současně plocha vzorku (AVZ) odpovídá látkovému množství obsaženému v roztoku vzorku (nVZ). Platí tedy jednoduchá rovnice o jedné neznámé, kde podíl ploch píku vzorku a standardu násobený látkovým množstvím standardu udává látkové množství ve vzorku (nVZ). Obrázek 5: Obecný výpočet látkového množství odštěpené látky z pryskyřice. AST ............................n ST AST – plocha standardu AVZ ............................nVZ nST – látkové množství standardu [mmol] nVZ n ST AVZ – plocha vzorku AVZ AST nVZ – látkové množství vzorku [mmol] Hodnota nVZ však odpovídá množství, které se uvolnilo při odštěpení látky z pryskyřice a zároveň bylo použito na měření analýzy (tedy 10 mg). Pro získání definitivní hodnoty loadingu je nutné přepočíst hodnotu loadingu pryskyřice na 1000 mg neboli dle definice na 1 g dle vztahu: Obrázek 6: Přepočet loadingu vzorku v mmol na jeden gram pryskyřice. lVZ nVZ 1g 10 10 3 g lVZ – loading vzorku definovaný v mmol na 1 g pryskyřice Je však nutné podotknout, že výše uvedená procedura je založená na jednobodové kalibraci a proto poskytuje pouze orientační výsledky, které jsou nicméně zcela dostačující pro zhodnocení nabitosti pryskyřice. Pro přesné stanovení by bylo nutné k výpočtu použít kalibrační křivku. Při využití jednobodové kalibrace je dále nutné, aby: (i) integrální - 18 - hodnoty AST a AVZ byly co nejbližší, (ii) se plochy píků AST a AVZ pohybovaly v lineární oblasti detektoru. Pokud tomu tak není, je vhodné provést ředění vzorků. Ukázkový výpočet loadingu při použití kyselé metody Schéma 15 demonstruje ukázkový příklad štěpení Fmoc-β-alaninu z 10 mg Wangovy pryskyřice pomocí 50% roztoku kyseliny trifluoroctové (detailní mechanismus viz kapitola 5 Mechanismy reakcí) a následném čtyřnásobném ředění vzorků. Po proměření LC-MS analýzy získáváme chromatogram čisté látky s plochou píku 34804 bodů při vlnové délce 300 nm (Obrázek 7). Schéma 15: Ukázkový případ štěpení s roztokem kyseliny trifluoroctové. Obrázek 7: HPLC záznam Fmoc-β-Ala-OH odštěpeného z Wangovy pryskyřice kyselou metodou pro kvantitativní analýzu při 300 nm. 2.50 33218 8.5e-1 8.0e-1 7.5e-1 Fmoc-β-Ala-OH po odštěpení z Rinkovy pryskyřice 7.0e-1 6.5e-1 6.0e-1 5.5e-1 Plocha píku 34804 5.0e-1 AU 4.5e-1 4.0e-1 3.5e-1 3.0e-1 2.5e-1 2.0e-1 1.5e-1 1.0e-1 5.0e-2 0.0 -5.0e-2 -1.0e-1 -0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 Současně na LC-MS proměříme i standard obsahující Fmoc skupinu (např Fmoc-α-Ala-OH) o koncentraci 0,5 mg/ml a zjistíme jeho plochu píku při maximální vlnové délce 300 nm (Obrázek 8). - 19 - Time 5.00 Obrázek 8: HPLC záznam standardu při 300 nm. 1.80 66988 7.75e-1 7.5e-1 7.25e-1 7.0e-1 6.75e-1 6.5e-1 6.25e-1 6.0e-1 5.75e-1 5.5e-1 5.25e-1 5.0e-1 4.75e-1 4.5e-1 AU 4.25e-1 4.0e-1 Fmoc-Ala-OH 3.75e-1 3.5e-1 3.25e-1 3.0e-1 Koncentrace 0.5 mg/ml 2.75e-1 2.5e-1 2.25e-1 2.0e-1 Plocha píku 66988 1.75e-1 1.5e-1 1.25e-1 1.0e-1 7.5e-2 5.0e-2 2.5e-2 0.0 -0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 Dle výše uvedených rovnic můžeme odvodit výpočet loadingu. Proměřený standard obsahuje 0,5 mg Fmoc-α-Alaninu v 1 ml vzorku. Podle standardního vztahu pro látkové množství převedeme výpočet na hodnotu v mmol. Výpočty: Převedení standardu na látkové množství: nST mST 0,5 10 3 g 1,6 10 3 mmol M ST 311 g mol 1 Výpočet látkového množství v měřeném vzorku (po ředění; pro 2,5 mg): AST 66988............................n ST 1,6 10 3 mmol AVZ 34804............................nVZ ? nVZ 1,6 10 3 mmol 34804 0,83 10 3 mmol 66988 Přepočet na loading definovaný pro 1 g pryskyřice: lVZ 0,83 10 3 mmol 1g 0,33 mmol na 1 g pryskyřice 2,5 10 3 g Pro ukotvení Fmoc-β-alaninu byla použita komerčně dodaná pryskyřice s loadingem 0,52 mmol/g. Výtěžnost imobilizačního kroku byla tedy 63%. - 20 - Time 5.00 Ukázkový výpočet při použití bazické metody Kromě kyselého štěpení celého produktu je možno pro kvantifikaci imobilizovaných Fmoc-derivátů použít i bazické štěpení Fmoc-skupiny. Při použití kvantifikace pomocí bazické metody tedy nedochází v níže uvedeném případě k rozštěpení vazby mezi linkerem a imobilizovanou látkou, ale štěpí se pouze protektivní skupina. Stejný proces se využívá při odstraňování Fmoc jako protektivní skupiny, kde nedochází ke změnám na dalších částech molekuly (viz kapitola 5 Mechanismy reakcí). Pro výpočet je použito 10 mg stejné pryskyřice s ukotveným Fmoc-β-alaninem. Schéma 16 popisuje dva produkty uvolněné při štěpení, pro správné určení loadingu se plochy píku obou produktů sčítají (Obrázek 9). Schéma 16: Ukázkový případ štěpení s piperidinem. Obrázek 9: HPLC záznam vzorku po štěpení bazickou metodou při 300 nm. 4.33 26604 1.8e-1 1.7e-1 1.6e-1 1.5e-1 1.4e-1 1.3e-1 1.2e-1 1.1e-1 AU 1.0e-1 9.0e-2 2.75 7543 Plocha píku 8643 8.0e-2 Plocha píku 27604 7.0e-2 6.0e-2 5.0e-2 4.0e-2 3.0e-2 2.0e-2 1.0e-2 0.0 -0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 Výpočty: Pro určení loadingu se použije stejný standard jako v předchozím případě, který je definován koncentrací 0,5 mg/ml, převeden na látkové množství 1,6 10-3 mmol. Výpočet látkového množství v měřeném vzorku (opět bylo použito čtyř násobné ředění vzorku – plocha píku tedy odpovídá 2,5 mg pryskyřice): - 21 - Time 5.00 AST 66988............................n ST 1,6 10 3 mmol AVZ 7543 26604................nVZ ? nVZ 1,6 10 3 mmol 8643 27604 0,86 10 3 mmol 66988 Přepočet na loading definovaný pro 1 g pryskyřice: lVZ 0,86 10 3 mmol 1g 0,35 mmol na 1 g pryskyřice 2,5 10 3 g Při porovnání s kyselou metodou je získaný loading srovnatelný, v tomto případě činí 67%. Při použití obou metod je ale nutno brát v potaz přítomnost relativní chyby způsobené přesností vážení a pipetování. Tato relativní chyba by neměla být vyšší než 10%. Vedle získávání dat pomocí LC-MS je možné použít i metodu NMR. V tom případě je však nutné provést štěpení z většího množství pryskyřice (stanovení metodou NMR vyžaduje větší množství vzorku, řádově v jednotkách mg, nejlépe 5-10 mg). Odparek po štěpení se rozpustí v deuterovaném rozpouštědle a loading se opět určí metodou vnějšího standardu. V tomto případě není metoda závislá na přítomnosti chromoforu a je tedy možné použít libovolnou látku jako vnější standard. - 22 - 3 Instrumentace Pro reakce v roztoku se v laboratoři používá skleněných nádob umístěných na elektromagnetické míchačce s magnetickým míchadlem uvnitř reakční nádoby. Při syntéze na pevné fázi není použití magnetického míchadla žádoucí, neboť vyvolává tření polymeru po dně nádoby a tím může dojít k rozemletí pryskyřice na menší částice. Důsledkem může být vznik příliš jemné suspenze komplikující filtrační/promývací proces. U všech reakcí na pevné fázi proto pracujeme s typově různými třepačkami (shakery), což eliminuje použití magnetického míchadla. Katedra organické chemie Univerzity Palackého převážně využívá instrumentální metody vyvinuté prof. Viktorem Krchňákem a dodávané firmou Torviq (www.torviq.com), proto jsou tyto techniky popsány detailněji. 3.1 Reakční nádoby V minulosti se používaly výhradně skleněné nádoby, jejichž obliba přetrvala dodnes, většinou však v oblasti peptidové chemie. Každá reakční nádoba musí být vybavená vhodným porézním materiálem – fritou pro snadnou filtraci reakčního roztoku od polymeru a následné promývání pryskyřice. Dále je nádoba opatřena přívodním a odvodním ventilem, nebo víčkem pro přidávání reakčního roztoku či reaktantů a vypouštění reakčního roztoku po reakci a při promývání. Reakční nádoby jsou dostupné v různých tvarech a velikostech pro analytické reakce až pro preparativní přípravu peptidů (Obrázek 10). Obrázek 10: Ukázka skleněných reakčních nádob firmy Wilmad-LabGlass. Obrázek: http://www.wilmad-labglass.com/ProductList.aspx?t=404 Vedle skleněných reakčních nádob je možné využít i velmi jednoduchého a levného způsobu provedení syntézy na pevné fázi, který byl představen v roce 1990 v odborném časopise Peptide Research36. Jedná se o použití běžných polypropylenových stříkaček s porézní fritou uvnitř (Obrázek 11). - 23 - Obrázek 11: Znázornění jednoduché a efektivní reakční nádoby pro syntézu na pevné fázi. Obrázek: RNDr. Viktor Krchňák, CSc. Polypropylenové platové stříkačky jsou dnes již standardním vybavením laboratoře, jsou dobře cenově dostupné a prakticky inertní téměř vůči všem chemikáliím a rozpouštědlům. Lze je také zahřívat do cca 100oC. Frita se snadno zasune pomocí pístu na dno stříkačky a vzniká tak reakční nádoba. Aby při třepání nedocházelo k úniku reakčního roztoku a znečištění okolí, umístí se na ústí stříkačky jednoduchá plastová zátka (Obrázek 12). Obrázek 12: Polypropylenové stříkačky - nádoby pro syntézu na pevné fázi. Foto: Mgr. Barbora Lemrová, Ph.D. 3.2 Paralelní syntéza Při přípravě látek na pevné fázi s využitím kombinatoriální chemie je výhodné pracovat v tzv. paralelní syntéze, tedy provádět větší počet reakcí zároveň. Přestože není složité pracovat s větším počtem injekčních stříkaček zároveň, může být manuální promývání většího počtu nádob časově náročné. Z toho důvodu byla v minulosti snaha vytvořit semi-automatický systém pro syntézu na pevné fázi, ale zároveň zohlednit finanční náročnost přístroje, spolehlivost, množství rozpouštědel a reaktantů, které budou použity, ale i jednoduchost obsluhy. Tento problém elegantně řeší tzv. „Domino Block“ představený Krchňákem a Paděrou v roce 199837. - 24 - Obrázek 13: Princip „Domino block“. Obrázek: RNDr. Viktor Krchňák, CSc. Domino block syntetizér je reakční a promývací zařízení pro manuální a semiautomatickou paralelní syntézu na pevné fázi. Je tvořen z teflonové destičky (Domino block) s otvory pro reakční stříkačky, které ústí do systému kanálků uvnitř destičky a sbíhají se do společného výstupu. Připojením Domino block na vakuový systém, zásobník s rozpouštědlem/reakčním roztokem a odpadní nádobu lze jednoduchým přepínáním vícecestného ventilu přidávat čisté rozpouštědlo/reakční roztok k pryskyřici a po promytí/reakci jej odstranit ze všech umístěných reakčních nádob najednou. Samotný Domino block se umístí na třepačku, aby bylo zajištěno rovnoměrné protřepávání pryskyřice při reakci i promývání. V celkovém zapojení s třepačkou, vícecestným ventilem, rozpouštědly, odpadním zásobníkem a zdrojem vakua se tento systém nazývá „Domino block syntetizér“ (Obrázek 14). Obrázek 14: Domino block syntetizér. Foto: RNDr. Viktor Krchňák, CSc. - 25 - Na standardní třepačce mohou být umístěny až čtyři domino blocky, z nichž každý je typicky konstruován na dvanáct reakčních stříkaček. Sumárně je tedy možné provádět v jednom okamžiku až 48 reakcí a poté všechny současně promýt. Pro práci za zvýšené teploty se využívá reaktorů použitelných jak pro klasickou roztokovou chemii, tak pro syntézu na pevné fázi. Zásadní rozdíl oproti reakci v roztoku je praktická nemožnost umístit reakční roztok s magnetickým míchadlem do olejové lázně. Jednak by docházelo k rozemletí pryskyřice na dně nádoby, navíc tento systém je značně neefektivní v situaci, kdy je nutné provádět několik syntéz najednou při stejné teplotě. Z tohoto důvodu se využívá paralelního reaktoru např. firmy Büchi, kde jsou v kovovém panelu umístěné otvory, do kterých se snadno vpraví originální skleněné nádoby s reakčním roztokem pryskyřice, nastaví se teplota a spustí třepání. Obrázek 15: Příklad paralelního neautomatického reaktoru firmy Büchi. Foto: Mgr. Barbora Lemrová, Ph.D. V případě reakcí, které vyžadují specifické reakční podmínky, je možné na poli syntézy na pevné fázi uplatnit i reakce v mikrovlnném reaktoru. V závislosti na použitém modelu přístroje je možné provést buď pouze jednu reakci nebo sekvenci reakcí za použití programovatelného autosampleru. - 26 - Obrázek 16: Modelový příklad mikrovlnného reaktoru firmy CEM Discover. Foto: Mgr. Eva Schütznerová, Ph.D. Stejně jako v předchozím případě i zde se pracuje s originálními reakčními nádobami, ze kterých je nutné po reakci obsah přesunout do promývací nádoby. V tomto případě ale míchání zajišťuje magnetické míchadlo, které se však díky tvaru reakční zkumavky nedotýká dna nádoby a nedochází k významnému drcení kuliček pryskyřice. 3.3 Automatická syntéza Vedle semi-automatického syntetizéru je možné pracovat i s plně automatickým systémem, který je využíván nejen k syntéze peptidů38,39, ale také oligosacharidů40 a oligonukleotidů41,42. V současné době je na trhu řada firem, které dodávají robotické syntetizéry s různými funkcemi. Je tak možné během velmi krátké doby provést stovky reakcí najednou. Syntetizéry jsou vybaveny různými velikostmi reakčních nádob, robotickým ramenem, které samostatně provádí nabírání a vypouštění reagencií a rozpouštědel. Je možné pracovat v široké škále teplot a tlaků i za použití inertních plynů. Integrovaný software dále plně zaznamená veškeré informace o každém reakčním kroku a dodá plnou dokumentaci k celkové reakční sekvenci. - 27 - Obrázek 17: Ukázka automatického syntetizéru SOPHAS firmy Zinsser. Foto: http://www.zinsserna.com/sophas.htm Práce s automatickým syntetizérem je vhodná přímo pro syntézu chemických knihoven, tedy látek, jejichž reakční sekvence je již plně optimalizována a nevyžaduje další úpravy. Nicméně úspěšnost takové přípravy velkého počtu látek závisí na počáteční časové investici do pečlivého naprogramování přístroje. - 28 - 4 Kombinatoriální chemie Kombinatoriální chemie je technika pro přípravu setu derivátů o různé velikosti (tzv. chemické knihovny), který vzniká úplnou kombinací definovaného počtu výchozích látek, tedy kombinatoriálním způsobem43-45. Použité výchozí látky nazýváme cizím termínem „building blocks“ a počet těchto látek rozhoduje o velikosti a různorodosti chemické knihovny. Pojem kombinatoriální chemie lze pro názornost vysvětlit na přípravě deazapurinů popsané v roce 2014 (Schéma 17)46. Publikovaná metoda využívá pěti krokové syntézy se třemi rozdílnými typy výchozích látek: aminokyseliny, sekundární aminy a aldehydy. Schéma 17: Syntéza deazapurinů. Aminokyselina je imobilizována na Rinkovu pryskyřici, následně je získaný amin arylován 2,4-dichloro-3-nitropyridinem, substituován druhý atom chloru sekundárním aminem a po redukci nitroskupiny dochází k uzavření druhého kruhu při reakci s aldehydy a odštěpení finálního deazapurinu z nosiče. Použitím a úplnou kombinací 10 rozdílných aminokyselin, 10 různých sekundárních aminů a 10 aldehydů získáme na konci reakční sekvence provedené kombinatoriálním způsobem 1000 látek (10x10x10 = 1000). Tuto metodu - kombinaci všech building blocků - nazýváme kombinatoriální syntéza. Kombinatoriální syntéza není omezena pouze na syntézu na pevné fázi, ale je možné tuto techniku využít i na poli roztokové chemie za předpokladu, že se plně kombinují všechny použité výchozí látky. V případě, kdy by se pro předchozí reakční sekvenci použilo všech 30 reaktantů (10+10+10), ale připravilo by se pouze např. 30 látek v nahodilé kombinaci, nemůžeme o kombinatoriální syntéze hovořit. Podstatou kombinatoriální chemie není použitá syntetická metoda ani druh instrumentace, zda se syntéza provádí ručně, polo-automaticky či automaticky, ale pouze provedení syntézy kombinatoriálním způsobem. - 29 - Mezi výhody syntézy na pevné fázi patří jednoduchá izolace látek spočívající ve filtraci a promytí pryskyřice. Dále je zde možnost využití vysoce vroucích a těžko odstranitelných rozpouštědel jako jsou N,N-dimethylformamid, dimethylsulfoxid či N-methylpyrolidon, které mohou být jednoduše z nosiče vymyty. Navíc lze použít vysoké koncentrace výchozích látek pro plnou konverzi reakce či opakovat reakci přidáním stejného reakčního roztoku a jeho opětovným promytím. Při návrhu přípravy chemické knihovny syntézou na pevné fázi je však také nutné zvážit její různé nároky, které mohou způsobit komplikace. Do reakční sekvence je nutné vnést další dva reakční kroky navíc, a to imobilizaci první výchozí látky a konečné odštěpení produktu z pryskyřice. Nutná je předchozí pečlivá optimalizace každého reakčního kroku, navíc může docházet k prodloužení reakční doby při srovnání s totožnou reakcí v roztoku, kde není kinetika reakce ovlivněna difuzí činidla do pórů pryskyřice. V konečném důsledku je potřeba posoudit požadované množství připravovaných látek, kde ve vyšších množstvích je již syntéza na pevné fázi poměrně drahou technikou vzhledem ke spotřebě reakčních činidel, rozpouštědel a ceně pryskyřice, resp. linkeru44. Typickým způsobem použití syntézy na pevné fázi je proto příprava spíše menšího množství produktů (mg – desítky mg) ve větším počtu (desítky – tisíce derivátů) Pro kombinatoriální syntézu na pevné fázi byla proto v průběhu let vyvinuta celá řada postupů, jak v relativně krátkém čase a ekonomicky efektivně připravit velký počet látek. 4.1 Split-and-Pool metoda Tato metoda byla popsána v roce 199147 a využívá principu, kdy počet reakčních nádob v daném reakčním kroku je stejný jako počet použitých reaktantů. Pokud například syntetizujeme tripeptid s použitím 20 běžných amino kyselin pro každou pozici, je možné kombinatoriálním způsobem připravit až 8000 tripeptidů (20x20x20 = 8000) s využitím pouhých 20 reakčních nádob. Výchozí pryskyřice se rozdělí do 20 reakčních nádob, ve kterých se provede imobilizace jednotlivých 20 amino kyselin A1 – A20 (Obrázek 18 demonstruje pouze prvních 5 nádob). Obrázek 18: Princip Split-and-Pool metody44. A1 Split A1 Pool Split A1 Pool Split Pool A2 A2 A2 A3 A3 A3 A4 A4 A4 A5 A5 A5 Obrázek: Practical aspects of combinatorial solid-phase synthesis. John Wiley & Sons, Inc.: 2012; pp 95-130 - 30 - Všech 20 imobilizovaných aminokyselin se smíchá, pečlivě zkombinuje a rozdělí rovným dílem do stejných 20 reakčních nádob. Každá nádoba tedy obsahuje rovnocennou směs 20-ti imobilizovaných aminokyselin. V druhém reakčním kroku se do každé reakční nádoby se směsí imobilizovaných aminokyselin přidají opět reakční roztoky 20 rozdílných aminokyselin (A1 – A20). Po tomto reakčním kroku každá reakční nádoba obsahuje 20 dipeptidů rozdílného složení. Následně se pryskyřice s navázanými dipeptidy smíchají a opět pečlivě rozdělí do 20 reakčních nádob a podrobí se znovu reakci s 20 různými amino kyselinami. Po třetím reakčním kroku každá nádoba obsahuje 400 tripeptidů, tedy celkem 8000 strukturně rozdílných tripeptidů. Klíčem k praktickému použití této metody je fakt, že cílová směs tripeptidů je velice snadno mechanicky dělitelná, neboť na jedné polystyrenové částici se nachází pouze jeden typ tripeptidu a nevznikají tak nedělitelné směsi látek. Stejný postup by byl v případě roztokové chemie zcela nepoužitelný. 4.2 Reakční nádoby v kombinatoriální syntéze Vedle již zmíněného reakčního systému firmy Torviq ve formě injekčních stříkaček s fritou za použití Domino block syntetizéru byly popsány i jiné reakční nádoby a způsoby provedení syntézy na pevné fázi a jejich současná aplikace pro kombinatoriální syntézu. 4.2.1 „T-bags“ V rámci využití „split and pool“ strategie aplikoval Richard A. Houghten polypropylenové sáčky, které připomínají čajový sáček48. Typická velikost sáčku byla 30x50 mm2 a množství pryskyřice uvnitř umožnilo přípravu 100–500 µmol látky. Výhodou je možné promývání všech reakčních sáčků v jedné nádobě a následné jednoduché rozdělení. V tomto případě je ale velmi komplikovaná automatizace. 4.2.2 „Kans“ Další vyvinutá reakční nádoba byla odvozena od kanystru, v tomto případě pro 300, 100 a 30 mg pryskyřice, která se nachází uvnitř a reakční roztok prostupuje přes póry kanystru49,50. Tyto nádoby byly navrženy pro automatickou syntézu firmou IRORI. - 31 - Obrázek 19: Ukázka různých velikostí nádob „Kans“. Foto: J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 9954-9967. 4.2.3 Kapsle Kapsle navržené Krchňákem v roce 2008 představují další alternativu pro kombinatoriální syntézu51. Skládají se z polypropylenového kroužku, který je z obou stran potažen propustnou teflonovou síťkou. Kapsle naplněné pryskyřicí se umístí do teflonové trubice, opatří koncovým uzávěrem a násadkou na domino blok syntetizér. Tímto způsobem je možné jednoduše podrobit sérií kapslí obsahující různé imobilizované výchozí látky jednomu typu reakce. Obrázek 20: Teflonová trubice s kapslemi s pryskyřicí. Foto: J. Comb. Chem. 2008, 10 (5), 714-720. 4.2.4 „SynPhase Lucerny“ Alternativou k různým zásobníkům na pryskyřici je využití tzv. SynPhase luceren, kde je pryskyřice nanesena v tenkém filmu na povrchu inertního nosiče a reakce probíhá přímo na této vrstvě52. K dostání jsou různé velikosti: A, D a L s deklarovaným loadingem 0,75; 0,35 a 0,15 µmol. Tato metoda byla úspěšně použita pro syntézu více než 300 000 látek53. - 32 - Obrázek 21: Princip a velikosti „SynPhase luceren“. Foto: Biopolymers 2000, 55 (3), 207-216. 4.3 Značení reakcí v kombinatoriální chemii Samotné provedení kombinatoriální syntézy je neefektivní bez vhodného značení jednotlivých reakčních nádob nebo nosičů. Nejjednodušším ale zároveň poměrně časově náročným procesem je manuální značení pomocí alfanumerických kódů. Alternativní metodou je v případě použití SynPhase luceren tzv. kódování pomocí náhrdelníku. Jednotlivé lucerny, každá s jinak modifikovanou strukturou, se navléknou na teflonové vlákno jako perly na náhrdelník, kdy předem definované pořadí luceren přesně označuje strukturu na dané lucerně54. Obdobně je možné aplikovat na lucerny barevnou značku. V případě plně automatizované syntézy bylo vyvinuto radiofrekvenční a optické kódování, které je hojně aplikováno při syntéze s tzv. kans nádobami opatřené počítačově čitelnou značkou. - 33 - 5 Mechanismy reakcí Tato kapitola se zaměřuje na popis mechanismů některých reakcí experimentálně prováděných ve Cvičení ze syntézy na pevné fázi a zároveň na způsob štěpení ukotvených sloučenin na kysele labilním linkeru. Řada reakcí je všeobecně platná jak v roztoku, tak na pevném nosiči, proto jsou pro jednoduchost popisovány tak, aby se zdůraznil princip reakce na obecném modelu bez přítomnosti pryskyřice. Jinak je tomu u mechanismů štěpení imobilizované látky z různých typů pryskyřic, kde je již polymer zahrnut. 5.1 Štěpení imobilizované látky z pryskyřice Kysele labilní linkery, které jsme si představili v tomto textu, podléhají stejnému principu štěpení sloučenin z pevného nosiče. Aktivní místo, které slouží k ukotvení výchozí látky je zároveň atom s velmi vysokou afinitou ke kyselým protonům nebo se na něj váže skupina s těmito vlastnostmi (X, Y). Aktivní místo se tedy vlivem silné kyseliny protonizuje. Pro odštěpení látky je zásadní atom kyslíku umístěný ihned za aromatickým jádrem linkeru, které po protonizaci v imobilizovaném místě poskytne elektrony směrem ke kladnému náboji a umožní tak přerušení vazby CH2-Y. Schéma 18: Obecný princip štěpení na kysele labilních linkerech. Mechanismy štěpení dle typu imobilizované látky a použitého pevného nosiče se mohou lehce lišit a budou detailněji rozvedeny na reálných příkladech Wangovy, Rinkovy a aminomethylové pryskyřice s BAL linkerem. 5.1.1 Štěpení esteru z Wangovy pryskyřice Wangova pryskyřice umožňuje tři typy ukotvení, z nichž jeden z nich je pomocí esterové vazby. Ta se velmi často používá pro imobilizaci Fmoc-amino kyselin, kdy po odštěpení získáváme produkty s koncovou karboxylovou skupinou. Mechanismus štěpení stejně jako i v dalších případech zahajuje proton kyseliny trifluoroctové, který se váže na kyslík s největší elektronovou hustotou. Získaný kladný náboj na uhlíku je poté stabilizován - 34 - přesunem elektronů přes benzenové jádro a dochází k přerušení vazby uhlík – kyslík. Zbývající část linkeru pak interaguje s trifluoracetátovým aniontem. Schéma 19: Mechanismus štěpení esteru z Wangovy pryskyřice. 5.1.2 Štěpení karbamátu z Rinkovy pryskyřice Při štěpení se stejně jako v předchozím případě protonizuje atom s největší elektronovou hustotou za vzniku kladného náboje, který elektronově bohatý aromatický systém stabilizuje přesunem elektronů. U Rinkovy pryskyřice se proces štěpení navíc umocňuje přítomností druhého aromatického jádra s methoxy skupinami, jež dodávají další elektrony do systému a podporují tak rozštěpení vazby uhlík dusík. Získaná imino forma je však nestabilní a ihned tautomerizuje na amid. Zbytek linkeru se opět stabilizuje trifluoracetátovým aniontem. Schéma 20 demonstruje kyselé štěpení v případě navázání Fmoc protektivní skupiny. Pokud je Rinkova pryskyřice modifikována libovolným acylem, je mechanismus štěpení totožný. - 35 - Schéma 20: Mechanismus štěpení na Rinkově pryskyřici modifikované Fmoc skupinou. V případě Rinkovy pryskyřice nemusí být reakční sekvence nutně zahájena acylací, ale požaduje-li to strategie syntézy i např. aromatickou nukleofilní substitucí. Poté se protonizuje přímo atom dusíku dle schématu 21. - 36 - Schéma 21: Mechanismus štěpení na Rinkově pryskyřici po arylační reakci. 5.1.3 Štěpení z aminomethylové pryskyřice s BAL linkerem Aminomethylová pryskyřice s BAL linkerem slouží k imobilizaci primárního alifatického aminu. Nicméně samotný ukotvený amin po protonizaci kyselinou trifluoroctovou nevytvoří silný odtah elektronů z vazby mezi linkerem a atomem dusíku. Proto je bez další modifikace vzniklého sekundárního aminu např. acylací či arylací imobilizační vazba neštěpitelná. Z tohoto důvodu je mechanismus popsán na imobilizovaném propylaminu, který byl dále podroben acylaci s Fmoc-β-alaninem. Štěpení je opět zahájeno navázáním kyselého protonu na místo s nejvyšší elektronovou hustotou. Dále pak dochází k přesunu elektronů přes aromatické jádro a přerušení vazby CH2-N. Stabilizace získaných produktů je totožná jako v předchozím případě, tautomerizace na amidickou formu a interakce trifluoracetylátového aniontu se zbývajícím linkerem. - 37 - Schéma 22: Mechanismus štěpení na aminomethylové pryskyřici s BAL linkerem. Stejně jako u Rinkovy pryskyřice i v tomto případě je možné získaný sekundární amin dále podrobit reakci s aromatickým halogenem místo acylace. Poté je mechanismus štěpení obdobný jako ve schématu 21. 5.2 Acylace HOBt technikou Acylační technika s využitím in situ připraveného benzotriazolového esteru byla poprvé popsána v roce 1970 jako nová metoda pro syntézu peptidů55. Používá se však jako standardní acylační technika nejen pro reakci amino kyselin, ale i při běžné organické syntéze. Vedle vzniku amidické vazby z libovolné karboxylové kyseliny a aminu je možné tuto acylaci aplikovat i na tvorbu esteru za katalýzy vhodnou bází, např. 4-N,N-dimethylaminopyridinem (DMAP). - 38 - Schéma 23: Sumární acylační reakce za vzniku esteru a amidu. 5.2.1 HOBt acylace za vzniku peptidické vazby Reakce je zahájena interakcí karboxylové kyseliny s dialkylkarbodiimidem (na pevné fázi běžně používané DIC – N,Nʼ-diisopropylkarbodiimid). Dochází k adici na uhlíkový atom karbodiimidu a zároveň k přesunu protonu na elektronově bohatý dusíkový atom. Následně do reakce vstupuje 1-hydroxybenzotriazol (HOBt), odštěpuje se dialkylmočovina a vzniká benzotriazolový ester. Poslední fáze již spočívá v ataku silně nukleofilního aminu na karbonyl, přesunu protonu a odstoupení 1-hydroxybenzotriazolu. Schéma 24: Acylace za vzniku amidu. 5.2.2 HOBt acylace za vzniku esterové vazby Jiná situace nastává u přípravy esterů, kde alkohol vystupuje jako slabší nukleofil. Tato reakce je založena na Steglichově esterifikaci56, kde je jako katalyzátor přidávána silná báze 4-N,N-dimethylaminopyridin (DMAP). V prvním kroku dochází opět ke vzniku derivátu O-acylmočoviny z DIC a kyseliny za přítomnosti DMAP. Následně interaguje DMAP s O-acylmočovinou, odstupuje dialkylmočovina a dochází k přesunu acylu na DMAP. Takto vzniklý intermediát při reakci s alkoholem již poskytuje požadovanou esterovou vazbu a opět se stabilizuje DMAP57. O-acylmočovina je velmi reaktivní meziprodukt, který však snadno v nepřítomnosti silného nukleofilu přesmykuje na nereaktivní N-acylmočovinu. Z tohoto důvodu je do reakční směsi přidáván HOBt, který ihned reaguje - 39 - s O-acylmočovinou za vzniku již stabilního benzotriazolového esteru. Ten opět s alkoholem umožňuje vzniku esteru a benzotriazolu. Tato vedlejší reakce je však oproti reakci s DMAP pomalejší. Schéma 25: Acylace za vzniku esteru. 5.3 Mitsunobu acylace V případě Mitsunobu acylace či alkylace se jedná o komplexní reakční mechanismus, kde do reakce vstupují dvě aktivační činidla trifenylfosfin a dialkylazodikarboxylát. Nejčastěji jsou používány tzv. DEAD (diethylazodikarboxylát) nebo DIAD (diisopropylazodiakarboxylát). Na stereocentrech reakce probíhá s čistou inverzí konfigurace, jedná se tedy o stereoselektivní typ reakce. Schéma 26: Souhrnné schéma Mitsunobu acylace. Reakční mechanismus zahajuje trifenylfosfin, který se nukleofilně aduje na dialkylazodikarboxylát za vzniku betainu. Ten následně deprotonizuje karboxylovou - 40 - kyselinu a vytvoří s ní tzv. iontový pár. Poté dochází k deprotonizaci alkoholu odstupujícím dialkylhydrazokarboxylátem a formování klíčového oxyfosfoniového iontu. V konečném stadiu karboxylát atakuje fosfoniový intermediát, odstupuje trifenylfosfin oxid a vzniká finální ester58. Schéma 27: Reakční mechanismus Mitsunobu acylace na obecném příkladu. 5.4 Reduktivní aminace Reduktivní aminace probíhá pomocí dvou krokové syntézy, kde napřed z aldehydické skupiny na linkeru a primárního aminu v kyselém prostředí vzniká stadium iminu, který je následně redukován vhodným komplexním hydridem za vzniku sekundárního aminu. Schéma 28: Sumární reakce reduktivní aminace na obecném příkladu. Reduktivní aminace je zahájena protonizací kyslíkového atomu aldehydu. Vzniká tak karbokation, na který se svým volným elektronovým párem váže primární amin přes dusíkový atom. Následně dochází k výměně protonu a odštěpení molekuly vody za vzniku iminu, který má dvě mezomerní formy. Po přidání triacetoxyborohydridu sodného se na kladně nabitý karbokation naváže hydridový ion redukčního činidla. Reduktivní aminace musí být prováděna za striktně bezvodého prostředí, aby nedocházelo k rozkladu iminu vodou. - 41 - Schéma 29: Obecný mechanismus reduktivní aminace. 5.5 Štěpení Fmoc protektivní skupiny Fmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl) protektivní skupina je jedna z nejčastěji používaných chránících skupin nejen při syntéze peptidů, ale i obecně v organické syntéze. Její štěpení probíhá obvykle v silně bazickém prostředí piperidinu, nicméně bylo popsáno i použití jiných bází59. Schéma 30: Mechanismus štěpení Fmoc protektivní skupiny. Mechanismus štěpení je založen na přítomnosti kyselého atomu vodíku na fluorenylovém kruhu, který se v silně bazickém prostředí piperidinu odštěpí ve formě protonu. Následně dochází k β-eliminaci a vytvoření dibenzofulvenu a alkylkarbamátu. - 42 - Alkylkarbamát se stabilizuje odštěpením oxidu uhličitého a v závěrečné etapě mechanismu piperidiniový kation zpět poskytne proton a vzniká výsledný amin. V případě dibenzofulvenu se také nejedná o konečné stadium reakce, ale dochází k interakci tohoto reaktivního elektrofilu s piperidinem. 5.6 Imobilizace aminu pomocí CDI aktivace Imobilizace přes karbamátovou vazbu na Wangově pryskyřici se hojně používá pro navázání a současné ochránění primárních aminů. Reakce probíhá ve dvou krocích, kdy v prvním kroku dochází k aktivaci 1,1’-karbonyldiimidazolem (CDI) a následně k reakci s primárním aminem. Schéma 31: Sumární reakce ukotvení aminu na Wangovu pryskyřici. Reakce je zahájena nukleofilním atakem alkoholu na elektronově deficitním atomu uhlíku CDI. Následně se vlivem silného indukčního efektu kyslíku odštěpuje imidazol. Do další části reakce již vstupuje primární amin, který se opět aduje na dvojnou vazbu karbonylu a po následném přesunu elektronů se odštěpí druhá molekula imidazolu a vzniká požadovaná pevná karbamátová vazba. Schéma 32: Obecný mechanismus aktivace alkoholu CDI a reakce s primárním aminem. 5.7 Cyklizace za vzniku 3-hydroxy-4(1H)-chinolonu Syntéza 3-hydroxy-4(1H)-chinolonů z fenacylesterů byla poprvé popsána v roce 1995 a v roce 2007 byla tato metoda aplikována na pevnou fázi15. Navržený mechanismus reakce je zahájen adicí amino skupiny na karbonyl s následným odštěpením vody za vzniku sedmičlenného kruhu, kde poté vlivem tautomerie dochází k novému ataku 60 - 43 - esterové skupiny, vytvoření šestičlenného cyklu a přesunu elektronů na konečnou 3-hydroxy-4(1H)-chinolonovou strukturu. Schéma 33: Cyklizace fenacylesterů za vzniku 3-hydroxy-4(1H)-chinolonu. - 44 - 6 Výhody a nevýhody syntézy na pevné fázi Syntéza na pevné fázi může představovat vhodnou alternativu oproti tradiční syntéze v roztoku. Neznamená to ale, že v určitých případech není naopak výhodnější připravovat látky pomocí roztokové chemie. Vždy je nutné individuálně zvážit, která metoda je pozitivnější v závislosti na typu, počtu a optimalizaci reakčních kroků, množství použitých reakčních činidel a připravovaných látek. Dále možnosti kontroly meziproduktů, izolace látek z roztoku či naopak z pevného nosiče a další aspekty organické syntézy. Jednotlivé hlediska syntézy na pevné fázi a syntézy v roztoku lze shrnout do jednoduché tabulky, podle které můžeme snadno rozhodnout, jakou techniku zvolit pro námi požadovaný typ organické syntézy. Klady syntézy na pevné fázi spočívají především v rychlém a jednoduchém odstranění reakčního roztoku, rozpouštědel a jednoduché izolaci intermediátů i konečných produktů. V průběhu reakčního procesu nedochází ke ztrátám při zpracování reakčních směsí a je velmi jednoduchá poloautomatizace i automatizace reakční sekvence. Tabulka 1: Porovnání syntézy v roztoku a syntézy na pevném nosiči. Parametr Syntéza v roztoku Syntéza na pevné fázi Syntetický krok navíc Žádný Imobilizace výchozí látky, štěpení produktu z pevného nosiče. Optimalizace reakčních podmínek Krátká Zdlouhavá a nutná Množství reagentů Ekvivalentní Výrazný nadbytek Aplikace libovolného typu organické reakce Snadná Možné limity Analýza intermediátů Ihned z reakční směsi Až po odštěpení (Polo)automatizace Složitá Jednoduchá Odstranění rozpouštědel Tradiční separační techniky Jednoduché promytí Ztráta (mezi)produktu vlivem isolace Částečná Žádná Syntetizované množství Libovolné Malé - 45 - Na druhou stranu je nutné uvědomit si i možná omezení syntézy na pevné fázi a následné zvážení aplikace roztokové chemie. Při syntéze na pevné fázi vnášíme do syntetického postupu dva reakční kroky navíc, a to ukotvení výchozí látky a štěpení jednotlivých intermediátů pro analýzu i konečné látky z pryskyřice. Nutná je také pečlivá optimalizace každého reakčního kroku, protože není možné čistit jednotlivé meziprodukty od vedlejších produktů (jsou ukotvené na tutéž polystyrenovou částici), je možné čistit až koncový produkt po odštěpení z polymeru. Dále syntéza na pevné fázi může vytvářet určité limity v některých nových typech organických reakcí a vyžaduje použití vysokého nadbytku reakčních komponent. - 46 - 7 Experimentální část 7.1 Kapacita bobtnání polystyrenových pryskyřic Pevný nosič může zaplňovat své póry rozpouštědly, tím dochází ke zvýšení jeho objemu a polymer tzv. bobtná. Míra zvyšování objemu závisí na charakteru rozpouštědla, struktuře polymeru i linkeru a významně ovlivňuje průběh reakce. 7.1.1 Srovnání kapacity bobtnání aminomethylové pryskyřice v různých rozpouštědlech Pro aminomethylovou pryskyřici byla popsána studie, která charakterizuje, že pokud 1 g suché aminomethylové pryskyřice nezvýší svůj objem ve vhodném rozpouštědle alespoň na 7 ml, není vhodná pro syntézu na pevné fázi a pravděpodobně bude způsobovat nepředvídatelné obtíže při reakcích4. Cílem této úlohy je najít nejvhodnější rozpouštědlo pro tento typ pevného nosiče a ověřit, zda je vhodný pro organickou syntézu na pevné fázi. Tabulka 2: Kapacita bobtnání aminomethylové pryskyřice v různých rozpouštědlech. Číslo Rozpouštědlo 1 DCM 2 DMF 3 THF 4 MeOH 5 Toluene 6 Et2O Objem pryskyřice [ml] Pořadí Pracovní postup: Do šesti polypropylenových stříkaček s fritou se naváží po 300 g aminomethylové polystyrenové pryskyřice. Jednotlivé naplněné stříkačky se postupně 3× promyjí různými rozpouštědly: DCM, DMF, THF, MeOH, Toluenem a diethyl etherem). Po odsátí rozpouštědla bez stlačování pístu se porovná objem nabobtnaných pryskyřic dle stupnice na stříkačce a zaznamená se do uvedené tabulky. - 47 - Po tomto experimentu se všechny navlhčené pevné nosiče recyklují a to tak, že se postupně promyjí 3× DCM a 3× MeOH, odstraní se písty a na horní část stříkačky se zasune další frita. Takto upravené stříkačky se suší na domino bloku pod proudem dusíku a opět se vrátí do původní nádoby. Vyhodnocení vhodnosti aminomethylové pryskyřice Dle teorie musí 1 g aminomethylová pryskyřice akceptovatelné pro syntézu zvýšit svůj objem ve svém nejvhodnějším rozpouštědle minimálně na 7 ml. Po vyhodnocení předešlé tabulky 2 se vybere nejhodnější rozpouštědlo, provede se bobtnání/promývání 1 g suché aminomethylové pryskyřice a vyhodnotí se, zda je uvedená šarže vhodná/nevhodná pro další syntézu. Po ukončení experimentu se pryskyřice opět 3× promyje MeOH, vysuší se a vrátí do zásobní lahvičky. Tabulka 3: Kapacita bobtnání aminomethylové pryskyřice ve vybraném rozpouštědle. Číslo Aminomethylová pryskyřice 1 g 1 Objem suché pryskyřice 2 Objem nabobtnané pryskyřice 3 Vhodná/nevhodná pro syntézu (Ano/Ne) Objem [ml] 7.1.2 Srovnání kapacity bobtnání různých pryskyřic Stejné množství polymerního nosiče s rozdílnou strukturou může vykazovat odlišnou kapacitu bobtnání i ve stejném typu rozpouštědla v závislosti na velikosti pórů, větvení polymeru a velikosti částic. Tabulka 4: Kapacita bobtnání různých druhů pryskyřic v dichlormethanu. Číslo Pevný nosič 1 Wang 2 Rink 3 AM Objem v DCM [ml] Pořadí Pracovní postup: Do tří polypropylenových stříkaček opatřených fritou se postupně naváží 300 mg různých pryskyřic (Wangova, Rinkova a aminomethylová pryskyřice). Pryskyřice se promyjí - 48 - 3× DCM a při poslední dávce se ponechají s rozpouštědlem třepat za laboratorní teploty po 10 minut. Po uplynutí této doby se vypustí DCM, aniž by se stlačil píst na pryskyřici a dle stupnice na stříkačce se porovná objem nabobtnaných pryskyřic. 7.2 Imobilizace piperazinu na Wangovu pryskyřici pomocí CDI aktivace Wangova pryskyřice umožňuje ukotvení primárních či sekundárních aminů přes karbamátovou vazbu. Tato imobilizační technika se provádí v případech, kdy je požadována volná amino skupina na finální sloučenině, která je však právě po dobu ukotvení na pryskyřici chráněná před vedlejšími reakcemi. Samotná Wangova pryskyřice je však v prvním kroku aktivována 1,1’-karbonyldiimidazolem (CDI) v bazickém prostředí. Po ukončení aktivace je přebytečné aktivační činidlo z pryskyřice vymyto a následně je k aktivované pryskyřici přidán roztok libovolného aminu (v našem případě piperazinu). Při reakci se aduje piperazin na karbonylovou vazbu se současným odstupem molekuly imidazolu. Pro odštěpení z pevného nosiče a možnosti provedení kvantifikace je volná amino skupina piperazinu fmocylována pomocí Fmoc-OSu a následně je konečná sloučenina odštěpena z pryskyřice. Schéma 34: Imobilizace piperazinu na Wangovu pryskyřici. Pracovní postup: Wangova pryskyřice (0,52 mmol/g; 100 mg) se nabobtná promytím 3× v DCM a následně se přidá roztok CDI (0,5 mmol; 81 mg) a pyridinu (0,5 mmol; 40 l) v 1 ml DCM a pryskyřice se nechá třepat za laboratorní teploty po dobu 2 hodin. Po ukončení reakční doby se pryskyřice promyje 3× DCM a přidá se roztok piperazinu (0,5 mmol; 43 mg) v 1 ml DCM. Vzniklá reakční směs se opět ponechá třepat za laboratorní teploty přes noc. Následující den se pryskyřice promyje 5× DCM a odebere se malý vzorek pryskyřice do Eppendorfovy zkumavky (~5 mg), přidá se 0,5 ml DCM a kapka 0,03 M roztoku bromfenolové modři (BB) v N-methylpyrrolidonu (NMP) pro důkaz přítomnosti amino skupin. Zbývající část asi 95 mg pryskyřice se fmocyluje 0,5 M roztokem Fmoc-OSu v DCM - 49 - po dobu 30 minut, poté se pryskyřice promyje 5× DCM, 3× MeOH a vysuší v proudu dusíku. Část suché pryskyřice se použije pro kvantifikaci, kdy se naváží 2× asi přesně 10 mg pryskyřice, ponechá se štěpit ve směsi kyseliny TFA/DCM a po odpaření štěpícího koktejlu se odparek rozpustí a analyzuje metodou LC-MS (viz kapitola kvantifikace). 7.3 Acylace Wangovy pryskyřice Koncová hydroxy skupina Wangovy pryskyřice se hojně využívá na ukotvení kyselin přes esterovou vazbu. Pro tento typ imobilizace je možné využít dvě rozdílné metody, a to standardní acylační techniku přes in situ připravený benzotriazolový ester, nebo tzv. Mitsunobovu reakci, která je výhodná při přípravě peptidů, kde je nebezpečí vzniku racemické směsi. 7.3.1 Acylace Wangovy pryskyřice za vzniku benzotriazolového esteru Acylace Wangovy pryskyřice probíhá přes stadium benzotriazolového esteru (viz kapitola mechanismy reakcí), ten nevzniká samovolně, ale aktivací N,N’-diisopropylkarbodiimidu (DIC). Vhledem k relativně nízké nukleofilitě hydroxy skupiny se však do reakce navíc přidává 4-dimethylaminopyridin (DMAP), který celou reakci katalyzuje. Tato technika se využívá i pro acylaci amino skupin za vzniku amidické vazby, kde díky vyšší nukleofilitě dusíkového atomu oproti kyslíkovému není reakci nutné katalyzovat DMAP. Scheme 35: Acylace Wangovy pryskyřice s Fmoc-Ala-OH. Pracovní postup: Wangova pryskyřice (0,52 mmol/g; 100 mg) se nabobtná 3× DCM a přidá se roztok Fmoc-Ala-OH (0,2 mmol; 62,2 mg), HOBt (0,2 mmol; 30,6 mg), DIC (0,2 mmol; 31 µl) a DMAP (0,05 mmol; 6 mg) v 0,5 ml DMF and 0,5 ml DCM. Reakční směs se ponechá reagovat po dobu 2 hodin za laboratorní teploty. Po ukončení reakce se odstraní reakční roztok a pryskyřice se promyje 3× DMF a 3× DCM. Následně se k promyté pryskyřici přidá 20% roztok piperidinu v DMF (1 ml) a pryskyřice se ponechá třepat za laboratorní teploty 20 minut. Poté se pryskyřice promyje 3× DMF a malý vzorek výchozí Wangovy pryskyřice (~10 mg) a pryskyřice po reakci (~10 mg) se dají do 2 Eppendorfových zkumavek, přidá se 0,5 ml DCM a kapka 0,03 M roztoku bromfenolové modře a sleduje se změna zabarvení. - 50 - Takto připravená pryskyřice se může po acylačním kroku i standardně kvantifikovat dle výše popsaných metod. 7.3.2 Acylace Wangovy pryskyřice pomocí Mitsunobu reakce Mitsunobu reakce probíhá vždy s čistou inverzí, proto se hojně používá pro inverzi stereogenních center při syntéze přírodních látek. Reakce probíhá pomocí dvou aktivačních činidel: trifenylfosfinu a diisopropylazodikarboxylátu (DIAD), které tvoří fosfoniový intermediát. Ten se váže na kyslík alkoholu a po substituci s karboxylátem odstupuje a rozpadá se (viz kapitola mechanismy reakcí). Schéma 36: Mitsunobu acylace Wangovy pryskyřice. Pracovní postup: Wangova pryskyřice (0,52 mmol/g; 100 mg) se nabobtná 3× DCM, 3× THF a promyje se 3× bezvodým THF. Následně se přidá roztok Fmoc-β-Ala-OH (0,2 mmol, 62,2 mg) a trifenylfosfinu (0,2 mmol, 52,4 mg) v 0,8 ml bezvodého THF a reakční směs se umístí do mrazáku po dobu 30 minut. Mezitím se připraví roztok rozpuštěním DIAD (0,2 mmol, 39 l) v 0,2 ml bezvodého THF a také se umístí na 30 minut do mrazáku. Po uplynutí této doby se pomocí spojky přidá roztok DIAD do reakčního roztoku s pryskyřicí a nechá se takto reagovat za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny. Poté se pryskyřice promyje 3× THF, 3× DCM a dále se zpracovává na standardní kvantifikaci. 7.4 Preparativní syntéza 2-substituovaného-3-hydroxy-4(1H)-chinolonu-7karboxamidu Hydroxychinolony vznikají termickou cyklizací fenacylesterů kyseliny anthranilové a vykazují pro ně typickou fluorescenční aktivitu. Jedna z metod využívá jako substrátu Rinkovy pryskyřice, kde je odstraněna chránící Fmoc skupina a následně dochází k acylaci 1-methyl 2-aminotereftalátem. V dalších krocích je provedena saponifikace methyl esteru a alkylace vhodnými bromketony. Takto vzniklý intermediát se odštěpí z pevného nosiče a závěrečná cyklizace probíhá při refluxu v kyselině trifluoroctové. - 51 - Schéma 37: Syntéza hydroxychinolonu na pevné fázi. Pracovní postup: Acylace s 1-methyl-2-aminotereftalátem Rinkova pryskyřice (0,49 mmol; 200 mg) se nabobtná 3× DCM a 3× DMF, přidá se 2 ml 50% roztoku piperidinu v DMF a ponechá se třepat za laboratorní teploty po dobu 10 minut. Po deprotekční reakci se pryskyřice promyje 3× DMF a 3× DCM. V závislosti na loadingu výchozí Rinkovy pryskyřice se připraví roztok 2 ekvivalentů 1-methyl-2aminotereftalátu (M = 195,05 mol/g), 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) (M = 153,1 mol/g) a N,Nʼ-diisopropylkarbodiimidu (DIC) (M = 126,2 mol/g; ρ = 0,805 g/cm3) ve 2 ml DMF a přidá se k pryskyřici. Vzniklá reakční směs se ponechá třepat za laboratorní teploty přes noc a poté se pryskyřice promyje 3× DCM a 3× DMF. Kvantitativní průběh reakce se ověří reakcí s Fmoc-OSu, kdy se malý vzorek zreagované pryskyřice (~10 mg) přesune do - 52 - stříkačky s fritou, přidá se 0,5 M roztok Fmoc-OSu v DCM a ponechá se reagovat po dobu 30 minut. Po ukončení reakce se pryskyřice promyje 5× DCM a následuje standardní štěpení vzorku v roztoku TFA/DCM a LC-MS analýza. Saponifikace methylesteru Pryskyřice 14 (190 mg) se promyje 3× DCM a 3× THF, poté se přidá 0,23 M roztok trimethylsilanolátu draselného (TMSOK) (0,47 mmol; 60 mg) ve 2 ml THF a reakční směs se ponechá třepat za laboratorní teploty přes noc. Po reakci se pryskyřice promyje 3×THF a 3× DCM a vzorek pryskyřice se standardně analyzuje na LC-MS. Příprava antranilátu K nabobtnané pryskyřici 15 (180 mg) se přidá 0,2 M roztok bromketonu (4-amino-3,5dichlorofenyl)acetyl bromid (0,4 mmol; 113 mg) a ekv. N,N-diisopropylethylaminu (EDIPA) (0,4 mmol; 70 l) ve 2 ml DMF. Reakční směs se ponechá na třepačce přes noc, promyje se 3× DMF, 3× DCM a analyzuje standardním způsobem. Štěpení a cyklizace hydroxychinolonu Pryskyřice 16 (170 mg) se dobře promyje 3× DCM, přidá se 3 ml štěpícího koktejlu přímo do reakční stříkačky a ponechá se třepat po dobu 30 minut. Následně se vzniklý roztok štěpící směsi a odštěpené látky 16a vypustí do připravené Erlenmayerovy baňky a pryskyřice se promyje dalšími dvěma podíly štěpícího koktejlu. Všechny podíly štěpení se přidají do společné baňky a vzniklý roztok se odpaří do sucha pod proudem dusíku. K získanému odparku se přidá 3 ml koncentrované trifluoroctové kyseliny a reakční roztok se zahřívá pod refluxem po dobu 2 hodin. Po ukončení reakce se TFA odpaří proudem dusíku a výsledný olejovitý odparek se sonifikuje v diethyl etheru po dobu 5 minut. Závěrem se vysrážená pevná látka 17 zfiltruje a promyje čistým diethyl etherem. Pro potvrzení získaného produktu se provede jednoduchý test fluorescence rozpuštěného produktu pod UV lampou. 7.5 Imobilizace propylaminu na aminomethylovou pryskyřici s BAL linkerem Aminomethylová pryskyřice se komerčně dodává ve formě hydrochloridu, proto je vždy prvním krokem přidání roztoku báze za vzniku volného aminu a následné navázání linkeru acylační reakcí s BAL linkerem. Úplná konverze acylace se potvrdí testem s bromfenolovou modří. Získaná aldehydická skupina se hodí pro ukotvení primárních aminů reduktivní aminací a probíhá ve dvou stupňové syntéze. Pro odštěpení a kvantifikaci získaného produktu je opět nutné provést fmocylační reakci s Fmoc-OSu. - 53 - Schéma 38: Acylace aminomethylové pryskyřice BAL linkerem a následná reduktivní aminace. Pracovní postup: Acylace s BAL linkerem Aminomethylová polystyrenová pryskyřice (0,98 mmol/g; 200 mg) se nabobtná 3× v DCM, neutralizuje se 5% roztokem EDIPA v DCM (2 ml) po dobu 5 minut a promyje se 3× DCM. Následně se přidá k pryskyřici roztok 4-(4-formyl-3-methoxyfenoxy)butanové kyseliny (BAL linker) (0,8 mmol; 214 mg), HOBt (0,8 mmol; 122 mg) a DIC (0,8 mmol; 122 l) v 2 ml DCM/DMF (1:1) a reakční směs se ponechá třepat za laboratorní teploty přes noc. Následující den se pryskyřice promyje 3× DMF, 3× DCM a malý vzorek pryskyřice (~10 mg) se přidá do Eppendorfovy zkumavky, přilije se 0,5 ml DCM a přidá se kapka 0,03 M roztoku bromfenolové modři v NMP. Žlutá nebo nazelenalá barva signalizuje nepřítomnost výchozích amino skupin. Reduktivní aminace s propylaminem Pryskyřice 19 (190 mg) se pečlivě 3× promyje bezvodým THF a 3× bezvodým DMF. Poté se připraví roztok propylaminu (0,8 mmol; 66 l), AcOH (200 l) v bezvodém DMF (1,8 ml) a přidá se k promyté pryskyřici. Reakční směs se ponechá za laboratorní teploty na shakeru do druhého dne. Následující den se reakční roztok ze stříkačky neodstraňuje a pokračuje se přidáním první porce triacetoxyborohydridu sodného (0,26 mmol; 56,5 mg) v bezvodém DMF (950 l) a AcOH (50 l). Ihned po přídavku se na stříkačce posune píst co nejvýše a stříkačka se v horní části propíchne jehlou, aby nedocházelo k jejímu přetlakování v důsledku vývoje vodíku. Takto upravená stříkačka s reakční směsí se upevní do horizontální polohy a nechá se intenzivně třepat za laboratorní teploty po 1 hodinu. - 54 - Následně se reakční nádoba otevře vytáhnutím pístu stříkačky a přidá se druhá porce triacetoxyborohydridu sodného (56,5 mg) a opět se směs třepe ve stejné poloze další 1 hodinu. Nakonec se stejným způsobem přisype poslední podíl triacetoxyborohydridu sodného a reakční směs se ponechá reagovat 2 hodiny. Po ukončení reakce se odstraní reakční roztok, pryskyřice se promyje 3× DMF a poté se neutralizuje přidáním 20% roztoku piperidinu v DMF (2 ml) po dobu 10 minut. Posléze se pryskyřice promyje 3× DMF, 3× DCM a vzorek pryskyřice (~30 mg) se použije na fmocylační reakci s 0,5 M roztokem Fmoc-OSu a kvantifikaci. 7.6 Acylační reakce aminomethylové pryskyřice s paralelní detekcí bromfenolovou modří Test bromfenolovou modří se využívá jako nedestruktivní metoda pro detekci volných amino skupin. Bromfenolové činidlo je možné aplikovat na polymer až po ukončení reakce, nebo je možné sledovat zabarvení pryskyřice v průběhu reakce a určit tak přesně dobu, kdy jsou všechny amino skupiny pokryty, což signalizuje zánik modrého zbarvení pryskyřice. Schéma 39: Acylace aminomethylové pryskyřice s Fmoc-Ala-OH . Pracovní postup: Aminomethylová pryskyřice (0,98 mmol/g; 100 mg) se nabobtná promytím 3× DCM a neutralizuje se přidáním 5% roztoku EDIPA v DCM (1 ml), dále je směs třepána za laboratorní teploty po dobu 5 minut. Poté se neutralizační roztok odstraní, pryskyřice se promyje 3× DCM a přidá se reakční roztok Fmoc-Ala-OH (0,3 mmol; 93 mg), HOBt (0,3 mmol; 46 mg), a DIC (0,3 mmol; 46 l) v 1 ml DCM/DMF (1:1). K reakční směsi se přidá jedna kapka 0,03 M roztoku bromfenolové modři v NMP, protřepe se a ihned se zaznamená barva pryskyřice. Takto se ponechá reakční směs třepat za laboratorní teploty přes noc s tím, že už po první hodině se opět zkontroluje a zaznamená zbarvení. Následující den se opět zkontroluje zbarvení pryskyřice, zaznamená se do tabulky a pryskyřice se promyje 3× DMF, 3× DCM a malý vzorek pryskyřice po reakci (~10 mg) se opět podrobí testu s bromfenolové modři v Eppendorfově zkumavce. - 55 - Tabulka 5: In situ detekce volných amino skupin v průběhu acylace. Číslo Reakční čas 1 Začátek reakce 2 Po ~ 1 hodině 3 Následující den 4 Po acylaci Barva zrnek pryskyřice Přítomnost volných amino skupin (Ano/Ne) 7.7 Potvrzení loadingu Rinkovy pryskyřice Každá komerčně dodávaná pryskyřice je definována svým loadingem v mmol/g. V řadě případů se však stává, že reálné nabití pryskyřice není natolik vysoké a je proto vhodné na začátku práce s novou šarží pryskyřice provést kontrolu loadingu. Velmi jednoduché je to v případě Rinkovy pryskyřice, kdy se provede štěpení definovaného množství ve štěpícím koktejlu (směs TFA/DCM nebo piperidinu/DMF) a připraví se vzorky na kvantifikaci jako ve standardním případě po navázání prvního building blocku. Schéma 40: Štěpení Rinkovy pryskyřice pomocí kyselé nebo bazické metody Pracovní postup: Kyselá metoda: Do dvou Eppendorfových zkumavek se naváží přesně 2× 10 mg Rinkovy pryskyřice, do každé se přidá 1 ml 50% roztoku TFA v DCM a takto se nechá pryskyřice třepat za - 56 - laboratorní teploty po dobu 30 minut. Poté se štěpící směs odpaří proudem dusíku, vzniklý odparek se rozpustí přesně v 1 ml MeOH a po intenzivním protřepání, popř. použití ultrazvukové lázně se takto připravený roztok naředí 4× methanolem do připravené analytické vialky. Oba vzorky se proměří na LC-MS spolu se standardem (roztok Fmoc-Ala-OH o koncentraci 0,5 mg/ml) a analýzy se vyhodnotí dle kapitoly určení loadingu pryskyřice). Bazická metoda Do dvou Eppendorfových zkumavek se naváží přesně 2× 10 mg Rinkovy pryskyřice, do každé se přidá přesně 1 ml 50% roztoku piperidinu v DMF a zkumavky se ponechají třepat za laboratorní teploty po dobu 10 minut. Poté se roztok s odštěpenou látkou naředí 4× methanolem: 250 l vzorku se napipetuje do analytické vialky a přidá se 750 l MeOH. Takto připravené vzorky se proměří na LC-MS spolu se standardem (Fmoc-Ala-OH 0,5 mg/ml) a získané analýzy se vyhodnotí dle podkapitoly určení loadingu pryskyřice. - 57 - 8 Reference 1. Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85 (14), 2149-2154. 2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1984/merrifieldbio.html 3. Merrifield, B. Life During a Golden Age of Peptide Chemistry; ACS: 1993. 4. Bouillon, I.; Soural, M.; Miller, M. J.; Krchnak, V. Resins with Identical Specifications Are Not Identical. Identifying a Useful Solid-Phase Resin. J. Comb. Chem. 2009, 11 (2), 213-215. 5. Soural, M.; Hlavac, J.; Krchnak, V. Linkers for solid-phase peptide synthesis. WileyVCH Verlag GmbH & Co. KGaA: 2011; pp 273-312. 6. Wang, S. S. p-Alkoxybenzyl alcohol resin and p-alkoxybenzyloxycarbonylhydrazide resin for solid phase synthesis of protected peptide fragments. J. Amer. Chem. Soc. 1973, 95 (4), 1328-1333. 7. Rink, H. Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxydiphenyl-methyl ester resin. Tetrahedron Lett. 1987, 28 (33), 3787-3790. 8. Jensen, K. J.; Alsina, J.; Songster, M. F.; Vagner, J.; Albericio, F.; Barany, G. Backbone Amide Linker Strategy for Solid-Phase Synthesis of C-Terminal-Modified and Cyclic Peptides. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120 (22), 5441-5452. 9. Barlos, K.; Gatos, D.; Kallitsis, I.; Papaioannou, D.; Sotiriou, P. Application of 4polystyryltriphenylmethyl chloride to the synthesis of peptides and amino acid derivatives. Liebigs Ann. Chem. 1988, (11), 1079-1081. 10. Krchnak, V.; Cabel, D.; Weichsel, A.; Flegelova, Z. Esterification of polymer-supported hydroxyl groups using the Mitsunobu reaction. Lett. Pept. Sci. 1995, 1 (6), 274-282. 11. Hanessian, S.; Xie, F. Polymer-bound p-alkoxybenzyl trichloroacetimidates: reagents for the protection of alcohols as benzyl ethers on a solid phase. Tetrahedron Lett. 1998, 39 (8), 733-736. 12. Hauske, J. R.; Dorff, P. A solid phase CBZ chloride equivalent. A new matrix specific linker. Tetrahedron Lett. 1995, 36 (10), 1589-1592. - 58 - 13. Vankova, B.; Krchnak, V.; Soural, M.; Hlavac, J. Direct C-H Arylation of Purine on Solid Phase and Its Use for Chemical Libraries Synthesis. ACS Comb. Sci. 2011, 13 (5), 496-500. 14. La Venia, A.; Dolensky, B.; Krchnak, V. Polymer-supported stereoselective synthesis of tetrahydro-2H-oxazolo[3,2-a]pyrazin-5(3H)-ones from N-(2-Oxo-ethyl)derivatized dipeptides via eastbound iminiums. ACS Comb. Sci. 2013, 15 (3), 162-167. 15. Soural, M.; Krchnak, V. Efficient Solid-Phase Synthesis of 2-Substituted-3-Hydroxy4(1H)-Quinolinone-7-Carboxamides with Two Diversity Positions. J. Comb. Chem. 2007, 9 (5), 793-796. 16. Krupkova, S.; Soural, M.; Hlavac, J.; Hradil, P. Solid-Phase Synthesis of 3-Hydroxy-6Nitroquinolin-4(1H)-ones with Two Diversity Positions. J. Comb. Chem. 2009, 11 (6), 951-955. 17. Vankova, B.; Hlavac, J.; Soural, M. Solid-Phase Synthesis of Highly Diverse PurineHydroxyquinolinone Bisheterocycles. J. Comb. Chem. 2010, 12 (6), 890-894. 18. Lemrova, B.; Soural, M. Solid-Phase Synthesis of 4,7,8-Trisubstituted 1,2,3,4Tetrahydro-benzo[e][1,4]diazepin-5-ones. ACS Comb. Sci. 2012, 14 (12), 645650. 19. McNally, J. J.; Youngman, M. A.; Dax, S. L. Mannich reactions of resin-bound substrates: 2. A versatile three-component solid-phase organic synthesis methodology. Tetr. Lett. 1998, 39 (9), 967-970. 20. Atherton, E.; Logan, C. J.; Sheppard, R. C. Peptide synthesis. Part 2. Procedures for solid-phase synthesis using N+--fluorenylmethoxycarbonyl amino acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 6574 decapeptide. J. Chem. Soc. , Perkin Trans. 1 1981, (2), 538-546. 21. Chhabra, S. R.; Khan, A. N.; Bycroft, B. W. Versatile Dde-based primary amine linkers for solid phase synthesis. Tetrahedron Lett. 1998, 39 (21), 3585-3588. 22. Drinnan, N.; West, M. L.; Broadhurst, M.; Kellam, B.; Toth, I. A novel method for solid-phase synthesis of oligosaccharides using the N-1-(4,4-dimethyl-2,6dioxocyclohexylidene)ethyl (Dde) linker. Tetrahedron Lett. 2001, 42 (6), 11591162. 23. Wagner, M.; Kunz, H. The (2-phenyl-2-trimethylsilyl)ethyl(PTMSEL) linker - a novel linker for the solid-phase synthesis of protected peptides and glycopeptides cleavable with fluoride. Angew. Chem. , Int. Ed. 2002, 41 (2), 317-321. - 59 - 24. Wagner, M.; Dziadek, S.; Kunz, H. The (2-phenyl-2-trimethylsilyl)ethyl-(PTMSEL)linker in the synthesis of glycopeptide partial structures of complex cell surface glycoproteins. Chem. - Eur. J. 2003, 9 (24), 6018-6030. 25. Dziadek, S.; Kunz, H. Synthesis of a tumor-associated 2,3-sialyl-T glycododecapeptide antigen from the tandem repeat region of the mucin MUC1. Synlett 2003, (11), 1623-1626. 26. Paterson, I.; Temal-Laib, T. Toward the Combinatorial Synthesis of Polyketide Libraries: Asymmetric Aldol Reactions with a-Chiral Aldehydes on Solid Support. Org. Lett. 2002, 4 (15), 2473-2476. 27. Guillier, F.; Orain, D.; Bradley, M. Linkers and Cleavage Strategies in Solid-Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry. Chem. Rev. 2000, 100 (6), 2091-2158. 28. Aurell, M. J.; Boix, C.; Ceita, M. L.; Llopis, C.; Tortajada, A.; Mestres, R. Polymersupported o-nitrophenylethylene glycols for photoremovable protection of aldehydes. J. Chem. Res. , Synop. 1995, (11), 452-453. 29. Sucholeiki, I. Solid-phase photochemical C-S bond cleavage of thioethers - a new approach to the solid-phase production of non-peptide molecules. Tetrahedron Lett. 1994, 35 (40), 7307-7310. 30. Forman, F. W.; Sucholeiki, I. Solid-Phase Synthesis of Biaryls via the Stille Reaction. J. Org. Chem. 1995, 60 (3), 523-528. 31. Walker, D.; Waugh, T. D. 2,3-Dichloro-5,6-Dicyanobenzoquinone (DDQ). A New Preparation. J. Org. Chem. 1965, 30 (9), 3240. 32. Kobayashi, S.; Aoki, Y. p-Benzyloxybenzylamine (BOBA) resin. A new polymersupported amine used in solid-phase organic synthesis. Tetrahedron Lett. 1998, 39 (40), 7345-7348. 33. Ho, C. Y.; Kukla, M. J. Carbamate linkers as latent N-methylamines in solid phase synthesis. Tetrahedron Lett. 1997, 38 (16), 2799-2802. 34. Bottom, C. B.; Hanna, S. S.; Siehr, D. J. Mechanism of the ninhydrin reaction. Biochem. Educ. 1978, 6 (1), 4-5. 35. Krchnak, V.; Vagner, J.; Safar, P.; Lebl, M. Amino acids and peptides. Part CCVI. Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acidbase indicator. Collect. Czech. Chem. Commun. 1988, 53 (11A), 2542-2548. 36. Krchnak, V.; Vagner, J. Color-monitored solid-phase multiple peptide synthesis under low-pressure continuous-flow conditions. Pept. Res. 1990, 3 (4), 182-193. - 60 - 37. Krchnak, V.; Padera, V. The domino blocks: a simple solution for parallel solid-phase organic synthesis. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8 (22), 3261-3264. 38. Clement, C. C.; Philipp, M.; Gingold, J. Molecular docking for generating peptides and peptido-mimetics inhibitors for thrombin and factor Xa. American Chemical Society: 2003; p COMP-147. 39. Rossi, D.; Amadio, M.; Carnevale Baraglia, A.; Azzolina, O.; Ratti, A.; Govoni, S.; Pascale, A.; Collina, S. Discovery of Small Peptides Derived from Embryonic Lethal Abnormal Vision Proteins Structure Showing RNA-Stabilizing Properties. J. Med. Chem. 2009, 52 (16), 5017-5019. 40. Plante, O. J.; Palmacci, E. R.; Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science (Washington, DC, U. S. ) 2001, 291 (5508), 15231527. 41. Song, Q.; Wang, Z.; Sanghvi, Y. S. A Short, Novel, and Cheaper Procedure for Oligonucleotide Synthesis Using Automated Solid Phase Synthesizer. Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 2003, 22 (5-8), 629-633. 42. Pon, R. T.; Damha, M. J.; Ogilvie, K. K. Modification of guanine bases by nucleoside phosphoramidite reagents during the solid phase synthesis of oligonucleotides. Nucleic Acids Res 1985, 13 (18), 6447-6465. 43. Czarnik, A. W.; DeWitt, S. H.; Editors. A Practical Guide to Combinatorial Chemistry; ACS: 1997. 44. Hlavac, J.; Soural, M.; Krchnak, V. Practical aspects of combinatorial solid-phase synthesis. John Wiley & Sons, Inc.: 2012; pp 95-130. 45. Bannwarth, W.; Hinzen, B.; Editors. Combinatorial Chemistry: From Theory to Application. [In: Methods Princ. Med. Chem.; 2006, 26]; Wiiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: 2006. 46. Lemrova, B.; Smyslova, P.; Popa, I.; Ozdian, T.; Zajdel, P.; Soural, M. Directed SolidPhase Synthesis of Trisubstituted Imidazo[4,5-c]pyridines and Imidazo[4,5b]pyridines. ACS Comb. Sci. 2014, Ahead. 47. Furka, A.; Sebestyen, F.; Asgedom, M.; Dibo, G. General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Pept. Protein Res. 1991, 37 (6), 487-493. 48. Houghten, R. A. General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985, 82 (15), 51315135. - 61 - 49. Xiao, X. Y.; Li, R.; Zhuang, H.; Ewing, B.; Karunaratne, K.; Lillig, J.; Brown, R.; Nicolaou, K. C. Solid-phase combinatorial synthesis using microKan reactors, Rf tagging, and directed sorting. Biotechnol. Bioeng. 2000, 71 (1), 44-50. 50. Nicolaou, K. C.; Pfefferkorn, J. A.; Mitchell, H. J.; Roecker, A. J.; Barluenga, S.; Cao, G. Q.; Affleck, R. L.; Lillig, J. E. Natural Product-like Combinatorial Libraries Based on Privileged Structures. 2. Construction of a 10 000-Membered Benzopyran Library by Directed Split-and-Pool Chemistry Using NanoKans and Optical Encoding. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122 (41), 9954-9967. 51. Bouillon, I.; Soural, M.; Krchnak, V. Resin Capsules: Permeable Containers for Parallel/Combinatorial Solid-Phase Organic Synthesis. J. Comb. Chem. 2008, 10 (5), 714-720. 52. Rasoul, F.; Ercole, F.; Pham, Y.; Bui, C. T.; Wu, Z.; James, S. N.; Trainor, R. W.; Wickham, G.; Maeji, N. J. Grafted supports in solid-phase synthesis. Biopolymers 2000, 55 (3), 207-216. 53. Ryba, T. D.; Depew, K. M.; Marcaurelle, L. A. Large Scale Preparation of SiliconFunctionalized SynPhase Polystyrene Lanterns for Solid-Phase Synthesis. J. Comb. Chem. 2009, 11 (1), 110-116. 54. Smith, J. M.; Gard, J.; Cummings, W.; Kanizsai, A.; Krchnak, V. Necklace-Coded Polymer-Supported Combinatorial Synthesis of 2-Arylaminobenzimidazoles. J. Comb. Chem. 1999, 1 (5), 368-370. 55. Konig, W.; Geiger, R. A new method for synthesis of peptides: activation of the carboxyl group with dicyclohexylcarbodiimide using 1-hydroxybenzotriazoles as additives. Chem Ber 1970, 103 (3), 788-798. 56. Neises, B.; Steglich, W. 4-Dialkylaminopyridines as acylation catalysts. 5. Simple method for the esterification of carboxylic acids. Angew. Chem. 1978, 90 (7), 556-557. 57. Spivey, A. C.; Arseniyadis, S. Regio- and position selective reactions and desymmetrizations. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: 2013; pp 12251284. 58. Grochowski, E.; Hilton, B. D.; Kupper, R. J.; Michejda, C. J. Mechanism of the triphenylphosphine and diethyl azodicarboxylate induced dehydration reactions (Mitsunobu reaction). The central role of pentavalent phosphorus intermediates. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104 (24), 6876-6877. 59. Jones, J. Amino Acid and Peptide Synthesis; Oxford University Press: 2002. 60. Hradil, P.; Jirman, J. Synthesis of 2-aryl-3-hydroxyquinolin-4(1H)-ones. Collect. Czech. Chem. Commun. 1995, 60 (8), 1357-1366 - 62 - Mgr. Barbora Lemrová, Ph.D. Mgr. Veronika Fülöpová Praktické aspekty syntézy na pevné fázi Výkonná redaktorka prof. PaedDr. Libuše Ludíková, CSc. Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová Technická redakce autor Grafické zpracování obálky Jiří Jurečka Publikace ve vydavatelství neprošla technickou ani jazykovou redakční úpravou. Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci Křížkovského 8, 771 47 Olomouc www.vydavatelstvi.upol.cz www.e-shop.upol.cz [email protected] 1. vydání Olomouc 2015 Ediční řada – Skripta ISBN 978-80-244-4536-6 Neprodejná publikace vup 2015/0160
Podobné dokumenty
Ze života společnosti Odborná setkání
Střípky a klípky o světových chemicích
považoval za morální použít stejné či podobné výsledky
k získání dvou titulů a až do smrti zůstal jen kandidátem
věd, což je zvláštní, protože mohl získat DrS...
Zajímavé experimenty - RNDr. Renata Šulcová, Ph.D.
aktuální otázky spojené s chemií (např. recyklace odpadů, znečištění životního prostředí,
alternativní pohonné hmoty, vlastnosti biopaliv a další), nebo takových experimentů, které
seznamují žáky s...
Published by
16th International Bratislava Meeting on Polymers.
Workshop/Conference. – Bratislava (SK), September 9-13, 2001.
In: 16th International Bratislava Meeting on Polymers. Coupled,
Hyphenated and Multi...
Zajímavé experimenty
aktuální otázky spojené s chemií (např. recyklace odpadů, znečištění životního prostředí,
alternativní pohonné hmoty, vlastnosti biopaliv a další), nebo takových experimentů, které
seznamují žáky s...
Liší se filozofií, přístupem
Studium dynamického chování směsi H 2 O/D 2 O pomocí NMR
Motivace a cíle práce
Voda je nejvíce zastoupenou látkou na planetě Zemi. Její význam pro život je zcela
zásadní. Spolu se zemskou atmosférou vytváří základní podmínky pro existenci života a je tak...
SYNTÉZA PEPTID Ů NA PEVNÉ FÁZI A KOMBINATORIÁLNÍ
Pokud se nám nepodaří nalézt podmínky k překonání obtížného místa v sekvenci kondenzací individuálních aminokyselin, musíme přistoupit k alternativě připojení malých fragmentů, případně k přípravě
...
4. Isomerie - Katedra organické chemie
setkáváme se zde na jedné straně takřka s nepřekonatelnými potížemi, na druhé straně však
známe sloučeniny, které na svůj isomer přecházejí snadno a někdy velmi snadno. Takovou
isomerii pak označuj...
o stavbě chromosomů zpřesnily analýzu genomu současně se zvýšenou rozlišovací možností analýzy, jak
uvádíme dále.
Metody hodnocení chromosomů
Základní metodou hodnocení chromosomů je jejich
studium...
