GBM Antibodies

REAGENCIE/ MATERIÁLY
GBM Antibodies
MPS
Not for use in the USA
| 12x8
Proužky mikrotitrační destičky
12 proužků × 8 jamek (pro 96 stanovení, Art. No. 13396),
pokrytých lidským rekombinantním alfa-3-řetězcem kolagenu typu
IV, obal obsahuje sušidlo
Enzyme Immunoassay
PRO UŽITÍ V „IN VITRO“ DIAGNOSTICE
NÁVOD K UŽITÍ
CAL
PŘEDPOKLÁDANÉ UŽITÍ
Varelisa EIA kit pro stanovování protilátek proti GBM je navržen pro semikvantitativní a
kvalitativní stanovení protilátek proti GBM – komponentě bazální membrány glomerulu
(alfa-3-řetězci kolagenu typu IV) v séru nebo plazmě, jako podpora diagnózy onemocnění
ledvin.
CONTROL | +
SOUHRN A ZÁKLADY
Protilátky proti bazální membráně glomerulu (GBM) ledvin jsou jedním ze tří specifických
kriterií pro diagnózu tzv. Goodpasture syndromu. Zbývající dvě kriteria hodnocení tohoto
orgán-specifického onemocnění jsou rychle postupující glomerulonefritida a krvácení do
plic1. U vzorků renálních biopsií pacientů trpících Goodpasture syndromem jsou při přímé
imunofluorescenci typickým nálezem lineární deposity IgM na GBM. Vedle Goodpasture
syndromu mohou být s protilátkami proti GBM spojeny i další autoimunitní onemocnění
- jako např.ANCA vaskulitidy a další onemocnění zahrnující glomerulonefritidu 2,3,4.
Protože protilátky proti GBM jsou silně potogenní a mohou poškozovat bazální membránu glomerulů ledvin, jejich přítomnost znamená pro pacienta vysoké nebezpečí akutního
selhání ledvin. Proto je stanovení protilátek proti GBM významné nejen pro diagnostikování Goodpasture syndromu, ale také u pacientů s glomerulonefritidou, pozitivními ANCA
protilátkami nebo čekajícími na transplantaci ledvin1. Antigenem rozpoznávaným GBM
protilátkami je alfa-3-řetězec kolagenu IV.typu, kolagenový řetězec vyskytující se takřka
výlučně jen v bazaální membráně ledvin a plic 5. Protože jsou protilátky namířeny proti
epitopům tzv. „nekolagenní“ domény, které jsou skryty uvnitř nativní struktury proteinu je
třeba užívat pro detekci GBM protilátek antigen denaturovaný. Toho lze obtížně dosáhnout v nepřímé imunofluorescenci, což způsobuje nízkou citlivost této metody.ELISA testy
(s čištěným antigenem) tímto nedostatkem netrpí a jsou vhodnou volbou 6. Pro vyloučení
falešně pozitivních výsledků způsobených protilátkami proti jiným než alfa-3- (IV) kolagenovým řetězcům používáme v soupravě Varelisa GBM Antibodies vysoce čištěný lidský
rekombinantní antigen získaný z Baculoviru.
PRINCIP METODY
Varelisa GBM Antibodies je nepřímý nekompetitivní enzymo- immuno test pro kvalitativní
nebo semikvantitativní stanovení protilátek proti komponentě bazální membrány glomerulu (alfa-3-řetězci kolagenu typu IV) v lidském séru nebo plazmě. Jamky mikrotitrační
destičky jsou pokryty lidským rekombinantním alfa-3-řetězcem kolagenu typu IV. Protilátky
specifické proti němu přítomné ve vzorku se na tento antigen naváží. Ve druhém kroku
se na komplex antigen-protilátka naváže druhá, značená protilátka (konjugát), čímž se
vytvoří enzymem značený komplex konjugát-protilátka-antigen. Tento komplex působí na
přidaný substrát a výsledkem je barevný roztok. Rychlost uvolnění barvy z chromogenu je
funkcí množství konjugátu navázaného na protilátky a je proto úměrné výchozí koncentraci příslušných protilátek ve vzorku séra nebo plazmy pacienta.
133-01 / CZ
CD V006
CONTROL
| -
Kalibrátor
6 lahviček s kalibrátory pro GBM protilátky o koncentracích 0 - 3
- 7 - 16 - 40 - 100 U/ml v PBS obsahujícím BSA, 0.095% (w/v) azidu sodného, detergent a lidské sérum, v množství 1,5 ml v každé
lahvičce, k okamžitému užití
Pozitivní kontrola
1 lahvička (červené víčko) pufru obsahujícího, 0.095% (w/v) azidu
sodného, detergent a lidské sérum, 1,5 ml, k okamžitému použití
Negativní kontrola
1 lahvička (červené víčko) pufru s BSA, obsahujícího 0.095% (w/v)
azidu sodného, detergent a lidské sérum, 3.5 ml, k okamžitému
použití
BUF | WASH | 20x Koncentrát promývacího pufru
1 lahvička 20x PBS koncentrátu obsahujícího 0.095% (w/v) azidu
sodného a detergent, 75 ml
DIL | SPL
Koncentrát ředidla vzorku
1 lahvička 5x PBS koncentrátu obsahujícího BSA, 0.095% (w/v)
azidu sodného a detergent, 100 ml (zbarveno žlutě)
CONJ | IgG
IgG HRP konjugát
1 lahvička konjugátu proti lidskému IgG značeného HRP
(křenovou peroxidázou) , 20 ml (zbarveno červeně), k okamžitému
užití, NEZMRAŽOVAT!
SUBS | TMB
Substrát TMB
1 lahvička TMB (3, 3‘, 5, 5‘ tetramethylbenzidin), 20 ml,
k okamžitému užití
SOLN | STOP
Stop roztok
1 lahvička 0.5 M H2SO4, 20 ml (bezbarvá), k okamžitému užití
Rámeček na proužky
Příbalový leták
Kontrolní certifikát
UPOZORNĚNÍ A PŘEDPOKLADY
• Pro In Vitro diagnostiku.
• Nelze použít vnitřně ani zevně u lidí ani zvířat.
• Neužívejte reagencie po uplynutí doby jejich použitelnosti.
• Nutno přesně dodržovat pracovní návod.
• Tato souprava obsahuje reagencie vyrobené ze součástí lidské krve.
• Suroviny byly imunochemicky testovány na HBsAg, protilátky proti HIV 1 a HIV 2 a
proti viru hepatitidy C - vsechny testy byly negativní. Přesto je třeba dodržovat všechna
bezpečnostní opatření platná pro práci s krevními deriváty. Dodržujte, prosím, HHS
Publication no. (CDC) 93-8395 nebo místní či národní pokyny pro bezpečnou práci v
laboratoři.
GBM
• VAROVÁNÍ! Kalibrátory, kontroly a pufry obsahují azid sodný (NaN3) jako ochrannou
látku. NaN3 může být toxický při požití nebo absorpci pokožkou či oční sliznicí. NaN3
může reagovat s olověným nebo měděným potrubím za vzniku vysoce explozivních
azidů kovů. Abyste zabránili vzniku těchto azidů, promývejte zařízení použité k likvidaci
uvedených roztoků velkým množstvím vody. Řiďte se, prosím, pokyny pro dekontaminaci dle CDC nebo lokálních či národních předpisů.
• Stop roztok obsahuje 0.5 M kyselinu sírovou. Kyselina sírová je jedovatá a korozivní
a při požití může být toxická. Zamezte kontaktu s pokožkou nebo oční sliznicí, abyste
zabránili poleptání.
• Při práci s dodávanými reagenciemi užívejte vhodné osobní ochranné prostředky.
• Dodržujte běžná opatření pro práci s nebezpečnými látkami a likvidujte je dle místně
platných předpisů.
Poznámky
• Doporučuje se provádět stanovení u kalibrátorů, pozitivní kontroly, negativní kontroly a
naředěných vzorků v duplikátech.
• Stanovení lze provést jako kvalitativní nebo kvantitativní. Je-li požadován kvantitativní
výsledek, je třeba změřit úplnou kalibrační křivku. Pro kvalitativní výsledky je třeba změřit
pouze negativní a pozitivní kontrolu.
• Neslévejte konjugát, kalibrátory nebo kontroly různých šarží.
• Před započetím práce musí být všechny reagencie zahřáty na teplotu laboratoře.
• Všechny inkubace se provádějí za laboratorní teploty 18–25 °C (64–77 °F).
• Neúplné nebo neúčinné promytí jamek povede k nedostatečné přesnosti.
SKLADOVÁNÍ
• Opakované zamražování a rozmražování vzorků pacientů může způsobit nesprávné
výsledky.
Soupravu skladujte při 2–8 °C (35–46 °F) v originálním obalu až do okamžiku použití.
Soupravu použijte před uplynutím data uvedeného na nálepce.
Pipetting Format
POŽADAVKY NA VZORKY
Stanovení může být provedeno ve vzorcích séra nebo plazmy. Lipemické, hemolyzované
nebo mikrobiologicky kontaminované vzorky mohou dávat špatné výsledky a neměly by
být používány. Vyhněte se opakovanému rozmražování a zamražování vzorků.
Vzorky by měly být skladovány při –20° C, rozdělené na alikvoty.
Ředění vzorků: vzorky řeďte v poměru 1 : 101 dodávaným ředidlem.
POSTUP
Materiály nutné, nikoli však dodávané
• Čtečka mikrotitračních destiček umožňující měření OD při 450nm
• Destilovaná nebo deionizovaná vody
• Nádoby na naředěný promývací pufr a ředidlo vzorků (2 l a 100 ml)
• Mikropipety (10, 50, 100, 1000 ul) nebo multipipeta
Příprava reagencií a vzorků
Promývací pufr:
Pro jednu destičku: k 75 ml Wash Buffer Concentrate přidat 1425 ml destilované nebo
deionizované H2O.
Pro jeden proužek: ke 2 ml Wash Buffer Concentrate přidat 38 ml destilované nebo deionizované H2O. Naředěný promývací pufr může být skladován při
2–8 °C (35–46 °F) 2 týdny.
Ředění séra/plazmy:
1 : 101; Příklad: 10 µl vzorku pacienta plus 1000 µl naředěného ředidla vzorků.
Proužky mikrotitrační destičky:
Remove strips to be used from sealed pouch. Immediately reseal pouch containing desiccant with remaining strips and store at 2-8 °C (35-46 °F) until use.
Objemy pro jednotlivé stanovení
Naředěný vzorek
Konjugát
100 µl
100 µl
Substrát TMB
100 µl
Stop roztok
50 µl
133-01 / CZ
CD V006
Kalibrátory: černá.
Kontroly: bílá, značeny +/–.
Pacienti: bílá, číslování 1 – 13 (příklad)
POSTUP TESTU
1. Nařeď sérum/plazmu (1:101).
2. Vyjmi proužky z obalu a upevni je do rámečku.
3. Těsně před použitím jednou promyj jamky promývacím pufrem: Naplň jamky 300 µl
promývacího pufru, ponech jej v nich 20 sekund a odsaj jej
4. Napipetuj 100 µl of kalibrátoru, negativní kontroly a naředěných vzorků pacientů do
správných jamek.
5. Inkubuj 30 minut.
6. Odsaj kapalinu z jamek a promyj je 3x promývacím pufrem (viy postup promývání).
7. Napipetuj 100 µl konjugátu do všech jamek.
8. Inkubuj 30 minut.
9. Odsaj kapalinu z jamek a promyj je 3x promývacím pufrem (viy postup promývání).
10. Napipetuj 100 µl substrátu TMB do všech jamek.
11. Inkubuj 10 minut ve tmě.
12. Napipetuj 50 µl Stop roztoku do všech jamek.
13. Odečti absorbanci (OD) při 450 nm, max. 30 minut po přidání Stop roztoku. Jako
referenční je doporučena vlnová délka 620 nm.
GBM
Postup promývání
Ruční promývání: promyj 3x s 20 sekundovým ponecháním promývacího roztoku v
jamce. Napipetuj 300 µl promývacího pufru do každé jamky a inkubuj 20 sekund. Odstraň
promývací pufr z jamek buď odsátím nebo převrácením a otřepáním destičky nad výlevkou (drž pevně rámeček s proužky!). Odstraň zbytky kapaliny z jamek poklepáním na
suchý filtrační papír. Postup opakuj ještě dvakrát. Užití automatické promývačky musí být
ověřeno podle výsledků získaných ručním promýváním.
Promyj jednou jamky promývacím pufrem: Naplň jamky 300 µl promývacího pufru, ponech jej v nich 20 sekund a odsaj jej.
Kalibrátory CAL , kontroly CONTROL | +
Předředěné vzorky pacientů
CONTROL
| -
Ÿ 30 min
) Odstraň kapalinu ) Promyj 3x jamky
Konjugát
CONJ |
VYPOČET VÝSLEDKU
Kvalitativní vyhodnocení
Pro kvalitativní vyhodnocení vzorků pacientů je třeba následujícím způsobem stanovit
hodnotu ODCut-off:
= ODCalibrator × Faktor
ODCut-off
Hodnota Faktoru pro pozitivní kontrolu je uvedena Certifikátu kontroly, který je v
soupravě.
Příklad:
ODCalibrator =
1.100
Factor
=
0.5
ODCut-off
=
1.100 x 0.5 = 0.550
Výpočet poměru
Pro získání názoru do jaké míry je vzorek pacienta pozitivní, lze pro daný analyt vypočítat
hodnotu poměru. Hodnota poměru pro daný analyt se spočítá následovně:
IgG
Ÿ 30 min
Příklad:
) Discard fluid ) Wash wells 3 times
Substrát
SUBS
| TMB
Ÿ10 min. ve tmě
Stop roztok
Poměr
ODCut-off
ODPatient Sample
Poměr
= ODPatient Sample / ODCut-off
=
0.550
=
1.980
=
1.980 / 0.550 = 3.6
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
SOLN | STOP
Pro hodnocení sér pacientů doporučuje Phadia následující rozmezí:
Hodnocení
Ÿ Během 30 min. odečti absorbanci při 450 nm
–
KONTROLA KVALITY
Nejsou-li dosaženy parametry kontroly kvality, jsou výsledky testu neplatné.
• Hodnota OD pozitivní kontroly musí být vyšší než 0.6.
• Hodnota OD negativní kontroly musí být nižší než 0.2.
• Hodnoty pro negativní a pozitivní kontroly musí ležet v rozmezí uvedeném na kontrolním
certifikátu.
KONTROLY
Kontrolní séra by měla být zařazena v každé analýze, aby bylo zajištěno, že všechny komponenty soupravy pracují správně. Pomocí opakovaných analýz by měly v každé laboratoři
být stanoveny průměrné hodnoty a přípustné rozmezí hodnot pro kontrolní séra.
Vedení záznamů
Je samozřejmým požadavkem SLP zaznamenávat pro každou analýzu čísla šarží a data
naředění použitých komponent.
Semikvantitativně
Kvalitativně
Negativní:
< 7 U/ml
Ratio
±
Nerozhodný:
7-10 U/ml
Ratio
+
Pozitivní:
> 10 U/ml
Ratio
< 1.0
1.0 to 1.4
> 1.4
Výše uvedené hodnoty jsou pouze navržené. Vzhledem k možným rozdílům, které mohou
mezi laboratořemi existovat díky mnoha faktorům – populace, dietní návyky, laboratorní
vybavení, výběr referenčních vzorků atd. – je třeba, aby si každá laboratoř stanovila svoje
rozmezí nebo ověřila použitelnost výše navržených hodnot.
OMEZENÍ METODY
Definitivní klinická diagnóza by neměla být založena na výsledku jediné diagnostické
metody, ale měla by být učiněna pouze lékařem po vyhodnocení všech klinických a laboratorních nálezů.
Řešení problémů
Vysoký blank; možné důvody
ODpozitivní kontrola < 0.6; možné důvody
• nedokonalé promývání
• teplota v laboratoři příliš nízká
•vysoká teplota v laboratoři
• neaktivní konjugát
• špatná kvalita vody
• měříící procedura (tj. nastavení foto-metru)
133-01 / CZ
CD V006
GBM
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Obecně - očekávané hodnoty v normální populaci jsou negativní. Avšak i u zdravé
populace mohou být GBM protilátky nalezeny. GBM protilátky jsou nacházeny převážně
u jedinců s Goodpasture syndromem, s glomerulonefritidou imunologického původu, u
ANCA pozitivních pacientů a pacientů s ostatními autoimunitními onemocněními zasahujícími ledviny2,3,4.
Očekávané hodnoty se mohou lišit i v závislosti na testované populaci. Níže uvedená data
ukazují rozdělení hodnot protilátek proti GBM ve skupině 1004 zdánlivě zdravých osob
testovaných firmou Phadia GmbH, Freiburg, SRN. Skupina obsahovala kavkazský typ s
rovnoměrně rozloženým pohlavím i věkem.
n:
1004
Průměr:
1.0 U/ml
Průměr +2s:
2.3 U-ml
Medián:
0.9 U/ml
95% Percentil:
2.0 IU/ml
CHARACTERISTIKA FUNKCE METODY
Standardizace
standardizace soupravy Varelisa GBM Antibodies assay je
provedena proti lidským IgG proti GBM.
Měřicí rozsahu
0.7 U/ml – 100 U/ml
Analytická citlivost
Mez detekce Varelisa GBM Antibodies assay je 0.7 U/ml
Analytická specificita:
Varelisa GBM Antibodies assay dovoluje stanovení IgG
protilátek proti lidskému rekombinantnímu GBM antigenu.
Přesnost
Vzorek
Pro stanovení přesnosti soupravy byla sledována variabilita ve stanovování 3 stejných vzorků v 5 nezávislých
analýzách. Každý vzorek byl stanoven 14 x v každé
analýze. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí
variační analýzy.
Průměr
Variabilita (CV %)
(U/ml)
Intra-assay
Inter-assay
1
16.1
8.6
3.3
2
40.5
9.4
11.0
3
61.2
10.6
8.7
133-01 / CZ
CD V006
ZÁRUKA
Uváděná data byla získána popsanou metodou. Jakákoli změna postupu, která nebyla
doporučena firmou Phadia GmbH může ovlivnit výsledky. V takovém případě Phadia
GmbH nenese jakoukoli záruku, včetně záruky prodejnosti výrobku a jeho vhodnosti
k použití. Phadia GmbH a její autorizovaní distributoři v takovém případě nebudou
zodpovědni ani za škody nepřímé a následné.
LITERATURA
1. Turner AN, Rees AJ (1998) Anti-glomerular basement membrane disease. In: Pusey CD, Rees AJ (eds)
Rapidly progressive glomerulonephritis. Oxford University Press, Oxford
2. Hellmark T, Niles JL, Collins AB, et al. (1997) Comparison of anti-GBM antibodies in sera with or without ANCA.
J Am Soc Nephrol 8, 376-385
3. Short AK, Esnault VLM, Lockwood CM (1995) Anti-Neutrophil cytoplasm antibodies and anti-glomerular basement membrane antibodies: Two coexisting distinct autoreactivities detectable in patients with rapidly progressive glomerulonephritis. Am J Kidney Dis 26, 439-445
4. Weber MFA, Andrassy K, Pullig O, et al. (1992) Antineutrophil cytoplasmic antibodies and antiglomerular basement membrane antibodies in Goodpasture's Syndrome and in Wegener's Granulomatosis.
J Am Soc Nephrol 2, 1227-1234
5. Kalluri R, Wilson CB, Weber M, et al. (1995) Identification of the alpha3 chain of type IV collagen as the common autoantigen in Antibasement Membrane Disease and Goodpasture Syndrome.
J Am Soc Nephrol 6, 1178-1185
6. Herody M, Bobrie G, Gouarin C, et al. (1993) Anti GBM disease: predictive value of clinical, histological and
serological data. Clin Nephrol 40, 249-255
ßLOTß Číslo šarže
Ä Biologické nebezpečí
'
(
ßIVDß
Skladuj při 2-8°C/35-46°F
Datum exspirace
¿
À
§
&
Obsahuje azid sodný
Obsahuje x stanovení
Čti Návod k použití
Vyrobeno
Pro užití v „in vitro“ diagnostice
Phadia GmbH
) &Munzinger
Straße 7, D - 79111 Freiburg, Germany
Phone: +49-761-47805-0 · Fax: +49-761-47805-120
E-mail: [email protected] / Internet: www.phadia.com
Issued March 2006
© Phadia GmbH, Freiburg, Germany
GBM