Mnohobuněčné kvasinky

Laboratoř buněčné biologie
PROJEKT
Mnohobuněčné kvasinky
Libuše Váchová
ve spolupráci s laboratoří Prof. Palkové (PřFUK)
Do laboratoře přijímáme studenty
se zájmem o vědeckou práci
Kontakt:
[email protected]
Modelový organismus:
kvasinka Saccharomyces cerevisiae
= pekařské droždí
Jednobuněčný eukaryotický mikroorganismus:
Používán jako model pro studium základních buněčných procesů
JEDNOTLIVÉ
KVASINKOVÉ BUŇKY
Kvasinky jsou
studovány na úrovni
jednotlivých buněk ve
třepaných kulturách
Kultivace za
příznivých podmínek
POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE
V původním přirozeném ekosystému se kvasinky
téměř nevyskytují jako jednotlivé buňky.
V přírodě vytvářejí různě složité mnohobuněčné
struktury
Příklady: Kolonie, biofilmy
Jaké možnosti mohou buňkám poskytnout mnohobuněčné struktury ?
Buňky populace mohou
interagovat, komunikovat a
synchronizovat vývoj
JEDNOTLIVÉ
KVASINKOVÉ BUŇKY
Buňky populace mohou
diferencovat a tvořit
specializované formy
POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE
Populace se může lépe
adaptovat na změny prostředí
Populace může být lépe
chráněna před vlivy prostředí
Existují procesy, které jsou specifické pro
mnohobuněčné populace
?
O jaké procesy jde
?
2 typy kmenů
Laboratorní kmeny
S. cerevisiae
Přírodní divoké kmeny
S. cerevisiae
Tvoří hladké
kolonie
vlastnosti shodné
i odlišné
Tvoří kolonie strukturované
Kmeny čerstvě izolované z přírody
Jaká je skutečnost ?
Jaké vlastnosti mají populace kolonie, které
je zvýhodňují ve srovnání se samostatnými
buňkami ?
Laboratorní kmeny
Jsou schopné komunikovat
Signální molekula: amoniak
Jsou schopné adaptovat
svůj metabolismus
Acidic
pH
pH
Alkali
ESR
ROS
ESR
GC
TCA
TCA
TCA
Limitace živin
Aktivní
mitochondrie
(oxidativní
fosforylace)
Ato
Pma1p
H+ATPase
H+
Stressed cells
(acidic phase)
Kolonie na agaru s pH indikátorem
žluté zbarvení – kyselé pH
fialové zbarvení – alkalické pH vyvolané NH3
H+
ATP ADP
NH4+
NH3 + H+
Adapted cells
(alkali phase)
Populace postupně vyčerpá dostupné živiny, zvyšuje
se produkce ROS
amoniak naindukuje v buňkách změny metabolismu,
které jsou výhodné pro další přežití
Buňky jsou schopné
diferencovat v rámci populace
Laboratorní kmeny
Vytvářejí specializované buněčné
skupiny se speciálními funkcemi
Příčný řez kolonií
pozorování
2-fotonovým
konfokálním
mikroskopem
Pohled na kolonii
zespodu
povrch agaru
150 μm
Pouze populace buněk v
zelené oblasti kolonie
produkuje specifický
membránový protein,
který je označen GFP
Žijí v méně příznivých podmínkách
Odlišné vlastnosti ?
Vnitřní struktura kolonie je odlišná
Přírodní kmeny
Jsou pevně přichyceny k podkladu
Laboratorní kmen
Přírodní kmen
100 μm
Příčný řez kolonií
10 μm
Ve spodní části vytvářejí
struktury, jakési „kořínky“
Oválné buňky
laboratorní: celá kolonie
přírodní: jen vrchní část
10 μm
10 μm
Používají dva hlavní typy
ochranných mechanismů
Produkují ochrannou extracelulární hmotu
Přírodní kmeny
Tvořena hlavně polysacharidy
Příčný řez kolonií (38 h)
povrch agaru
100 μm
pohled do povrchových
vrstev kolonie skenovacím
elektronovým mikroskopem
Extracelulární hmota v červené oblasti je málo
propustná
Zabraňuje pronikání nežádoucích látek
Používají dva hlavní typy
ochranných mechanismů
Přírodní kmeny
Produkují a aktivují transportéry
mnohočetné lékové resistence
Konkrétně
Pdr5p a Snq2p
Mohou odstraňovat extracelularní toxické látky
Příčný řez kolonií
Barvení:
ConA/Nile red
povrch agaru
10 μm
100 μm
V povrchové zeleně zbarvené
oblasti kolonie jsou aktivní
transportéry mnohočetné lékové
resistence
Naše představa: Oba mechanismy se doplňují
Transportéry aktivně odstraňují škodlivé látky
přicházející z prostředí a extracelulární hmota
zabrání jejich průniku dovnitř kolonie.
Přírodní kmeny
Populace v kolonii se může nerušeně vyvíjet a
přežívat po dlouhou dobu
METODIKY
• Analýza proteinů (elektroforéza,
imunodetekce, HPLC)
• Analýza enzymů
• Genetické a genové manipulace
• Microarrays - změny exprese genomu
3
6
10
13 17
22
26 31 d
12
19 d
Pma1p
5
Pma1p
[%]
100
BY4742
90
80
70
60
50
ARGININE
40
Pma1p ATPase activity
20
0
5
1600
10
15
nmol/g wet weight
30
[days] 20
BY4742
sok2
1400
1200
1000
800
600
25
peroxisomal catalase Cta1p
20
15
10
5
0
S3
Cta1p
Ctt1p
Cta1p
Ctt1p
S5
S7
S9
S12
S14
SF6
SF7
S19
S21
S25
S28
200
0
cytosolic superoxide dismutase Sod1p
1
0
S32
0
5
10
15
20
25
30 [d]
25
30 [d]
25
30 [d]
GLUTAMINE
350
BY4742
sok2
300
250
200
150
100
50
S3
S5
S7
S9
S12
S14
SF6
SF7
S19
S21
S25
S28
S32
0
Sod1p
nmol/g wet weight
Catalase activity (U/mg)
cytosolic catalase Ctt1p
2
nmol/g wet weight
Superox ide dismutase activity (U/mg)
400
30
0
5
10
15
20
ALANINE
3500
BY4742
sok2
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
METODIKY
• Mikrobiologické techniky
• Konfokální a fluorescenční mikroskopie
(fluorescenční proteiny, barvení)
• Elektronová mikroskopie
METODIKY
• Speciální techniky analýzy kolonií
150 μm
500 μm
Děkuji za pozornost !