P027 Příprava Cox4-1/Cox4-2 knockout modelů pro studium

Komentáře

Transkript

P027 Příprava Cox4-1/Cox4-2 knockout modelů pro studium
P027
Příprava Cox4-1/Cox4-2 knockout modelů pro studium regulace mitochondriální
cytochrom c oxidázy
Čunátová Kristýna, Kaplanová Vilma, Houštěk Josef, Mráček Tomáš, Pecina Petr
Fyziologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4
E-mail: [email protected]
Sekce: Biochemie membrán a bioenergetika
Cytochrom c oxidáza (COX) je multipodjednotkovým terminálním enzymem elektrontransportního řetězce uloženého ve vnitřní mitochondriální membráně. Její úlohou je přenos
elektronů na terminální akceptor - kyslík, který je redukován na vodu. Enzym rovněž přispívá
k tvorbě protonového gradientu přenosem protonů do mezimembránového prostoru. Tento
gradient je dále využíván ATP syntázou k tvorbě ATP. Savčí COX je tvořena
13 podjednotkami, z nichž tři jsou kódovány mitochondriální DNA a zbylých deset jadernou
DNA.
Významnou regulační úlohu hraje největší jaderně kódovaná podjednotka Cox4, která má
dvě tkáňově a vývojově specifické izoformy. Tyto izoformy pravděpodobně vznikly genovou
duplikací a subfunkcionalizací. Existují mezi nimi strukturní odlišnosti, které mohou
ovlivňovat funkci izoforem této podjednotky v rámci regulace COX. Izoforma Cox4-1 je
exprimována ve všech tkáních, zatímco Cox4-2 je u savců ve větším množství detekovatelná
pouze v plicích, srdci a mozku. Ke zvýšení exprese Cox4-2 izoformy dochází ve všech
tkáních za hypoxie, kdy tato „výměna“ izoforem může modulovat tok elektronů COX za
snížené koncentrace kyslíku a předcházet tím vzniku reaktivních forem kyslíku.
Za účelem výzkumu regulační funkce jednotlivých izoforem v rámci enzymu
připravujeme knockout modely (KO) na pozadí HEK293 buněčné linie. Za normoxie
HEK293 buňky obsahují především Cox4-1 izoformu, zatímco za hypoxie dochází k navýšení
exprese Cox4-2 izoformy. Naším cílem je příprava COX4-1KO a COX4-2KO klonů a
následně i COX4-1/2 dvojitých KO klonů, které budou využity ke vložení Cox4-1 či Cox4-2
izoformy s cílenou mutagenezí klíčových aminokyselin pro studium jejich významu in vivo.
KO klony připravujeme pomocí CRISPR CAS9-10A systému (CRISPR CAS9-10A paired
nickase targeted knock-out), který je vhodný pro genomovou editaci lidských buněčných linií,
včetně HEK293. Tato metoda spočívá ve využití párů guide RNA (gRNA), které cílí na exony
genu (early exons), a CAS9-10A nikázy, která vytvoří jednovláknové zlomy obou vláken
DNA mezi specificky nasedajícími gRNA.
Diskutovány budou naše poznatky týkající se fungování COX s chybějící izoformou
Cox4-1 nebo Cox4-2.
Projekt je podporován grantem GAČR 16-13671S.

Podobné dokumenty

System Biosciences ceník 2016

System Biosciences ceník 2016 Extra T7 gRNA PCR primer mix (5 uM) Transfection-ready Cas9 SmartNuclease AAVS1 gRNA Transfection-ready hspCas9-T2A-GFP SmartNuclease mRNA (wildtype Cas9 with GFP marker) Transfection-ready hspCas9...

Více

Téma: Buněčné dýchání Hlavní katabolická dráha – Rozklad živin

Téma: Buněčné dýchání Hlavní katabolická dráha – Rozklad živin v Krebsově cyklu, která slouží jako dopravník pro atomy …… Dýchací řetězec patří z hlediska typu reakce k reakcím oxidoredukčním, tzn. že v reakci jde o přenos……………… Atomy vodíku jsou rozděleny na ...

Více

Jungova diplomka bak

Jungova diplomka bak X chromosom je mimo jiné zajímavý tím, že na něm probíhá specifická evoluce, díky tomu, že se, na rozdíl od autozomů, v populaci nachází v poměru 3/4. Gen Idgf4, který je lokalizován na pohlavním c...

Více

Na Boha si přece „hrajeme“ už dávno

Na Boha si přece „hrajeme“ už dávno „Za úspěšné splnění mimořádného nebo zvlášť významného pracovního úkolu může zaměstnavatel poskytnout zaměstnanci odměnu,“ odvolal se v dopise na

Více

(El) Elektrodialýza

(El) Elektrodialýza Selektivita iontově-selektivních membrán silně závisí na koncentraci solí ve vnějším roztoku. S rostoucí koncentrací dochází ke zvýšení intenzity difúzního toku solí z vnějšího roztoku do prostředí...

Více

Co nového v genetice. „Revoluce" v genetice

Co nového v genetice. „Revoluce odst. 1 Zásah směřující ke změně lidského zárodečného genomu lze provádět u pacientů pouze pro preventivní nebo léčebné účely u závažných geneticky podmíněných nemocí za podmínky zachování jeho při...

Více

Manometr s příslušenstvím ti11 rev A

Manometr s příslušenstvím ti11 rev A Montáž, údržba a bezpečnostní opatření Kompletní informace naleznete v Návodu pro montáž a údržbu (IM-P027-02) dodávaným s výrobkem. Základní montážní doporučení Stejně jako jiné komponenty instrum...

Více