Časopis - Beckman Coulter

Transkript

informační magazín číslo 5 - 2007
AUTOMATICKÝ ANALYZÁTOR
UNICEL® DXC 800 V RUTINNÍM PROVOZU
TŘÍLETÁ ZKUŠENOST SE SMĚRNICÍ O IVD MD
PRŮTOKOVÝ CYTOMETR
CELL LAB QUANTA SC MPL
Akreditace klinických
laboratoří v ČR
Problematika kvality práce laboratorního komplementu a certifikace a akreditace laboratoří nabývají v poslední době na významu. Položil jsem
několik otázek na toto téma našemu přednímu
odborníkovi v oblasti laboratorní medicíny, Prof.
MUDr. Tomáši Zimovi, DrSc. MBA, přednostovi
Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, děkanovi 1. LF UK a předsedovi České společnosti klinické biochemie.
Jaké jsou možnosti prokazovat kvalitu laboratoří?
Řada laboratoří u nás poskytuje kvalitní laboratorní služby včetně konzultační činnosti pro zdravotníky i pacienty. Kvalita jednotlivých činností koncem 20. a na počátku 21. století se prokazuje posouzením nezávislými experty podle určitých standardů
či norem. Ve zdravotnictví obecně se uplatňuje několik přístupů. Jedním z průkazů
kvality laboratorního stanovení je úspěšná účast v externím hodnocení kvality. Dále
to je systém certifikace dle ISO 9001, akreditace dle ISO 15189 případně 17025, dále
je možná akreditace klinických laboratoří popřípadě celých zdravotnických zařízení
systémem JCI standardů, akreditace klinických laboratoří dle CPA standardů (používá
se především v UK) nebo CAP v klinických laboratořích. Tyto přístupy jsou mezinárodní a srovnatelné na celém světě. K nim přistupují systémy s národní platností jako
je audit klinických laboratoří prostřednictvím NASKL nebo akreditace zdravotnických
zařízení SAK (Sdružená akreditační komise).
Jaký je mezinárodní přístup k akreditaci laboratoří?
V zemích EU jsou země, kde je většina laboratoří akreditována (např. skandinávské
státy) dle ISO 17025 a které se dle sdělení kolegů ze Švédska zatím nechystají přejít
na normu 15189. Jiné země se akreditují dle národních standardů jako například
v Holandsku. Ve Velké Británii existují oba způsoby akreditace systémem národního
akreditačního orgánu a samostatně stojící organizace pro akreditaci laboratoří, zde
však došlo k dohodě o propojení obou systémů. Řada laboratoří je akreditována dle
ISO 15189.
Jaká je situace u nás?
U nás byly nejprve laboratoře akreditovány dle ISO 17025. Byly to laboratoře zdravotnických ústavů, následně referenční laboratoře a některá klinická pracoviště. Od
zavedení normy ISO 15189 se klinické laboratoře akreditují podle této normy a počet
těchto laboratoří postupně stoupá a v současné době jich je asi 30.
Jak může lékař rozpoznat kvalitní laboratoř?
Rozlišení laboratoře kvalitní, se kterou by měl lékař či zdravotnické zařízení spolupracovat, od ostatních se může jevit jako obtížné, avšak lze uvést několik základních
kritérií. Jedním ze základních kritérií je schopnost laboratoře poskytovat poradenskou a konzultační službu pro lékaře s informacemi nejen o spektru svých vyšetření,
ale i o ostatních méně častých analýzách. Lékaři by měla laboratoř poskytnout informaci, které analyty vyšetřuje a které předává do jiných laboratoří k vyšetření. Lékař,
pokud spolupracuje s některou laboratoří řadu let, by měl zvážit, zda mu změna
laboratoře, která je někdy nabízena, přinese lepší kvalitu. Klíčovým kritériem je také
rychlost provedení vyšetření pro pacienta. Moderní analytická technika umožňuje
provést většinu laboratorních vyšetření tentýž den, a tak pacient nemusí čekat třeba
2
týden na výsledek. Jedním ze způsobů prokazování
kvality práce v laboratoři je postupné zavádění certifikace dle normy ISO 9001 a akreditace dle ISO 15189
nebo 17025. Jsou také akreditovány celá zdravotnická
zařízení podle mezinárodních standardů.
Jaké myslíte, že jsou základní požadavky
na zdravotnické laboratoře?
Základní požadavky a kritéria pro laboratoře z hlediska
klienta – lékaře, zdravotnického zařízení či pacienta
jsou dostupnost a komplexnost služeb, rychlá odezva
laboratoře, spolehlivost a správnost výsledků, informovanost a konzultace o prováděných činnostech, ale
také analýza stížností a reklamací.
Jak pokračujete v zavádění systémů
kvality na Vašem Ústavu?
Od udělení akreditace dle ISO 17025 v roce 2004 se
řada věcí změnila. Při pravidelných dozorových návštěvách jsme postupně rozšiřovali počet akreditovaných metod nejen v klinické biochemii, ale také v sérologii a molekulární biologii. Začali jsme také
s implementací požadavků ISO 15189 do dalších laboratoří našeho Ústavu.
Na jaře 2007 nás čeká reakreditace. Při stanovení
další strategie v oblasti kvality vycházíme z toho, že
laboratoře v Ústavu jsou různého zaměření. Naším
cílem je implementovat ISO 15189 do laboratoří klinické mikrobiologie a ATB centra, laboratoří klinické imunologie a alergologie a klinicko-biochemické laboratoře v areálu dětské kliniky na Karlově a tím významně
rozšířit počet akreditovaných metod v širokém spektru
laboratorní medicíny. V závislosti na typu laboratoře
budeme zároveň udržovat akreditaci dle ISO 17025,
popř. akreditaci podle obou norem souběžně.
ŠTĚPÁN TINTĚRA
[email protected]
Obsah
Automatický analyzátor UniCel® DxC 800
v rutinním provozu
4
Automatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 je plně automatizovaný,
analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Zkušenosti z ročního provozu analyzátorů UniCel® DxC800 v biochemickém úseku OKBHI NNH.
Šetřte svůj čas...
8
Nabízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické i postanalytické fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzátory Beckman Coulter
řady UniCel (biochemické a imunochemické analyzátory) používají shodné
kompatibilní stojánky na vzorky.
Vidíte do zkumavky?
8
Funkce kontroly kvality a integrity vzorku a polychromatické korekce
analyzátorů UniCel® DxC 600/800
Analýzy bez prostojů
9
Předepsaná údržba pro biochemické analyzátory řady UniCel DxC® Beckman
Coulter aneb kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.
Časopis vydává a distribuuje
IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10
Tříletá zkušenost se směrnicí o IVD MD
Časopis připravují
7. prosince 2006 uplynuly tři roky od data, kdy začala být v členských zemích
EU a EFTA uplatňována Směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických
prostředcích in vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR v den vstupu ČR
do EU 1. května 2004.
Mgr. Jiří Moos, CSc.
Mgr. Pavel Kružík
Mgr. Patrik Šaf
RNDr. Helena Kurzweilová
RNDr. Běla Říčařová, CSc.
Ing. Petr Suchan
Mgr. Markéta Krupařová
Ing. Roman Šandrik, PhD.
Ing. Kateřina Ťuková
Ing. Lukáš Palivec, PhD.
Do časopisu přispěli
Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc. MBA, VFN
RNDr. Štěpán Tintěra
Ing. Ladislava Dubská, Nemocnice Na Homolce
Ing. Miroslav Bischof
Ing. Petr Šmídl
Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., FN Plzeň
Mgr. Pavel Kružík
MUDr. Tomáš Soukup, LF UK Hradec Králové
Mgr. Jiří Moos, CSc.
Ing. Roman Vlček
RNDr. Helena Kurzweilová
Mgr. Hana Machová
Mgr. Markéta Krupařová
Ing. Petr Suchan - titulní foto
11
Diagnostický a prognostický význam
thymidinkinázy (TK) u nádorových onemocnění
12
Průtokový cytometr
CELL LAB QUANTA SC MPL
15
Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou určeny pro výzkumné aplikace.
Kombinují měření objemu buněk Coulterovou metodou, rozptylu světla (Side
Scatter) a fluorescencí na třech fotonásobičích s použitím více zdrojů světla.
Na měření objemu nemá vliv tvar, barva a optické vlastnosti částic.
Stanovení základních biologických
charakteristik v laboratoři tkáňových kultur
18
Buňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty – hovoříme
o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka tak
představuje hmotný, konečný, otevřený a hierarchicky uspořádaný systém,
který je vysoce adaptivní, schopný autoregulace a autoreprodukce
Immunotech a.s. Beckman Coulter
a jeho sponzorská činnost
22
Nina Nováková
Pozvánky na akce
23
Tiskárna
Pozvánka na přehlídku nabídky přístrojů firmy Beckman Coulter, Inspekce rotorů
do ultracentrifug a vysokovýkonných centrifug, Seminář DNA analýza IV
Grafická podoba
REPRO servis s. r. o.
Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5
Náklad čísla
1400 výtisků
Kde se můžeme setkat (březen – červen 2007)
Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech, a.s. formou stánku
3
24
Obr. 1: UniCel® DxC 800,
Beckman Coulter
kem tedy může být najednou v analyzátoru 40
vzorků. Ze vzorkového karuselu jsou vzorky pipetovány do MC a CC části dvěma pipetory. Každý z nich
je opatřen detektorem sraženin. Ihned po napipetování vzorku jsou sektory vysunuty do prostoru,
odkud je lze vyjmout.
MC část (Modular Chemistry)
Automatický
analyzátor UniCel®
DxC 800 v rutinním
provozu
Úvod
Automatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 (obr. 1) je plně automatizovaný analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Na biochemický úsek OKBHI NNH byl tento analyzátor nainstalován v prosinci 2005, v lednu 2006 následovala instalace druhého, stejného typu analyzátoru. Na
analyzátorech se denně zpracovává v rutinním provozu cca 450-500 vzorků sér
nebo plasem, cca 100 vzorků močí a asi 10-15 vzorků mozkomíšních moků, dalších 60-80 vzorků se zpracovává v odpolední a noční pohotovostní službě. Obsluhu každého analyzátoru zajišťuje během řádné pracovní doby 1 laborantka.
Popis analyzátoru
Analyzátor se skládá z následujících částí: sektor pro manipulaci se vzorky, MC
část (Modular Chemistry), CC část (Cartridge Chemistry), reakční karusel, dvojitý reagenční karusel a řídící PC.
Sektor pro manipulaci
se vzorky
Vzorky jsou do analyzátoru vsunovány ve
vzorkových sektorech se čtyřmi pozicemi
pro zkumavky, příp. kepíky. Vstupní pás je
lineární, má prostor pro 25 stojánků a lze jej
napojit na preanalytickou linku. Analyzátor
může být vybaven propichovačem uzavřených zkumavek. Samozřejmou výbavou je
čtečka čárových kódů pro načítání sektorů,
práci s primárními zkumavkami a čtení
čárového kódu na pozadí. V sektorech jsou
vzorky vsunuty pomocí podavače do vzorkového karuselu. Vzorkový karusel má deset
pozic, z toho dvě pro statimové vzorky. Cel-
Obr. 2: MC část
(Modular Chemistry)
V této části se provádějí rychlá statimová stanovení
analytů na elektrodách nebo fotometricky (obr. 2).
MC část umožňuje stanovení Na, K, Cl, Ca (ISE) (obr.
3), glukózy (kyslíkový senzor), albuminu (BCP), celkové bílkoviny (biuret), močoviny (vodivostní elda),
fosforu (fosfomolybdátová metoda) a kreatininu
(alkalický pikrát). Reagenční roztoky jsou dodávány
ve dvoulitrových kanystrech, opatřených čárovým
kódem, v kterém je zakódován název, šarže a objem
(obr. 4). K měření elektrolytů se vzorek ředí pufrem.
Elektrody pro měření draslíku, chloridů a vápníku
jsou opatřeny výměnnými špičkami, které se
v odpovídajících periodách jednoduchým způsobem vymění a jakákoliv jejich další údržba (broušení, leštění apod.) odpadá. Na základě naší roční
zkušenosti lze konstatovat, že životnost jednotlivých membrán je významně delší, než jakou garantuje výrobce. Dalším prvkem, který je v MC části
určen k pravidelné obměně, je glukózový senzor.
V podmínkách naší laboratoře byla životnost senzoru 8 měsíců.
Výsledky měření na MC části jsou k dispozici do
42 sec, pokud je analyzátor v chodu, pokud startuje ze standby, pak jsou výsledky z této části změřeny do 2 minut.
CC část (Cartridge Chemistry) (obr. 5)
V této části analyzátoru probíhají fotometrická
měření. Reagencie pro tuto část analyzátoru jsou
Obr. 5: CC část (Cartridge Chemistry)
Obr. 6: Dvojitý reagenční karusel
Obr. 4: Zásobní roztoky pro MC část
dodávány v reagenčních zásobnících, rozdělených vnitřními přepážkami na tři
oddělené prostory. Zásobníky jsou uchovávány v dvojitém reagenčním karuselu
s kapacitou 59 pozic (obr. 6). Reagenční
karusel je chlazen na 2 – 8 °C. Ve vstupní
části karuselu jsou umístěny dvě čtečky
čárových kódů, každá z nich je určena pro jedno
patro karuselu. Z čárového kódu je, podobně jako
u MC roztoků, načten název a šarže reagencií. Počet
testů je upřesněn po kontrole hladiny roztoků
pomocí senzorů na reagenčních pipetorech. Vzhledem k tomu, že analyzátor je zcela otevřený systém, lze používat i reagencie uživatelské (UDR).
Tyto reagencie je třeba zadávat manuálně z klávesnice řídícího PC. Z reagenčního karuselu jsou roztoky pipetovány do kyvet reakčního karuselu
pomocí dvou reagenčních jehel. Reakční karusel
obsahuje 125 skleněných kyvet s optickou dráhou
paprsku 0,5 cm a výškou 30 mm. Po každém přídavku reagencie nebo vzorku do kyvety je obsah
Obr. 3: ISE modul
kyvety promíchán vysokorychlostním
zlaceným rotačním míchadlem. Míchadla jsou poté omyta a osušena v příslušné mycí cele. Reagenční jehly mají své
mycí stanice umístěny přímo na konci
pipetorů a proces mytí probíhá během
pohybu jehly. Zdvojené reagenční jehly
a časově úsporný způsob mytí umožnily
zkrátit takt analyzátoru na 8 sekund.
Fotometr se skládá z xenonové pulzní
lampy, silikon-diodového pole, monochromátoru a příslušné elektroniky. Jako
doplňkový modul lze požadovat také
modul NIPIA pro imunochemická stanovení.
Promývací stanice kyvet se skládá ze čtyř jehel, zvedacího zařízení a příslušných hadiček. Mycí stanice odsává obsah kyvet po reakci, provádí proplach mycím roztokem a destilovanou vodou a nakonec setření vnitřního
povrchu kyvet stírátkem. Pryžové stírátko je třeba pravidelně kontrolovat, při
opotřebování je nutná výměna. Na našem pracovišti jej měníme přibližně
v intervalu 4 týdnů.
Ovládací prvky analyzátoru
Analyzátor se ovládá prostřednictvím ovládacích tlačítek (RUN, STOP, PRIORITY), základní provozní funkce jsou řízeny prostřednictvím dotykové obrazovky, lze používat i klávesnici a myš.
Software analyzátoru
Software je velice logický, přehledný a snadno pochopitelný.
Hlavní obslužná obrazovka informuje nejen o aktuálním stavu systému
(STANDBY, RUNNING, STOPPED aj.) ale např. i o komunikační aktivitě mezi
analyzátorem a LIS. Zobrazuje obsazenost analyzátoru sektory, včetně přehledu vzorků a fáze jejich zpracování. Podrobná informace o požadovaných
testech u jednotlivých vzorků se zobrazí po kliknutí na příslušný vzorek.
V horní části obrazovky je řada ikon, z kterých vycházejí provozní a progra-
Na základě naší roční zkušenosti lze
konstatovat, že životnost jednotlivých membrán je významně delší,
než jakou garantuje výrobce.
5
Kontrolní vzorek může být v analyzátoru zpracován po manuálním
zadání na sektor/pozici a po výběru
testů, nebo automaticky, pokud jsou
kontrolní materiály označeny čárovým kódem.
movací funkce: programování vzorku, databáze výsledků, přehled reagencií,
databáze kontrol, systém setup, údržba, pokyny a nápověda.
Programování vzorků - optimálním řešením je zpracovávání primárních
zkumavek s čárovým kódem, napojení analyzátoru na LIS a obousměrný přenos dat. Napojení s laboratorním informačním systémem INFOLAB (ing. Paclt
a Mgr. Stávek) je zcela bezproblémové. Manuální programování vyžaduje
zadání stojánku a pozice, ID vzorku, typ vzorku a výběr požadovaných testů.
Je třeba upozornit na to, že posun kurzoru mezi jednotlivými aktivními poli
lze realizovat pomocí myši nebo tabelátorem, nelze použít ENTER. Ze stejné
obrazovky, ze které se programují vzorky, lze manuálně programovat i provedení kontrol, pokud pro ně nepoužíváme čárové kódy. Software na této obrazovce umožňuje dále zadat: RERUN (opakování měření všech nebo vybraných
testů), CLEAR (smazání sektoru, pozice či vzorku), OPTION (např. zadání ručního ředění, umožňuje modifikovat počet opakování vzorku), BATCH (programování vzorků v dávkách), přehled naprogramovaných vzorků aj.
Databáze výsledků – umožňuje vyhledat, zobrazit a tisknout pacientské
a kontrolní výsledky dle zvoleného kritéria. V paměti systému může být uchováno max. 150 000 výsledků. Po naplnění této kapacity začíná systém chronologicky přepisovat nejstarší výsledky. V této databázi lze také vyvolat
k výsledkům odpovídající graf absorbance v závislosti na čase (ABS). To je
vhodná pomůcka při odstraňování problémů u dokončených výsledků
metod.
Systém setup (nastavení systému) – zahrnuje 29 funkcí nastavení systému.
Mnohé z nich se nastavují jen jednou, při instalaci systému (např. datum/čas,
jazyk, alarm, výběr jednotek
u originálních metod, nastavení
Obr. 7: Inventura reagencií CC části
čárového kódu, komunikace
s LIS aj.), nebo se jejich nastavení nemusí vůbec provést (např.
zadání hesla, kterým je možno
chránit některé funkce analyzátoru). S některými z nich se průběžně pracuje, mění se a doplňují (např. konfigurace nabídky
metod, nastavení panelů, vytvoření programu pro uživatelské
reagencie, nastavení referenčních/kritických rozsahů u metod
aj.).
Přehled reagencií (vkládání/
kalibrace) - v této části menu
je přehled všech reagencií, které
jsou vloženy v analyzátoru. Pro
reagencie v MC části jsou v přehledu uvedena v % množství
roztoků, která v kanystrech zbývají, dále pak informace o době,
po kterou je reagencie v analyzátoru a kalibrační status. Pořa-
6
dí metod v této části přehledu je fixní. Na dalších
obrazovkách je přehled zásobníků v CC části,
u každého zásobníku je uveden aktuální počet zbývajících testů, exspirace a kalibrační status. Tuto
část inventury lze uspořádat podle požadavků
uživatele, a to podle pořadí v karuselu, podle počtu
zbývajících testů, podle doby exspirace reagencie
nebo kalibrace. V naší laboratoři používáme setřídění podle abecedy, neboť využíváme možnosti
naplnit do analyzátoru více zásobníků pro jednu
metodu a v abecedním seznamu je pak velmi přehledné, kolik testů pro danou metodu máme aktuálně připraveno (obr. 7). Z této obrazovky se také
aktivuje vkládání nového zásobníku a kalibrace
metod. Velkou výhodou je, že vkládání dalších
zásobníků lze provádět za chodu analyzátoru. S MC
reagenciemi jsou spojeny i další roztoky: odpěňovací No Foam a koncentrát mycího roztoku Wash
Concentrate Buffer II (příp. mazivo pro propichovač uzavřených zkumavek) (obr. 8).
Kalibrace: u kalibrátorů na bázi séra je nutné
vložení kalibrační diskety. Pro kalibraci reagencie
je třeba přiřadit kalibrátoru číslo stojánku/pozici
nebo jeho ID. U uživatelských metod musíme pro
kalibrátory vyčlenit příslušný počet pozic v sektorech. Kalibrace uživatelských metod, na rozdíl od
originálních metod, nelze sdružovat, přestože je
použit jeden kalibrátor. Pro kalibraci metod stanovení enzymů dle IFCC je k dispozici Enzyme Validator.
Kontrola jakosti – QC menu umožňuje nadefinovat 1-100 kontrolních materiálů názvem
Obr. 9: Grafické
znázornění QC
a šarží. Pro každou metodu se zadává cílová hodnota a směrodatná odchylka. Pro jeden kontrolní
materiál je možné konfigurovat max. 175 metod.
Frekvenci provádění kontrolních měření si určuje
uživatel dle vlastního systému řízení kvality
zavedeného v laboratoři. Hodnoty měření kontrolních materiálů jsou ukládány v databázi analyzátoru a lze je presentovat v podobě numerického přehledu i v grafické podobě (obr. 9).
V sumárním přehledu jsou také uvedeny základní
statistické parametry (počet měření, průměr,
směrodatná odchylka, variační koeficient). Kontrolní vzorek může být v analyzátoru zpracován
po manuálním zadání na sektor/pozici a po výběru testů, nebo automaticky, pokud jsou kontrolní
materiály označeny čárovým kódem. Pro zpracování kontrolních vzorků označených čárovým
kódem je třeba aktivovat funkci Auto Generation
of Control. Při aktivaci této funkce lze také aktivovat funkci Multiple Cartridge. Pokud je tato
funkce aktivována, provádí se kontrolní měření
ze všech zásobníků, které jsou v daném okamžiku
v analyzátoru umístěny. V opačném případě probíhá kontrolní měření u metod, které mají osazeno více zásobníků, jen ze zásobníku, který byl
vložen dříve.
Uživatelsky
definovaná metoda
Analyzátor UniCel® DxC 800 je
otevřený systém, v software (system setup) lze definovat až 100
uživatelských metod pro metodiky endpoint, kinetické, metody
kalibrovatelné i metody nevyžadující kalibraci. Je třeba nastavit následující parametry:
■ název metody (max. 4 alfanumerické znaky)
■ typ reakce (endpoint, kinetika)
■ jednotky, přesnost, směr reakce,
matematický model (lineární,
nelineární)
■ primární vlnová délka (výběr z 10 vlnových délek: 340, 380, 410, 470, 520,
560, 600, 650, 670 nebo 700 nm)
■ sekundární vlnová délka (výběr ze stejných vlnových délek)
■ počet kalibrátorů (0-6), hodnoty kalibrátorů, doba platnosti kalibrace
■ reagenční objemy (celkem 200-327 ul) (dávkování reagencií: čas přidání
vzorku: 0, primární pipetování reagencie: -180 sec, pipetování druhé reagencie: lze od -180 do 738 sec, reálně jsou reagencie pipetovány v 8 sec
intervalech, dávkování třetí reagencie: -172,9 až 738 sec
■ objem vzorku (3-40 ul)
■ časy odečtu pro blank (start:-180 až 1704 s, konec: 180-1720 s)
■ časy odečtu pro reakci (start:1 až 1704 s, konec: 9 až 1720 s)
■ použitelná rozmezí výsledků
■ chybové detekční limity
Údržba
V software analyzátoru je instalován elektronický deník údržby. Je to vhodná
pomůcka pro sledování toho, jaká údržba má být provedena, kdy je nutné ji
provést, a zároveň lze zaznamenat, kým byla údržba provedena. Intervaly
prováděné údržby jsou stanovené pro analyzátor, na kterém se zpracuje cca
400 vzorků denně. Údržba je plánována v následujících intervalech: každý
týden, měsíc, dva měsíce, tři měsíce, čtyři měsíce, šest měsíců.
Velmi se nám osvědčilo skutečně pravidelnou údržbu provádět. Rozhodně
poctivé provádění týdenní, měsíční a dvouměsíční údržby je doporučeníhodné. Výměnu špičky u vápníkové a draslíkové elektrody provádíme dle potřeby.
Také výměna glukózového senzoru je prováděna ad hoc.
Závěr
Na základě zkušeností z ročního provozu analyzátorů Uni®Cel DxC 800 v biochemickém úseku OKBHI NNH můžeme konstatovat, že se jedná o velice
vydařený produkt firmy Beckman Coulter, spolehlivé, robustní a výkonné
zařízení, které si pro snadnou obsluhovatelnost a programovatelnost získalo
oblibu nejen u laborantek, ale i u provozních chemiků v naší laboratoři.
Dodávky reagencií od firmy Immunotech a.s. jsou řešeny obratem, také servisní podpora je na výborné úrovni.
ING. LADISLAVA DUBSKÁ,
OKBHI-NEMOCNICE NA HOMOLCE,
ROENTGENOVA 2, 150 30 PRAHA 5,
E-MAIL: [email protected],
FOTO: VLADIMÍR STUDNIČKA, NNH
Obr. 8: Systémové roztoky
7
Obr. 1
Vidíte do
zkumavky?
Funkce kontroly kvality
a integrity vzorku a polychromatické korekce analyzátorů UniCel® DxC 600/800
Šetřte svůj čas..
abízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické
i postanalytické fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzátory Beckman Coulter řady UniCel® (biochemické a imunochemické
analyzátory) používají shodné kompatibilní stojánky na vzorky (obr. 1).
Do těchto stojánků lze současně vkládat primární i sekundární zkumavky a různý typ materiálu (sérum, plasma, moč, likvor). Biochemické
a imunochemické vzorky se vkládají do stojánků přímo bez třídění. Stojánky se vzorky se následně centrifugují v centrifuze SPINCHRON DLX. Odpadá
ruční manipulace se zkumavkami před a po centrifugaci. Vzorky ve stojánku se
po centrifugaci přímo vkládají do imunochemického analyzátoru UniCel® DxI
800. Po aspiraci příslušných objemů se stojánky se zkumavkami, které jsou uvolněny z imunochemického analyzátoru, vloží přímo do biochemického analyzátoru UniCel® DxC. Doba zádrže vzorků v jednotlivých analyzátorech je minimální.
Imunochemický analyzátor UniCel® DxI 800 uvolní stojánek se 4 zkumavkami
do 2 minut, biochemický analyzátor
uvolní stojánek po 10 minutách.
Biochemický analyzátor UniCel® DxC
může být vybaven automatizovaným
propichováním uzávěrů (Obr. 2).
Odpadá manuální odstranění zátek
u statimových i rutinních vzorků.
Analyzátory Beckman Coulter lze
napojit na řídící SW DataManagement
REMISOL 2000, který komunikuje
s LIS/NIS jen jedním napojením. Systém umožňuje aktivně sledovat vzorek v reálném čase, vyhodnocovat
kontrolní vzorky, provádět autovalidaci výsledků podle analytických a lékařských kritérií a další řadu funkcí.
Redukuje se pracnost, šetří se čas
a zvyšuje se kvalita vydávaných výsledků a bezpečnost práce. Snižuje se celkový čas TAT.
MIROSLAV BISCHOF
[email protected]
Obr. 2
8
Každý vzorek při zapnutí této funkce je automaticky analyzován za účelem zjištění hemolýzy, ikterických vzorků a lipémie. V protokolu výsledku
jsou zahrnuty numerické hodnoty (indexy) pro
relativní koncentrace (rozsahy) uvedených interferencí. Hodnoty jsou automaticky odesílány přímo do LIS či do SW DataManagement REMISOL
2000, kde lze nastavit pravidla pro další analytické či lékařské automatické hodnocení (autovalidaci) výsledků. Hodnoty se tisknou v pacientském
protokolu pod oblastí pro speciální výpočty. Funkce Auto Serum Index slouží pro účely posouzení
integrity vzorku; hodnoty nemají diagnostický
význam.
Pro měření se používá reagencie DIL1, která je
v analyzátoru a vkládá se jako ostatní reagencie.
Analyzátor změří vzorek s reagencií při 5 různých
vlnových délkách 340, 410, 470, 600 a 670 nanometrů a vyhodnotí automaticky příslušný index
pro hemolýzu (hemoglobin), ikteritu (bilirubin)
a lipémii.
Vzorky jsou shodné jako pro rutinní stanovení.
Doporučuje se čerstvé sérum nebo plasma, které
je odděleno co nejdříve od červených krvinek.
Doporučený limit je do dvou hodin. Oddělené
sérum nebo plasma se nemá skladovat déle než 8
hodin při teplotě +15 °C až +30 °C. Pokud nejsou
měření provedena do 8 hodin, sérum nebo plasma
se může skladovat při teplotě +2 °C až +8 °C.
Pokud nejsou měření provedena do 48 hodin nebo
Funkce kontroly kvality a integrity vzorku
umožňuje obsluze pracovat s primárními či
sekundárním zkumavkami v plně automatizovaném režimu, bez
nutnosti manuální
vizuální kontroly.
budou vzorky skladovány déle než 48 hodin, musí
být vzorky zamraženy a uchovány při -15°C až 20°C. Zamražené vzorky se mohou po rozmražení
analyzovat jen jednou.
Analýzy
bez prostojů
Předepsaná údržba pro biochemické analyzátory řady UniCel® DxC Beckman Coulter aneb
kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.
Polychromatické korekce
Systém dále provádí automatickou polychromatickou korekci pro eliminaci vlivu analyzátoru,
vzorku (př. interference), reagencie, chromoforu.
Používá měření absorbance chromoforu při více
vlnových délkách.
Shrnutí
Funkce kontroly kvality a integrity vzorku umožňuje obsluze pracovat s primárními či sekundárním zkumavkami značenými čárovým kódem/bez
kódů v plně automatizovaném režimu, bez nutnosti manuální vizuální kontroly stavu kvality
séra či plasmy a zcela eliminovat subjektivní hodnocení obsluhou. Snižují se tím náklady, šetří se
čas, neopakují se měření, minimalizuje se možnost vydání výsledků ovlivněných jednotlivými
interferencemi. Způsob zpracování vzorků je
standardizovaný a poskytuje vždy stejně kvalitní
výsledky.
Údržba jakéhokoli biochemického analyzátoru je nezbytná pro zajištění stálé připravenosti systému pro optimální měření a provoz a redukuje tím zároveň i servisní zásahy. Každý výrobce doporučuje optimální postupy údržby a jejich frekvenci tak, aby zajistil nejvyšší kvalitu měření a stálou připravenost systému pro
měření. Každá údržba vyžaduje svůj čas a příslušný zásah obsluhy. Četnost údržby
dále závisí na vytíženosti systému v čase a počtu zpracovávaných vzorků.
Všechny analyzátory Beckman Coulter jsou vyvíjeny pro zjednodušení
a minimalizaci údržby a zvyšují produktivitu a automatizaci celého laboratorního procesu zpracování vzorku. Analyzátory Beckman Coulter UniCel® DxC
vyžadují minimální údržbu a jejich design byl navržen pro maximální komfort
obsluhy. Byl také zohledněn požadavek na minimální čas pro zajištění správné
funkce a udržení funkčnosti systémů při plném zatížení v klinickém provozu.
Ovládací software je navržen tak, aby automaticky sledoval a vyhodnocoval
jednotlivé kroky údržby.
Uvádíme specifické frekvence údržby a průměrný čas potřebný pro každou
údržbu analyzátorů UniCel® DxC 600 a 800. Frekvence je odvozena od průměrného zpracování 400 vzorků za jeden den. V tabulce je uvedeno množství času,
které stráví obsluha při provádění údržby. Všechny uváděné hodnoty jsou
v minutách a vteřinách.
MIROSLAV BISCHOF
[email protected]
Denní údržba
Není požadována.
Týdenní údržba
Údržba 1 x za týden
DxC 600
DxC 800
Kontrola reagenčních tras
0:25
0:25
Výměna stírátka kyvet
1:20
1:20
-
3:30
Čištění povrchu dávkovacích jehel
2:20
2:20
Čištění průtokové cely a modulů
1:20
1:20
Čištění dávkovací jehly CC
(čas do tisku protokolu)
0:30
0:30
Kontrola chloridové kalibrační
hodnoty SPAN
0:40
0:40
Celkový čas údržby 1 x za týden
6:35
10:05
Čištění modulu ALBm a TPm
Systém monitoruje provádění
údržby (kdo, kdy, historii) a zobrazuje dobu do další údržby či počet
vzorků, které lze analyzovat do
další údržby.
9
Měsíční údržba
Procedura
Čištění měřících modulů (MC)
Čištění elektrody BUNm
DxC 600
DxC 800
3:35
3:55
-
6:20
Čištění mixérů
0:30
0:30
Kalibrace lamp modulů a senzorů
0:10
0:10
Celkový čas měsíční údržby
4:15
10:55
DxC 600
DxC 800
6:00
6:00
Údržba každé dva měsíce
Procedura
Výměna ostří propichovadla zátek
(jen s CTS fcí) *
Kontrola/výměna vzduchových filtrů
1:30
1:30
Celkový čas procedur každé 2 měsíce
7:30
7:30
* Jen pro analyzátory verze PRO vybavené funkcí propichování
uzávěrů zkumavek (Close Tube Sampling).
Periodická údržba
Procedura
DxC 600
DxC 800
Výměna injekčního pístu
5:30
5:30
Celkový čas procedur každé tři měsíce
5:30
5:30
Vyčištění reagenčních tras MC modulu
8:00
24:50
Celkový čas procedur každé čtyři měsíce
8:00
24:50
Výměna špičky CALC elektrody
5:30
5:30
Výměna špičky K elektrody
5:30
5:30
Výměna AccuSense™ Glucose
Oxygen sensoru
5:10
5:10
16:10
16:10
KAŽDÉ TŘI MĚSÍCE
KAŽDÉ ČTYŘI MĚSÍCE
KAŽDÝCH ŠEST MĚSÍCŮ
Celkový čas procedur každých šest měsíců
Neměníme lampu u fotometru. Garantujeme životnost minimálně 5 let.
Shrnutí
Uvedené údaje prokazují reálnou úsporu času nutnou pro údržbu a připravenost analyzátorů řady Unicel® DxC. Výrazně se snížil čas na údržbu a přípravu
systému pro provoz a reálný „postkalibrační čas“. Denní údržba se zcela zrušila.
Potřebný čas na týdenní údržbu se zredukoval na 6 minut 35 vteřin u analyzátoru DxC® 600 a 10 minut 5 vteřin u analyzátoru DxC® 800.
Část údržeb je plně automatizována. Systém monitoruje provádění údržby
(kdo, kdy, historii) a zobrazuje dobu do další údržby či počet vzorků, které lze
analyzovat do další údržby.
Snížily se předvším nároky na zaškolení a připravenost obsluhy. To vše přináší snížení nákladů, snížení prostojů analyzátorů a obsluhy a celkové snížení TAT
laboratoře.
Nečekáte na výsledky. Měříte, kdy potřebujete.
MIROSLAV BISCHOF
[email protected]
10
Partner
klinických
laboratoří
www.beckman.cz
e skutečnosti k tomu došlo s nepatrným zpožděním 7. července 2004
ve formě nařízení vlády č. 453/2004
Sb. Je nemalou zásluhou tehdejšího
předsedy asociace CZEDMA a vedoucího
pracovníka Immunotech a.s., že díky jeho
expertní spolupráci s legislativním odborem
MzČR při tvorbě české transpozice máme k dispozici právní předpis bez závažných omylů, chyb
a nejasností.
Řada uživatelů IVD MD očekávala, že výrobky
označené CE budou, podobně jako Tornádo Lou
z Limonádového Joe, „jiné, lepší!“. Byli pak do jisté
míry zklamáni, neboť tomu tak na první pohled
nebylo. Jaká ovšem byla a je skutečnost? Zůstaneme-li u literární nadsázky, pak tyto výrobky,
řečeno Cyranem, „uvnitř tají elegance květ“. Co je
tím míněno? Aby mohl výrobce prohlásit výrobek
za shodný, musí splnit řadu podmínek daných
Směrnicí, jako jsou:
■ aplikace relevantních harmonizovaných norem,
■ vypracování přesně definovaného souboru
technické dokumentace, návaznosti na mezinárodně uznávané referenční materiály nebo
referenční metody, označování výrobků,
■ poskytování přesně stanovených informací
uživateli
■ a jedna z nejdůležitějších podmínek - ověření
funkční účinnosti výrobku.
V neposlední řadě Směrnice ukládá výrobcům
zavést a udržovat systém úplné poprodejní sledovatelnosti výrobků a zavádí dozor nad kvalitou
IVD MD a bezpečností jejich
používání. V rámci tohoto dozoru
je výrobce povinen informovat
uživatele, a v řadě případů i státní
orgány dozoru v zemích EU a EFTA, o rizicích nežádoucích příhod
spojených s použitím určitého IVD
MD, o přijatých nápravných opatřeních a o jejich výsledcích.
Nejdůležitější změnou kvality
v případě shodného IVD MD je
však skutečnost, že Směrnice jasně stanoví, že výrobce přebírá
plnou odpovědnost za správnou
funkci IVD MD, dodržel-li uživatel
pokyny výrobce k jeho skladování
a použití.
Proč je stále třeba, více než tři
roky po uvedení Směrnice v život,
hovořit o omylech s ní spojených?
Jedná se zejména o některé, stále
se opakující požadavky uživatelů
Tříletá zkušenost se
směrnicí o IVD MD
7. prosince 2006 uplynuly tři roky od data,
kdy začala být v členských zemích EU a EFTA uplatňována Směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in
vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR
v den vstupu ČR do EU 1. května 2004.
ohledně dokumentace poskytované výrobci. Velmi často jsou vyžadovány
dokumenty, které v rámci platné legislativy vůbec neexistují – certifikát
(značky) Nepotvrzení o značce CE, prohlášení o tom, že výrobky splňují
předpisy pro použití při poskytování zdravotní péče apod. Žádný takový
dokument není Směrnicí ani NV 453 definován. Navíc Směrnice nezná pojem
distributor, nýbrž pouze výrobce a jeho oprávněný zástupce v případě, že
sídlo výrobce není v jednom ze členských států EU. Pokud tedy není distributor výslovně oprávněn výrobcem jednat jeho jménem v určitých legislativních záležitostech, má jakékoli potvrzení distributora o IVD MD z hlediska
našeho právního řádu pro uživatele pochybnou validitu. Z tohoto důvodu je
Immunotech a.s. společností Beckman Coulter, Inc. zmocněn jednat v ČR ve
smyslu našeho právního řádu jejím jménem.
Dalším zdrojem nedorozumění je vyžadování prohlášení o shodě, někdy
dokonce v ověřeném překladu. Směrnice i NV 453 stanoví, že posoudil-li
výrobce kladně shodu IVD MD s podmínkami Směrnice, je povinen vystavit
ES prohlášení o shodě (EC Declaration of Conformity).
Prohlášení o shodě je interní dokument výrobce, který není určen k uživatelům. Výrobce je povinen jej předložit pouze státním orgánům dozoru a/
nebo notifikovaným osobám, a to nikoli automaticky, nýbrž pouze na
vyžádání v odůvodněných případech. Dále je stanoveno, že se toto prohlášení vystavuje v jednom z úředních jazyků některého členského státu EU.
Metodický pokyn SÚKL ZP-19 z 1. října 2004 jasně stanoví, že prohlášení
o shodě není dokumentem, který by měl mít poskytovatel zdravotní péče
v držení, a dále že dokladem shodnosti
výrobku je pro poskytovatele značka
shody CE.
Dalším
občas
prezentovaným
„mýtem“ je hledání a nalézání vazeb
mezi Směrnicí a některými harmonizovanými normami, zejména normou
pro akreditaci laboratoří – ISO EN
15189 a normou pro poskytované EHK
– ISO EN 14136.
Ve skutečnosti zde žádná přímá ani
mandatorní vazba neexistuje a ani
existovat nemůže. Směrnice je právní
předpis, který je prostě pro výrobce
závazný a tím pádem jsou pro výrobce
závazné všechny harmonizované normy, které jsou na jeho činnost aplikovatelné.
Naproti tomu laboratoř, která se
neřídí normou ISO EN 15189, může
zcela legálně působit v rámci poskytování zdravotní péče. Tím není samo-
11
Je tedy zřejmé, že běžné materiály pro EHK nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD
(zejména správnosti a návaznosti), což také není jejich účel.
zřejmě řečeno, že „zákazníci“ a/nebo plátci nemohou dát přednost laboratoři, která je nějakým průkazným způsobem akreditována nebo certifikována.
Směrnice se nevztahuje ani na poskytovatele EHK, i když se o EHK zmiňuje v tom smyslu, že výsledky EHK přispívají k poprodejnímu sledování IVD
MD, což znamená, že jsou jedním ze zdrojů dat pro výrobce. Rozhodně však
není EHK nástrojem či prostředkem dozoru nad kvalitou IVD MD. Tato role je
legislativně vymezena pouze příslušným statním orgánům a notifikovaným
osobám.
Směrnice stanoví, že materiály (vzorky) používané v EHK nejsou IVD MD,
z čehož přímo vyplývá, že nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD
MD. Je to důsledkem toho, že v jiné části Směrnice se uvádí, že materiály pro
kontrolu kvality IVD MD musí být rovněž IVD MD a musí mít značku CE. Míní
se tím ty materiály pro kontrolu (kontrolní vzorky), které poskytuje uživatelům jako součást soupravy sám výrobce IVD (pak se na ně vztahuje značka CE
soupravy) nebo materiály pro kontrolu jakosti daného IVD (nebo určité, přesně specifikované skupiny IVD MD), které jako takové byly vyrobeny a označeny. Výrobce takovýchto materiálů musí v informaci pro uživatele uvést, pro
jaké, naprosto konkrétní a jasně specifikované výrobky je takovýto kontrolní
materiál určen a ručí za to, že s těmito IVD MD správně funguje. Je tedy
zřejmé, že běžné materiály pro EHK nemohou být používány pro kontrolu
kvality IVD MD (zejména správnosti a návaznosti), což také není jejich účel.
To je možné pouze v těch případech, kdy výrobce takovéhoto kontrolního
materiálu deklaruje, pro jaké systémy (IVD MD) je určen, ověří jeho funkční
způsobilost pro tento účel, vystaví ES prohlášení
o shodě a označí svůj produkt značkou shody CE.
Tento legislativní požadavek není samoúčelný,
nýbrž reflektuje požadavek na přiměřenou komutabilitu kalibrátorů a kontrolních materiálů. O co
se vlastně jedná? Výrobce IVD MD v je povinen
specifikovat, pro jaký typ vzorku je jeho výrobek
určen. Zpravidla se jedná o nativní lidské sérum,
lidskou plazmu, popř. moč či jinou tělní tekutinu.
Je zřejmé, že takovýto požadavek je pro jakékoli
kontrolní vzorky používané v širším měřítku velmi obtížně splnitelný, zvláště uvědomíme-li si, že
v některých, zejména imunoanalytických systémech, mohou být problematické i „pooly“. A to
nehovořím o stabilizaci, lyofilyzaci, mrazení
a podobně. V řadě typů stanovení nemusí být,
a také patrně není, komutabilita kontrolních
materiálů významný problém. Jako příklad je
možné uvést řadu základních parametrů z oboru
klinické biochemie, neboť se jedná o stanovení
jednoduchá (což samozřejmě v žádném případě
nesnižuje význam). Opačným příkladem jsou
imunochemická stanovení, založená na principu
interakce antigenu s jednou nebo dvěma protilátkami. Tato interakce může být významně ovlivněna i malými odchylkami prostředí, ve kterém
probíhá a proto je k hodnocení kvality takovýchto výrobků přistupovat kriticky a obezřetně.
PETR ŠMÍDL
[email protected]
Diagnostický a prognostický
význam thymidinkinázy (TK)
u nádorových onemocnění
Úvod
Enzymatická aktivita thymidinkinázy (TK) je nezbytná pro proces zabudování thymidinu do buněčné DNA. De novo je syntéza thymidinfosfátu katalyzována za normální situace pomocí thymidylátsyntetázy, a to z deoxyuridinmonofosfátu za přítomnosti kyseliny listové a vitaminu B12. Fyziologickou
funkcí TK v organismu je fosforylace thymidinu, při které dochází k přeměně
deoxythymidinu na deoxythymidinmonofosfát, který se v přítomnosti adenozintrifosfátu mění na trifosfátovou formu potřebnou pro syntézu DNA,
čímž je umožněna syntéza DNA náhradní (záchrannou) cestou. Proto se zvýšená produkce TK pozoruje u intenzivně se dělících tkání a TK je považována
za významný marker buněčné proliferace. Cílem studie bylo ověřit diagnostický a prognostický význam TK u nádorových onemocnění.
Materiál a metodika
Thymidinkináza byla měřena pomocí radioreceptorové analýzy (RRA) za užití diagnostické soupravy firmy Immunotech (Praha) (3). Sérové hodnoty TK
byly měřeny u 1087 nemocných s nádorovým onemocněním (355 nemoc-
12
ných s hematologickou malignitou, 732 pacientů
se solidními tumory). Všechny odběry byly provedeny za standardních podmínek z kubitální žíly
v ranních hodinách. Až do laboratorní analýzy
byly všechny vzorky skladovány při -20 °C.
Sérové hodnoty nádorových markerů byly korelovány s klinickým stavem nemocných. Nemocní
s nádory prsu a kolorekta byli systematicky sledováni v průběhu follow up a nádorové markery byly
u těchto nemocných odebírány v pravidelných
intervalech 3-5 měsíců. Diagnostický význam
thymidinkinázy byl retrospektivně vyhodnocen
u 68 nemocných s nádorem prsu a u 48 nemocných s kolorektálním karcinomem, u kterých byla
v průběhu dispenzarizace zaznamenána progrese
onemocnění (lokální recidiva či vzdálené metastázy).
Sérové hodnoty TK a klinické stavy (remise,
progrese) byly nezávisle na sobě vyhodnoceny 2
lékaři. Hodnoty TK byly také stanoveny u kontrolní skupiny probandů (100 zdravých kontrol, 100
nemocných s bakteriální infekcí, 100 nemocných
s imunoalteračním onemocněním). Statistická
analýza (základní deskriptivní statistika, výpočet
specificit a senzitivit) byla provedena pomocí
statistického softwaru S.A.S, verze 6.2.
Výsledky
Tabulka 1 uvádí základní deskriptivní statistiku
hodnot kontrolní skupiny. Výsledky jsou shrnuty
na obrázcích 1 až 4. Obrázek 1 uvádí senzitivity
při 95% specificitě pro hematologické malignity
(56 nemocných leukemií, 68 s Hodgkinovým lymfomem, 36 s non-Hodgkinovým lymfomem, 40
s mnohočetným myelomem a 155 s myelodysplastickým syndromem). Obrázek 2 ukazuje stejné parametry pro předoperační hodnoty u solidních nádorů (300 nemocných s nádorem prsu,
300 nemocných s nádorem kolorekta, 97 nemocných s nádorem děložního čípku a 35 nemocných
s nemalobuněčným plicním karcinomem-NSCLC).
Kromě jednorázového stanovení TK u předoperačních hodnot byly hodnoty TK systematicky
sledovány v průběhu follow up. Na obrázku 3 a 4
jsou uvedeny mediány koncentrací TK a senzitivity TK pro predikci progrese 9, 6 a 3 měsíce před
klinickou manifestací a v době klinické manifestace progrese, která byla prokázána pomocí
vyšetřovacích metod (zobrazovací, endoskopické). Úsečky v grafu vyjadřují minimální a maximální naměřenou koncentraci TK. Obrázek 3 uvádí tyto hodnoty naměřené pro nádory prsu,
obrázek 4 pro nádory kolorekta.
Diskuse
V naší laboratoři se zabýváme systematickým
měřením hodnot thymidinkinázy již od r. 1990
Obr. 1: Senzitivity TK (IU/L) při 95% specificitě
u hematologických malignit (n=355)
Tabulka 1: Základní deskriptivní statistika TK (IU/L)
u kontrolní skupiny
Skupina
N
Medián
Min.-Max.
Zdraví probandi
100
4
1-6
Nemocní s bakteriální infekcí
100
10
4-15
Nemocní s imunoalteračním
onemocněním
40
28
2-56
(4). TK je stanovována především u hematologických malignit (5, 6). Problematikou solidních nádorů se v současné době zabývá omezený počet autorů, většina prací s touto tematikou pochází z let 1994-98 (7, 8, 9, 10). Např.
Thomas a kol. již popsal význam TK u kolorektálního karcinomu a Robertson
a kol. a Kaušitz a kol. popsali korelaci mezi hladinami TK a stadiem onemocnění u karcinomu prsu. Byl také pospán význam stanovení TK v průběhu
follow up (7, 8, 9). Později se výzkum zaměřil více na onkofetální a mucinózní nádorové markery a na význam stanovení TK se téměř pozapomnělo (11,
12, 13, 14, 15).
Na základě výsledků naší studie můžeme konstatovat, že TK je sekundární
diagnostický nádorový marker a primární význam má jen u některých hematologických malignit (4, 5). Na základě našich zkušeností můžeme konstatovat, že hodnoty tohoto markeru korelují se závažností tohoto onemocnění.
Zdá se být velmi dobrým diagnostickým a prognostickým nádorovým markerem pro monitoraci průběhu vývoje onemocnění. Pomocí TK je možno
predikovat progresi nádorového onemocnění 3 měsíce před klinickou manifestací, v některých případech dokonce 6-9 měsíců před klinickou manifestací relapsu. To se zdá být výhodou i přes nízkou orgánovou specifitu, ale na
rozdíl od ostatních nádorových markerů má TK primární význam jako marker buněčné proliferace u nádorových onemocnění (2, 16, 17).
Pomocí thymidinkinázy je možno
predikovat progresi nádorového
onemocnění 3 měsíce před klinickou
manifestací, v některých případech
dokonce 6-9 měsíců před klinickou
manifestací relapsu.
Obr. 2: Předoperační hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při
95% specificitě u pacientů se solidními nádory
13
Obr. 3: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specificitě
pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou
manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0)
u nemocných s nádorem prsu.
Obr. 4: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specificitě
pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou
manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0)
u nemocných s nádorem kolorekta.
Závěr
Thymidinkináza je sekundárním nádorovým markerem, který je užitečný především pro monitoraci follow up nádorových onemocnění. Elevace hodnot
tohoto markeru musí být interpretována vždy při podrobné znalosti klinického stavu nemocného, protože musí být vyloučeny nespecifické elevace sérových hodnot (zánětlivá a imunoalterační onemocnění).
Literatura
1. Chuanjing Wu, Rong-Jiang Yang, Ji Zhou, Shing Bao, Li Zou, Pinggan
Zhang, Yongrong Mao, Jianping Wu, Qimin He. Production and characterisation of a novel chicken IgY antipody raised against C-terminal peptide from
human thymidine kinase 1. Journal of Immunological Methods, 277, 2003,
157-169.
2. Wu J, Mao Y, He L, Wang N, Wu C, He Q, Skog S. A new cell proliferating
marker: cytosolic thymidine kinase as compared to proliferating cell nuclear
antigen in patients with colorectal carcinoma.Anticancer Res 20(6C):481520, 2000.
3. Topolcan O, Holubec L Jr, Finek J, Stieber P, Holdenrieder S, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Lipska L. Changes of thymidine kinase (TK)
during adjuvant and palliative chemotherapy. Anticancer Res. 2005 MayJun; 25(3A):1831-3.
4. Lejcko J., Jungerova J., Topolcan O., Koza V.: Thymidine kinase at malignant
lymphogranuloma and Non-Hodgkin Lymphoma. Prakt. Lék. (Praha), 72,
1992, č. 5, 171-173.
5. Poley S., Stieber P., Nussler V. et al.: Serum thymidine kinase in nonHodgkin lymphomas with special regard to multiple myeloma. Anticancer
Res. 17 (4B) 1997: 3025-9.
6. Christiansen I., Gildlof C., Kalkner K.M. et al: Elevated serum levels of
soluble ICAM-1 in non-Hodgkin’s lymphomas correlate with tumour burden,
disease activity and other prognostic markers. Br J Haematol. 92 (3) 1996:
639-46.
7. Thomas WM, Robertson JF, McKenna PG, O‘Neill KL, Robinson MH, Hardcastle JD. Serum thymidine kinase in colorectal neoplasia. Eur J Surg Oncol.
1995 Dec; 21(6):632-4.
8. Robertson JF, O‘Neill KL, Thomas MW, McKenna PG, Blamey RW. Thymidine
kinase in breast cancer. Br J Cancer. 1990 Oct; 62(4): 663-7.
9. Kausitz J., Kuliffay P., Pecen L. et al.: Correlation of cytosolic concentrations of ER, PS2, Cath-D, TPS, TK and cAMP in primary breast carcinomas.
Neoplasma,41, 1994, 331-336
10. Roman S., Christensen I. J., Chinot O. et al.: Prognostic value of cytosolic
14
thymidine kinase activity as a marker of proliferation in breast cancer. Int.J.Cancer, 61, 1995, 7-12
11. Chester SJ, Maimonis P, Vanzuiden P, Finklestein M, Bookout J, Vezeridis MP. A new radioimmunoassay detecting early stages of colon cancer: a comparison with CEA, AFP, and Ca 19-9. Dis
Markers. 1991 Sep-Oct; 9 (5) : 265-71.
12. Haglund C, Kuusela P, Roberts P, Jalanko H.
Tumour marker CA 125 in patients with digestive
tract malignancies. Scand J Clin Lab Invest. 1991
May; 51 (3): 265-270.
13. Kuusela P, Haglund C, Roberts PJ. Comparison
of a new tumour marker CA 242 with CA 19-9, CA
50 and carcinoembryonic antigen (CEA) in digestive tract diseases. Br J Cancer. 1991 Apr; 63 (4):
636-40.
14. Kornek G, Depisch D, Temsch EM, Scheithauer
W. Comparative analysis of cancer-associated
antigen CA-195, CA 19-9 and carcinoembryonic
antigen in diagnosis, follow-up and monitoring
of response to chemotherapy in patients with
gastrointestinal cancer. J Cancer Res Clin Oncol.
1991; 117 (5): 493-6.
15. Ial‘chenko NA, Lagutin VD, Lavik NN, Musin II.
[The clinical information value of an immunoenzyme study of the tumor markers CA-19-9, CEA
and AFP in cancer of the stomach, pancreas, colon
and rectum] Vopr Onkol. 1991; 37(9-10): 921-4.
16. O‘Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK. Thymidine kinase: diagnostic and prognostic potential.:
Expert Rev Mol Diagn: 1(4): 428-33, 2001.
17. Tanigawa N, Katoh Y, Fujii H, Shimomatsuya T,
Aotake T, Yamakawa M. Prediction of prognosis of
patients with gastrointestinal cancer based on
thymidine uptake. Gan To Kagaku Ryoho. 21 (3):
388-94, 1994.
PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.,
ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY,
FN PLZEŇ, DR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŃ,
E-MAIL: [email protected]
olitelně je možno použít argonový
laser (488 nm) nebo rtuťovou výbojku (excitace při 366, 405 a 435 nm) .
Cytometr QUANTA SC MPL je vybaven
podavačem a aspiruje z destiček různých
formátů (24, 96 nebo 384 jamek) nebo mikrozkumavek. Minimální aspirovaný objem je
25 μL, maximální 300 μL. Software umožňuje
předdefinovat míchání vzorků nebo přidání reagencie přístrojem v objemu 1-250 μL včetně inkubace před aspirací. Aspirační jehla je automaticky
omývána před každou další aspirací vzorku.
Analyzátor je vhodný pro měření absolutních
počtů buněk a stanovení buněčného cyklu, apoptózy, životnosti buněk, měření povrchových a intracelulárních znaků apod.
Pro tyto aplikace jsou vyvinuty kompletní laboratorní postupy včetně přípravy vzorků a nastavení
přístroje:
■ DNA Cell Cycle Analysis with 4’, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) or Propidium Iodide (PI)
Nuclear Stains
■ Evaluation of Cellular Viability with Propidium
Iodide or 7-Amino-Actinomycin D
Průtokový cytometr
CELL LAB QUANTA
SC MPL
Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou
určeny pro výzkumné aplikace. Kombinují
měření objemu buněk Coulterovou metodou,
rozptylu světla (Side Scatter) a fluorescencí na
třech fotonásobičích s použitím více zdrojů
světla. Na měření objemu nemá vliv tvar, barva
a optické vlastnosti částic.
■
Evaluation of Apoptosis with Annexin V and Propidium Iodide or 7-AminoActinomycin D
■ Green Fluorescent Protein (GFP)
■ Measurement of Active Caspase-3 in Apoptotic Cells Using Beckman Coulter‘s
Cell Lab Quanta™ SC
■ Cell Cycle Analysis with Dual Measurement of Cyclin A2 Expression and DNA
Content
■ Determination of P44/42 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Phosphorylation Using the Beckman Coulter Quanta™ SC Flow Cytometer
■ Fluorescence Concentration Measurement Using the Beckman Coulter Quanta™ SC
■ 3-Color Compensation Using Beckman Coulter‘s Cell Lab Quanta™ SC Flow
Cytometr System
■ Enumeration of Mitotic Cells with Dual Measurements of Histone H3 Phosphorylation and DNA Content
■ Cytokine Expression in Serum of Coronary Disease Patients Using the Human
Cardiovascular 7Plex FlowCytomix Multiplex Bead Assay
Souprava Human FlowCytomix Cardiovascular 7plex Multiplex kit (Obj. číslo
BMS711FF) je určena pro stanovení sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, P-selektinu, t-PA
a VCAM-1.
Tyto aplikační listy vám na požádání zašleme v pdf formátu (pkruzik@
beckmancoulter.com). Popsané postupy jsou použitelné i na dalších typech
průtokových cytometrů.
Průtokové cytometry Cell Lab QUANTA SC MPL, QUANTA SC a QUANTA představují ucelenou řadu analyzátorů pro výzkumná pracoviště. Základní verze
cytometru QUANTA, která je vhodná pro laboratoře pracující s tkáňovými kulturami, je vybavena dvěma fotonásobiči, laserem 488 nm nebo rtuťovou lampou, popř. oběma světelnými zdroji současně.
15
Beckman Coulter IOTest® iTox3
Tyto reagencie jsou určeny pro stanovení subpopulací lymfocytů periferní krve,
kostní dřeně nebo lymfatických uzlin laboratorního potkana v kombinaci
IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC (reagencie pro stanovení subpopulací lymfocytů T) a IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC
(reagencie pro stanovení lymfocytů T, B a buněk NK).
IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD4-PC7 / CD8-APC
obj. číslo A32909, 50 testů
CD3
CD4
CD8
klon
1F4
OX-38
OX-8
izotyp
IgM
IgG2a
IgG1
IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD45RA-PC7 / CD161a-APC
obj. číslo A32910, 50 testů
CD3
CD45RA
CD161
klon
1F4
OX-33
10/78
izotyp
IgM
IgG1
IgG1
Obě kombinace konjugovaných monoklonálních protilátek jsou použitelné
na průtokových cytometrech FC 500 s dvěma lasery. Při přípravě vzorků se
používá metoda bez promývání s využitím lyzačního činidla VersaLyse. Po přidání kalibračních partikulí Flow-COUNT Fluorospheres je možné stanovovat
absolutní počty subpopulací lymfocytů.
Tato tříbarevná konfigurace (FITC/PC7/APC) výrazně usnadňuje analýzu na
průtokovém cytometru bez potřeby nastavování kompenzací. Navíc je možné
podle potřeby přidat další monoklonální protilátku značenou PE, např. pro stanovení aktivačních znaků (CD25-PE).
Doplňující reagencie
Reagencie
Klon
Velikost
Obj.číslo
Anti-Rat CD45-PE, IOTest®
OX-1
50 testů
A36700
150 testů
A07704
VersaLyse Lysing Solution
100 testů
A09777
IOTest3 Fixative Solution
100 testů
A07800
Flow-COUNT Fluorospheres
200 testů
7547053
7-AAD Viability Dye
Pracoviště s vysokou kapacitou mohou využít pro
stanovení z plné krve průtokový cytometr FC 500
MPL (Multi Platform Loader). Přístroj v této verzi
automaticky aspiruje z mikrozkumavek s objemem
1,4 ml uložených v držáku pro 96 jamkovou destičku. Pro měření vzorků s větším objemem jsou
vhodné standardní zkumavky 12 x 75 mm v držáku
pro 40 zkumavek.
Automatizovaná příprava
vzorků s Beckman Coulter
Biomek® NXP
Automatizovanou přípravu vzorků je možné zabezpečit pomocí přístroje Biomek® NXP. Tento systém
umožňuje automatické pipetování, ředění a dávkování reagencií a vzorků. Biomek® NXP umožňuje
pracovat s formátem destiček - 96, 384 a také
s běžnými formáty zkumavek. Biomek® NXP lze
dále volitelně doplnit dalším příslušenstvím jako
například detektorem pro měření absorbance, fluorescence a luminiscence DTX 800/880, dále třepačkou, termostatem a případně skladem vzorků.
Využití tak nachází nejen při přípravě vzorků pro
průtokovou cytometrii, ale především pro DNA/
RNA purifikaci, pro PCR a sekvenční clean-up
a další. Biomek® NXP je optimalizován pro přípravu
a purifikaci DNA/RNA reagenciemi Agencourt®.
Nové reagencie pro
průtokovou cytometrii
CD23-PE, IOTest®, PN
A33099
Liquid 2 mL – 20 μL / test
Molekula CD23 je přítomna na lymfocytech B a monocytech. Dále je přítomna na širokém spektru lymfocytů
T, eozinofilech, krevních destičkách,
Langerhansových buňkách a subpopulacích epiteliálních buněk tymu a neutrofilech.
CD5-ECD, IOTest®, PN A33096
Molekula CD5 je přítomna na povrchu zralých lymfocytů T, na povrchu většiny tymocytů a dále
u subpopulace lymfocytů B. Není exprimována na
granulocytech, monocytech ani krevních destičkách.
Antigen CD13 je přítomen na buňkách myeloidního původu včetně neutrofilů, eozinofilů, bazofilů
a monocytů normální periferní krve. Chybí na lymfocytech T a B, erytrocytech a krevních destičkách.
Existuje pět variant molekuly CD13 s odlišnou glykosylací, což vysvětluje odlišné vazebné vlastnosti
různých protilátek CD13.
Monoklonální protilátka 3G8 se váže na FcγRIIIA
a FcγRIIIB.
Schopnost klonu 3G8 specificky vázat CD16 byla
testována v rámci 5. konference o lidských leukocytárních diferenciačních antigenech („5th HLDA
Workshop on Human Leukocyte Differentiation
Antigens“), která se konala v Bostonu v USA, v roce
1993.
Regulační lymfocyty T
V současné době se věnuje velká pozornost stanovení regulačních lymfocytů T (Tregs). Nejčastěji
používaným znakem pro identifikaci této subpopulace CD4+CD25+ lymfocytů T je transkripční faktor
FoxP3. Pro stanovení tohoto znaku je nezbytná
permeabilizace, která je zdrojem metodických problémů. Řada současných publikací se věnuje membránovému znaku CD127, jehož exprese je snížena
na regulačních lymfocytech T ( Liu et al., CD127
expression inversely correlates with FoxP3 and
suppressive function of human CD4+ T reg cells,
JEM, 2006, 203, 7, 1701-1711).
Využití tak nachází nejen
pro přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii, ale především pro DNA/RNA purifikaci, pro PCR a sekvenční
clean-up a další.
CD127 je α podjednotka IL-7R. Molekula je asociována s γ
řetězcem (CD132), který je společný pro IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, and IL-21R.
Nachází se na tymocytech, progenitorech buněk T a B, zralých buňkách T,
monocytech a některých dalších lymfoidních a myeloidních buňkách.
Stanovení regulačních lymfocytů T v kombinaci CD3+CD4+CD25brightCD12
7dim-to-neg Tregs je možné provést monoklonálními protilátkami s různými
fluorochromy:
CD3, IOTest, 100 testů, FITC
A07746
CD127, IOTest, 100 testů, PE
IM1980
CD8, CYTO-STAT, 50 testů,ECD
6604728
CD25, IOTest, 100 testů,PC5
IM2646U
CD4, IOTest, 100 testů, PC7
6607101
CD4, CYTO-STAT, 50 testů, ECD
6604727
CD4, IOTest, 100 testů, FITC
A07750
CoulterCounter.com
V průběhu ledna byly zprovozněny nové webové stránky s názvem CoulterCounter.com. Jsou určeny především uživatelům analyzátorů částic série LS,
RapidVue, N5, SA 3100 a MultiSizer3. Stránky obsahují literaturu, vysvětlení
principů (Coulterův princip, Miova teorie rozptylu světla apod. ) a popis jednotlivých aplikací pro uvedené přístroje.
Pro aplikace v biologii je používán Multisizer3, kterému jsou věnovány články
na téma:
■ Real Time Detemination of Cell Volume Changes of Sperm Used for Cryopreservation
■ Determination of Cell Aggregation in Bacteria Cultures for Contact Lens Disinfection Efficacy Testing
■ Beer, Evaluation of Final Product and Filtration Efficiency
PAVEL KRUŽÍK
[email protected]
Stanovení základních
biologických charakteristik
v laboratoři tkáňových kultur
Soukup T., Rückerová H., Karbanová J., Suchánek
J., Kudrnáčová J., Vlček R., Moos J.
uňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty –
hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka tak představuje hmotný, konečný, otevřený
a hierarchicky uspořádaný systém, který je vysoce adaptivní,
schopný autoregulace a autoreprodukce.
Jednou ze základních vlastností biologického systému je růst.
Růst zahrnuje procesy syntézy jednotlivých stavebních komponent
živého systému a odráží procesy transkripce a translace genetické informace a navazuje na ně. U mnohobuněčných organismů je růst vyjádřen
též proliferační aktivitou buněk. V průběhu ontogeneze je rychlost růstu
proměnlivá a růst navíc souvisí s procesy regeneračními a některými procesy adaptačními.
V podmínkách laboratoří buněčných/tkáňových kultur si denně ozřejmujeme základní charakteristiky růstu studiem růstu individuálních
buněk a buněčných populací. Růst individuální buňky sledujeme přímo
(mikroskopicky) nebo nepřímo (mikrofotograficky či mikrokinematograficky). Růst buněčné populace se obvykle hodnotí pomocí parametrů růstu
odvozených od proliferační aktivity buněk sledované buněčné populace.
Za podmínek statické kultivace je možné růst populace rozdělit do čtyř
fází: 1) Fáze klidová (tzv. lag fáze), 2) Fáze exponenciální, 3) Fáze stacionární a 4) Fáze odumírání. Grafickým vyjádření prvních tří fází je sigmoidální křivka.
„Proč tedy sledovat tzv. základní biologické
charakteristiky?“
Protože získáme lepší kontrolu nad celým procesem dlouhodobé kultivace
buněk v podmínkách in vitro. Díky této nepopulární „matematice v laboratoři“ jsme schopni kvalitně hodnotit použité laboratorní postupy, kultivační média, separační metody, vhodnost/nevhodnost povrchů kultivačních nádob apod. Můžeme hodnotit celou řadu dalších parametrů
Obr. 1 Lidské mezenchymové kmenové buňky
izolované z kostní dřeně (primokultura)
18
ovlivňujících naše in vitro experimenty. Za zcela
klíčové, např. pro laboratoře kultivující kmenové
buňky, považujeme stanovení počtu populačních zdvojnásobení a času potřebného na toto
zdvojnásobení, abychom prokázali neomezený
proliferační potenciál těchto buněk.
Jaké biologické chcarakteristiky
nejčastěji stanovujeme?
Jsou to: 1) Počet buněk, 2) Průměr buněk, 3)
Distribuce průměrů, 4) Trend velikosti buněk
(tzv. size trend), 5) Plating efficiency, CFU, 6)
Počet populačních zdvojnásobení (tzv. No. of
population doublings), 7) Čas potřebný na
zdvojnásobení populace (tzv. doubling time)
a 8) Viabilita.
Metodické přístupy
Pro stanovení výše jmenovaných biologických
charakteristik je samozřejmě nutné patřičné
vybavení. Do jisté míry vystačíme s mikroskopem a „Bürkerovou komůrkou“. Avšak pro reprodukovatelné, přesné a rychlé stanovení je
s výhodou použít některý z analyzátorů buněk
a částic (viz. článek v IVD 3/2006 „Analyzátory
buněk a částic“). Každý z analyzátorů má však
své limity, které budeme demonstrovat dále.
V naší laboratoři pracujeme v zásadě se třemi
typy buněčných kultur (obrázek 1-4): A) Kultury
lidských kmenových buněk rostoucí adherentně,
B) Kultury lidských nádorově transformovaných
Obr. 2 Spontánně transformované lidské stromální
buňky izolované z lymfatické uzliny (40. pasáž)
Obr. 3 Kmenové buňky
zubní pulpy rostoucí ve
formě sfér
Obr. 6 Distribuce průměrů čtyř lidských spontánně
transformovaných stromálních linií
buněk s různými subpopulacemi, a konečně C)
Kultury buněk rostoucí ve formě trojrozměrných
útvarů – sfér.
Jednotlivé buněčné typy je nutné pro analýzu
připravit. Kolonie přisedlé k podkladu musíme
enzymaticky rozvolnit (obrázek 5) a resuspendovat na jednotlivé buňky, které můžeme měřit
podle použitého přístroje v rozsahu velikostí 270 mikrometrů. Buňky rostoucí ve formě sfér
analyzujeme podle potřeby a odhadovaného
průměru buďto vcelku, nebo opět enzymaticky
rozvolněné.
Stanovení počtu, velikosti a distribuce
průměrů patří mezi nejzákladnější charakteristiky. Stanovujeme je vždy (jsou základními
kvantitativními daty pro výpočet dalších charakteristik), a to za pomocí přístrojů Z2 Coulter
a Vi-Cell XR.
Na výsledcích analýzy distribuce průměrů transformovaných stromálních buněk lze demonstrovat
sílu jednotlivých analytických metod. Pomocí Coulterova impedančního principu jsme schopni přesně
analyzovat jednotlivé subpopulace buněčné kultury v rozsahu průměrů 6-28 mikrometrů (obrázek 6).
Informace o životnosti jednotlivých subpopulací
však chybí.
Analýza stejné buněčné populace pomocí
trypanové modři a analýzy obrazu přístrojem
Vi-Cell XR (obrázek 6a) nám sice nepodá tak
přesný pohled na distribuci průměrů, ale doplní
tolik potřebný parametr – viabilitu. Víme tedy
jaké procento buněk je životaschopných a pro
další analýzy a nasazení buněk do nových kultivačních nádob již počítáme pouze s procentem
viabilních buněk.
U buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (např. granulózové buňky z ovariálního folikulu) může při analýze počtu a distribuce průměrů dojít k problému, zejména
použití analýzy obrazu je málo vhodné. Toto
Obr. 6a Distribuce průměrů viabilních, spontánně
transformovaných stromálních buněk (viabilita 95%)
Obr. 7 Distribuce průměrů granulózových buněk měřená
přístrojem Vi-Cell XR.
Obr. 4 Osteoblasty diferencované z kmenových buněk
zubní pulpy, sféra vznikla spontánní sedimentací
Obr. 5 Mezenchymové kmenové buňky 10 minut po
enzymatickém uvolnění od podkladu
19
Obr. 8 Distribuce průměrů granulózových buněk
měřená přístrojem Z2 Coulter.
Obr. 9 Příklad hodnocení trendu velikosti subpopulace
lidských kmenových buněk v průběhu prvních 15-ti pasáží.
Obr. 10 Graf demonstrující kumulaci populačních
zdvojnásobení u tří kultur lidských kmenových buněk.
Kultury MPCs a MPCs/osteoporotic překročily tzv.
Hayflickův limit.
Obr. 11 Graf generační doby tří kultur lidských
kmenových buněk.
20
Stanovení počtu,
velikosti a distribuce
průměrů patří mezi
nejzákladnější charakteristiky. Stanovujeme
je vždy, a to za pomocí
přístroju Z2 Coulter
a Vi-Cell XR.
demonstrujeme na následujících snímcích analýzy granulózových buněk. Jednotlivé buňky
jsme byli schopni hodnotit pouze pomocí impedančního principu přístroje Z2 (obrázky 7, 8).
Populace v rozsahu průměrů 10-20 mikrometrů
zůstala přístroji Vi-Cell skryta.
Nutno však podotknout, že analýza buněk menších průměrů než 7 mikrometrů může činit interpretační potíže naopak při použití přístroje Z2
Coulter. Takováto analýza vyžaduje vysoké nároky
na čistotu nosného roztoku a kyvet. Za méně kvalitních podmínek pak analýza buněk menších průměrů není přesná a v poolu měřených buněk se
nachází množství neživých částic a nečistot.
Zajímavou funkcí obou zmiňovaných přístrojů
je záznam a hodnocení trendu velikosti buněk
(obrázek 9). Tato charakteristika je velmi cenná
při hodnocení průměrných dat v průběhu dlouhodobé kultivace.
Mezi velmi důležité biologické charakteristiky
odvozené od počtu buněk a času, který uplynul
od nasazení buněk po jejich sběr jsou – počet
populačních zdvojnásobení (total/cumulative
population doublings) a čas potřebný na
zdvojnásobení populace (doubling time).
Počet populačních zdvojnásobení lze vypočítat dle následujícího vzorce:
No(PD) = (log Nt – log N0)/0,301
kde No (PD) je počet populačních zdvojnásobení, Nt je počet buněk po enzymatické disociaci/
sběru buněk, N0 je počet nasazených buněk.
Výsledné číslo můžeme hodnotit buďto individuálně, nebo kumulovaně v průběhu dlouhodobé kultivace. Regresní analýza individuálních
hodnot při každé pasáži vypovídá o trendu proliferačního potenciálu buněčné kultury. Kumulace dat je významná pro zaznamenání překročení tzv. Hayflickova limitu (60 populačních
zdvojnásobení), tj. k průkazu neomezeného proliferačního potenciálu (obrázek 10).
Čas potřebný na zdvojnásobení populace je
veličinou odvozenou od počtu buněk a od doby,
která uplynula od nasazení po sběr kultivovaných buněk.
Obr. 12, 12A Výsledky analýzy viability a distribuce
průměrů myších neurálních kmenových buněk
G = (t x log2)/(log Nt – log N0)
kde G je generační doba – čas potřebný na
zdvojnásobení populace, t je čas, který uplynul
od doby nasazení buněk po jejich sběr, Nt je
počet buněk po enzymatické disociaci/sběru
buněk, N0 je počet nasazených buněk.
Generační dobu nejčastěji vyjadřujeme graficky pro celou dobu dlouhodobé kultivace (obrázek 11).
Závěrem bychom rádi demonstrovali raritní
využití přístroje Vi-Cell XR pro analýzu trojrozměrných sfér o velikosti kolem 50 mikrometrů.
V experimentu jsme hodnotili nejprve počet
a distribuci průměrů viabilních myších neurálních kmenových buněk (obrázky 12, 12a). Tyto
po přenesení do kultivačních nádob s neošetřeným, neadhezivním povrchem formovaly sféry
různých velikostí. Tyto jsme průběžně analyzovali přístrojem Vi-Cell XR a kvantitativně jsme
tak hodnotili schopnost neurálních kmenových
buněk tvořit sféry viabilních buněk. Limitem
našich měření byla maximální velikost 70 mikrometrů. Měření sfér pomocí Coulterova impedančního principu plánujeme v brzké době.
MUDR. TOMÁŠ SOUKUP,
ÚSTAV HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE,
LF UK HRADEC KRÁLOVÉ,
Obr. 13 Analýza trojrozměrných sfér neurálních
kmenových buněk o průměrech 30-60 mikrometrů.
ŠIMKOVA 870, 500 01 HRADEC KRÁLOVÉ
ROMAN VLČEK
JIŘÍ MOOS
Poděkování: Práce byla podpořena grantovými
projekty MSM 0021620820, MŠMT 2006 č. 6354c a grantovým projektem Nadace Tomáše Bati.
Poděkování dále patří přednostovi Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové Prof.
MUDr. Jaroslavu Mokrému, Ph.D., laborantkám
Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci
Králové a Jiřímu Moosovi za uvedení do problematiky analýzy buněk a částic.
Vyhlášení vítězů soutěže „Pomozte nám chytit šotka“
V minulém čísle jsme vás poprosili o pomoc, protože se v naší redakci usadil zlomyslný šotek, který zákeřně zaměňoval
písmenka ve slovech. Všem, kteří se lovu na šotka zúčastnili, děkujeme. Se svým úlovkem se přihlásili čtyři lovci a lovkyně, kteří dostali zaslouženou odměnu. Jsou to:
MUDr. Anežka Fišerová ze III.kliniky infekčních a tropických nemocí Fakultní nemocnice Na Bulovce
MUDr. Pavel Jindra z Hematologicko-onkologického oddělení Fakultní nemocnice v Plzni
Michaela Valešová z Hematologického oddělení, Klinlab
Lenka Nováková OKB Nemocnice Znojmo
Všem úspěšným lovcům blahopřejeme!
VAŠE REDAKCE
21
Immunotech a.s.
Beckman Coulter
a jeho sponzorská
činnost
Společnost Immunotech a.s. patří mezi firmy,
které se svým úspěchem alespoň nějakou
měrou snaží pomoci těm, kteří jsou určitým
způsobem handicapovaní a jejichž startovní
čára je omezena nebo vůbec neexistuje.
tohoto důvodu již několik let finančně podporujeme projekty
zaměřené na integrování lidí se speciálními potřebami do většinové společnosti.
Immunotech a.s. byl v letech 2005-2006 hlavním sponzorem projektu
Dobromysl.cz, který realizuje občanské sdružení pro integraci lidí
s postižením Máme otevřeno?. Dobromysl.cz je internetový portál
o lidech a pro lidi se speciálními potřebami. Cílovou skupinou
tohoto projektu jsou rodiny lidí s mentálním postižením a lidé z pomáhají-
22
cích profesí (sociální pracovníci, psychologové,
speciální pedagogové atd.). Jedná se o poměrně
širokou skupinu lidí, protože v České republice je
téměř 300 000 lidí s mentálním postižením, kteří
potřebují služby sociálních organizací, opatrovníků a kteří mají své rodiny. Portál Dobromysl.cz
umožňuje najít aktuální informace z oboru, sdílet
informace z této oblasti, seznámit se a informovat o dostupných službách pro mentálně
postižené. Jednou z ambicí projektu je prostřednictvím informování o tomto druhu zdravotního
postižení zlepšit vztahy mezi většinovou společností a členy minorit. Tematicky projekt pokrývá
hlavní oblasti života, jako jsou rodina, vztahy,
škola, práce, bydlení, zájmy, zdraví a zaměřuje se
přitom především na možnosti začlenění člověka
s postižením do běžného života a na jeho přirozené fungování v rámci komunity.
Tento portál v současné době měsíčně navštíví
přes 11 000 uživatelů.
Jednou z ambicí
projektu je
prostřednictvím
informování o tomto
druhu zdravotního
postižení zlepšit vztahy
mezi většinovou
společností a členy
minorit.
Naše společnosti dále zakoupila 60 kusů diářů
na rok 2006, které vydává rovněž občanské
sdružení pro lidi s postižením Máme otevřeno?.
Tématem diáře pro rok 2006 byly příběhy
o zaměstnávání lidí s mentálním postižením
a grafickou značkou byl chameleon. Ptáte se proč
právě chameleon? Tento ještěr se kromě jiného
vyznačuje také tím, že jeho oči se hýbou nezávisle na sobě všemi směry – může se dívat zároveň
jedním okem dopředu a druhým dozadu. V našem
obvyklém slova smyslu je schopnost chameleona
měnit barvy symbolem bezpáteřnosti a proradnosti, naopak na ostrově Madagaskar jej lidé
uctívají a říkají: „Dělej to jako chameleon při chůzi – dívej se kupředu a zároveň se ohlížej zpátky.“
Cílem diáře pro rok 2006 bylo, aby svět byl chameleonem v madagaskarském významu, abychom uměli nejen hledět vstříc do budoucnosti,
ale abychom se také druhým okem ohlíželi zpátky
a pomohli všem těm, kteří nemohou jít tak, jako
jdeme my.
V roce 2007 se stala společnosti Immunotech
a.s. partnerem při realizaci projektu „Sociální
automobil“ pro Prahu 10. Tento automobil je
zvláštně upravený pro přepravu postižených lidí.
Zakoupením reklamní plochy na sociálním vozidle jsme podpořili tvorbu a obnovu vozového
parku v ústavech a zařízeních, která svou činnost
zaměřují na výchovu, vzdělávání, rehabilitaci
a integraci zdravotně či mentálně postižených
lidí.
I v dalších letech bychom velmi rádi pokračovali ve sponzorování podobných projektů, tj.
v pomoci lidem se speciálními potřebami, jejichž
integrace do společnosti by bez aktivní podpory
okolí nebyla možná.
Dovolte, abychom poděkovali i vám – našim
zákazníkům, protože bez vás bychom těmto lidem
nemohli pomoci.
HANA MACHOVÁ
[email protected]
Pozvánky na akce
IMMUNOMEDICA
Vážení přátelé,
s blížícím se jarem se blíží také termín mezinárodního zdravotnického veletrhu
Pragomedica. V době konání veletrhu, ve dnech 18. a 19. dubna 2007, jsme pro
vás připravili přehlídku nabídky přístrojů firmy Beckman Coulter. Tým produktových specialistů a obchodních zástupců vám bude plně k dispozici. Přehlídka
se jako již tradičně koná v prostorách firmy Immunotech.
Těšíme se na setkání s vámi!
FRIP 2007
Inspekce rotorů do ultracentrifug a vysokovýkonných
centrifug proběhne ve dnech 17. – 19. 4. 2007 v Praze, v Brně
a v Bratislavě.
Zajišťujeme svoz a inspekci rotorů a organizujeme přednášky o novinkách
nejen v oblasti centrifugace. Prosíme zájemce, aby se informovali na adrese
[email protected].
DNA analýza IV
Seminář DNA analýza IV se koná v Praze v Lékařském domě
v Praze ve dnech 24. – 25. 5. 2007.
Přednášky z minulého ročníku si můžte prohlédnout zde: http://www.immunotech.cz/news/DNAIII/Prezentace.zip.
Pokud máte zájem o podrobnější informace, informujte se, prosím, na adrese
[email protected].
23
Kde se můžeme setkat
(březen – červen 2007)
Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku
21. 3. 2007
16. – 20. 4. 2007
24. - 25. 5. 2007
Setkání pracovníků klinické biochemie
a hematologie Plzeňského a Karlovarského
kraje
Klatovy
FRIP 2007
Praha, Brno, Bratislava
DNA analýza
Praha
22. – 24. 4. 2007
1. 6. 2007
Pracovní dny zdravotních laborantů a všeobecných sester pracujících v hematologii
a transfuzní službě
Špindlerův Mlýn
ES TOOLS
Brno
22. 3. 2007
Pracovní den ČSKB – sekce biochemických
laborantů
Praha
17. – 19. 5. 2007
28. - 31. 3. 2007
V. Martinské imunologické dni
Martin
XIV. česko – slovenská konference o hemostáze a trombóze s mezinárodní účastí
Hradec Králové
1. - 3. 4. 2007
23. - 25. 5. 2007
28. imunoanalytické dny
České Budějovice
XXV. Setkání biochemiků Královéhradeckého,
Pardubického a Jihočeského regionu
Trutnov
11. - 12. 6. 2007
Seminář Moravskoslezského kraje
Žermanice
16. - 19. 6. 2007
XXI. Olomoucké hematologické dny
Olomouc
23. – 26. 6. 2007
Česká společnost analytické cytometrie
Brno

Časopis - Beckman Coulter

Transkript

Podobné dokumenty